CN111848732A - 多肽组合物及疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包含衍生于SART3、p56和p14的多肽组合物。本发明还提供了一种包含该多肽组合物的药物组合物、肿瘤疫苗、负载该多肽组合物的细胞、该细胞的制备方法、包含该多肽组合物的DC疫苗、一种激活的T细胞与前述中的任一种或多种在制备预防核/或治疗癌症的药物中的用途。本发明提供的多肽组合物负载DC后呈递并激活特异性的CD8+CTL，从而达到对肿瘤细胞的靶向毒性作用。其衍生的肿瘤疫苗、DC疫苗、药物组合物等能够显著激活免疫效应细胞并提高其激活相关的细胞因子分泌水平和对肿瘤细胞的杀伤水平，具有潜在的临床价值。

Description

多肽组合物及疫苗
技术领域
本发明涉及医学免疫学领域，具体地涉及一种多肽组合物及疫苗。
背景技术
近年来，通过外科手术结合放化疗治疗癌症取得了一些进展，提高了患者生存率，尤其是乳腺、肺、前列腺和肾脏扩散性癌症病人的生存率得以提高。然而，大多数这类治疗都具有显著的毒副作用，易伤害到正常的细胞。
肿瘤在机体内能引发体液免疫应答和细胞免疫应答。肿瘤抗原在细胞内加工成肽段后与细胞表面的主要组织相容性复合体I类分子结合并呈递给CD8+细胞毒性淋巴细胞，或先从肿瘤细胞上脱落，再由抗原提呈细胞摄取、加工成肽段后与表面主要组织相容性复合体II类分子结合并呈递给CD4+辅助性淋巴细胞，进而诱发机体的抗肿瘤细胞免疫应答。对抗肿瘤免疫及恶性肿瘤进展过程中遗传改变的认识的加深，使得人类能够开发更有选择性的安全治疗方法，采用通过激活免疫系统的方法以攻击正在发生的肿瘤，即肿瘤疫苗。根据肿瘤疫苗的具体用途，可以分为预防性疫苗和治疗性疫苗两类。预防性疫苗的主要功能为控制肿瘤的发生；治疗性疫苗以肿瘤相关抗原为基础，主要用于化疗后的辅助治疗。肿瘤疫苗中的一种为基于树突状细胞(DC)的疫苗。由于DC大量表达共刺激分子，并且具有既可有效地致敏CD4+辅助T细胞(T helper,Th)又可致敏CD8+细胞毒性T细胞(Cytotoxic TLymphocyte,CTL)的能力，故DC细胞与B淋巴细胞与巨噬细胞不同。DC通过负载肿瘤抗原并诱导为成熟的DC,产生特异性抗肿瘤免疫应答。基于此，已经用DC开发出多种抗肿瘤疫苗，包括肿瘤抗原肽负载DC、肿瘤全细胞抗原负载DC、肿瘤细胞RNA负载DC、肿瘤细胞DNA负载DC、外泌体(exosome)负载DC、细胞因子、趋化因子基因修饰DC。目前DC疫苗已经在恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌等癌种当中进行了尝试，并部分取得了成功。各种形式的DC疫苗已在肿瘤的免疫治疗中开始尝试并在初步临床试用中显示出了良好的疗效。其中由美国Dendreon公司生产的DC疫苗Provenge在2010年被美国国家食品药品监督管理局批准上市，用于晚期尤其是对激素疗法失效的前列腺癌病人，疗效显示与安慰剂相比，其能够延长患者的生存时间超过4个月(Nature Medicine,2010,16(6):615.)。
当前大多数临床试验中仍然采用自体全肿瘤裂解液来负载DC，具体操作是将病人自身的肿瘤组织通过多次循环冻融进行裂解，以裂解液对DC细胞进行刺激(CancerImmunol Immunother,2006,55:819；medical oncology,2006,23:273.)。冻融循环会诱导产生肿瘤细胞坏死，但冻融诱导的肿瘤细胞坏死并不具有免疫源性，甚至会抑制Toll样受体(TLR)诱导的DC细胞成熟及正常功能(Hatfeld P,Merrick AE,West E,O’Donnell D,Selby P,Vile R,et al.Optimization of dendritic cell loading with tumor celllysates for cancer immunotherapy.J Immunother(2008)31(7):620–32)，并且病人的肿瘤组织并非总是容易获得。肿瘤细胞裂解液，纯化的肿瘤相关抗原和肿瘤衍生mRNA也被证明可以用作负载DC的抗原来源。肿瘤细胞裂解液能够提供多种抗原供DC加载，并能诱导CD4+和CD8+T细胞应答和赋予DC不同的损伤相关分子模式(Damage-Associated MolecularPatterns，DAMP)以确保DC的成熟，但也会向DC提供免疫调节型细胞因子，诱导DC细胞发生耐受转化(Guida M,Pisconte S,Colucci G.Metastatic melanoma:the new era oftargeted therapy.Expert Opin Ther Targets 2012；16Suppl 2:S61-70)；纯化的肿瘤相关抗原负载DC能够激活抗原特异性T细胞应答，并诱导CD4+和CD8+T细胞应答，但单次使用的不同的抗原种类数量有限。肿瘤衍生mRNA可以转入肿瘤相关抗原和共刺激分子，保证I型MHC的抗原呈递，并且不需要交叉呈递(Robbins PF,Morgan RA,Feldman SA,Yang JC,Sherry RM,Dudley ME,Wunderlich JR,Nahvi AV,Helman LJ,Mackall CL,et al.Tumorregression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanomausing genetically engineered lymphocytesreactive with NY-ESO-1.J Clin Oncol2011；29:917-24)，但不能诱导DC细胞成熟，也不能诱导有效的CD4+免疫应答，同时单次使用的不同的抗原种类数量也有限。
当使用肿瘤相关抗原中的短肽片段作为负载DC的抗原时，可以有效地增加单次使用时能够涉及到的抗原种类的数量，提高CD4+和CD8+T细胞的免疫应答水平，但需要先测定受试者的HLA单倍型，并在选定的肿瘤相关抗原中选取适当的肽段验证其是否能够与该HLA单倍型结合。HLA等位基因在不同种族人群中具有高度的多态性。根据世界卫生组织统计，截至2018年4月，I型HLA等位基因的数量已超过13000个，其中HLA-A等位基因4200个，HLA-B等位基因5091个，HLA-C等位基因3854个(http://www.hla.alleles.org/nomenclature/stats.html)。其中，亚洲人群常见的HLA分型多为HLA-A2、A3和A24(Experimental andTherapeutic Medicine,2011,2:109-117.)。HLA-A2、A11和A24三种分型能够覆盖超过中国人口的90％(Immunol Today,1996；17:261.)。HLA-A2属于HLA-A2超型，在中国人群中频率最高为45.9％，HLA-A11属于HLA-A3超型，在白种人(Caucasian)中频率最低，为37.5％，在中国人中频率最高，达52.7％；HLA-A24属于HLA-A24超型，在白种人中频率最低，为23.9％，在中国人中频率为40.1％，在日本人中频率最高，为58.6％(Curr Opinion In Immunol,1998,10:478-482；Immunogenetics,1999,50(3-4):201-212.)。目前针对各HLA分型都缺少包含能够有效被抗原呈递细胞呈递的免疫源性多肽组合物及包含这类多肽组合物的肿瘤疫苗。
发明内容
本发明针对目前对于在中国人群中频率最高的HLA-A11分型还缺少包含能够有效被抗原呈递细胞呈递的免疫源性多肽组合物及包含这类多肽组合物的DC疫苗这一技术问题，提供了一种多肽组合物及包含所述多肽组合物的肿瘤疫苗。本发明的多肽组合物和包含该多肽组合物的肿瘤疫苗能够有效诱导DC成熟，并能激活T细胞产生较高的肿瘤细胞杀伤活性，具有较大的抗肿瘤潜力。
本发明一方面提供了一种多肽组合物，其包含衍生于包括选自CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p53、p16和p21中的一种或多种的分离的多肽。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含衍生于SART3、p56和p14的分离的多肽。在一优选实施方案中，所述衍生于SART3、p56和p14的分离的多肽的质量比为1︰1︰1。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含衍生于gp100、EPS8和p16的分离的多肽。在一优选实施方案中，所述衍生于gp100、EPS8和p16的分离的多肽的质量比为1︰1︰1。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含衍生于p14、CypB和WHSC2的分离的多肽。在一优选实施方案中，所述衍生于p14、CypB和WHSC2的分离的多肽的质量比为1︰1︰1。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含衍生于EPS8、CypB和WHSC2的分离的多肽。在一优选实施方案中，所述衍生于EPS8、CypB和WHSC2的分离的多肽的质量比为1︰1︰1。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含衍生于SART3、p56、p14、gp100、EPS8和p16的分离的多肽。在一优选实施方案中，所述衍生于SART3、p56、p14、gp100、EPS8和p16的分离的多肽的质量相等。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含衍生于SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p16、p53和p21的分离的多肽。在一优选实施方案中，所述衍生于SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p16、p53和p21的分离的多肽的质量相等。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含衍生于CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p53、p16和p21的分离的多肽。在一优选实施方案中，所述衍生于CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p53、p16和p21的分离的多肽的质量相等。
在一优选实施方案中，所述衍生于SART3的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:1所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于p56的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:2所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于p14的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:3所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于gp100的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:4所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于EPS8的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:5所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于p16的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:6所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于CypB的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:7所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于WHSC2的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:8所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于p53的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:9所示。
在一优选实施方案中，所述衍生于p21的分离的多肽的序列为SEQ ID NO:10所示。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:1-3所示的分离的多肽。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:4-6所示的分离的多肽。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的分离的多肽。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的分离的多肽。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物包含序列为SEQ ID NO:1-6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的分离的多肽。
本发明另一方面还提供了一种药物组合物，其包含前述多肽组合物。
在一优选实施方案中，所述药物组合物还包含辅剂和/或药学上可接受的盐。
本发明另一方面还提供了一种肿瘤疫苗，其包含前述多肽组合物。
在一优选实施方案中，所述肿瘤疫苗还包含佐剂。优选地，所述佐剂包括选自铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、前列腺素E2、α干扰素、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、水包油乳液、油包水乳液、纳米乳液、微粒递送系统、脂质体、微球、生物可降解微球、斑块病毒体、蛋白脂质体、蛋白酶体、免疫刺激复合体(ISCOMs、ISCOMATRIX)、微颗粒、纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合微米/纳米颗粒、聚合薄片状底物颗粒(PLSP)、微颗粒树脂、纳米脂质体聚合凝胶(nanolipogel)、合成的/生物可降解的及生物相容性半合成或天然聚合物或树枝状聚合物(如PLG、PLGA、PLA、聚己酸内酯、硅聚合物、聚酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯苄基三甲基氯化铵、聚苯乙烯二乙烯基苯树脂、聚磷腈、聚-[二-(羧基乙酰苯氧基)磷腈(PCPP)、聚-(甲基丙烯酸甲酯)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸及衍生物、壳聚糖及其衍生物、多糖、δ菊粉多糖、糖脂(合成的或天然的)、脂多糖、一种或多种聚阳离子化合物(如聚氨基酸、聚-(γ-谷氨酸)、聚-精氨酸-HCl、聚-L-赖氨酸、多肽、生物高聚物)、阳离子二甲基二(十八烷基)铵(DDA)、α-半乳糖苷神经酰胺及其衍生物、古细菌脂质及衍生物、内酰胺、gallen、甘油酯、磷脂和螺旋体中的一种或多种。中的一种或多种。
本发明另一方面还提供了一种负载前述多肽组合物的细胞。
在一优选实施方案中，所述细胞为抗原呈递细胞。
在一优选实施方案中，所述抗原呈递细胞表达的HLA分型为HLA-A11。
在一优选实施方案中，所述抗原呈递细胞为选自巨噬细胞、B细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)中的一种或多种；优选地，所述抗原呈递细胞为DC。
在一优选实施方案中，所述DC来源于PBMC中的单核细胞。在另一优选实施方案中，所述DC为人工构建的能够在体外永生化扩增和培养的DC细胞系或DC前体细胞系。
本发明另一方面还提供了一种负载前述多肽组合物的细胞的制备方法，包括：
(1)将DC前体细胞与细胞因子接触，使所述DC前体细胞分化为未成熟DC；
(2)使前述多肽组合物与(1)中未成熟DC接触，进行抗原负载，获得DC-多肽混合物；
(3)使(2)中所述DC-多肽混合物与DC促成熟因子接触，进一步诱导DC成熟，获得负载前述多肽组合物的细胞。
在一优选实施方案中，(1)中所述DC前体细胞为CD14+DC前体细胞；优选地，为血液中PBMC中的单核细胞。
在另一优选实施方案中，(1)中所述DC前体细胞为CD34+DC前体细胞；优选地，为造血祖细胞。
在一优选实施方案中，(1)中所述细胞因子包括IL-4和GM-CSF。在一优选实施方案中，所述IL-4的工作浓度为10-100ng/mL；优选地，为10-50ng/mL；更优选地，为50ng/mL在另一优选实施方案中，所述GM-CSF因子的工作浓度为10-100ng/mL；优选地，为50-100ng/mL；更优选地，为100ng/mL。
在一优选实施方案中，(1)中所述接触为向包含所述DC前体细胞的培养基中加入所述细胞因子，共同孵育。在一优选实施方案中，所述共同孵育的时间为2-5天；优选地，为3-5天。在一优选实施方案中，所述共同孵育的温度为37℃；在另一优选实施方案中，所述共同孵育的CO2浓度为5％。
在一优选实施方案中，(2)中所述多肽组合物中的多肽各自分别加入(1)中所述未成熟DC。
在一优选实施方案中，(2)中所述多肽组合物中的多肽混合均匀后加入(1)中所述未成熟DC。
在一优选实施方案中，(2)中所述接触为向包含所述未成熟DC和(1)中所述细胞因子的培养基中加入前述多肽组合物，共同孵育。
在一优选实施方案中，所述共同孵育的时间为2-5天；优选地，为2天。在一优选实施方案中，所述共同孵育的温度为37℃；在另一优选实施方案中，所述共同孵育的CO2浓度为5％，所述百分比为体积百分比。
在一优选实施方案中，(2)中前述多肽组合物加入(1)中所述未成熟DC后，所述DC-多肽混合物中每种多肽的工作浓度为20-60μg/mL；优选地，为40-60μg/mL，如40μg/mL。
在一优选实施方案终，(3)中所述接触为向(2)中所述DC-多肽混合物中加入所述DC促成熟因子，共同孵育。
在一优选实施方案中，所述共同孵育的时间为1-3天；优选地，为1天。在一优选实施方案中，所述共同孵育的温度为37℃；在另一优选实施方案中，所述共同孵育的CO2浓度为5％，所述百分比为体积百分比。
在一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括选自TNF-α,IL-1β,IL-6和PGE2中的任意一种或多种。
在一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括选自TNF-α,IL-1β,IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP中的任意一种或多种；优选地，包括IFN-γ、poly(I:C)和R848；更优选地，包括IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP。在一优选实施方案中，IFN-γ的工作浓度为10-1000IU/mL；优选地为100-300IU/mL；更优选地，为100IU/mL。在另一优选实施方案中，poly(I:C)的工作浓度为1-200μg/mL，优选地，为20-40μg/mL；更优选地，为30μg/mL。在另一优选实施方案中，R848的工作浓度为0.1-50μg/mL；优选地，为1-10μg/mL；更优选地，为5μg/mL。在另一优选实施方案中，ATP的工作浓度为0.1-10mM；优选地，为0.1-5mM；更优选地，为1mM。
在一优选实施方案中，所述负载前述多肽组合物的细胞的制备方法包括：
(1)向含有受试个体的单核细胞培养体系中加入IL-4和GM-CSF因子；
优选地，所述IL-4的工作浓度为10-100ng/mL；更优选地，为10-50ng/mL；
优选地，所述GM-CSF因子的工作浓度为10-100ng/mL；更优选地，为50-100ng/mL；
(2)培养至第3天，半量更换培养基，补加IL-4和GM-CSF因子至各自启始的工作浓度；
(3)培养至第5天，加入前述多肽组合物后继续培养，所述多肽组合物中各条多肽的工作浓度为20-60μg/mL；优选地，为40μg/mL；
(4)培养至第7天，加入DC促成熟因子IFN-γ、poly(I:C)和R848至工作浓度分别为100IU/mL、30μg/mL和5μg/mL，继续培养24h，获得成熟DC。
在一优选实施方案中，(1)中所述单核细胞通过从外周血中分离的PBMC经过培养和分离获得。优选地，通过以下方法获得：获取外周血PBMC，培养后将悬浮细胞与贴壁细胞分离，所述贴壁细胞即为单核细胞。
本发明另一方面还提供了一种DC疫苗，其包含负载前述多肽组合物的DC。
在一优选实施方案中，所述负载前述多肽组合物的DC可以通过前述方法制得。
在一优选实施方案中，所述DC疫苗还包含佐剂。优选地，所述佐剂包括选自铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、前列腺素E2、α干扰素、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、水包油乳液、油包水乳液、纳米乳液、微粒递送系统、脂质体、微球、生物可降解微球、斑块病毒体、蛋白脂质体、蛋白酶体、免疫刺激复合体(ISCOMs、ISCOMATRIX)、微颗粒、纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合微米/纳米颗粒、聚合薄片状底物颗粒(PLSP)、微颗粒树脂、纳米脂质体聚合凝胶(nanolipogel)、合成的/生物可降解的及生物相容性半合成或天然聚合物或树枝状聚合物(如PLG、PLGA、PLA、聚己酸内酯、硅聚合物、聚酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯苄基三甲基氯化铵、聚苯乙烯二乙烯基苯树脂、聚磷腈、聚-[二-(羧基乙酰苯氧基)磷腈(PCPP)、聚-(甲基丙烯酸甲酯)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸及衍生物、壳聚糖及其衍生物、多糖、δ菊粉多糖、糖脂(合成的或天然的)、脂多糖、一种或多种聚阳离子化合物(如聚氨基酸、聚-(γ-谷氨酸)、聚-精氨酸-HCl、聚-L-赖氨酸、多肽、生物高聚物)、阳离子二甲基二(十八烷基)铵(DDA)、α-半乳糖苷神经酰胺及其衍生物、古细菌脂质及衍生物、内酰胺、gallen、甘油酯、磷脂和螺旋体中的一种或多种。
本发明另一方面提供了一种激活的T细胞，其通过将未激活的T细胞与前述DC疫苗接触而激活。
在一优选实施方案中，所述接触为共同孵育。在一优选实施方案中，所述共同孵育的温度为37℃。在一优选实施方案中，所述共同孵育的时间为2-48小时，优选地，为24-48小时；更优选地，为24小时。在一优选实施方案中，所述共同孵育的CO2浓度为5％。在一优选实施方案中，所述共同孵育使用的培养基为包含2％v/vFBS的AIM-V培养基；优选地，所述共同孵育使用的培养基中还包含工作浓度为100U/mL的IL-2。
在一优选实施方案中，所述未激活的T细胞与前述DC疫苗中的DC的数量比为10︰1-50︰1；优选地，为20︰1-50︰1；更优选地，为20︰1。
在一优选实施方案中，所述未激活的T细胞与所述DC疫苗中的DC来源于相同或不同的个体。
在一优选实施方案中，所述未激活的T细胞为CD8+T细胞。
本发明另一方面提供了一种在受试个体的体内引发免疫应答的方法，包括：
(1)获得受试个体的DC前体细胞；
(2)通过前述DC疫苗的制备方法用(1)中所述受试个体的DC前体细胞制得DC疫苗，回输到(1)中所述受试个体的体内。
在一优选实施方案中，所述单核细胞通过以下方法获得：抽取所述受试个体的外周血，通过密度梯度离心法分离获得PBMC，培养后将悬浮细胞与贴壁细胞分离，所述贴壁细胞即为单核细胞。
在一优选实施方案中，所述培养用的培养基为不含血清的AIM-V培养基。
在一优选实施方案中，所述培养的时间为1-5小时，优选2小时。
在一优选实施方案中，所述培养的时间为过夜。
在一优选实施方案中，所述培养的温度为37℃。
在一优选实施方案中，所述培养的CO2浓度为5％。
本发明另一方面提供了前述多肽组合物、药物组合物、肿瘤疫苗、负载前述多肽组合物的细胞、DC疫苗和激活的T细胞中的一种或多种在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
在一优选实施方案中，所述癌症选自肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、间皮瘤、大肠癌、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、肾细胞癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、胆管癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、尿路上皮癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、霍奇金淋巴瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症和各类白血病与淋巴癌以及各类癌前病变中的任意一种或多种。
本发明所取得的积极效果在于：本发明提供的多肽组合物通过负载DC后呈递并激活特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)而达到对肿瘤细胞的靶向毒性作用。本发明的多肽组合物及其衍生的肿瘤疫苗、DC疫苗、药物组合物能够显著激活免疫效应细胞，特别是T细胞，明显提高其激活相关的细胞因子的分泌水平和对肿瘤细胞的杀伤水平，具有潜在的临床价值。
附图说明
图1a：多肽组合物1负载后诱导DC分泌IL-12的分泌水平；
图1b：多肽组合物2负载后诱导DC分泌IL-12的分泌水平；
图2a：多肽组合物1负载后DC表面CD80和HLA-ABC阳性率；
图2b：多肽组合物2负载后DC表面CD80和HLA-ABC阳性率；
图3a：负载多肽组合物1的DC-CTL与对照组T细胞的CD4+细胞与CD8+细胞的比例；
图3b：负载多肽组合物1的DC-CTL与对照组T细胞的CD3+CD107a细胞的比例；
图3c：负载多肽组合物1的DC-CTL与对照组T细胞的IFN-γ分泌水平；
图4a：负载多肽组合物2的DC-CTL与对照组T细胞的CD4+细胞与CD8+细胞的比例；
图4b：负载多肽组合物2的DC-CTL与对照组T细胞的CD3+CD107a细胞的比例；
图4c：负载多肽组合物2的DC-CTL与对照组T细胞的IFN-γ分泌水平；
图5a：负载多肽组合物1的DC刺激下的T细胞增殖水平与对照T细胞增殖水平的比较；
图5b：负载多肽组合物2的DC刺激下的T细胞增殖水平与对照T细胞增殖水平的比较；
图6a：分别负载多肽组合物1和肽1、2和3的DC-CTL对PANC-1细胞的杀伤效果曲线；
图6b：分别负载多肽组合物2和肽4、5和6的DC-CTL对PANC-1细胞的杀伤效果曲线；
图6c：负载多肽组合物2的DC-CTL对PANC-1细胞的杀伤效果曲线；
图7：分别负载多肽组合物5、6、7、8和肽2的DC-CTL对PANC-1细胞的杀伤效果曲线；
图8a：分别负载多肽组合物1和肽1、2和3的DC-CTL对SKOV-3细胞的杀伤效果曲线；
图8b：分别负载多肽组合物2和肽4、5和6的DC-CTL对SKOV-3细胞的杀伤效果曲线；
图9a：分别负载多肽组合物1和多肽组合物3的DC-CTL对PANC-1细胞的杀伤效果曲线；
图9b：分别负载多肽组合物2和多肽组合物4的DC-CTL对PANC-1细胞的杀伤效果曲线；
以上附图中标注的“对照组T细胞组”指用未负载任何多肽的DC刺激的T细胞实验组。
具体实施方式
本发明中，所述CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p53、p16和p21包括肿瘤相关抗原CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8与细胞衰老相关蛋白p53、p16和p21。在肿瘤免疫中，肿瘤相关抗原的抗原表位的多肽片段与抗原呈递细胞如DC表面的HLA结合，形成HLA-肿瘤抗原表位肽复合物被TCR识别，进而被呈递给T细胞，使能够识别相应肿瘤抗原表位的T细胞被特异性激活并扩增。扩增的T细胞成为特异性靶向该肿瘤相关抗原的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL),对表达该肿瘤相关抗原的肿瘤细胞产生细胞介导的免疫杀伤作用。衰老细胞可以激活先天免疫反应和适应性免疫反应，维持组织稳态。此外，新发现表明程序性诱导细胞衰老可能对调节生殖过程很重要，部分原因是免疫清除。抗原p16，p53及p21与衰老细胞及肿瘤的发生具有显著的联系。目前可以广泛认可的衰老细胞的生物标志物(如β-半乳糖苷酶，p16INK4A)即包括p16，并且p53和p21在细胞周期的调控中具有与p16相似的作用，同时，在多种肿瘤细胞中，均可见p16或p53的调控突变或缺失。因此，本发明通过DC负载衰老细胞短肽来激活特异性CTL，从而达到对肿瘤细胞的靶向毒性作用。
具体地，本发明提供了一种多肽组合物，其包含衍生于包括选自CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p53、p16和p21中的一种或多种的分离的多肽。在一实施方案中，所述多肽组合物中的分离的多肽与抗原呈递细胞相结合，可以用于引发免疫应答反应。所述多肽组合物可以作为对发生中的癌症进行预防和治疗的试剂对受试者施用。
本发明还提供了包含上述多肽组合物的肿瘤疫苗。所述肿瘤疫苗能够在体内引发免疫应答。在一实施方案中，所述免疫应答可以是体液免疫应答。在另一实施方案中，所述免疫应答可以是细胞介导的免疫应答。
本发明还提供了包含上述多肽组合物的DC疫苗。所述DC疫苗包含负载有上述多肽组合物中一条或多条分离的多肽的成熟DC。本发明还提供了制备所述DC疫苗的制备方法，包括用上述多肽组合物接触未成熟的DC，使DC负载所述多肽组合物中的一条或多条分离的多肽。负载上述多肽组合物能够显著使未成熟DC转化为成熟DC，进而获得包含负载有上述多肽组合物中的肿瘤抗原多肽和/或衰来细胞相关抗原多肽的成熟DC和所述DC疫苗。
本发明还提供了一种在受试个体内引发免疫应答反应的方法，包括获取受试个体的PBMC，培养后分离获得单核细胞，诱导成为未成熟DC后负载上述多肽组合物中的一条或多条分离的多肽，使DC成熟后将负载有上述多肽组合物的DC回输至受试个体体内。特别地，本发明还提供了一种负载有上述多肽组合物的DC。
本发明还提供了一种激活的T细胞，所述激活的T细胞通过接触上述DC疫苗而被激活。
本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括向患有癌症的个体中回输上述多肽组合物、肿瘤疫苗和DC疫苗中的一种或多种。在一优选实施方案中，所述患癌症的个体中的癌细胞表面表达水平升高的肿瘤相关抗原包括上述多肽组合物中的分离的多肽所代表的抗原表位中的一种或多种。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。非如下另行定义，否则本文中的术语按照本领域通常所用的方式使用。
在本发明中，术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非标准的氨基酸来进行的修饰。多肽可来自天然生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从一个指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。
术语“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代，氨基酸序列发生变化但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以指具有与参照多肽的序列基本相同的氨基酸序列的多肽。参照多肽具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如亲水性、带点区域的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中本认为通常涉及微小的改变。这些微小的改变可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。
术语“野生型”具有其在此项技术中所理解的含义，其是指具有如在自然界中发现的呈“正常”(如与突变体、患病者、改变者等形成对比)状态或情形的结构和/或活性的实体。所属领域的技术人员将了解，野生型基因和多肽通常以多种不同形式(例如等位基因)存在。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”，是指被肿瘤细胞特异性表达或被肿瘤细胞以与相同组织种类的非肿瘤细胞相比较高频率或密度表达的抗原。肿瘤相关抗原可以是正常不被宿主表达的抗原；它们可经突变、截短、错误折叠、或正常被宿主表达的分子的其他方式异常显现；它们可与正常表达的分子相同但以异常高水平表达；或它们可以在异常的情况或环境中表达。肿瘤相关抗原可以是，例如，蛋白或蛋白片段、复杂碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸、或这些或其他生物分子的组合。
术语“疫苗”是指用于施用至哺乳动物的免疫原性组合物，其用于在哺乳动物中引发针对特定抗原的免疫反应。疫苗典型地包含相似于或衍生自该免疫反应的目标的试剂(已知为“抗原”或“免疫原”)，该目标诸如造成疾病的微生物或肿瘤细胞。意图用于肿瘤诸如癌症的治疗的疫苗，典型地包含衍生自目标肿瘤上所发现的肿瘤相关抗原且能够引发对目标肿瘤上的肿瘤相关抗原的免疫原性的抗原。
术语“CypB”是指cypB基因的表达产物亲环素B蛋白，可以是人亲环素B蛋白或非人的哺乳动物亲环素B蛋白。
术语“WHSC2”是指“Whsc2”基因的表达产物WHSC2蛋白，可以是人WHSC2蛋白或非人的哺乳动物WHSC2蛋白。
术语“SART3”是指sart3基因的表达产物SART3蛋白，可以是SART3蛋白或非人的哺乳动物SART3蛋白。
术语“p56”是指p56基因的表达产物p56蛋白，可以是人p56蛋白或非人的哺乳动物p56蛋白。
术语“p14”是指p14基因的表达产物p14蛋白，可以是人p14蛋白或非人的哺乳动物p14蛋白。
术语“gp100”是指gp100基因的表达产物gp100蛋白，可以是人gp100蛋白或非人的哺乳动物gp100蛋白。
术语“EPS8”是指EPS8基因的表达产物EPS8蛋白，可以是人EPS8蛋白或非人的哺乳动物EPS8蛋白。
术语“p53”是指p53基因的表达产物p53蛋白，可以是人p53蛋白或非人的哺乳动物p53蛋白。
术语“p16”是指p16基因的表达产物p16蛋白，可以是人p16蛋白或非人的哺乳动物p16蛋白。
术语“p21”是指p21基因的表达产物p21蛋白，可以是人p21蛋白或非人的哺乳动物p21蛋白。
术语“癌症”、“肿瘤”和“恶性”指或描述在哺乳动物中典型地是特征为不受控制的细胞生长的生理病症。癌症的实例包括但不限于上皮癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(诸如肝癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介导的乳腺癌)、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、血癌(包括但不限于急性髓细胞性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM))、各种类型的头颈癌(包括但不限于鳞状细胞癌)、以及粘液性起源的癌症(诸如粘液性卵巢癌)、胆管癌(肝)以及肾乳头状癌。在某些实施例中，该血癌选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、以及慢性骨髓性白血病。
术语“免疫增强剂”，如本文所使用，意指一种物质，当它与免疫原混合时能够比免疫原单独存在时诱发更强的免疫应答。例如，一种免疫增强剂能够提高免疫源性，并提供优异的免疫应答。又例如，一种免疫增强剂能够通过提高巨噬细胞和其他抗原呈递细胞上的共刺激因子的表达来起作用。
术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
术语“DC促成熟因子”是指任何能够促进未成熟DC向成熟DC转化的蛋白质、核酸、多肽、复合物、提取物、分离物或以上的组合物，其可以通过与未成熟DC接触而使未成熟DC向成熟DC转化。成熟DC的验证方法可以是检测本领域所周知的成熟DC表面所表达的分子标志和/或成熟DC所分泌的细胞因子，包括但不限于CD80、CD83、CD86、CCR7、HLA-ABC、HLA-DR和IL-6。
术语“分离的”是指通过人工的方法将天然存在的生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、抗体，或其形成的复合物等从体内的天然状态中分离、提纯或在体外被从头合成后所形成的状态。
术语“工作浓度”是指某种试剂或某种有效成分在溶液体系中发挥功效时的实际的浓度。通常，某种试剂或某种有效成分会在使用前配置成为浓度较高的母液或储存液储存，在使用时再按一定比例加入到最终反应体系中被稀释，通常其稀释后获得的最终浓度即为工作浓度。
术语“负载”是指蛋白质、多肽或核酸分子直接与细胞表面上的受体相结合，形成细胞与蛋白质、多肽或核酸分子的复合体。所述结合作用可以是共价结合，也可以是非共价结合，包括受体与配体的相互结合。例如，负载抗原肽的DC即为抗原肽与DC表面表达的与所述抗原肽的HLA分型相匹配的HLA分子相结合而形成的DC-抗原肽复合体。
术语“DC-细胞毒性T淋巴细胞”或“DC-CTL”是指被负载抗原肽的成熟DC所激活的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)，其能够特异性结合表达含有所述成熟DC所负载的抗原肽的抗原，并对表达该抗原的细胞产生细胞杀伤作用，是通过DC介导的细胞免疫的主要执行者。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是指能够表达主要组织相容性复合物(MHC)I型或II型的一类细胞，能够通过MHC结合抗原肽形成MHC-抗原肽复合物并进一步结合T细胞表面的受体进而激活T细胞的一类细胞，包括但不限于树突状细胞(dendritic cell,DC)、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、Langerhans细胞。
术语“负载抗原的抗原呈递细胞”包括已暴露于抗原并被抗原活化的APC。例如，APC可以在体外(例如在有抗原存在的培养期间)负载抗原。APC也可以通过暴露于抗原而在体内被负载。“抗原负载的APC”通常以两种方式之一制备：(1)被称为抗原肽的小片段直接“脉冲”到APC的外部与MHC分子结合；(2)APC与多肽大片段、完全蛋白质或蛋白质颗粒孵育，然后多肽大片段、完全蛋白质或蛋白质颗粒由APC摄取。这些多肽大片段或蛋白质分子通过APC被消化成小的肽段，并且最终被运输并呈递在APC表面上。此外，还可以通过将编码抗原的多核苷酸导入细胞中来产生负载抗原的APC。多肽组合物
本发明提供了一种多肽组合物，所述多肽组合物包括选自衍生于CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p53、p16和p21中的一种或多种的分离的多肽。在一实施方案中，所述多肽组合物中包含的分离的多肽是其各自对应的抗原蛋白的抗原表位。在一实施方案中，所述分离的多肽对应的抗原表位具有免疫源性。在一实施方案中，所述分离的多肽可以是相应抗原蛋白的一部分，其长度短于全长抗原蛋白。本发明还提供了用所述多肽组合物刺激受试者个体体内免疫应答反应的方法和预防和/或治疗受试个体癌症的方法。本发明还提供了包含所述多肽组合物的疫苗，具有治疗和/或预防癌症的用途。
在本发明中，CypB、WHSC2、SART3、p56、p14、gp100、EPS8、p53、p16和p21代表其各自相应的抗原蛋白，具有本领域所周知的含义和序列，包括其各自分子的氨基酸野生型序列和各种已知的或可能存在的变体序列。
在一优选实施方案中，所述分离的多肽包含相应的上述抗原蛋白的抗原表位。在一优选实施方案中，所述抗原表位各自单独地或在一起能够引起免疫应答。在一优选实施方案中，所述免疫应答可以是细胞介导的免疫应答和/或体液免疫应答。在一优选实施方案中，所述抗原表位或所述多肽组合物中的一条或多条多肽能够提供预防和/或治疗癌症的效果。
在一优选实施方案中，所述分离的多肽的长度在50个氨基酸以内；优选地，在30个氨基酸以内。例如，所述分离的多肽的长度可以是5-30个氨基酸、8-25个氨基酸、8-15个氨基酸或9-12个氨基酸。例如，所述分离的多肽的长度可以是9个氨基酸。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物中的分离的多肽可以为包含所述分离的多肽的抗原表位的变体。所述变体为所述分离的多肽的功能等同物，具有改变的序列，其在对应于所述分离的多肽所包含的抗原表位序列中存在一个或多个氨基酸替换，或有一个或多个氨基酸被添加到所述抗原表位序列中，或有一个或多个氨基酸从所述抗原表位序列中被删除而不影响包含所述抗原表位的分离的多肽及包含所述分离的多肽的多肽组合物的功能。在一优选实施方案中，有1-5个氨基酸，优选地有1-3个氨基酸被添加到所述抗原表位序列的N端和/或C端。
在一优选实施方案中，所述衍生于SART3的分离的多肽为SART3的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:1所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于p56的分离的多肽为p56的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:2所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于p14的分离的多肽为p14的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:3所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于gp100的分离的多肽为gp100的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:4所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于EPS8的分离的多肽为EPS8的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:5所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于p16的分离的多肽为p16的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:6所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于CypB的分离的多肽为CypB的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:7所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于WHSC2的分离的多肽为WHSC2的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:8所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于p53的分离的多肽为p53的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:9所示的序列。
在一优选实施方案中，所述衍生于p21的分离的多肽为p21的抗原表位。优选地，其包含SEQ ID NO:10所示的序列。
在一优选实施方案中，所述氨基酸替换可以是非保守氨基酸替换或保守氨基酸替换。保守氨基酸替换指替换的氨基酸与野生型的所述分离的多肽中的对应的氨基酸具有类似的结构和化学性质。例如，保守氨基酸替换可以包含脂肪族或疏水氨基酸之间的相互替换，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸之间的相互替换；还可以是包含羟基氨基酸的替换，如丝氨酸和苏氨酸之间的相互替换；还可以是酸性氨基酸之间的相互替换，如天冬氨酸和谷氨酰胺；还可以是芳香族氨基酸的相互替换，如苯丙氨酸和酪氨酸之间的相互替换；还可以是碱性氨基酸的相互替换，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸之间的相互替换；还可以是小氨基酸的相互替换，如丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸之间的相互替换。
多肽组合物可包含合适的载体或赋形剂。这类载体或赋形剂应不对DC的生存及生物学功能产生任何实质性影响。多肽组合物可以是本领域可接受的形式，如冻干粉末。或者，该多肽组合物可以是溶液的形式，如包含灭菌注射用水或有机溶剂，如DMSO。
对多肽组合物中各多肽的用量配比并无特殊限制，任意两种多肽的重量比可在1︰3到3︰1的范围内。通常，多肽组合物中各多肽的用量相同，即重量比为1。
应理解，本发明所述多肽组合物可以通过本领域所周知的常规方法制备得到，包括但不限于通过固相合成的化学合成后经HPLC将合成产物与副产品分离，以及在活细胞内表达编码包含本发明多肽组合物中抗原片段的多肽的核酸或通过体外的无细胞翻译系统翻译上述编码核酸后通过纯化，获得本发明多肽组合物中的抗原肽片段。此外，本发明所述多肽组合物中所包含的不需要的小分子可通过充分透析被去除，所得产物冻干后可添加其他赋形剂以形成需要的制剂。还应当理解，本发明多肽组合物中可能附带的一些在疫苗组分中产生的氨基酸、突变体、化学修饰等基本不会干扰抗体或TCR识别抗原表位序列。
细胞
本发明还提供了一种负载上述多肽组合物的细胞。在一优选实施方案中，所述细胞为抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，具有与被负载的多肽相匹配的HLA分型。所述抗原呈递细胞可以为专职抗原呈递细胞(professional antigen presentingcell)或非专职抗原呈递细胞(non-professional antigen presenting cell)。在一优选实施方案中，所述专职抗原呈递细胞为DC、巨噬细胞或B细胞，优选地为DC。所述非专职抗原呈递细胞为表达I型HLA的抗原呈递细胞。所述抗原呈递细胞通过暴露于所述多肽组合物，例如通过与所述多肽组合物共同孵育培养而被所述多肽组合物加载，获得负载多肽组合物的抗原呈递细胞。
本领域技术人员知晓并理解，APC以暴露于抗原的方式被“脉冲”(pulse)或加载包含所述抗原的抗原表位的片段，暴露的时间需要足够长，以使得包含所述抗原的表位的片段能够被呈递到所述APC的表面。在一优选实施方案中，所述APC可以被暴露于以多条短多肽片段的形式存在的抗原，即暴露于抗原肽下，所述抗原肽被直接加载到APC表面。除短多肽片段外，APC也可以与衍生于抗原蛋白的大片段、完整的抗原全蛋白或包含抗原蛋白的颗粒一起孵育。所述衍生于抗原蛋白的大片段、完整的抗原全蛋白或包含抗原蛋白的颗粒可以被APC通过胞吞等方式吞入包内，而后被溶酶体或蛋白酶体加工为短多肽片段并最终被运载并呈递到APC的表面，与APC表面的HLA结合形成抗原呈递复合物。
在一优选实施方案中，负载有所述多肽组合物的抗原呈递细胞可以通过在体外(invitro)或体内(in vivo)使APC接触上述多肽组合物中的一条或多条分离的多肽制得。当所述APC在体外加载所述多肽组合物的抗原肽时，所述APC可以在培养皿或孔板上铺板生长，然后再暴露于足够量的包含抗原肽的多肽组合物，并与之接触足够长的时间使抗原肽与APC相结合。抗原肽结合APC所需要使用的量和结合时间可以通过本领域所周知的检测方法进行确定。本领域技术人员所知晓的其他方法，如免疫检测或结合检测，也可以被用于检测暴露于包含抗原肽的多肽组合物后的APC上是否负载有抗原肽。
在一优选实施方案中，所述APC为DC，所述DC的来源可以是自体来源或异体来源。在一优选实施方案中，所述DC可以分离自受试个体。在另一优选实施方案中，所述DC可以是人工构建的与天然DC具有相似生物学特性的DC细胞系，其在细胞的形态和/或基因表型上与天然DC类似，如在CN201810368646.3中所记载的转导有表达Tax基因的慢病毒载体的DC细胞，其CD3表达为阴性，CD70、CD80、CD83、CD86、CCR7和HLA-DR等DC标志分子均有表达；又如在US20050272151A1中所记载的GEN2.2细胞系，其为浆细胞样DC细胞系，具有CD4+,HLA-DR+,CD123+,CD45RA+,CD11c-,CD13-的表型。在另一优选实施方案中，所述DC可以分化自DC前体细胞系，如分化自MUTZ-3细胞系，其为表达单核细胞标志分子单核细胞特异性酯酶和CD14的细胞系(Santegoets SJ,van den Eertwegh AJ,van de Loosdrecht AA,ScheperRJ,de Gruijl TD.Human dendritic cell line models for DC differentiation andclinical DC vaccination studies.J Leukoc Biol.2008Dec；84(6):1364-73.)。
在一优选实施方案中，负载本发明多肽组合物的抗原呈递细胞为DC，优选地，所述DC可来自单核细胞。例如，DC的获得方式可以是从受试个体的血液中分离PBMC，再从中分离出单核细胞，然后向所述单核细胞中加入适当的细胞因子，如GM-CSF和IL-4，诱导所述单核细胞向DC分化。又例如，DC的获得方式可以是向永生化的单核细胞的细胞系中加入上述细胞因子，诱导其向DC分化。DC也可以直接获得自永生化的DC细胞系，如在CN201810368646.3中所记载的转导有表达Tax基因的慢病毒载体的DC细胞系。在一优选实施方案中，GM-CSF的工作浓度为50-500ng/mL，优选地为50-100ng/mL，更优选地为100ng/mL；IL-4的工作浓度为5-100ng/mL，优选地为10-50ng/mL，更优选地为50ng/mL。
在一优选实施方案中，加入细胞因子后第5天时，所述单核细胞被诱导分化为未成熟DC，此时加入本发明所述多肽组合物与未成熟DC接触，如共同孵育，使本发明多肽组合物负载未成熟DC。在一优选实施方案中，本发明多肽组合物中每条多肽的工作浓度为10-100μg/mL；优选地，为20-80μg/mL；更优选地，为40μg/mL。在一优选实施方案中，所述未成熟DC与所述多肽组合物可以接触1-2天，优选地，接触2天。在一优选实施方案中，在所述未成熟DC与所述多肽组合物接触1-2天即加入细胞因子第6-7天后，DC仍未完全成熟。此时向包含未完全成熟的DC与本发明多肽组合物的混合物中加入DC促成熟因子，如加入选自TNF-α,IL-1β,IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP中的一种或多种，孵育8-48小时，优选地孵育24小时，使DC完全成熟，获得负载本发明多肽组合物的DC。在一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括TNF-α,IL-1β,IL-6和PGE2，优选地，TNF-α的工作浓度为5-50ng/mL、如10-30ng/mL，IL-1β的工作浓度为5-50ng/mL、如10-30ng/mL，IL-6的工作浓度为800-1500U/mL、如800-1200U/mL，PGE2的工作浓度为0.5-3μg/mL、如0.5-1.5μg/mL。在一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)和R848。在另一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP。在一优选实施方案中，IFN-γ的工作浓度为10-1000IU/mL；优选地为100-300IU/mL；更优选地，为100IU/mL；poly(I:C)的工作浓度为1-200μg/mL，优选地，为20-40μg/mL；更优选地，为30μg/mL；R848的工作浓度为0.1-50μg/mL；优选地，为1-10μg/mL；更优选地，为5μg/mL；ATP的工作浓度为0.1-10mM；优选地，为0.1-5mM；更优选地，为1mM。在一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP，IFN-γ的工作浓度为100IU/mL，poly(I:C)的工作浓度为30μg/mL，R848的工作浓度为5μg/mL。
本发明因此还提供了一种负载多肽组合物的细胞的制备方法，其包括(1)使前述多肽组合物与未成熟DC接触，进行抗原负载，获得DC-多肽混合物；(2)使(1)中所述DC-多肽混合物与DC促成熟因子接触，进一步诱导DC成熟，获得负载前述多肽组合物的细胞。
在一优选实施方案中，所述未成熟DC可以由DC前体细胞分化而来。在一优选实施方案中，所述为成熟DC可以由单核细胞分化而来。所述单核细胞可以根据本领域所周知的，与细胞因子GM-CSF与IL-4接触后能够在体外诱导分化未成熟DC。GM-CSF与IL-4的用量可以为本领域所知晓的已经报道过的用量。优选地，GM-CSF的工作浓度为50-500ng/mL，优选地为50-100ng/mL，更优选地为100ng/mL；IL-4的工作浓度为5-100ng/mL，优选地为10-50ng/mL，更优选地为50ng/mL。在一优选实施方案中，所述单核细胞可以通过分离个体的PBMC后进行培养而获得。所述PBMC的分离方法可以为本领域所周知的方法，例如抽取个体的血液，通过密度梯度离心法分离。所分离的PBMC经过培养后，贴壁细胞即基本为单核细胞。培养PBMC的时间优选地为2-8小时，更优选地为8小时。
在一优选实施方案中，未成熟DC的前体细胞可以为造血干细胞谱系来源的CD34+DC前体细胞。在一优选实施方案中，所述CD34+DC前体细胞分离自脐带血，可以经过大量扩增后再与细胞因子GM-CSF和IL-4相接触而被诱导分化为未成熟DC。CD34+DC前体细胞大量扩增的方法可以为本领域所知晓的方法，具体可见WO2010055900A1中所公开的方法。在另一优选实施方案中，未成熟DC的前体细胞可以为永生化的DC前体细胞系。如上述MUTZ-3细胞系，其为表达单核细胞标志分子单核细胞特异性酯酶和CD14的细胞系。
在一优选实施方案中，所述未成熟DC细胞可以为细胞系，其经过转基因改造后而具有在体外永生化无限扩增的能力。如在CN201810368646.3中所记载的转导有表达Tax基因的慢病毒载体的DC细胞系。
在一优选实施方案中，细胞因子GM-CSF和IL-4与所述未成熟DC的前体细胞的接触为在培养基中共孵育。所述共孵育的时长为本领域所周知的时间，以使未成熟DC前体细胞能够分化为未成熟DC为标准。在一优选实施方案中，所述共孵育的时长为3-6天；优选地，为3-5天；更优选地，为5天。细胞因子GM-CSF和IL-4与未成熟DC的前体细胞共孵育的培养基可以是本领域任何常规的适合培养免疫细胞的培养基。在一优选实施方案中，所述培养基可以为选自AIM-V、DMEM和RPMI-1640中的任一种或多种，优选地为AIM-V培养基。在一优选实施方案中，所述AIM-V培养基为不含任何血清的培养基。
与所述未成熟DC的前体细胞共孵育的细胞因子GM-CSF和IL-4的工作浓度可以为本领域所周知的浓度，以能够实现诱导未成熟DC的前体细胞，如单核细胞分化为未成熟DC为标准。例如可以为根据中国专利申请CN201610522851.1中所记载的GM-CSF和IL-4的工作浓度。在一优选实施方案中，GM-CSF的工作浓度可以为5-300ng/mL；优选地，为10-100ng/mL；更优选地，为50-100ng/mL；进一步更优选地，为100ng/mL。在一优选实施方案中，IL-4的工作浓度为5-100ng/mL；优选地，为10-100ng/mL；更优选地，为10-50ng/mL；进一步更优选地，为10ng/mL。
本发明多肽组合物与未成熟DC的接触可以为在培养基中共孵育。所述共孵育的时长可以为本领域所周知的多肽负载DC的时长，以本发明所述多肽组合物中抗原肽能够结合到DC表面HLA形成HLA-抗原肽复合物为标准。在一优选实施方案中，所述共孵育的时长为1-2天，优选地为2天。在一优选实施方案中，孵育所用的培养基可以是本领域任何常规的适合培养免疫细胞的培养基。在一优选实施方案中，所述培养基可以为选自AIM-V、DMEM和RPMI-1640中的任一种或多种，优选地为AIM-V培养基。在一优选实施方案中，所述AIM-V培养基为不含任何血清的培养基。
未成熟DC与本发明多肽组合物接触后，本发明多肽组合物对DC的成熟具有一定的促进作用，但仍然需要其他DC促成熟因子的加入并与DC和多肽组合物的混合物接触。加入的其他的DC促成熟因子可以是本领域所周知的或已经公开的能够促进DC成熟的因子，包括但不限于TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP中的任意一种或多种。在一优选实施方案中，加入的所述DC促成熟因子为选自TNF-α,IL-1β,IL-6、PGE2、IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP中的一种或多种。在另一优选实施方案中，加入的所述DC促成熟因子包括TNF-α,IL-1β,IL-6和PGE2；优选地，TNF-α的工作浓度为5-50ng/mL、如10-30ng/mL；IL-1β的工作浓度为5-50ng/mL、如10-30ng/mL；IL-6的工作浓度为800-1500U/mL、如800-1200U/mL；PGE2的工作浓度为0.5-3μg/mL、如0.5-1.5μg/mL。在另一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)和R848。在另一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)、R848和ATP。在一优选实施方案中，IFN-γ的工作浓度为10-1000IU/mL；优选地为100-300IU/mL；更优选地，为100IU/mL；poly(I:C)的工作浓度为1-200μg/mL，优选地，为20-40μg/mL；更优选地，为30μg/mL；R848的工作浓度为0.1-50μg/mL；优选地，为1-10μg/mL；更优选地，为5μg/mL；ATP的工作浓度为0.1-10mM；优选地，为0.1-5mM；更优选地，为1mM。在一优选实施方案中，所述DC促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)和R848，IFN-γ的工作浓度为100IU/mL，poly(I:C)的工作浓度为30μg/mL，R848的工作浓度为5μg/mL。
在一优选实施方案中，所述DC-多肽混合物与DC促成熟因子接触为在培养基中共孵育。所述共孵育的时长可以为本领域所周知的时长，以DC促成熟因子能够诱导未成熟DC至成熟为标准。在一优选实施方案中，所述共孵育的时长可以为24-72小时；优选地，为24-48小时；更优选地，为24小时。在一优选实施方案中，孵育所用的培养基可以是本领域任何常规的适合培养免疫细胞的培养基。在一优选实施方案中，所述培养基可以为选自AIM-V、DMEM和RPMI-1640中的任一种或多种，优选地为AIM-V培养基。在一优选实施方案中，所述AIM-V培养基为不含任何血清的培养基。
本发明相应地还提供了一种激活的免疫效应细胞，通过使未激活的免疫效应细胞与上述负载本发明多肽组合物的细胞接触获得。在本发明所提供的能够负载多肽组合物的细胞如DC，在其表面表达某一亚型的HLA如A11，与该某一特定亚型的HLA相匹配的抗原肽如肿瘤抗原肽与之结合后形成HLA-抗原肽复合物，进而被T细胞表面特异性识别该复合物的受体TCR所识别并结合，表达该TCR的T细胞因此受到刺激并开始增殖。
在一优选实施方案中，所述免疫效应细胞为选自T细胞或NK细胞，优选地为T细胞。在一优选实施方案中，所述负载本发明多肽组合物的细胞为DC。在一优选实施方案中，所述免疫效应细胞与负载本发明多肽组合物的细胞为来自相同个体或不同个体；优选地，为来自相同个体。在一优选实施方案中，所述负载多肽组合物的细胞为DC，所述免疫效应细胞为T细胞。所述负载多肽组合物的DC与所述T细胞的数量比可以为本领域所周知的任何比例，只要所述负载多肽组合物的DC能够有效激活识别其表面HLA-抗原肽复合物的T细胞即可，优选地，为1︰10-1︰50，更优选地为1︰20-1︰50，进一步更优选地，为1︰20。在一优选实施方案中，所述负载多肽组合物的DC与T细胞的接触为共同孵育。优选地，所述共同孵育的时长为2-48小时；更优选地，为24-48小时；进一步更有选地，为24小时。在一优选实施方案中，所述共同孵育在培养基中进行，所述培养基为AIM-V、DMEM或RPMI1640；优选地，所述共同孵育在AIM-V培养基中进行；更优选地，所述AIM-V培养基包含2％v/vFBS。在一优选实施方案中，所述AIM-V培养基中还包含IL-2。优选地，所述IL-2的工作浓度为10-100U/mL，如100U/mL。
疫苗
本发明还提供了一种适于免疫治疗的疫苗。在一优选实施方案中，所述疫苗为肿瘤疫苗，所述肿瘤疫苗包含前述多肽组合物。在一优选实施方案中，所述肿瘤疫苗可以被注射到受试者体内，通过负载到受试者体内的抗原呈递细胞上如DC上与识别所述肿瘤疫苗中抗原肽的相应亚型的HLA相结合后形成HLA-抗原肽复合物，所述HLA-抗原肽复合物与相应的特异性TCR结合，激活表达该特异性TCR的T细胞。
在另一优选实施方案中，所述疫苗为DC疫苗，所述DC疫苗包含前述负载本发明多肽组合物的DC。在一优选实施方案中，所述DC可以是由来源于受试者自体血液中分离获得的DC前体细胞、如来源于脐带血的CD34+的造血前体细胞或来源于外周血CD14+的单核细胞分化而来的DC。本发明多肽组合物与受试者体内分离、培养、扩增并分化后获得的自体DC共孵育后，获得包含本发明多肽组合物与负载有所述多肽组合物中的抗原肽的成熟DC的细胞混合物制剂。DC前体细胞分化为DC的培养方法可以为本领域周知的方法或任何其他能够使DC前体细胞分化为DC的方法，如在培养基中加入细胞因子GM-CSF与IL-4进行分化培养。所述细胞混合物制剂作为DC疫苗回输到受试者体内，所述多肽组合物中的抗原肽通经过受试者的自体成熟DC被呈递，激活特异性的T细胞从而引起体内针对包含所述多肽组合物中的抗原肽所包含的抗原表位的免疫应答。在另一优选实施方案中，所述DC可以是由永生化DC前体细胞系经过体外扩增培养后再进行分化培养而获得的细胞。所述永生化的DC前体细胞系可以是本领域所周知的或已公开报导过的细胞系，如MUTZ3细胞系，或通过CN201810368646.3中所记载的方法制备的永生化DC前体细胞系。所述永生化DC前体细胞系可以在体外进行大量扩增后通过分化培养而形成DC，所述分化培养的方法可以为前述方法。本发明多肽组合物与由上述永生化DC前体细胞系扩增后进行分化培养而获得的DC共孵育后获得包含本发明多肽组合物与负载有多肽组合物抗原肽的成熟DC的细胞混合制剂，该细胞混合制剂作为DC疫苗输入到受试者体内，通过DC呈递其负载的抗原肽进而激活特异性的T细胞应答。在一优选实施方案中，对受试者个体施用包含分化自所述永生化DC前体细胞系DC的疫苗时可以同时施用能够降低免疫排斥反应的试剂，如抑制内源TCR表达的抑制剂。
成熟DC的验证方法可以是检测本领域所周知的成熟DC表面所表达的分子标志和/或成熟DC所分泌的细胞因子，包括但不限于CD80、CD83、CD86、CCR7、HLA-ABC、HLA-DR和IL-6。所述验证方法所采用的检测手段可以是本领域任何能够检测上述分子标志和/或细胞因子的检测手段，包括但不限于ELISA、Western杂交和流式细胞仪检测。
在一优选实施方案中，所述疫苗还包含佐剂。所述佐剂可以为本领域所周知的能够提升免疫应答效应的化合物小分子、生物大分子、组合物、复合物或提取物。在一优选实施方案中，所述佐剂包括选自铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、前列腺素E2、α干扰素、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子、水包油乳液、油包水乳液、纳米乳液、微粒递送系统、脂质体、微球、生物可降解微球、斑块病毒体、蛋白脂质体、蛋白酶体、免疫刺激复合体(ISCOMs、ISCOMATRIX)、微颗粒、纳米颗粒、生物可降解的纳米颗粒、硅纳米颗粒、聚合微米/纳米颗粒、聚合薄片状底物颗粒(PLSP)、微颗粒树脂、纳米脂质体聚合凝胶(nanolipogel)、合成的/生物可降解的及生物相容性半合成或天然聚合物或树枝状聚合物(如PLG、PLGA、PLA、聚己酸内酯、硅聚合物、聚酯、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯磺酸钠、聚苯乙烯苄基三甲基氯化铵、聚苯乙烯二乙烯基苯树脂、聚磷腈、聚-[二-(羧基乙酰苯氧基)磷腈(PCPP)、聚-(甲基丙烯酸甲酯)、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸及衍生物、壳聚糖及其衍生物、多糖、δ菊粉多糖、糖脂(合成的或天然的)、脂多糖、一种或多种聚阳离子化合物(如聚氨基酸、聚-(γ-谷氨酸)、聚-精氨酸-HCl、聚-L-赖氨酸、多肽、生物高聚物)、阳离子二甲基二(十八烷基)铵(DDA)、α-半乳糖苷神经酰胺及其衍生物、古细菌脂质及衍生物、内酰胺、gallen、甘油酯、磷脂和螺旋体中的一种或多种。
在一优选实施方案中，所述疫苗被用于预防或治疗癌症。在一优选实施方案中，根据本发明对病患施用所述疫苗可以在外科手术去除肿瘤之前或之后发生，或在放化疗治疗癌症之前或之后发生。在另一优选实施方案中，所述疫苗可以与其他组合物或药物产品一起或联合向患癌个体施用。应理解，本发明所述疫苗除了可以施用于已经罹患癌症的个体外，也可以施用于没有患癌但具有患癌风险的个体。
根据本发明制备的疫苗可以广泛施用于癌症的治疗或预防，其部分取决于所述疫苗的抗原形成部分的选择。根据本发明所记载的实施能够治疗或预防的癌症包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、间皮瘤、大肠癌、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、肾细胞癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、胆管癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、尿路上皮癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、霍奇金淋巴瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症和各类白血病与淋巴癌以及各类癌前病变
在另一优选实施方案中，所述疫苗可以通过节内注射被施用于腹股沟节。可选地，取决于疫苗的靶标，所述疫苗可以经皮下或皮内施用于接受治疗的患癌症病人的手足。其他施用路径，例如肌肉内注射或血液注射也可以采用。
此外，所述疫苗也可以与佐剂和/或免疫调节剂一起施用，以增强其在病人体内免疫反应的活性。所述佐剂可选自上述佐剂中的任意一种或多种，可根据具体情况作出不同的选择和组合。所述免疫调节剂可以为本领域所周知的具有调节免疫活性的小分子、生物大分子、提取物、药物组合物和/或复合物，可以在本领域已经公开发表的论文、教科书、会议纪要等当中获得。
在一优选实施方案中，取决于所制备的疫苗的类型，所述疫苗的生产规模如果需要时可以通过在生物反应器或发酵罐或类似的适于细胞批量生长的容器和装置中培养细胞而进行扩大。在一优选实施方案中，根据本发明，包含生产的或回收的所述疫苗或抗原的装置或组合物适于持续或间断性释放的，可以被植入体内或在身体相应位置进行局部施用，以达到缓慢和定时地释放这些材料进入体内的效果。
疾病的治疗方法
本发明还提供了一种治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括对受试者施用有效剂量的前述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种。
在一优选实施方案中，所述癌症包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、间皮瘤、大肠癌、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、肾细胞癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、胆管癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、尿路上皮癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、霍奇金淋巴瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症和各类白血病与淋巴癌以及各类癌前病变。
在一优选实施方案中，所述方法包括治疗和预防两方面中至少一方面的效果。在一优选实施方案中，本发明所述方法为预防目的，本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种在癌症或癌前病变发生前对受试者个体施用。在某些情况下，所述疫苗在上述一种或多种癌症发病后对受试者个体施用，旨在预防出现更进一步的症状或已经发生的症状进一步恶化。本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种的预防性施用旨在预防或减轻任何后续的症状。在另一优选实施方案中，本发明所述方法为治疗目的，本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种在癌症发生时或癌症发生后对受试者个体施用，旨在减轻已经产生的癌症的症状。
在一优选实施方案中，所述方法中的针对任何特定治疗应用的所述有效剂量可以取决于不同的因素来确定，如癌症的种类、癌症发病的程度、受试者个体的状况如年龄、性别、体重、身体各项指标的水平等以及所施用的具体药剂的组分以及施用的具体方式。对于所施用的包含本发明所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种的药剂的有效剂量，本领域技术人员可以按找所述药剂中包含的具体组分来根据经验决定，而无需进行另外不必要的试验。
在一优选实施方案中，所述多肽组合物、药物组合物、负载多肽组合物的细胞和疫苗中的一种或多种的施用的具体方式可以由本领域技术人员根据癌症的种类、癌症发病的程度、受试者个体的状况受试者个体的状况如年龄、性别、体重、身体各项指标的水平等以及所施用的具体药剂的组分来确定，例如，可以通过包括但不限于静脉内、肌肉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、创伤内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻腔内、阴道内、直肠内、不经肠胃地、全身地、局部地、肿瘤内、经腹膜、脑室内、经皮下、经结膜下、经粘膜、透粘膜地、心包内、脐带内、眼眶内、经口、透皮地、经肺内、经吸入、经注射、经植入、经回输、经连续回输、经局部灌注、经导管、经灌洗、用乳剂和用脂质体组合物中的一种或多种手段对受试者个体施用。
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例中所述的“过夜”指超过8小时。
以下实施例针对中国人群中比例较高的HLA分型-A11型，提供了多种包含多条肿瘤抗原肽的多肽组合物，每种多肽组合物种包括了针对HLA-A11分型的至少3条肿瘤相关抗原表位多肽。以下实施例所用到的多肽如下表1所示：
表1
Figure BDA0002046430730000261
Figure BDA0002046430730000271
以下实施例所用到的多肽组合物如下表2所示：
表2
Figure BDA0002046430730000272
Figure BDA0002046430730000281
以下实施例中的DC前体细胞与T细胞从供体受试者的血液PBMC中分离获得，具体步骤如下：HLA-A11型供体受试者的血液与等体积生理盐水混合，总体积为35mL,沿管壁缓慢加入含15mL Ficoll的离心管中，可见血液与Ficoll明显分层，800g离心20min，离心后吸取白色细胞层，转至另一离心管中，加生理盐水，1500rpm，10min，离心清洗，弃去废液，再加生理盐水离心清洗一次。清洗后的细胞转入培养瓶中培养贴壁过夜，收集悬浮细胞即T细胞，计数，冻存，剩余贴壁细胞为单核细胞(DC前体细胞)，可诱导分化为DC。
以下实施例中若无特别说明，所实用的多肽组合物中的每种多肽的工作浓度均为40μg/mL。
实施例1多肽组合物诱导DC成熟与活化
DC前体细胞加入不含血清的AIM-V培养基(购自Gibco)，添加IL-4与GM-CSF至工作浓度分别为50ng/mL与100ng/mL后继续培养。培养至第三天半量换液，补加IL-4与GM-CSF至各自工作浓度分别为50ng/mL与100ng/mL。培养至第五天，不同组DC前提细胞分别加入多肽组合物1和2，具体加入方法为，先进行培养基的半量换液，然后各肽贮存液先自-80℃冰箱取出，在室温下自然融化，涡旋混匀，添加至培养瓶内至瓶内各肽工作浓度均为40μg/mL。另外设置不负载多肽组合物的DC作为对照。使用过程中避免多肽贮存液的反复冻融。培养至第七天，按标示用量加入IFN-γ、poly(I:C)和R848，IFN-γ的工作浓度为100IU/mL，poly(I:C)的工作浓度为30μg/mL，R848的工作浓度为5μg/mL，继续培养24h，用以进一步刺激活化DC。收集细胞培养上清，用ELISA法检测IL-12含量，轻轻吹打收集所得DC，分别用FITC标记的CD80抗体和APC标记的HLA-ABC抗体与收集的DC避光孵育30分钟，加载细胞到流式细胞仪检测CD80与HLA-ABC阳性率。CD80是成熟DC的表面标志物之一，HLA-ABC可代表主要MHC I类分子的表达情况，而MHC I类分子的表达与抗原呈递密切相关。
结果如图1-2所示。图1a和图1b分别显示，经过多肽组合物1或2处理后细胞培养基上清中IL-12含量均在600pg/mL左右，远高于未负载多肽组合物的DC的IL-12分泌量。图2a和图2b分别显示，经多肽组合物1或2刺激活化后的DC的CD80与HLA-ABC阳性率均较高，如图2a和2b所示，表明DC成熟度较高，抗原呈递能力较强。
实施例2多肽组合物诱导DC激活的T细胞的细胞活化表型检测
取实施例1经多肽组合物1或2刺激活化后的DC与相应供体受试者T细胞按1︰20的比例共孵育24小时，采用含2％FBS的AIM-V培养基，加入IL-2至工作浓度达到100U/mL，培养3天，获得DC-CTL。用针对CD3、CD4和CD8的荧光抗体分别与上述DC-CTL和对照组T细胞(未与DC共孵育的T细胞)共孵育后，通过流式细胞仪测试DC-CTL细胞和对照组T细胞中CD3+CD4+细胞与CD3+CD8+细胞的占比。
取上述DC-CTL与stimulation cocktail(plus protein transport inhibitors)(购自eBioscience；货号：00-4975-93)共孵育过夜后，用针对CD3和CD107a的荧光抗体分别与DC-CTL和对照组T细胞孵育，通过流式细胞仪检测CD3+CD107a+细胞的占比。
通过流式细胞检测IFN-γ的分泌水平，具体操作步骤见Slagter-
Figure BDA0002046430730000291
JG,RaneyA,Lewis WE,Debenedette MA,Nicolette CA,Tcherepanova IY.Evaluation of RNAAmplification Methods to Improve DC Immunotherapy Antigen Presentation andImmune Response.Mol Ther Nucleic Acids.2013May 7；2或Tsing-Lee Tang-Huau,PaulGueguen,Christel Goudot,Mélanie Durand,Mylène Bohec,Sylvain Baulande,BenoitPasquier,Sebastian Amigorena，Elodie Segura Human in vivo-generated monocyte-derived dendritic cells and macrophages cross-present antigens through avacuolar pathway.Nature Communications 9,Article number:2570(2018)。
结果如图3-4所示。图3a和图4a显示，用多肽组合物1(图3a)和多肽组合物2(图4a)共孵育后，DC-CTL与对照组T细胞相比，CD3+CD4T细胞和CD3+CD8T细胞占比均未发生明显变化。
图3b和图4b显示，与多肽组合物1(图3b)和多肽组合物2(图4b)共孵育后，DC-CTL与对照组T细胞相比，CD3+CD107a细胞的阳性比例有了非常显著的提升；
图3c和图4c显示，与多肽组合物1(图3c)和多肽组合物2(图4c)共孵育后，DC-CTL与对照组T细胞相比，CD3+细胞胞内IFN-γ水平均明显更高。
以上结果表明，经过本发明多肽组合物处理后获得的DC-CTL CD4+/CD8+比例未受影响，但细胞活化程度较高，且能分泌更高水平的细胞因子IFN-γ，间接反映对肿瘤细胞的杀伤功能也更强。
实施例3多肽组合物诱导DC激活的T细胞的细胞增殖能力检测
取实施例1经多肽组合物1或2刺激活化后的DC与相应供体受试者T细胞按1︰20的比例共孵育24小时，在DC与T细胞共孵育之前，预留1×106个T细胞，离心洗去培养基，-80℃冰箱冻存，用于制备T细胞增殖标曲。未负载多肽组合物与负载了多肽组合物1或2的DC与供体T细胞均以1︰20的比例共孵育，采用含2％FBS的AIM-V培养基，加入IL-2至工作浓度100U/mL培养；共孵育24小时后，用移液器吹打混匀各孔细胞，从各培养孔中分别取50μL细胞悬液，离心洗去培养基，-80℃冰箱冻存，用于T细胞增殖测试24小时测试点；共孵育48小时后，用移液器吹打混匀各孔细胞，从各培养孔中分别取50μL细胞悬液，离心洗去培养基，-80℃冰箱冻存，用于T细胞增殖测试48小时测试点；共孵育72小时后，用移液器吹打混匀各孔细胞，从各培养孔中取50μL细胞悬液，离心洗去培养基，-80℃冰箱冻存，用于T细胞增殖测试72小时测试点。具体测试方法按照Invitrogen
Figure BDA0002046430730000301
Cell Proliferation AssayKit说明书操作，根据测试结果形成各组增殖曲线。
结果如图5所示。图5a和5b分别显示多肽组合物1负载的DC与多肽组合物2负载的DC与T细胞共孵育后获得的DC-CTL的增殖曲线。图5a和5b显示，多肽组合物1和2负载的DC与T细胞孵育后获得的DC-CTL与未负载任何多肽组合物的DC与T细胞孵育后获得的细胞相比增殖水平均大幅提升，表明负载多肽组合物1或2的DC可使T细胞有效扩增。T细胞激活后扩增也是发挥抗肿瘤免疫作用的重要环节，因此多肽组合物1或2具有较好的潜在抗肿瘤效果。
实施例4多肽组合物诱导DC激活的T细胞对胰腺癌细胞PANC-1(HLA-A2，A11)的杀伤效果
采用实时无标记细胞功能分析仪检测按实施例2中的方法(不使用stimulationcocktail刺激，其他操作与实施例2记载的方法相同)获得的、分别用多肽组合物1及其组分肽1、肽2、肽3各单肽诱导DC激活的T细胞在体外对胰腺癌细胞PANC-1的杀伤作用。具体地，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测多肽组合物1及肽1、肽2、肽3各单肽按实施例2方法负载DC后进行活化后获得的DC-CTL的体外杀伤活性，步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：胰腺癌细胞PANC-1(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在包含检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始step2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入上述按实施例2方法用多肽组合物1及肽1、肽2、肽3各单肽分别负载获得的DC-CTL，每孔50μl，效靶比分别设置为10:1，以采用未负载任何多肽组合物或单肽的来自同一供体受试者的T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察仪器记录的细胞功能曲线。
多肽组合物2及其单独组分肽4、肽5和肽6负载DC对PANC-1的杀伤实验操作同上述多肽组合物1与肽1-3的操作。
结果如图6a、6b和6c所示。图6a和图6b、6c分别显示用多肽组合物1及其组分肽1-3和多肽组合物2及其组分肽4-6分别负载DC后处理T细胞获得的DC-CTL对靶细胞PANC-1的杀伤曲线。图6b和图6c代表相同样品的两次重复实验的结果。与仅加入PANC-1细胞的细胞生长曲线相比，其余各样品在24h加入效应细胞后曲线均有所下降，表明经过多肽组合物1或2及其组分单肽处理过的DC-CTL对HLA配型匹配的PANC-1细胞(HLA-A2，A11)具有生长抑制作用。特别地，多肽组合物1和2相对于其各自的组分单肽对PANC-1细胞的抑制作用最强，对靶细胞PANC-1的杀伤效果明显优于各单肽。
实施例5多肽组合物诱导DC激活的T细胞对癌细胞PANC-1的特异性杀伤作用
采用实时无标记细胞功能分析仪检测按实施例2中的方法(不使用stimulationcocktail刺激，其他操作与实施例2记载的方法相同)获得的、分别用多肽组合物5、多肽组合物6、多肽组合物7、多肽组合物8和肽2诱导DC激活的T细胞在体外对胰腺癌细胞PANC-1的杀伤作用。多肽组合物5和8中的肽7为中国专利CN1318447C“得自亲环蛋白B的肿瘤抗原肽”中的SEQ ID NO:27所公开的衍生于亲环素B的抗原肽；肽8为中国专利CN101854945B“CTL诱导剂组合物”中的SEQ ID NO:12所公开的衍生于WHSC2的抗原肽。其中具体地，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测多肽组合物5、6、7、8和肽2按实施例2方法负载DC后进行活化后获得的DC-CTL的体外杀伤活性，步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：胰腺癌细胞PANC-1(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在包含检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始step2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入上述按实施例2方法分别用多肽组合物5、6、7、8和肽2负载获得的DC-CTL，每孔50μL，效靶比分别设置为10:1，以采用未负载任何多肽组合物或单肽的来自同一供体受试者的T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察仪器记录的细胞功能曲线。
结果如图7所示。图7显示用多肽组合物5、6、7、8和肽2分别负载DC后处理T细胞获得的DC-CTL对靶细胞PANC-1的杀伤曲线。与仅加入PANC-1细胞的细胞生长曲线相比，其余各样品在24h加入效应细胞后曲线均有所下降，表明经过多肽组合物5、6、7、8和肽2分别处理过的DC-CTL对HLA配型匹配的PANC-1细胞(HLA-A2，A11)具有生长抑制作用。
进一步地，与未负载任何多肽的受试者T细胞样品组相比，多肽组合物5、6、8和肽2负载受试者DC后对PANC-1细胞的杀伤效果与未负载多肽的T细胞相比处于相同水平。多肽组合物7与未负载多肽的T细胞相比对PANC-1细胞的杀伤力显著更高，明显优于多肽组合物5、6、8和肽2单肽。
实施例6多肽组合物诱导DC激活的T细胞对卵巢腺癌细胞SKOV-3的非特异性杀伤作用
采用实时无标记细胞功能分析仪检测按实施例2方法(不使用stimulationcocktail刺激，其他操作与实施例2记载的方法相同)获得的、分别用多肽组合物1及其组分肽1、肽2、肽3各单肽诱导DC激活的T细胞在体外对卵巢腺癌细胞SKOV-3的杀伤作用。具体地，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA))检测多肽组合物1及肽1、肽2、肽3各单肽按实施例2方法负载DC后进行活化后获得的DC-CTL的体外杀伤活性，步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：卵巢腺癌细胞SKOV-3(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μL铺在包含检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入上述按实施例2方法用多肽组合物1及肽1、肽2、肽3各单肽分别负载获得的DC-CTL，每孔50μL，效靶比分别设置为10:1，以采用未负载任何多肽组合物或单肽的来自同一供体受试者的T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察仪器记录的细胞功能曲线。
多肽组合物2及其单独组分肽4、肽5和肽6负载DC对SKOV-3的杀伤实验操作同上述多肽组合物1与肽1-3的操作。
结果如图8所示。图8a和图8b分别显示用多肽组合物1及其组分肽1-3和多肽组合物2及其组分肽4-6分别负载DC后处理T细胞获得的DC-CTL对靶细胞SKOV-3的杀伤曲线。与仅加入SKOV-3细胞的细胞生长曲线相比，其余各组样品在24h加入效应细胞后曲线均未发生明显下降。SKOV-3细胞的HLA分型为A3，图8a和8b表明，本发明多肽组合物及其组分单肽处理获得的DC-CTL对HLA配型不匹配的SKOV-3细胞(HLA-A3)不具有非特异性杀伤作用，证明本发明多肽组合物诱导DC激活的T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用受MHC分型限制。
对比例1多肽组合物3和4处理获得的DC-CTL分别与多肽组合物1和2处理获得的DC-CTL对肿瘤细胞杀伤效果的比较。
多肽组合物3和4的组分见表2。在多肽组合物3中，肽7和肽8替换了多肽组合物1中的肽1和肽2；在多肽组合物4中，肽7和肽8替换了多肽组合物2中的肽4和肽6。按实施例4的操作分别对多肽组合物1和3，以及多肽组合物2和4对PANC-1细胞的杀伤效果进行对比。
结果如图9所示。图9a显示与多肽组合物3处理后获得的DC-CTL相比，多肽组合物1处理后获得的DC-CTL对靶细胞PANC-1的杀伤效果明显更强。图9b显示与多肽组合物4处理后获得的DC-CTL相比，多肽组合物2处理后获得的DC-CTL对靶细胞PANC-1的杀伤效果更明显。
图9a和图9b中的结果说明，多肽组合物1和2分别比多肽组合物3和4能够在负载DC后更好地激活T细胞，具有更强的刺激T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，因而具有更强的潜在地抗肿瘤效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
上海细胞治疗研究院
<120> 多肽组合物及疫苗
<130> 193512
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Trp Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Gln Asn Leu Glu Arg Gly Tyr Arg
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Val Cys Pro Trp Thr Trp Leu Arg
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Val Gly Ala Thr Lys Val Pro Arg
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Val Leu Ser Pro Leu Leu Asn Lys
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Lys Leu Lys His Tyr Gly Pro Gly Trp Val
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Ser Leu Asp Ser Asp Pro Trp Val
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys
1 5

Claims (18)

1.一种多肽组合物，其特征在于，其由序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的分离的多肽组成。
2.根据权利要求1所述多肽组合物，其特征在于，所述序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的分离的多肽的质量比为1︰1︰1。
3.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1或2中所述多肽组合物。
4.根据权利要求3所述药物组合物，其特征在于，其还包含辅剂和/或药学上可接受的盐。
5.一种肿瘤疫苗，其特征在于，其包含权利要求1或2中所述多肽组合物。
6.根据权利要求5所述肿瘤疫苗，其特征在于，其还包含佐剂。
7.负载权利要求1或2中所述多肽组合物的细胞。
8.根据权利要求7所述细胞，其特征在于，其为抗原呈递细胞；优选地，所述抗原呈递细胞表达的HLA分型为HLA-A11。
9.根据权利要求8所述细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞为树突状细胞，所述树突状细胞来源于血液中PBMC中的单核细胞。
10.一种制备权利要求8或9所述细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将树突状细胞前体细胞与细胞因子接触，使所述树突状细胞前体细胞分化为未成熟树突状细胞；
(2)使权利要求1或2中所述多肽组合物与(1)中未成熟树突状细胞接触，进行抗原负载，获得树突状细胞-多肽混合物；
(3)使(2)中所述树突状细胞-多肽混合物与树突状细胞促成熟因子接触，进一步诱导树突状细胞成熟，获得负载权利要求1或2中所述多肽组合物的细胞。
11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，(1)中所述树突状细胞前体细胞为血液中PBMC中的单核细胞；和/或，
(1)中所述细胞因子包括IL-4和GM-CSF，所述IL-4的工作浓度为50ng/mL，所述GM-CSF因子的工作浓度为100ng/mL；和/或，
(1)中所述接触为向包含所述树突状细胞前体细胞的培养基中加入所述细胞因子，共同孵育，所述共同孵育的时间为2-5天；和/或，
所述共同孵育的温度为37℃；和/或，
所述共同孵育的CO2浓度为5％，所述百分比为体积百分比；和/或，
(2)中所述多肽组合物中的多肽各自分别加入或混合均匀后加入(1)中所述未成熟树突状细胞；和/或，
(2)中所述接触为向包含所述未成熟树突状细胞和(1)中所述细胞因子的培养基中加入权利要求1或2中任所述多肽组合物，共同孵育；
优选地，所述共同孵育的时间为2天；和/或，
所述共同孵育的温度为37℃；和/或，
所述共同孵育的CO2浓度为5％，所述百分比为体积百分比；和/或，
(2)中权利要求1或2中所述多肽组合物加入(1)中所述未成熟树突状细胞后，所述树突状细胞-多肽混合物中每种多肽的工作浓度为40μg/mL；和/或，
(3)中所述接触为向(2)中所述树突状细胞-多肽混合物中加入所述树突状细胞促成熟因子，共同孵育，所述共同孵育的时间为1天；和/或，
所述共同孵育的温度为37℃；和/或，
所述共同孵育的CO2浓度为5％，所述百分比为体积百分比；和/或，
所述树突状细胞促成熟因子包括IFN-γ、poly(I:C)和R848，IFN-γ的工作浓度为100IU/mL，poly(I:C)的工作浓度为30μg/mL，R848的工作浓度为5μg/mL。
12.一种树突状细胞疫苗，其特征在于，其包含负载权利要求1或2中所述多肽组合物的树突状细胞。
13.根据权利要求12所述树突状细胞疫苗，其特征在于，所述负载权利要求1或2中所述多肽组合物的树突状细胞通过权利要求10或11中所述方法制得。
14.根据权利要求12或13所述树突状细胞疫苗，其特征在于，其还包含佐剂。
15.一种激活的T细胞，其特征在于，其通过将未激活的T细胞与权利要求12-14中任一项所述树突状细胞疫苗接触而激活。
16.根据权利要求15所述激活的T细胞，其特征在于，所述接触为共同孵育，所述共同孵育的温度为37℃，所述共同孵育的时间为6小时，所述共同孵育使用的培养基为包含2％FBS的AIM-V培养基，所述百分比为体积百分比，所述共同孵育使用的培养基中还包含工作浓度为100U/mL的IL-2。
17.根据权利要求15或16所述激活的T细胞，其特征在于，所述未激活的T细胞与权利要求12-14中任一项所述树突状细胞疫苗中的树突状细胞的数量比为20︰1。
18.权利要求1或2所述多肽组合物、权利要求3或4所述药物组合物、权利要求5或6所述肿瘤疫苗、权利要求7-9中任一项所述细胞、权利要求12-14中任一项所述树突状细胞疫苗和权利要求15-17中任一项所述激活的T细胞中的一种或多种在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
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