RU2497543C2 - Композиции и способы применения белка са9 для стимуляции иммунного ответа - Google Patents
Композиции и способы применения белка са9 для стимуляции иммунного ответа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2497543C2 RU2497543C2 RU2010122345/15A RU2010122345A RU2497543C2 RU 2497543 C2 RU2497543 C2 RU 2497543C2 RU 2010122345/15 A RU2010122345/15 A RU 2010122345/15A RU 2010122345 A RU2010122345 A RU 2010122345A RU 2497543 C2 RU2497543 C2 RU 2497543C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- protein
- isolated
- cells
- complex
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 37
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title abstract description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 title abstract description 3
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 claims abstract description 281
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 claims abstract description 271
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 115
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 114
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 70
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 48
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 26
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 11
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 9
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 claims description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 abstract description 26
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 abstract 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 57
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 51
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 21
- 101150051208 HSPH1 gene Proteins 0.000 description 19
- 102100031624 Heat shock protein 105 kDa Human genes 0.000 description 19
- 101100071630 Mesocentrotus franciscanus HSP110 gene Proteins 0.000 description 19
- 101100451677 Mus musculus Hspa4 gene Proteins 0.000 description 19
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 19
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 16
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 16
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 15
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 15
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 14
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 14
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 14
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 9
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 9
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 8
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 229920000855 Fucoidan Polymers 0.000 description 7
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- -1 fluorescein isocyanate Chemical class 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 4
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 102000051505 human CA9 Human genes 0.000 description 3
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000011502 immune monitoring Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HLXHCNWEVQNNKA-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2,3-dihydro-1h-inden-2-amine Chemical compound COC1=CC=C2CC(N)CC2=C1 HLXHCNWEVQNNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 201000003076 Angiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 241000120529 Chenuda virus Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000009047 Chordoma Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 208000009798 Craniopharyngioma Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 101100016370 Danio rerio hsp90a.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100285708 Dictyostelium discoideum hspD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 206010014967 Ependymoma Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 102100034048 Heat shock factor 2-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 102100034049 Heat shock factor protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100034047 Heat shock factor protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034052 Heat shock factor protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100040414 Heat shock transcription factor, X-linked Human genes 0.000 description 1
- 102100040415 Heat shock transcription factor, Y-linked Human genes 0.000 description 1
- 208000001258 Hemangiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101001016882 Homo sapiens Heat shock factor 2-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101001016883 Homo sapiens Heat shock factor protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001016879 Homo sapiens Heat shock factor protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001016871 Homo sapiens Heat shock factor protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001037907 Homo sapiens Heat shock transcription factor, X-linked Proteins 0.000 description 1
- 101001037904 Homo sapiens Heat shock transcription factor, Y-linked Proteins 0.000 description 1
- 101100341519 Homo sapiens ITGAX gene Proteins 0.000 description 1
- 101001014223 Homo sapiens MAPK/MAK/MRK overlapping kinase Proteins 0.000 description 1
- 101001123080 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3D Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 208000007054 Medullary Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 101100124792 Mus musculus Hsph1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 201000010133 Oligodendroglioma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000007641 Pinealoma Diseases 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 101100071627 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) swo1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000000576 arachnoid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 208000003362 bronchogenic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 210000000860 cochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000002445 cystadenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 101150115114 dnaJ gene Proteins 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 102000007192 gp100 Melanoma Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010008486 gp100 Melanoma Antigen Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000025750 heavy chain disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002222 hemangioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000049409 human MOK Human genes 0.000 description 1
- 102000047755 human PPP1R3D Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012804 lymphangiosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000001611 myxosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004019 papillary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000010198 papillary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024724 pineal body neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004123 pineal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000027317 positive regulation of immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000020874 response to hypoxia Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 201000008407 sebaceous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000007321 sebaceous carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 201000010965 sweat gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4634—Antigenic peptides; polypeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464476—Heat shock proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
- A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6043—Heat shock proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/622—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier non-covalent binding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/56—Kidney
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для стимуляции иммунного ответа. Для этого индивидууму вводят композицию, содержащую комплекс изолированного белка угольной ангидразы IX (СА9) и антигена, где изолированный белок СА9 и антиген нековалентно связаны друг с другом. Группа изобретений также относится к композиции, содержащей очищенную популяцию дендритных клеток, которые вступали в контакт с вышеуказанной композицией. Группа изобретений обеспечивает стимуляцию иммунного ответа путем усиления иммуногенности антигена за счет включения в комплекс белка СА9, который может функционировать в качестве шаперона. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил., 8 пр.
Description
По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №61/001602, поданной 2 ноября 2007 г, описание которой включено в данное описание путем ссылки.
Данная работа была поддержана грантом №1K23CA12007501A1 от Национальных Институтов Здоровья. Правительство США имеет определенные права на данное изобретение.
Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится в целом к стимуляции иммунных ответов и, в частности, к применению угольной ангидразы IX (CA9) для стимуляции иммунного ответа, направленного против антигена.
Предшествующий уровень техники
Экспрессия CA9 связана с опухолевым ростом и коррелировалась с прогнозом при различных видах рака мозга, легких, молочной железы, шейки матки, почек, желудочно-кишечного тракта и головы и шеи (1-6). CA9 экспрессируется в ответ на снижение парциального давления кислорода (7). Считается, что это адаптивный ответ, который приводит к увеличенной доставке кислорода и питательных веществ к опухоли и может содействовать прогрессированию заболевания и, в конечном счете, метастазированию раковых клеток. Экспрессия СА9 увеличивается при многих солидных злокачественных опухолях, причем наибольшая экспрессия имеется в опухолевых клетках, непосредственно прилегающих к областям некроза (1, 7). СА9 также является маркером гипоксии в нормальных клетках и большинстве злокачественных опухолей. При всех злокачественных новообразованиях, где сообщалось о СА9 как о прогностическом маркере, за исключением прозрачно-клеточной почечноклеточной карциномы (RCC), увеличенная экспрессия CA9 прогнозировала худший прогноз (1-4, 6). Экспрессия в другой нормальной ткани ограничивается базальными клетками волосяных фолликулов, эпителием гонад, паутинным сплетением и некоторыми отделами слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (8). Однако при прозрачно-клеточной RCC экспрессия CA9 не регулируется парциальным давлением кислорода. CA9 присутствует более чем в 80% первичных и метастатических RCC, и СА9 присутствует в 95-100% прозрачно-клеточного варианта, наиболее распространенного гистологического типа RCC. CA9 не экспрессирован в нормальной почечной ткани (8, 9). Представляется, что для прозрачно-клеточной RCC СА9 является превосходным маркером, который способствует установлению диагноза, определению прогноза, прогнозированию реакции на лечение и служит в качестве мишени для лечения. В частности, высокая экспрессия CA9 является независимым прогностическим показателем более длительного специфичного для заболевания выживания у пациентов с метастатической RCC (5, 10) и улучшенного выживания у пациентов с локализованной RCC (11, 12). Однако, несмотря на широко распространенный интерес к CA9 и лучшее понимание молекулярного дефекта, ведущего к избыточной экспрессии при прозрачно-клеточной RCC, непонятен механизм, связывающий экспрессию CA9 с улучшенным прогнозом и реакцией на лечение у пациентов с RCC, в то же время в иных отношениях являющийся показателем неблагоприятного прогноза. Поэтому, существует потребность в разработке способов и композиций с использованием CA9 для применения в качестве терапевтического средства.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданно обнаруженной у CA9 функции шаперона, выполняемой подобно белку теплового шока (HSP). В частности, в данном описании раскрывается, что CA9, а также растворимая форма CA9, которая отделяется с поверхности определенных клеток и приблизительно на 4 кДа меньше, чем CA9 полной длины, может ингибировать вызванную нагреванием агрегацию белка и может содействовать сворачиванию белка. Однако авторы показывают, что в отличие от HSP, CA9 может образовывать иммуногенные комплексы с антигенами при комнатной температуре (например, приблизительно 20°C) и при температуре тела человека (например, 37°C). В данном описании также показано, что CA9 интернализуется представляющими антиген клетками и перерабатывается в первую очередь по протеосомальному пути, который считается важным для активации опосредованных клетками иммунных ответов. Кроме того, авторы продемонстрировали на мышиной модели меланомы, что способ по изобретению эффективен для стимуляции антиген-специфического противоопухолевого ответа, который является более выраженным, чем ответ, генерируемый антигеном, в отсутствие белка CA9. Соответственно, изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа на антиген, включающему введение композиции по изобретению индивидууму в количестве, эффективном для стимуляции иммунного ответа на антиген, где иммунный ответ на антиген является более выраженным, чем иммунный ответ, стимулированный антигеном, в отсутствие белка CA9. Композиции по изобретению содержат антиген и изолированный белок CA9. Изолированный белок CA9 и антиген предоставлены в комплексе, причем комплекс может представлять собой нековалентную связь между изолированным CA9 и антигеном или может представлять собой химически конъюгированный белок CA9 с антигеном, или может представлять собой слитый белок CA9/антигена. Иммунный ответ, стимулированный введением композиции, может быть профилактическим или терапевтическим и может включать гуморальный или клеточно-опосредованный иммунный ответ, или их комбинацию. Изобретение может использоваться для стимуляции иммунного ответа против широкого разнообразия пептидных и белковых антигенов, но белки теплового шока не включены в объем антигенов, используемых в композициях и способах по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления антиген представляет собой опухолевый антиген.
Краткое описание фигур
На фиг.1А в виде фотографии представлены результаты прерывистого анализа, использованного для того, чтобы показать, что CA9 способен связывать белки-клиенты. Люцифераза (Luc) служила в качестве белка-клиента, и CA9 образовывал комплекс с Luc при 37°C и 43°C. HSP110 служил в качестве положительного контроля и образовывал комплекс с люциферазой при 43°C, но не при 37°C. Овальбумин (OVA) служил в качестве отрицательного контроля и не обладал способностью выполнять функции шаперона. Полосы без шаперона (1ая полоса) были включены в качестве контролей. Иммунопреципитацию (IP) выполняли, используя антитела против CA9, HSP110 или OVA с последующим вестерн-блоттингом (WB) с антителом против люциферазы. На нижней панели WB выполняли с анти-люциферазой для подтверждения того, что прерывистый анализ OVA был успешным.
На фиг.1B графически представлены данные, демонстрирующие, что рекомбинантный CA9, так же как HSP70, эффективен в предотвращении агрегации люциферазы при 43°C. OVA служил в качестве контрольного белка. Мониторинг агрегации люциферазы в динамике во времени осуществляли измерением оптической плотности при 320 нм.
На фиг.1C в виде фотографии представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие, что CA9 способен предотвращать агрегацию люциферазы и удерживать ее в растворе. Люциферазу нагревали до 43°C в течение 30 мин с белком шаперона (CA9, HSP110, OVA) или без него. Всю реакционную смесь центрифугировали при 16000×g в течение 15 мин для отделения супернатанта и осадка после центрифугирования. В контрольных ответах (полосы 1 и 2) большая часть люциферазы агрегировалась и была обнаружена в осадке после центрифугирования. CA9 и HSP110 были способны удерживать люциферазу в растворе при температуре теплового шока. Вся реакционная смесь служила в качестве контроля загрузки.
На фиг.1D представлено графическое изображение данных, демонстрирующих, что изолированный белок CA9 и классические белки теплового шока представляют собой белки, денатурированные шапероном, и обеспечивают возможность повторного сворачивания. Люциферазу денатурировали при 43°C в течение 30 мин в присутствии CA9, HSP110, HSP70 или OVA (отрицательный контроль). Добавляли лизат кроличьих ретикулоцитов (RRL), и повторное сворачивание оценивали мониторингом ферментной активности люциферазы. Молярное отношение белка шаперона к люциферазе составляло 20:1. Способность повторного сворачивания коррелировалась со способностью предотвращать агрегацию белков-клиентов; CA9 и HSP70 были одинаковы по их способности предотвращения агрегации и повторного сворачивания люциферазы. Для экспериментов, выполненных в трех повторах, представлена средняя величина±SEM (стандартная ошибка среднего).
На фиг.2A представлено графическое изображение данных, показывающих, что CA9 связывает DC (дендритные клетки) насыщаемым образом, что указывает на связывание, опосредованное рецепторами. Полученные из костного мозга DC (1×106/мл) инкубировали при 4°C с CA9, меченным FITC (флюоресцеин-изоцианатом) или BSA, меченным FITC, в течение 30 мин и дважды промывали 1% BSA/PBS (бычий сывороточный альбумин/забуференный фосфатом солевой раствор). Связывание CA9 оценивали измерением средней интенсивности флюоресценции (MFI) с использованием проточной цитометрии.
На фиг.2B представлено графическое изображение данных, показывающих конкурентный анализ связывания CA9 с DC. Связывание CA9 с DC ингибировалось немеченым CA9. DC, полученные из костного мозга (1×106/мл), инкубировали при 4°C с немеченым CA9 или BSA в указанных концентрациях, промывали и затем инкубировали с 200 мкг/мл CA9, меченного FITC.
На фиг.2C представлено графическое изображение данных, показывающих, что связывание CA9 с DC ингибируется лигандом акцепторного рецептора. DC, полученные из костного мозга (1×106/мл), инкубировали при 4°C с фукоиданом или BSA в указанных концентрациях, промывали и затем инкубировали с 200 мкг/мл CA9, меченного FITC.
На фиг.2D представлено графическое изображение данных, показывающих, что связывание CA9 было уменьшено в DC из акцепторного рецептора А (SRA) от нокаутированных мышей (мышей SRA-KO), по сравнению с DC от мышей дикого типа (WT), указывая на то, что связывание CA9 частично опосредуется SRA. DC, полученные из костного мозга (1×106/мл), инкубировали при 4°C с BSA, CA9 или фукоиданом в концентрации 500 мкг/мл перед промыванием и затем инкубировали с 200 мкг/мл CA9, меченного FITC. «Усы» указывают SEM для экспериментов, выполненных в трех повторах.
На фиг.3А представлено графическое изображение данных, показывающих, что опухолевые клетки сбрасывают растворимую форму CA9. Клеточные лизаты из человеческих почечных опухолей зондировали антителом против CA9, демонстрирующим экспрессию CA9 полной длины. Такие же опухоли, выращенные в кратковременных культурах, сбрасывали растворимую Форму CA9 (sCA9), которая имела размер, приблизительно на 4 кДа меньше, чем CA9 полной длины. Прозрачно-клеточные опухоли (опухоли 30-34) экспрессировали и сбрасывали CA9. Здоровые почки (Ki) и 2 папиллярные почечные опухоли (опухоли 28 и 29) не экспрессировали или не сбрасывали CA9.
На фиг.3B представлено графическое изображение данных, показывающих, что сброшенный CA9 обладает свойствами, подобно шаперону. SCA9 был так же эффективен как CA9 полной длины в ингибировании агрегации люциферазы при 43°C. Мониторинг агрегации люциферазы с течением времени проводили измерением оптической плотности при 320 нм.
На фиг.3C представлено графическое изображение данных, показывающих, что растворимый CA9 связывает DC насыщаемым образом. Клетки DC, полученные из костного мозга (1×106/мл), инкубировали при 4°C с sCA9 или BSA, меченым FITC, в течение 30 мин и дважды промывали 1% BSA/PBS (слева). Как и с CA9, связывание sCA9 с DC ингибировалось немеченым CA9 и фукоиданом, свидетельствуя о том, что CA9 и sCA9 связывают акцепторные рецепторы на DC (справа). Клетки DC, полученные из костного мозга (1×106/мл), инкубировали при 4°C с BSA, CA9 или фукоиданом при 500 мкг/мл перед промыванием и инкубировали с 200 мкг/мл меченого FITC CA9. «Усы» указывают SEM для экспериментов, выполненных в трех повторах.
На фиг.3D представлено графическое изображение данных, показывающих, что растворимый CA9 содействует повторному сворачиванию денатурированного белка. Люцифераза денатурировалась при 43°C в течение 30 мин в присутствии CA9, sCA9 и HSP110. Добавляли лизат кроличьих ретикулоцитов, и повторное сворачивание оценивали мониторингом ферментной активности люциферазы. Молярное отношение белка шаперона к люциферазе составляло 20:1. CA9 и sCA9 были одинаковы в их способности повторно сворачивать люциферазу. Средняя величина±SEM представлены для экспериментов, выполненных в трех повторах.
На фиг.4A представлено графическое изображение данных, показывающих, что и CA9, и сброшенный CA9 (sCA9) способны связывать и нести люциферазу к DC. CA9 и sCA9 образовывали комплексы с люциферазой при 37°C в течение 30 мин и инкубировали с DC, полученными из костного мозга при 4°C в течение 2 ч. CA9 и sCA9 без люциферазы и одну люциферазу также инкубировали с DC и служили в качестве контролей. DC дважды промывали для удаления несвязанного CA9, лизировали в буфере RIPA и зондировали вестерн-блоттингом антителами против люциферазы и против CA9.
На фиг.4B представлена фотография, полученная при выполнении анализа с использованием конфокальной микроскопии, демонстрирующая, что CA9 способна связывать DC и быть интернализированным. В частности, конфокальная микроскопия показала CA9, меченный FITC, связанный с поверхностью полученных из костного мозга DC при 4°C. DC промывали для удаления несвязанного CA9 и инкубировали при 37°C в течение 2 часов, что приводило к интернализации CA9, меченного FITC. Проводили контрокрашивание ядра DAPI (диамидин-2-фенилиндолом).
На фиг.4C представлена фотография, полученная при выполнении вестерн-блоттинга, показывающая, что DC способны интернализировать и перерабатывать CA9. CA9 давали возможность связывать DC в течение 2 ч при 4°C. DC дважды промывали и инкубировали в свежей среде при 37°C в течение указанного времени. CA9 клеточной поверхности промывали, и мониторинг внутриклеточного CA9 проводили вестерн-блоттингом для выявления CA9. β-актин служил в качестве контроля загрузки. В необработанной группе (контроль), обработка CA9 приводила к уменьшению внутриклеточного CA9, выявленного вестерн-блоттингом. Предварительная обработка DC MGl32 (ингибитор протеосомы) или NH4Cl (ингибитор лизосомы) в течение 30 мин при 37°C показала, что CA9 обрабатывался обоими путями; однако протеосомальный путь был преобладающим.
На фиг.5А представлено графическое изображение результатов, полученных иммунизацией мышей C57/BL6 (5 на группу) комплексом CA9-gp100 (CA9+gp100), которое демонстрирует стимуляцию противоопухолевого эффекта против опухолевых клеток B16-gp100. Опухолевые клетки B16-gp100 (2×105) инъецировали интрадермально через 7 дней после 3 иммунизаций, проводимых с интервалом 7 дней. Величины P на основании повторных измерений с использованием ANOVA (вариационный анализ), который учитывает вариабельность внутри каждой группы, представлены в таблице, сравнивающей каждую группу с контрольными мышами, которым инъецировали PBS. Скорость роста опухолей значимо отличалась при сравнении мышей, иммунизированных CA9+gp100, и мышей в любой контрольной группе; например, величина p составила 0,0036 при сравнении с группой CA9+gρ100, и мышами, иммунизированными инъекцией CA9 и gp100 в отдельные бока (CA9L-gp100R). Одинаковые результаты были получены в 3 отдельных экспериментах.
На фиг.5B представлено графическое изображение результатов, полученных иммунизацией мышей комплексом CA9+gp100, который стимулировал gp100-специфический ответ IFN-γ (интерферон-гамма) из клеток CD8+, измеренный с использованием анализа иммуноферментного анализа ELISPOT. Средняя величина±SEM представлены для экспериментов, выполненных в трех повторах.
На фиг.5C представлено графическое изображение результатов, полученных иммунизацией мышей комплексом CA9+gp100, который стимулировал специфическую для опухоли Т-клеточный ответ, измеренный с использованием анализа высвобождения 51Cr. Средняя величина±SEM представлены для экспериментов, выполненных в трех повторах.
На фиг.5D представлено графическое изображение результатов, показывающих, что сброшенный CA9 способен стимулировать специфический клеточный иммунный ответ против мышиного пептида gp100 (EGSRNQDWL (SEQ ID NO:2)). Иммунизация DC, обработанными комплексом из CA9 и пептида gp100, вызывала пептид-специфический ответ цитотоксических Т-клеток, измеренный с использованием анализа высвобождения 51Cr. Мышей C57/BL6 (3 на группу) иммунизировали 3 раза с интервалом 7 дней 2×106 DC, полученными из костного мозга, обработанными указанными белок-пептидными комплексами в концентрации 10 мкг/мл и активировали LPS (липополисахаридом). Средняя величина±SEM представлены для экспериментов, выполненных в трех повторах.
На фиг.6A представлена фотография, на которой показаны результаты вестерн-блоттинга, полученные при анализе эффекта цитокинов на отделение и экспрессию CA9. Экспрессия CA9 линией клеток R6 RCC была увеличена в ответ на среды, кондиционированные человеческими WBC, обработанными IL2 (интерлейкин 2) и IFN-α (интерферон-альфа). WBC выделяли из крови человека и обрабатывали IL2, IFN-α, IFN-γ или не обрабатывали ничем (контроль) в течение 24 ч для получения кондиционированных сред (CM). Клетки R6 обрабатывали CM в течение 48 ч перед лизисом и зондированием антителом против CA9. CM использовали, поскольку цитокины обеспечивают терапевтическое благоприятное действие стимуляцией иммунных клеток, а не нацеливаясь непосредственно на опухоли.
На фиг.6B представлена фотография, фотография, на которой показаны результаты вестерн-блоттинга, свидетельствующие о том, что сброс CA9 первичными опухолевыми эксплантатами в кратковременной культуре увеличивается в ответ на действие IL2. Первичные почечные опухоли культивировали с IL2 или без него. Культуральные среды зондировали антителом против CA9. Культуральные среды разделяли электрофорезом и окрашивали кумасси голубым, и они служили в качестве контроля. IL2 наносили непосредственно на хирургические образцы, которые содержат как опухолевые клетки, так и иммунные клетки.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям и способам стимуляции иммунного ответа на антиген у индивидуума. Композиция содержит комплекс изолированного белка CA9 и антигена. Способ включает введение композиции индивидууму в количестве, эффективном для стимуляции иммунного ответа на антиген, где стимулированный иммунный является более выраженным, чем иммунный ответ, стимулированный одним антигеном. Стимулированный иммунный ответ может оказывать терапевтический или профилактический эффект и может включать клеточно-опосредованный и/или гуморальный ответ или его комбинацию.
Настоящее изобретение основано на неожиданно обнаруженной у CF9 новой функции шаперона, и это считается открытием первого белка клеточной поверхности, который может функционировать в качестве шаперона. «Шаперон» в целом считается в данной области белком, который может связывать белки-клиенты, предотвращать агрегацию белков-клиентов при температурах, вызывающих тепловой шок, таких как температуры приблизительно 42-43°C, и обеспечивать возможность повторного свертывания денатурированных белков. Однако тепловое повреждение белков, необходимое для образования комплексов с белками-шаперонами, может происходить при температурах, достигающих приблизительно 55°C. Белки теплового шока (HSP) являются хорошо известными, вездесущими внутриклеточными шаперонами, экспрессия которых запускается индуцированными тепловым шоком факторами транскрипции, включая HSFl, HSF2, HSF2BP, HSF4, HSF5, HSFXl, HSFX2, HSFYl, HSFY2. Авторы продемонстрировали, что CA9 выполняет много функций, обычно относимых к белкам теплового шока HSP, и что растворимая форма CA9, которая отделяется от поверхности клеток, также обладает свойствами шаперона HSP. В частности, авторы продемонстрировали, что CA9 ингибирует вызванную нагреванием агрегацию белка, обеспечивает возможность повторного сворачивания денатурированного белка и восстанавливает ферментативную функцию белков, с которыми он образует комплексы. Авторы продемонстрировали, что CA9 связывается с дендритными клетками (DC) специфичным для рецептора образом, и показали, что связанный CA9 интернализуется DC и перерабатывается в первую очередь по протеосомальному пути, который, как считают, необходим для представления экзогенных антигенов на MHC I (главном комплексе тканевой совместимости) и активации Т лимфоцитов CD8+. Считается также, что такое представление антигена является важным для стимуляции вакциной иммунного ответа, который может ингибировать рост опухолей. Таким образом, приведенные результаты совместно указывают на то, что CA9, вероятно, играет непосредственную роль в стимуляции адаптивного иммунного ответа. В этом отношении, авторы также продемонстрировали на модели рака в виде мышиной меланомы, что введение композиции, содержащей CA9 и антиген, может стимулировать специфический для антигена противоопухолевый ответ, который является более выраженным, чем ответ, генерируемый одним антигеном.
Несмотря на указанные выше сходства между CA9 и HSP, CA9 имеет несколько необычных и желаемых признаков, по сравнению с HSP, и поэтому не считается одним из HSP. Например, HSP индуцируются нагреванием и, в соответствии с их ролью в обеспечении термической устойчивости, HSP связывают антигены-мишени при температурах, вызывающих тепловой шок, например, 42-43°C. Напротив, CA9 индуцируется не только нагреванием (но и гипоксией), и авторы продемонстрировали, что CA9 эффективно связывает антигены-мишени при 37°C. Кроме того, CA9 может также образовывать иммуногенные комплексы при комнатной температуре. Таким образом, такое свойство CA9 может содействовать более эффективному получению композиций на основе CA9 для применения в способе по изобретению. Кроме того, HSP являются внутриклеточными шаперонами и в целом высвобождаются во внеклеточную среду только после нарушения клеточной целостности. С другой стороны, CA9 представляет собой белок клеточной поверхности и также может сбрасываться во внеклеточную среду жизнеспособными клетками. Кроме того, в клетках с интактной реакцией на гипоксию, CA9 экспрессируется в ответ на уменьшение парциального давления кислорода. Поэтому и без связи с какой-либо конкретной теорией, полагают, что настоящее изобретение выявляет, что экспрессия и сброс CA9 может представлять собой общий механизм вовлечения иммунной системы в нацеливание на внеклеточные антигены в ответ на гипоксический стресс, и может объяснить благоприятный прогноз в случаях RCC, где растворимый CA9 сбрасывается из опухолей. Кроме того, клетки, экспрессирующие CA9 в организме хозяина, могут представлять непрерывный источник для продукции иммунного адъюванта, который мог бы служить содействию иммуностимулирующим эффектам настоящего изобретения.
Белок CA9 полной длины имеет следующую аминокислотную последовательность:
1 maplcpspwl pllipapapg ltvqlllsll llvpvhpgrl prmqedsplg ggssgeddpl
61 geedlpseed spreedppge edlpgeedlp geedlpevkp kseeegslkl edlptveapg
121 dpqepqnnah rdkegddqsh wryggdppwp rvspacagrf qspvdirpql aafcpalrpl
181 ellgfqlppl pelrlrnngh svqltlppgl emalgpgrey ralqlhlhwg aagrpgseht
241 veghrfpaei hvvhlstafa rvdealgrpg glavlaafle egpeensaye qllsrleeia
301 eegsetqvpg ldisallpsd fsryfqyegs lttppcaqgv iwtvfnqtvm lsakqlhtls
361 dtlwgpgdsr lqlnfratqp lngrvieasf pagvdsspra aepvqlnscl aagdilalvf
421 gllfavtsva flvqmrrqhr rgtkggvsyr paevaetga. (SEQ ID NO:1).
кДНК человеческого CA9 известна в данной области и кодирует белок из 459 аминокислот с N-концевой внеклеточной частью из 414 аминокислот, связанной посредством прогнозированной гидрофобной трансмембранной области (ТМ) из 20 аминокислот с прогнозированным С-концевым внутриклеточным хвостом (IC) из 25 аминокислот. Прогнозированная последовательность ТМ представлена в SEQ ID NO:1 в виде аминокислот 415-434. Прогнозированная последовательность IC представлена в SEQ ID NO:1 в виде аминокислот 435-459. Таким образом, прогнозированная последовательность сброшенного белка CA9 представлена в SEQ ID NO:1 в виде аминокислот 1-414.
CA9 полной длины имеет прогнозированную молекулярную массу 49,7 кДа, но он может быть выявлен на вестерн-блотах 54 кДа и 58 кДа. Сброшенная форма CA9 представляет собой растворимую форму CA9, которая высвобождается в культуральную среду и в биологические жидкости, наиболее вероятно, путем протеолитического отщепления внеклеточной части от трансмембранной и внутриклеточной последовательностей. Сброшенный CA9 на 4 кДа меньше чем CA9 полной длины, по данным выявления на вестерн-блотах и, таким образом, мигрирует в виде сдвоенных полос 50/54 кДа (Zavada et al., Br J Cancer. 2003 Sep 15;89(6):1067-71), но имеет прогнозированную молекулярную массу 45,7 кДа.
Композиции по настоящему изобретению содержат изолированный белок CA9. Под термином «изолированный белок CA9» подразумевается, что белок выделен из его естественной среды. Считается, что описанные в настоящем изобретении комплексы CA9/антигена содержат изолированный белок CA9.
Белок CA9 для применения в композициях и способах по изобретению может быть выделен из клеток, которые экспрессируют белок CA9. Некоторые неограничивающие примеры таких клеток включают клетки, которые эндогенно экспрессируют белок CA9 из геномных кодирующих последовательностей, и клетки, которые были подвергнуты манипуляция генной инженерии для экспрессии рекомбинантного белка CA9. Такая рекомбинантная экспрессия белка CA9 может быть достигнута с использованием широкого разнообразия обычных методик и систем рекомбинантной экспрессии белка, известных в данной области. Альтернативно, сброшенный белок CA9 может быть выделен с использованием известных способов из сред для клеточных культур, в которых культивируются клетки, экспрессирующие CA9 посредством эндогенной генной экспрессии или генной инженерии. В случае пептидных антигенов, пептиды могут быть химически синтезированы при помощи любой из разнообразных хорошо известных методик или могут быть получены в результате протеолитического расщепления более крупных белков.
Изолированный белок CA9 необязательно должен представлять собой очищенный белок. Однако изолированный белок CA9 может, тем не менее, быть очищен до любой желаемой степени чистоты. Способы очистки белка хорошо известны в данной области и могут применяться для получения очищенного белка СА9 для использования в настоящем изобретении.
Предусматривается, что настоящее изобретение может применяться для стимуляции иммунного ответа на любой белок, полипептид или пептидный антиген, за исключением того, что используемый в данном описании термины «антиген» и «антигены» не включают HSP. Примеры HSP включают hsp40, калретикулин, hsp60, hsp70, hsp90, HSP110. Таким образом, за исключением иных случаев, описанных в данном описании, антигены, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают, но без ограничения, антигены, экспрессируемые раковыми клетками или инфекционными агентами. Антиген может быть хорошо охарактеризован или может быть неизвестен, кроме как известностью его присутствия, например, в лизате из определенного типа клеток, такого как опухоль или бактериальная культура.
В одном варианте осуществления антиген, присутствующий в изолированных комплексах CA9/антиген по изобретению, представляет собой опухолевый антиген. Опухолевые антигены могут быть получены при помощи обычных методик, таких как получение лизатов опухолевых клеток повторным замораживанием и оттаиванием опухолевых клеток/тканей в забуференном фосфатом солевом растворе, содержащем лейпептин и апротинин (полученный из свежей биопсии ткани опухоли или из опухолевых клеток, генерированных in vitro тканевой культурой). Такое замораживание и оттаивание приводит к лизису клеток. Опухолевой лизат может быть получен путем центрифугирования и сбора надосадочной жидкости. Лизаты опухолевых клеток могут применяться сразу или замораживаться и храниться, например, при -70°C до готовности к использованию.
В различных вариантах осуществления антиген может представлять собой антиген, экспрессируемый раковыми клетками, конкретные примеры которых включают, но без ограничения, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, псевдомиксому брюшины, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному ободочной кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечноклеточную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильнса, рак шейки матки, рак семенников, карциному легких, мелкоклеточную карциному легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, нейрому слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, лейкоз, лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрома и болезнь тяжелых цепей. В одном варианте осуществления антиген представляет собой gp 100.
В других вариантах осуществления, антигены, используемые в изобретении, могут представлять собой такие, которые экспрессируются инфекционными агентами. Примеры таких инфекционных агентов включают, но без ограничения, вирусы, бактерии, грибы и другие паразиты. Примеры вирусов включают, но без ограничения, вирусы гепаптита типа В или типа С, гриппа, ветряной оспы, аденовирус, вирус простого герпеса типа I или типа II, чумы рогатого скота, риновирус, эховирус, тотавирус, респираторный синцитиальный вирус, вирус папилломы, цитомегаловирус, эхиновирус, арбовирус, гантавирус, коксаки вирус, вирус эпидемического паротита, вирус кори, вирус краснухи, вирус полиомиелита, вирус иммунодефицита человека типа I или типа II. Примеры бактерий включают, но без ограничения, M. tuberculosis, микобактерию, микоплазму, Neisseria и Legionella. Примеры других паразитов включают, но без ограничения, рикеттсии и хламидии.
Без намерения быть связанными какой-либо конкретной теорией, считают, что для применения в способе по изобретению, изолированный белок СА9 и антиген должны присутствовать в комплексе и, таким образом, соединены друг с другом химическим связыванием, таким как ковалентные связи, ионные связи, водородные связи и/или связи Ван дер Ваальса или их комбинации. Таким образом, в одном варианте осуществления белок СА9 и антиген могут присутствовать в комплексе, где белок СА9 и антиген ковалентно не связаны друг с другом. Способы образования комплексов белка/антигена без ковалентного связывания известны в данной области и могут использоваться для образования комплексов между изолированным белком СА9 и одним или более антигенами. Комплексы по изобретению могут содержать белок СА9 и антиген или могут состоять по существу из белка СА9 и антигена, или могут состоять из белка СА9 и антигена.
В одном варианте осуществления комплекс, содержащий изолированный СА9 и нековалентно связанный антиген, может быть образован в подходящем буфере при комнатной температуре (например, приблизительно 20°C), или при более высокой температуре, например, 37°C, но ниже более высоких температур, обычно требуемых для того, чтобы HSP образовывали комплекс с белком, например, 43°C. Соответственно комплексы CA9/антигена по настоящему изобретению могут быть образованы, например, при температуре в диапазоне от 20°C до 42°C, включительно, и включая все целые числа от 20°C до 42°C. Комплексы могут также быть образованы при более высоких температурах. В одном варианте осуществления комплекс CA9/антиген образуется при 37°C. Подходящие молярные отношения CA9 к антигену могут быть определены специалистами в данной области, с учетом благоприятного эффекта, раскрытого в данном описании. В одном варианте осуществления используется отношение CA9/антигена 1:1.
В одном варианте осуществления для использования в настоящем способе эндогенный CA9 может быть изолирован из биологического образца, содержащего клетки, такого как биологический образец, полученный из опухоли, и выделенный белок CA9, таким образом, может уже образовывать комплексы с опухолевыми антигенами, против которых надлежит стимулировать иммунный ответ.
В другом варианте осуществления изолированный белок CA9 может быть ковалентно связан с антигеном, например, химическим конъюгированием белка CA9 с антигеном для образования комплекса конъюгата изолированного белка CA9/антигена. Подходящие способы химического конъюгирования белков известны в данной области и могут использоваться для образования конъюгатов изолированного белка CA9/антигена для композиций и способов по изобретению. Кратко, CA9 могут быть ковалентно конъюгированы с антигеном посредством поперечной сшивки аминокислотных остатков CA9 с аминокислотными остатками антигена. Аминокислотные остатки могут быть конъюгированы, например, поперечной сшивкой амино, сульфгидрильных или групп карбоновых кислот с использованием широкого разнообразия хорошо известных реагентов и методик.
В еще одном варианте осуществления комплекс CA9/антигена может быть получен в виде слитого белка CA9/антигена. Кратко, для получения такого слитого белка, последовательности ДНК, кодирующие белок CA9, и антиген могут быть сконструированы с использованием обычных методик и экспрессированы в подходящем типе клеток с использованием любого целесообразного вектора экспрессии. Затем слитый белок может быть экспрессирован в клетках и изолирован с использованием любого способа, известного специалистам в данной области. В одном варианте осуществления слитый белок CA9/антигена может быть отделен линкерной последовательностью.
В еще одном варианте осуществления изолированный белок CA9 может быть смешан с клеточным материалом, таким как опухолевый лизат, для обеспечения возможности связывания CA9 с одним или более опухолевыми антигенами, присутствующими в лизате, образуя, таким образом, гетерогенную смесь изолированных комплексов CA9/антигена, которая может использоваться в способе по изобретению в качестве мультивалентной противораковой вакцины. Таким образом, будет понятно, что могут быть предоставлены изолированные белки CA9 для применения в изобретении с тем, чтобы дискретные изолированные белки CA9 образовывали комплексы с различными антигенами.
В композициях и способах по изобретению могут использоваться любые из различных средств доставки. Подходящие средства доставки включают, но без ограничения, представляющие антиген клетки (APC), такие как дендритные клетки, макрофаги, B клетки, моноциты и другие клетки, которые могут методами генной инженерии сделаны эффективными APC.
В одном варианте осуществления изобретение относится к композиции и способу стимуляции у индивидуума иммунного ответа на антиген, включающему введение индивидууму композиции, содержащей APC, такие как дендритные клетки, которые вступили в контакт с комплексом, содержащим изолированный белок CA9 и антиген. Дендритные клетки могут содержать комплекс белка CA9/антигена во время, когда дендритные клетки вводятся индивидууму. Это может быть достигнуто, например, предварительной загрузкой дендритных клеток комплексом или трансфекцией клеток ДНК, кодирующей белок CA9, и антигеном в виде или различных белков, или в виде слитого белка.
Когда используются APC, то APC, такие как дендритные клетки, могут быть сначала выделены у индивидуума и подготовлены для воздействия комплекса CA9/антиген с использованием обычных методик. Дендритные клетки могут быть выделены у индивидуума, у которого желателен стимулированный иммунный ответ на антиген, или могут быть выделены у другого индивидуума.
В одном варианте осуществления изобретение относится к по существу очищенной популяции дендритных клеток, которые контактировали с комплексом CA9/антиген.
Для применения в композициях и способах по изобретению, может быть использован любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области. Тип носителя варьируется в зависимости от пути введения. Композиции по настоящему изобретению могут составляться для любого целесообразного пути введения, включая, например, местное, пероральное, интраназальное, внутривенное, внутричерепное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель может содержать воду, солевой раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения, можно использовать любой из указанных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Композиции могут также содержать буферы (например, нейтральный забуференный солевой раствор или забуференный фосфатом солевой раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), манит, антиоксиданты, хелатообразующие агенты, такие как EDTA или глютатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия) и/или консерванты.
Композиции по изобретению могут вводиться с использованием любого подходящего пути введения. Некоторые неограничивающие примеры включают пероральный, парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и интраназальный. Парентеральные вливания включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное и подкожное введение.
Введение композиций по изобретению может выполняться в сочетании с обычными видами лечения, которые предназначены для лечения заболевания или расстройства, связанного с антигеном. Например, композиция может вводиться перед, одновременно или после обычных противораковых видов лечения. Такие виды лечения могут включать, но без ограничения, виды химиотерапии, хирургические вмешательства и лучевую терапию.
Как правило, соответствующая дозировка и схема лечения предоставляет композицию в количестве, эффективном для стимуляции иммунного ответа, который обеспечивает терапевтический и/или профилактический благоприятный эффект. Мониторинг такого ответа может осуществляться улучшенным клиническим исходом, например, ингибированием роста опухоли и/или метастазирования, повышенной устойчивостью к инфекции, улучшенной активацией иммунных клеток и/или другими параметрами, которые очевидны для специалистов в данной области, в зависимости от подвергаемого лечению состояния.
Пути и частота введения терапевтических композиций, раскрытых в данном описании, а также дозировка будут варьироваться от индивидуума к индивидууму и могут быть легко установлены с использованием стандартных методик. В целом, количество каждого комплекса CA9/антиген, присутствующего в дозе, может находиться в диапазоне примерно от 100 мкг до 5 мг на кг массы тела хозяина. Подходящие объемы будут варьироваться в зависимости от размеров тела пациента, но обычно будут находиться в диапазоне примерно от 0,1 мл до примерно 5 мл. В одном варианте осуществления, композиция по изобретению может вводиться один раз в неделю всего в количестве 3 доз.
Пример 1
В данном примере представлено описание материалов и способов, которые использовались при создании изобретения.
Мыши, клеточные линии и конструкты ДНК
Самок мышей C57/BL6 в возрасте 6-8 недель закупали в NCI (Frederick, MD) и содержали в условиях, лишенных болезнетворных микроорганизмов. Мышей SR-A null, подвергнутых обратному бридингу в исходный фенотип C57BL/6J, получали у B. Berwin (Dartmouth University) в виде щедрого дара господ T. Kodama из Токийского университа (Tokyo University) и M.W. Freeman (Massachusetts General Hospital, NHLBI Program in Genomics Applications). Клетки B16, трансдуцированные человеческим gp100 (B16-gp100), были любезно предоставлены доктором Alexander Rakhmilevich (University of Wisconsin, Madison, WI). R6, линия клеток человеческой RCC, которая экспрессирует CA9, была даром доктора Arie Belldegrun (UCLA, Los Angeles). Клетки RENCA и RENCA, устойчиво трансдуцированные для экспрессии человеческого CA9 (RENCA-CA9) были даром доктора Arie Belldegrun (UCLA, Los Angeles, CA). Эти клетки поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FBS; Life Technologies, Grand Island, NY), 2 ммоль/л L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
кДНК для мышиного HSP110, мышиного HSP70, человеческого CA9 и человеческого gp100 (дар доктора Nicholas Restifo, National Cancer Institute, Bethesda, MD) клонировали в вектор pBacPAK-his (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), трансформировали в монослой клеток Sf21 с использованием вируса с дефектной репликацией, и экспрессировали, используя систему бакуловируса BacPAK. Белки очищали с использованием никелевой колонки с нитрилуксусной кислотой-агарозой (Qiagen, Valencia, CA). Концентрации белка измеряли с использованием набора Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Чистоту белка оценивали с использованием электрофореза в додецилсульфате натрия-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и окрашиванием кумасси голубым. Уровни эндотоксина в рекомбинантных белках оценивали, используя набор лизата Limulus Amebocyte (Biowhittaker, Walkersville, MD) и составляли 10-25 эндотоксиновых единиц/мг белка.
Образование комплекса шаперон-антиген
Для образования комплекса между шапероном (т.е. HSP110, CA9, OVA) и антигеном (т.е. gp100 и люциферазой), 2 белка объединяли в молярном соотношении 1:1 и инкубировали в течение 30 мин при 37°C или при температурах теплового шока 43°C, как описано ранее (27). Комплекс предварительно обрабатывали 30 мкл зерен белка G и подвергали иммунопреципитации с использованием мышиного моноклонального антитела против человеческого CA9 (дар доктора Egbert Oosterwijk, University of Nijmegen, Nijmegen, Netherlands), ранее описанного кроличьего антитела против HSP110 (28) или мышиного антитела против OVA (Sigma, St. Louis, MO). После электрофореза SDS-PAGE (10%), выполняли вестерн-блоттинг с использованием антитела против люциферазы (Promega, Madison, WI) или антитела против gp100 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Агрегация люциферазы и анализ повторного сворачивания
Для анализа агрегации люциферазы, 0,15 мкМ люциферазы (Sigma, St Louis, MO) и белок шаперон (т.е. CA9, HSP110, HSP70) инкубировали в 25 мМ Hepes (pH 7,9), 5 мМ стеарата магния, 50 мМ KCl и 5 мМ β-меркаптоэтанола при 43°C в течение 30 мин. OVA служил в качестве контроля для белков-шаперонов. Мониторинг агрегации белков осуществляли измерением оптической плотности при 320 нм. Для подтверждения того, что белки-шапероны предотвращали агрегацию, растворы центрифугировали при 16000×g в течение 15 мин, и растворимую и осажденную фракции разделяли, проводили SDS-PAGE и подвергали вестерн-блот анализу с антителом против люциферазы (Promega, Madison, WI).
Для анализа повторного сворачивания люциферазы, люциферазу и белок-шаперон нагревали в буфере повторного сворачивания (25 мМ Hepes, pH 7,6, 5 мМ MgCl2, 2 мМ дитиотрейтол и 2 мМ АТФ) при 43°C в течение 30 мин. Нагретую люциферазу разводили в 100 раз в буфере повторного сворачивания, содержащем 60% лизат кроличьих ретикулоцитов (Promega, Madison, WI) и инкубировали при 30°C в течении 2 ч. Для измерения активности люциферазы, раствор дополнительно разводили в 5 раз в 25 мМ Hepes (pH 7,6), 1 мг/мл бычьем сывороточном альбумине; 10 мкл добавляли к 100 мкл раствора для анализа люциферазы (Promega, Madison, WI). Количественное определение активности люциферазы проводили с использованием люминометра Lumat LB9501 (Berthoid, Bad. Wildbad, Germany).
Предотвращение опухоли и иммунный мониторинг
Самок мышей C57/BL6 (NCI, Frederick, MD) в возрасте 6-8 недель (5 на группу) иммунизировали 3 раза с интервалом 7 дней 100 мкл вакцины. У мышей проводили антигенную стимуляцию 2×105 B16-gp100 клетками путем интрадермальной инъекции, через 7 дней после последней иммунизации. Опухоли измеряли через каждые 3 дня с использованием электронного циркуля и рассчитывали объем опухоли [(самый маленький диаметр2×самый большой диаметр)/2]. Полный набор экспериментов повторяли 3 раза. Были описаны анализы ELISPOT и высвобождения 51Cr (27). Кратко, лимфатические узлы (LN) и селезенку извлекали через 2 недели после иммунизации. Т клетки CD8+ изолировали отрицательным отбором с использованием колонок обогащения CD8+ клетками (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canada). Обогащенные CD8+ T клетки (5×104/лунка) инкубировали с клетками DC 1.2, предварительно подвергнутыми импульсному воздействию gp100 (10 мкг/мл) при 37°C в течение 48 ч. Пятна IFN-γ подсчитывали с использованием устройства KS Elispot System (версия 4.3.56) от компании Zeiss Microscopy (Oberkochen, Germany).
Для анализа высвобождения 51Cr, спленоциты и LN извлекали через 2 недели после иммунизацию и стимулировали in vitro клетками B16-gp100, предварительно обработанными митомицином (50 мкг/мл) в течение 5 дней. Затем спленоциты серийно разводили в 96-луночном планшете, содержащем меченные 51Cr опухолевые клетки (1×104 клеток/лунка) в трех повторах при изменяющемся соотношении E:T. После 8 ч инкубации при 37°C, супернатант анализировали на радиоактивность с использованием гамма счетчика (Packard, Downers Grove, IL).
Для анализа CTL (цитотоксических Т лимфоцитов) in vivo, спленоциты брали у интактных мышей для получения клеток-мишеней. Эритроциты лизировали и на одноклеточные суспензии спленоцитов, 1×107 клеток/мл, импульсно обрабатывали в течение 30 мин при 37°C 10 мкМ пептида или без него в среде DMEM (модифицированной Дульбекко среда Игла), содержащей 10% FBS. Двухклеточные популяции в концентрации 2×107 клеток/мл (в PBS/0,1% BSA) метили различными концентрациями CFSE (0,5 или 12,5 мкМ). Мечение CFSE прекращали добавлением равного объема FBS в течение 1 мин и промыванием 3 раза полной средой RPMI 1640. 5×106 клеток из каждой популяции, подвергнутой импульсной обработке пептидом и не подвергнутой такой обработке, смешивали и инъецировали внутривенно иммунизированным и неиммунизированным мышам.
Мышей умерщвляли через 16 ч. Одноклеточные суспензии спленоцитов анализировали проточной цитометрией. Специфический лизис флюоресцентных донорских спленоцитов в процентах у иммунизированных мышей рассчитывали следующим образом:
[(число не подвергнутых импульсному воздействию мишеней×A-число подвергнутых импульсному воздействию мишеней)/число не подвергнутых импульсному воздействию мишеней×A]×100,
где A=[число подвергнутых импульсному воздействию мишеней/число не подвергнутых импульсному воздействию мишеней] у неиммунизированных мышей-реципиентов.
Генерирование иммунного ответа sCA9
Мышей (5 на группу) иммунизировали 3 раза с интервалами 7 дней вакцинами на основе DC. Группы вакцинации включали DC, обработанные комплексом CA9 и мышиным пептидом gp100 (EGSRNQDWL с чистотой >99% по ВЭЖХ, синтезированным Alpha Diagnostic international, San Antonio, TX) (CA9+пептид), HSP110+пептид и sCA9+пептид. Необработанные DC и обработанные OVA+пептид служили в качестве отрицательного контроля. Для образования белково-пептидных комплексов, 2 мкг пептида инкубировали в течение 30 мин с 20 мкг белков (OVA при 43°C, CA9 при 37°C, sCA9 при 37°C или HSP110 при 43°C). Белково-пептидные комплексы добавляли к DC, полученным из костного мозга.
Для генерирования DC, образцы костного мозга брали из бедренных и большеберцовых костей мышей и обрабатывали буфером для лизиса эритроцитов, промывали и высевали при плотности 1×106 клеток на 1 мл в 12-луночных планшетах в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS и 10 нг/мл рекомбинантного фактора, стимулирующего колонии мышиных гранулоцитов-моноцитов (GM-CSF) (eBioscience, San Diego CA). Клетки подавали каждый 2 день и собирали между 7 и 9 днями. Культуры состояли из 75-90% клеток CD11C+. Для генерирования вакцин, культивированные клетки подвергали импульсной обработке в течение 4-6 часов 10 мкг/мл белково-пептидного комплекса и обрабатывали 100 нг/мл LPS в течение 16 часов. 2×106 клеток инъецировали мыши подкожно. Через 7 дней после последней иммунизации, лимфатические узлы и спленоциты собирали для анализов CTL реакции CA9 на цитокины in vivo и in vitro.
Ответ CA9 на цитокины
Мониторинг экспрессии CA9 осуществляли зондированием лизатов клеток R6 антителами против CA9 после обработки кондиционированными средами (CM) в концентрации 200 мкл/мл в течение 48 ч. WBC отделяли от цельной крови, полученной от здоровых людей, и культуральные среды от WBC, обработанные 100 нг/мл цитокинами или без обработки (контроль) в течение 24 ч служили в качестве CM. Для мониторинга сбрасывания CA9 из краткосрочных культур эксплантатов RCC, фрагменты опухоли, разрезанные на кусочки по 1 мм (33 мг/мл) споласкивали бессывороточной средой DMEM, культивировали с IL2 (100 нг/мл) или без него в DMEM с 10% FBS в 24-луночном планшете и инкубировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO2 в течение 3 дней. Для количественного анализа экспрессии CA9, фрагменты опухоли оценивали вестерн-блоттингом, используя антитело против CA9.
Связывание комплекса шаперона-антигена дендритными клетками (DC)
К меченному FITC CA9 или BSA (контрольный белок), добавляли FITC (Sigma, St. Louis, MO) при 20M избытке в 0,1M буфере бикарбонат/карбонат натрия. Свободный FITC удаляли на колонке с Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Белки подвергали SDS-PAGE для подтверждения конъюгации FITC.
Для оценки связывания с DC, 10 мкг/мл конъюгированных с FITC белков инкубировали в течение 20 мин на льду с DC, полученными из мышиного костного мозга (см. подраздел «Генерирование иммунного ответа sCA9») в концентрации 1×106 клеток/мл в 100 мкл PBS, содержащем 1% BSA. Для исследования конкуренции связывания, немеченый CA9 или фукоидан добавляли в изменяющихся концентрациях к 1×106 DC/млл при 4°C в течение 20 мин. DC промывали 3 раза 1% BSA/PBS и затем инкубировали с 200 мкг/мл FITC-CA9. Проводили контрокрашивание ядра DAPI.
Клетки фиксировали 1% параформальдегидом (Fisher, Fair Lawn, NJ) и исследовали конфокальной микроскопией (Bio-Rad 600, Hercules, CA) и анализировали проточной цитометрией (Becton Dickenson, La Jolla, CA).
Обработка комплекса шаперон-антиген DC
DC выращивали до 90% слияния, обрабатывали 10 мкМ MGl32 или 10 мМ NH4Cl в течение 2 ч при 37°C. Необработанные клетки служили в качестве контролей. Клетки охлаждали до 4°C в течение 30 мин перед добавлением CA9 в концентрации 10 мкг/мл. Клетки выдерживали при 4°C в течении еще одного часа и затем промывали охлажденной полной средой RPMI 1640. Затем клетки нагревали до 37°C, и собирали в точки времени 0, 0,5, 1, 2, 4 и 24 ч, промывали и обрабатывали буфером для анализа радиоиммунной защиты (RIPA) (Sigma, St. Louis, MO) в течение 15 мин на льду для лизиса клеток. 20 мкг лизата подвергали вестерн-блоттингу. Блоты зондировали мышиным антителом против человеческого CA9.
Кратковременная культура почечной опухоли из хирургических образцов
Свежие опухоли почек человека получали от учрежденной службы заготовки тканей в соответствии с протоколом, утвержденным IRB (153605). Опухолевые ткани разрезали на кусочки по 1 мм, споласкивали бессывороточной средой RPMI 1640, суспендировали в DMEM с 10% FBS и инкубировали в 100 мм чашках Петри при 37°C в инкубаторе с 5% CO2. Для количественного определения CA9, сбрасываемого из опухолей, культуральную среду собирали из суспензионной культуры через 2 дня. Для количественного определения уровней CA9 в опухоли, небольшие фрагменты опухоли обрабатывали буфером RIPA. CA9 из культуральной среды или клеточного экстракта анализировали вестерн-блоттингом.
SCA9 концентрировали из клеток RENCA-CA9, сбрасывающие растворимую форму CA9, которая на 4 кДа меньше, чем CA9. Клетки RENCA-CA9 культивировали в 20 мл среды RPCI 1640 с 10% FBS. Клетки, выращенные до 100% слияния, культивировали в течение еще 24 часов в бессывороточной среде RPMI 1640. Культуральную среду диализировали в течение 24 ч с PBS и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 1 ч в концентрирующей пробирке. Концентрацию sCA9 измеряли вестерн-блоттингом, используя очищенный CA9 в качестве стандарта. Среду от материнских клеток RENCA, которые не экспрессируют CA9, концентрировали, используя такой же протокол, и они служили в качестве контроля.
Анализ данных
Планки погрешности показаны ±SEM для экспериментов, выполненных в трех повторах. Различия роста опухолей оценивали с использованием повторных мер ANOVA. Величина P<0,05 считалась статистически значимой. Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения Stata 8.2 (StataCorp, College Station, Texas).
Пример 2
В данном примере описана способность изолированного белка CA9 действовать в качестве шаперона.
Для оценки наличия функции шаперона у CA9, люциферазу использовали в качестве белка-репортера (фиг.1А). HSP110, который представляет собой белок теплового шока с хорошо охарактеризованной функцией шаперона (29), служил в качестве положительного контроля, и овальбумин (OVA) служил в качестве отрицательного контроля. CA9, HSP110 или OVA смешивали с люциферазой в соотношении 1:1. Иммунопреципитацию выполняли антителами против CA9, HSP110 или OVA, и комплекс зондировали антителами против люциферазы. HSP110 эффективно и необратимо образовывал комплекс с люциферазой при 43°C. CA9 был более эффективен в образовании комплекса с люциферазой при комнатной температуре, чем при 43°C.
Для тестирования того, защищает ли люциферазу от агрегации образование комплекса между CA9 и люциферазой, CA9 и люциферазу смешивали в молярных соотношениях 1:1 и нагревали до 43°C (фиг.1B). Мониторинг агрегации белка осуществляли с течением времени оптической денсометрией. HSP70 представляет собой еще один хорошо охарактеризованный белок теплового шока. HSP110 и HSP70 включены в качестве положительных контролей. HSP110 был способен полностью предотвратить агрегацию люциферазы, и HSP70 и CA9 были одинаково эффективны в ингибировании агрегации люциферазы. Овальбумин (OVA) был отрицательным контролем и не был способен предотвратить агрегацию люциферазы. В подтверждающем эксперименте, CA9 был способен удерживать люциферазу в растворе при 43°C (фиг.1C). Смесь CA9 и люциферазы нагревали до 43°C и центрифугировали. Как CA9, так и HSP110 были эффективны в удерживании большей части люциферазы в супернатанте и вне осадка после центрифугирования.
HSP содействуют сворачиванию вновь синтезированных белков и повторному сворачиванию денатурированных белков. Для анализа на наличие этой функции, денатурированный нагреванием фермент может быть объединен с шаперонами в лизате кроличьих ретикулоцитов, и может быть проведен мониторинг восстановления ферментативной активности. Для оценки способности CA9 повторно сворачивать денатурированный белок, люциферазу использовали в качестве фермента-репортера (фиг.1D). HSP110 был самым эффективным шапероном для обеспечения возможности повторного сворачивания денатурированной нагреванием люциферазы. CA9 и HSP70 были одинакового эффективны. OVA служил в качестве отрицательного контроля и не содействовал повторному сворачиванию.
Пример 3
Данный пример демонстрирует, что изолированный CA9 может связываться с клетками, представляющими антиген.
Авторы продемонстрировали, что CA9 связывается с DC насыщаемым образом, указывающим на специфическое рецепторное связывание (фиг.2A). Связывание CA9 блокировали немеченым CA9 (фиг.2B) и фукоиданом (фиг.2C), который является лигандом для акцепторных рецепторов. Акцепторный рецептор А представляет собой один из многих акцепторных рецепторов на DC. Связывание CA9 уменьшалось, когда анализ связывания выполняли с использованием полученных из костного мозга DC, полученных у нокаутированных акцепторным рецептором А мышей (фиг.2D).
Пример 4
Данный пример демонстрирует, что сброшенный CA9 действует в качестве шаперона.
В предыдущих сообщениях описана растворимая форма сброшенного CA9, сбрасываемая с поверхности RCC (25, 26). Эти сообщения были подтверждены блоттингом клеточной культуральной среды для CA9 (фиг.3A). Растворимая форма CA9 (sCA9), которая была приблизительно на 4 кДа меньше, чем CA9 полной длины, сбрасывался из краткосрочной культуры прозрачно-клеточных опухолей почек. Однако здоровые почки и папиллярные опухоли почек не сбрасывали CA9. SCA9 и CA9 были одинаково эффективны в предотвращении агрегации люциферазы при 43°C (фиг.3B). Ключевые исследования связывания повторяли с использованием sCA9 с результатами, идентичными результатам, полученным для CA9. SCA9 также связывал DC насыщаемым образом (фиг.3C), и связывание sCA9 ингибировалось немеченым CA9 и фукоиданом (фиг.3D).
Пример 5
Данный пример иллюстрирует опосредованную CA9 доставку антигена к DC и переработку CA9.
Доставка антигенов к DC представляет собой раннюю стадию генерирования адаптивного иммунного ответа. Как CA9, так и sCA9 были способны связывать люциферазу и доставлять ее к свежим мышиным DC (фиг.4A). Комплекс sCA9 и люциферазы добавляли к DC при 4°C. Вестерн-блот анализ показал, что люцифераза связывалась с DC при образовании комплексов с sCA9 или CA9, но не когда одну люциферазу добавляли к DC. CA9, меченный FITC, связывался с поверхностью DC при 4°C, как показано конфокальной микроскопией (фиг.4B). Когда клетки нагревали до 37°C, меченый CA9 интернализировался DC.
После интернализации CA9, следующая стадия в активации адаптивного иммунного ответа представляет собой обработку CA9 DC. Мониторинг связывания с клеточной поверхностью проводили при 4°C. Для мониторинга статуса внутреннего CA9, клетки инкубировали при 37°C для обеспечения возможности протекания внутриклеточных процессов. CA9 на клеточной поверхности промывали и внутриклеточный CA9 измеряли зондированием клеточного лизата. При 37°C внутриклеточное содержание CA9 быстро увеличивалось, но он почти не выявлялся в пределах 4 часов (фиг.4C). Для оценки пути переработки CA9, мониторинг содержания внутриклеточного CA9 проводили в присутствии NH4Cl и MGl32, которые ингибируют соответственно лизосомы и протеосомы. Хотя и NH4Cl, и MGl32 ингибировали переработку CA9, MGl32 был более эффективен в ингибировании переработки CA9. Поэтому, внутриклеточный CA9 перерабатывается в первую очередь протеосомами, которые перерабатывают антигены для перекрестного представления.
Пример 6
Данный пример демонстрирует, что введение композиции, содержащей комплекс изолированного CA9 и антигена, стимулирует иммунный ответ на антиген in vivo, который является более выраженным, чем ответ, стимулированный композицией, содержащей антиген, но не содержащей CA9.
Для тестирования того, может ли CA9 стимулировать иммунный ответ, использовали модель мышиной меланомы для нацеливания на антиген меланомы, gp100. Рекомбинантный CA9 и gp100 подвергали образованию комплекса in vitro (CA9+gp100) и использовали для иммунизации мышей C57/BL6. Мышей подвергали антигенной стимуляции сингенными опухолями B16, устойчиво трансдуцированными gp100. У мышей, иммунизированных CA9+gp100, имелся значительно более медленный рост опухоли (фиг.5A) и более длительное выживание, по сравнению с любой из контрольных групп (p<0,05, данные не показаны). Иммунизация CA9+gp100 вызывала gp100-специфический ответ IFN-γ, измеренный с использованием анализа ELISPOT (фиг.5B), и ответ специфичных для опухоли цитотоксических Т клеток, измеренный с использованием анализа высвобождения 51Cr (фиг.5C). Таким образом, иммунный мониторинг продемонстрировал, что CA9 способен вызывать gp100-специфический клеточный иммунный ответ.
Подобно CA9 полной длины, sCA9 был способен стимулировать специфический иммунный ответ.На модели мышиной меланомы, описанной на фиг.5A-C, человеческий gp100 использовали в качестве мишени вакцины. Поэтому, сам gp100 вызывал незначительный противоопухолевый иммунный ответ; однако такая модель эффективно демонстрирует, что иммунность gp100 усиливается CA9. В подтверждающем исследовании, мышиный пептид gp100 (pep) оценивали в качестве мишени для генерирования специфического цитотоксического Т-клеточного ответа. Мышей иммунизировали DC, обработанными комплексом CA9 и пептидом (CA9+пептид) или sCA9 и пептидом (sCA9+пептид). У иммунизированных мышей развились pep-специфические цитотоксические T-лимфоциты (CTL), как определено с использованием анализа высвобожден 51Cr (фиг.5D).
Пример 7
Данный пример иллюстрирует экспрессию и сбрасывание CA9 в ответ на цитокины.
Сообщалось, что экспрессия CA9 в первичной почечной опухоли прогнозирует ответ на лечение IL2. В качестве скринингового исследования, мониторинг экспрессии CA9 в линии человеческих клеток R6 RCC после добавления кондиционированных сред (CM) из WBC, обработанных различными цитокинами (фиг.6A). CM использовали, поскольку цитокины обеспечивают терапевтическую выгоду стимуляцией иммунных клеток, а непосредственно не нацеливаясь на опухоли. Экспрессия CA9 увеличивалась в ответ на IL2 и INF-α, но не INF-γ.
Поскольку сообщалось, что CA9 прогнозирует ответ на лечение IL2, авторы задались вопросом, увеличивается ли сбрасывание CA9 кратковременно культурой эксплантатов RCC в ответ на IL2 (фиг.6B). Во всех 3 исследованных прозрачно-клеточных RCC, сброс CA9 увеличился в ответ на IL2. Одна папиллярная опухоль с отсутствием исходной экспрессии CA9 (опухоль 29) сбрасывала низкие уровни CA9 после обработки IL2. IL2 непосредственно наносили на хирургические образцы, которые содержали как опухолевые клетки, так и иммунные клетки.
Пример 8
В данном примере представлено подтверждающее доказательство того, что CA9 представляет собой прогностический маркер у пациентов с почечно-клеточной карциномой.
Экспрессию CA9 количественно определяли с использованием RT-PCR в реальном масштабе времени и замороженных RCC от 46 пациентов с клинически локализованными RCC, которые были подвергнуты хирургической резекции с намерением излечения. В таблице 1 суммированы клинические и патоморфологические признаки. При средней продолжительности наблюдения 13,7 месяцев, у пациентов с низкой экспрессией CA9 была значительно больше вероятность рецидива метастатического заболевания (p=0,0326).
Таблица 1 | |
Характеристики пациентов | |
Средний возраст (диапазон) | 46 (43-88) |
Мужчины:женщины | 22:24 |
Стадия (%) | |
I | 26(57) |
II | 9(20)) |
III | 11(24) |
Степень злокачественности по Fuhrman, определяемая по размеру клеточных ядер | |
1 | 3(7) |
2 | 26(57) |
3 | 12(26) |
4 | 5(11) |
Claims (18)
1. Способ стимуляции иммунного ответа против антигена у индивидуума, включающий введение индивидууму композиции, содержащей комплекс изолированного белка угольной ангидразы IX (СА9) и антигена, где изолированный белок СА9 и антиген нековалентно связаны друг с другом.
2. Способ по п.1, где комплекс образуется при температуре от 30°С до 42°С включительно.
3. Способ по п.1, где комплекс образуется при 37°С.
4. Способ по п.1, где антиген представляет собой опухолевый антиген.
5. Способ по п.1, где изолированный белок СА9 получают из среды для культуры клеток, в которой культивируются клетки, экспрессирующие белок СА9.
6. Способ по п.1, где опухолевый антиген и изолированный белок СА9 присутствуют в комплексе, образованном смешиванием изолированного белка СА9 с лизатом опухоли.
7. Способ по п.1, где композиция дополнительно содержит представляющие антиген клетки, которые вступали в контакт с комплексом перед введением индивидууму.
8. Способ по п.1, где иммунный ответ против антигена, стимулированный введением комплекса, включает клеточно-опосредованный иммунный ответ против антигена.
9. Способ по п.1, где антиген представляет собой антиген меланомы.
10. Способ по п.9, где антиген меланомы представляет собой gp 100.
11. Композиция для стимуляции иммунного ответа, содержащая комплекс изолированного белка угольной ангидразы IX (СА9) и антигена, где изолированный белок СА9 и антиген нековалентно связаны друг с другом.
12. Композиция по п.11, где антиген представляет собой опухолевый антиген.
13. Композиция по п.12, где опухолевый антиген и изолированный белок СА9 присутствуют в комплексе, образованном смешиванием изолированного белка СА9 с лизатом опухоли.
14. Композиция по п.11, где комплекс образуется при температуре от 30°С до 42°С включительно.
15. Композиция по п.11, дополнительно содержащая клетки, представляющие антиген.
16. Композиция по п.11, где антиген представляет собой антиген меланомы.
17. Композиция по п.16, где антиген меланомы представляет собой gp 100.
18. Композиция для стимуляции иммунного ответа, содержащая очищенную популяцию дендритных клеток, которые вступали в контакт с композицией по п.11.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US160207P | 2007-11-02 | 2007-11-02 | |
US61/001,602 | 2007-11-02 | ||
PCT/US2008/082217 WO2009059281A1 (en) | 2007-11-02 | 2008-11-03 | Compositions and methods for using ca9 protein to stimulate an immune response |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010122345A RU2010122345A (ru) | 2011-12-10 |
RU2497543C2 true RU2497543C2 (ru) | 2013-11-10 |
Family
ID=40591521
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010122345/15A RU2497543C2 (ru) | 2007-11-02 | 2008-11-03 | Композиции и способы применения белка са9 для стимуляции иммунного ответа |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8236320B2 (ru) |
RU (1) | RU2497543C2 (ru) |
WO (1) | WO2009059281A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9050291B2 (en) * | 2009-12-08 | 2015-06-09 | Health Research Inc. | Methods and compositions using peroxiredoxin 1 (PRX1) as an adjuvant |
WO2016161309A1 (en) * | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Colorado State University Research Foundation | Optimized cancer stem cell vaccines |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6027887A (en) * | 1992-03-11 | 2000-02-22 | Institute Of Virology, Solvak Academy Of Sciences | MN gene and protein |
US5387676A (en) * | 1992-03-11 | 1995-02-07 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | MN gene and protein |
JP2003510334A (ja) * | 1999-09-30 | 2003-03-18 | コリクサ コーポレイション | 癌及び感染症の予防及び治療のためのストレスタンパク質組成物及び方法 |
AU2003223186A1 (en) * | 2002-05-23 | 2004-01-23 | Bayer Healthcare | SOLUBLE FORM OF CARBONIC ANHYDRASE IX (s-CA IX), ASSAYS TO DETECT s-CA IX AND CA IX's COEXPRESSION WITH HER-2/neu/c-erbB-2 |
ES2527946T3 (es) * | 2003-03-05 | 2015-02-02 | Dendreon Corporation | Composiciones y métodos que emplean polipéptidos de marco de lectura alternativa para el tratamiento de cáncer y enfermedades infecciosas |
US7585945B2 (en) * | 2006-08-25 | 2009-09-08 | Health Research, Inc. | Use of recombinant heat shock protein complexed to kidney cancer antigen |
-
2008
- 2008-11-03 RU RU2010122345/15A patent/RU2497543C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-11-03 US US12/263,756 patent/US8236320B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-03 WO PCT/US2008/082217 patent/WO2009059281A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KIM H.L. et al. Evaluation of renal cell carcinoma vaccines targeting carbonic anhydrase IX using heat shock protein 110 // Cancer Immunol Immunother., 2007, Jul;56(7), pp.1097-1105.. HERNANDEZ J.M. et al. Novel kidney cancer immunotherapy based on the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and carbonic anhydrase IX fusion gene// Clin Cancer Res., 2003, May;9(5), pp.1906-1916. MUKOUYAMA H et al. Generation of kidney cancer-specific antitumor immune responses using peripheral blood monocytes transduced with a recombinant adenovirus encoding carbonic anhydrase 9 // Clin Cancer Res., 2004, Feb 15;10(4), pp.1421-1429. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2010122345A (ru) | 2011-12-10 |
US20090142365A1 (en) | 2009-06-04 |
WO2009059281A1 (en) | 2009-05-07 |
US8236320B2 (en) | 2012-08-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6134763B2 (ja) | GM−CSF及びインターフェロンαを用いて生成され、且つ熱処理され死滅したがん細胞を取り込んだ樹状細胞 | |
US10799553B2 (en) | Composition comprising a nucleotide sequence encoding an ELA2 fusion protein and plasmacytoid dendritic cells | |
US20080044484A1 (en) | Use of polymeric nanoparticles for vaccine delivery | |
US11638753B2 (en) | Lipids as synthetic vectors to enhance antigen processing and presentation ex-vivo in dendritic cell therapy | |
JP4632664B2 (ja) | 非ペプチド結合ストレス応答性ポリペプチドによる免疫応答の調節 | |
US6451316B1 (en) | Methods for generating antigen-reactive T cells in vitro | |
US20190125852A1 (en) | Compositions and methods for tumor vaccination using prostate cancer-associated antigens | |
JP2014521657A (ja) | 膵臓がんに対する樹状細胞(dc)ワクチン療法 | |
KR20080042097A (ko) | 수포에 담긴 불완전 리보솜 생성물(DRribble) 및면역 반응을 자극하기 위해 이를 이용하는 방법 | |
JP2006518219A (ja) | 電気穿孔法による細胞への抗原の負荷方法 | |
US20230105457A1 (en) | Immunogenic Compounds For Treatment Of Adrenal Cancer | |
CA2630175C (en) | Immunotherapeutic method for treating and/or preventing ovarian cancer | |
CA2304952C (en) | Mannose-receptor bearing cells and antigen conjugate for immunotherapy | |
RU2497543C2 (ru) | Композиции и способы применения белка са9 для стимуляции иммунного ответа | |
US20200113983A1 (en) | Immunogenic Compounds For Cancer Therapy | |
JP2002512202A (ja) | メラノーマの免疫治療用のワクチンアジュバント | |
JP2022036961A (ja) | 樹状細胞療法においてex vivoでの抗原のプロセシングと提示を亢進させるための合成ベクターとしての脂質 | |
Spagnoli et al. | Active antigen-specific immunotherapy of melanoma: from basic science to clinical investigation | |
JP2007505601A (ja) | ワクチン | |
CN112402596B (zh) | 多肽组合物及疫苗 | |
EA037056B1 (ru) | Ксеногенные вакцины, полученные из здоровых тканей, для преодоления иммунной толерантности в отношении опухолеассоциированных антигенов | |
CN111848732A (zh) | 多肽组合物及疫苗 | |
CN111848733A (zh) | 一种多肽组合物及疫苗 | |
Slovin | Prostate-specific membrane antigen vaccines: naked DNA and protein approaches | |
WO2006109193A2 (en) | Selection of highly efficient antigen presenting cells for regulating immunity and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201104 |