CN101835908A - 诊断疾病的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过将诊断基因开关构建物引入对象的细胞，并监测报道基因的表达来诊断该对象中疾病或病症的方法和组合物。本发明还涉及监测疾病或病症进展或疾病或病症的治疗效力的方法和组合物。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及通过将诊断基因开关构建物(diagnostic gene switch construct)引入某对象的细胞并监测报道基因的表达来诊断该对象的疾病或病症的方法和组合物。本发明还涉及监测疾病或病症进展或监测疾病或病症治疗的效力或毒性的方法和组合物。
背景技术
用于对象中是否存在疾病的诊断测试早已存在，但研究人员仍找寻表现出灵敏度(能过早地检测)和特异性(消除假阳性和假阴性)提高的改进测试。诊断测试的其它理想的特征包括便于使用、快速出结果和能持续检测疾病进展或正在进行的治疗的效力。
因此，本领域需要提供这些理想特征的新诊断方法和组合物。
发明概述
本发明基于利用疾病特异性启动子检测疾病所提供的特异性和灵敏度与调控配体依赖性基因开关系统的组合来提供诊断和监测方法。本发明涉及诊断对象中疾病或病症的方法和组合物。本发明还涉及监测对象中疾病或病症进展或监测所给予的疾病或病症的治疗方法在对象中的效力或毒性的方法和组合物。
本发明的一个实施方式包括诊断对象的疾病或病症的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关(gene switch)的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子(diagnostic switch promoter)操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示所述对象具有所述疾病或病症。
在一个实施方式中，所述诊断方法在从所述对象分离的细胞中离体进行。
在一个实施方式中，通过将本发明组合物引入细胞来实施诊断方法，所述细胞是从所述对象分离从而产生修饰细胞，并将所述修饰细胞重新引入所述对象。
在一个实施方式中，所述诊断方法在体内进行。
在进一步的实施方式中，利用非自体细胞，例如该对象的同种异体或异种细胞进行所述诊断方法，并且修饰的非自体细胞引入该对象。
在本发明的一方面，所述基因开关是基于蜕皮素受体(EcR)的基因开关。
在一个实施方式中，所述基因开关包含第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
在本发明的另一方面，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
本发明的其它实施方式涉及监测对象中疾病或病症进展的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表示所述对象中所述疾病或病症进展。
本发明的进一步实施方式涉及监测对象中疾病或病症治疗的效力的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表示所述治疗的效力。
本发明的另一实施方式涉及监测所给予的疾病或病症的治疗在对象中的潜在毒性的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的该细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表示所述治疗的毒性。
本发明的另一实施方式涉及监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到所给予以供治疗的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达水平表示所给予以供治疗的因子的水平。
在进一步的实施方式中，可利用非自体细胞，例如该对象的同种异体或异种细胞实施各方法，并且修饰的非自体细胞给予该对象。
本发明的一个实施方式包括检测接受器官或组织移植的对象中移植排斥的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示检测到移植排斥。
本发明的其它实施方式涉及检测接受器官或组织移植的对象中移植排斥进展的方法，包括
(a)将以下多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表示所述对象中所述移植排斥的进展。
在进一步的实施方式中，可通过将本发明的多核苷酸引入非自体细胞，例如所移植器官或组织的同种异体或异种细胞来实施检测或监测移植排斥的方法，并且先将修饰的非自体细胞引入器官或组织再移植。
在上述方法中，在一个实施方式中，编码基因开关的多核苷酸和编码与启动子相连的报道基因的多核苷酸是较大多核苷酸，例如载体的一部分。在另一实施方式中，编码基因开关的多核苷酸和编码与启动子相连的报道基因的多核苷酸是不同的多核苷酸。
本发明还涉及可用于所述方法的诊断基因开关构建物。
本发明还涉及包含本发明诊断基因开关构建物的载体。
本发明还涉及实施本发明方法的试剂盒，其装有，例如基因开关构建物、载体、配体等。在一个实施方式中，所述试剂盒可装有可包含本发明多核苷酸的细胞(例如，自体或非自体细胞)。
附图简述
图1显示了本发明诊断基因开关的实施方式，其中编码配体依赖性转录因子的两个不同部分的两个转录因子序列受不同启动子的控制。″Dx-开关组分″表示基因开关；″AD″表示反式激活域；″DBD″表示DNA结合结构域；″LBD″表示配体结合结构域；″标准Dx-报道子(reporter)″表示报道基因；″P1″和″P2″表示两种不同的疾病-或病症-反应性启动子。在图1的另一实施方式中，″P1″是组成型启动子；″P2″和″P3″是不同的疾病-或病症-反应性启动子。
图2显示了本发明诊断基因开关的实施方式，其中编码配体依赖性转录因子的两个不同部分的两个转录因子序列受不同启动子的控制。″Dx-开关组分″表示基因开关；″AD″表示反式激活域；″DBD-A″表示第一DNA结合结构域；″DBD-B″表示第二DNA结合结构域；″LBD″表示配体结合结构域；″标准Dx-报道子-A″表示第一报道基因；″标准Dx-报道子-B″表示第二报道基因；″P1″、″P2″和″P3″表示三种不同的疾病-或病症-反应性启动子。在图2的另一实施方式中，″P1″是组成型启动子；″P2″和″P3″是不同的疾病-或病症-反应性启动子。
图3显示了本发明诊断基因开关的实施方式，其中编码配体依赖性转录因子的两个不同部分的两个转录因子序列受不同诊断开关启动子的控制。″Dx-开关组分″表示基因开关；″AD″表示反式激活域；″DBD″表示DNA结合结构域；″LBD″表示配体结合结构域；″标准Dx-报道子″表示报道基因；″P1″、″P2″、″P3″和″P4″表示四种不同的疾病-或病症-反应性启动子。
图4显示了本发明诊断基因开关的实施方式，其中编码配体依赖性转录因子的两个不同部分的两个转录因子序列受不同启动子的控制，并且存在对照报道基因。″Dx-开关组分″表示基因开关；″AD″表示反式激活域；″DBD-A″表示第一DNA结合结构域；″DBD-B″表示第二DNA结合结构域；″LBD″表示配体结合结构域；″标准Dx-报道子-A″表示第一报道基因；″对照-报道子-B″表示第二报道基因；″P1″和″P2″表示二种不同的疾病-或病症-反应性启动子；″P3″和″P4″表示二种不同的控制启动子。在图4的另一实施方式中，″P3″和″P4″是组成型启动子。
图5显示单启动子穿梭载体的实施方式(SEQ ID No.：5)，其包括IL-24/mda-7启动子。利用该载体产生的腺病毒用于转导从淋巴样品分离的细胞。
图6显示双启动子载体的实施方式(SEQ ID NO.：6)，其包含TRPM4和TRGC1/TARP启动子。可利用非病毒转导系统将该DNA载体用于转导前列腺活检样品。
图7单启动子载体的实施方式(SEQ ID NO.：7)，其包含ADAM-17启动子和CD95-ADAM8双报道子(SEQ ID NO.：10)。
图8显示双启动子载体的实施方式(SEQ ID NO.：8)，其包含CXCL9和SEMA7A启动子和CD40-CD3双报道子(SEQ ID NO.：12)。
图9显示单启动子载体的实施方式(SEQ ID NO.：9)，其包含ADAM-17启动子和碱性磷酸酶-c末端CD40报道子(SEQ ID NO.：14)。
图10显示基于血清的报道子，其设计为在人体内表达时不显示免疫原性特性。这些报道子由天然存在于细胞表面或血清中的人氨基酸序列构成。因此，这些报道子在人体内表达时没有免疫原性，也不会受到免疫攻击。在一个实施方式中，基于血清的报道子是能进行ELISA捕捉和检测的双表位报道子，例如CD95-ADAM8报道子(SEQ ID NO.：10-11)、CD40-CD3报道子(SEQ IDNO.：12-13)、CD28-CD3报道子(SEQ ID.NO.：16-17)和CD28-CD40报道子(SEQ ID NO.：18-19)。该设计利用单肽(信号P)以便转运入分泌途径，其后是具有接头(L)的细胞表面抗原的表位。在其它实施方式中，每种设计利用接头和表位的不同组合。在另一实施方式中，基于血清的报道子是碱性磷酸酶报道子，例如碱性磷酸酶-c末端CD40报道子(SEQ ID NO.：14-15)，从而能进行免疫捕捉随后进行报道子活性的酶检测。对于可分泌的酶报道子，碱性磷酸酶报道子利用组织非特异性碱性磷酸酶。细胞表面抗原的表位包括在羧基末端以便在检测碱性磷酸酶活性之前进行免疫捕捉。在图10的其它实施方式中，其它碱性磷酸酶报道子是：碱性磷酸酶-氨基末端CD40报道子(SEQ ID NO.：20-21)和碱性磷酸酶-c末端CD28报道子(SEQ ID.NO.：22-23)。
发明详述
本发明涉及利用基因开关诊断对象中疾病或病症的方法和组合物。本发明还涉及检测对象中疾病或病症进展或其治疗的方法和组合物。本发明方法可离体(通过将基因开关引入对象的分离细胞)或在体内(通过将基因开关引入对象的分离细胞并将该细胞重引入该对象或将基因开关直接引入该对象的细胞)进行。在另一实施方式中，包含基因开关的细胞可以是非自体细胞(例如，同种异体或异种细胞)。本发明方法涉及利用配体依赖性转录因子的表达在一个或多个诊断开关启动子控制下的基因开关。本文所述方法和组合物提供高度灵敏和高度特异性的诊断技术，其中诊断步骤的定时受控于将配体给予包含基因开关的细胞，从而能最佳地检测疾病或病症的存在以及连续或间歇监测疾病或病症的进展或治疗的效力或毒性。
提供以下定义，这些定义有助于理解本发明的范围和实施。
处于本发明的目的，术语“分离的”指从其原始环境(其天然存在的环境)取出的生物学材料(细胞、核酸或蛋白质)。例如，存在于植物或动物的天然状态中的多核苷酸不是分离的，然而，与其天然存在的毗邻核酸相分离的同一多核苷酸认为是“分离的”。
适用于生物学材料的术语“纯化的”不要求该材料的存在形式显示绝对纯度，排除其它化合物的存在。其不过是一种相对的定义。
“核酸”、“核酸分子”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，指单链形式或双链螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或它们的任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子仅指该分子的一级和二级结构，并不将其局限于任何具体的三级形式。因此，该术语包括在线形或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋化DNA和染色体中发现的双链DNA，等等。讨论具体双链DNA分子的结构时，本文可根据沿DNA的非转录链(即，具有与mRNA的同源序列的链)仅以5’到3’方向给出序列的正常惯例描述序列。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。DNA包括但不限于：cDNA、基因座DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。
应用于多核苷酸序列的术语“片段”指相对于参比核酸长度降低并在共同部分包含与参比核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。本发明的这种核酸片段可以适当地包含在作为其成分的较大多核苷酸中。这种片段包含长度为至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多个本发明核酸的连续核苷酸的寡核苷酸或由它们构成。
本文所用的“分离的核酸片段”指单链或双链RNA或DNA聚合物，任选含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可包含cDNA、基因座DNA或合成DNA的一个或多个片段。
“基因”指包含编码功能分子的核苷酸的多核苷酸，包括仅通过转录产生(例如，生物活性RNA分子)或通过转录非翻译(例如，多肽)的功能分子。术语“基因”包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还指表达特定RNA、蛋白质或多肽的核酸片段，其在编码序列之前(5’-非编码序列)和之后(3’-非编码序列)包含调控序列。“天然基因”指天然发现的包含其本身调控序列的基因。“嵌合型基因”指非天然基因的任何基因，其包含未在自然界中一起发现的调控和/或编码序列。因此，嵌合型基因可包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或衍生自同一来源的调控序列和编码序列，但排列方式不同于天然发现的。嵌合型基因可包含衍生自不同来源的编码序列和/或衍生自不同来源的调控序列。“内源性基因”指在生物体的基因组中其天然位置发现的天然基因。“外来”基因或“异源”基因指不是宿主机体中正常发现的，而是通过基因传递引入该宿主机体的基因。外来基因可包含插入非天然机体中的天然基因，或嵌合型基因。“转基因”是通过转化方法引入基因组的基因。
“异源DNA”指不是天然位于细胞中，或细胞的染色体位点中的DNA。异源DNA可包括细胞的外来基因。
术语“基因组”包括染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
当单链形式的核酸分子可在合适的温度和溶液离子强度的条件下与另一核酸分子退火时，称该核酸分子可与另一核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA“杂交”。杂交和洗涤条件是本领域熟知的，例子见Sambrook等，刊于Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(1989)，特别是其中的第11章和表格11.1(通过引用全文纳入本文)。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严谨性”。
可调整严谨性条件以筛选适度相似的片段，例如远相关生物体的同源性序列，筛选高度相似片段，例如复制极其相关生物体的功能酶的基因。对于初步筛选同源性核酸，可采用对应于Tm为55℃的低严谨性杂交条件，例如，5XSSC、0.1％SDS、0.25％奶，无甲酰胺；或者30％甲酰胺、5X SSC、0.5％ SDS。中等严谨性杂交条件对应于较高的Tm，例如，40％甲酰胺，和5X或6X SSC。高度严谨性杂交条件对应于最高Tm，例如50％甲酰胺，5X或6X SSC。
杂交要求两个核酸含有互补序列，虽然取决于杂交的严谨性，但碱基之间的错配是可能的。利用术语“互补”描述能彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明还包括与本文所公开或所用完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互补的分离核酸片段。
在本发明的一个实施方式中，采用包括在Tm为55℃实施杂交步骤的杂交条件并利用上述条件检测多核苷酸。在其它实施方式中，Tm是60℃、63℃或65℃。
杂交后洗涤还决定了严谨性条件。一组条件采用一系列洗涤，开始为6XSSC、0.5％ SDS，室温下15分钟(min)；然后替换为2X SSC、0.5％ SDS、45℃，30分钟；然后是0.2X SSC、0.5％ SDS，50℃，30分钟，重复两次。优选的一组严谨性条件利用较高的温度，其中洗涤与上述相同，除了在0.2XSSC、0.5％ SDS中的最后两次30分钟洗涤温度升高至60℃。优选的另一组高严谨性条件采用65℃，在0.1X SSC、0.1％ SDS中进行最后两次洗涤。
杂交核酸的适度严谨性取决于本领域熟知的核酸长度和互补程度。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性越高，具有那些序列的核酸杂交体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已有计算Tm的方程(参见Sambrook等，同上，9.50-0.51)。对于与较短核酸，即寡核苷酸杂交，错配的位置更重要，寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
在本发明的一个实施方式中，采用杂交条件检测多核苷酸，所述杂交条件包括在低于500mM盐和至少37℃进行杂交步骤，在2X SSPE中，至少63温度进行洗涤步骤。在另一实施方式中，杂交条件包括在低于200mM盐和至少37℃进行杂交步骤。在进一步的实施方式中，杂交条件包括杂交和洗涤步骤均为2X SSPE和63℃。
在另一实施方式中，可杂交核酸的长度是至少约10个核苷酸。可杂交核酸的最低长度优选至少约15个核苷酸；例如至少约20个核苷酸；例如至少30个核苷酸。此外，技术人员应知道可根据诸如探针长度等因素，视需要调节温度和洗涤溶液盐浓度。
术语“探针”指可与互补的单链靶核酸碱基配对形成双链分子的单链核酸分子。
本文所用的术语“寡核苷酸”指可与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分子杂交的短核酸。寡核苷酸可以作标记，例如32P-核苷酸，或已共价偶连了标记物，例如生物素的核苷酸。标记的寡核苷酸可用作探针来检测核酸的存在。寡核苷酸(其中一条和两条可作标记)可用作PCR引物，用于克隆全长核酸或其片段、用于DNA测序或用于检测核酸的存在。寡核苷酸还可用于和DNA分子形成三螺旋。通常合成制备寡核苷酸，优选用核酸合成仪。因此，可将寡核苷酸制备成含非天然产生的磷酸酯类似键，例如硫酯键等。
“引物”指与靶核酸序列杂交以形成双链核酸区域的寡核苷酸，该区域可用作合适条件下DNA合成的起点。这种引物可用于聚合酶链式反应或DNA测序中。
“聚合酶链式反应”缩写成PCR，指酶促扩增特异性核酸序列的体外方法。PCR包括一系列重复的温度循环，其中每个循环包括3个阶段：模板核酸变性以分离靶分子诸链，单链PCR寡核苷酸引物与模板核酸退火，和DNA聚合酶使得退火引物延伸。PCR提供检测核酸的初始组合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量条件下测定靶分子相对量的方法。
“逆转录-聚合酶链式反应”缩写成RT-PCR，指从一种或多种RNA分子酶促产生一种或多种cDNA靶分子，然后酶促扩增上述一种或多种cDNA靶分子内一种或多种特定核酸序列的体外方法。RT-PCR还提供检测核酸的初始组合中靶分子是否存在，以及在定量或半定量条件下测定靶分子相对量的方法。
DNA“编码序列”指编码多肽的双链DNA序列，当其置于合适调控序列的控制下，能在细胞中体内或体外转录和翻译成多肽。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、其中或下游(3’非编码序列)的核酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不限于：原核生物序列、mRNA的cDNA、基因组DNA序列和甚至是合成DNA序列。如果编码序列要在真核生物中表达，多聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3’。
“开放读框”缩写成ORF，指一定长度的核酸序列，可以是DNA、cDNA或RNA，其包含翻译起始信号或起始密码子，例如ATG或AUG和终止密码子，其有翻译成多肽序列的可能。
本文利用术语“头-对-头”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的5’端毗连另一多核苷酸的编码链的5’端时，该两条多核苷酸以头-对-头取向布置，从而各多核苷酸的转录方向远离另一多核苷酸的5’端的方向进行。术语“头-对-头”可缩写为(5’)-到-(5’)，还可以符号(←→)或(3’←5’5’→3’)表示。
本文利用术语“尾-对-尾”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的3’端毗连另一多核苷酸的编码链的3’端时，该两条多核苷酸以尾-对-尾取向布置，从而各多核苷酸的转录方向朝另一多核苷酸进行。术语“尾-对-尾”可缩写为(3’)-到-(3’)，还可以符号(→←)或(5’→3’3’←5’)表示。
本文利用术语“头-对-尾”描述两条多核苷酸序列相对彼此的取向。当一条多核苷酸的编码链的5’端毗连另一多核苷酸的编码链的3’端时，该两条多核苷酸以头-对-尾取向布置，从而各多核苷酸的转录方向与另一多核苷酸的转录方向相同。术语“头-对-尾”可缩写为(5’)-到-(3’)，还可以符号(→→)或(5’→3’5’→3’)表示。
术语“下游”指相对参比核苷酸序列3’定位的核苷酸序列。具体地说，下游核苷酸序列通常涉及转录起点后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起点的下游。
术语“上游”指相对参比核苷酸序列5’定位的核苷酸序列。具体地说，上游核苷酸序列通常涉及位于转录起点或编码序列的5’侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起点的上游。
术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”可互换使用，指能结合双链DNA内的特定核苷酸序列并在其中进行切割的酶。
“同源重组”指将外来DNA序列插入另一DNA分子，例如将载体插入染色体。载体优选靶向用于同源重组的特异性染色体位点。对于特异性同源重组，载体可含有足够长的染色体序列的同源性区域，从而载体能互补结合并掺入染色体。同源性区域越长，序列相似性越高可增加同源重组的效率。
可采用本领域已知的几种方法来扩增本发明的多核苷酸。一旦确立合适的宿主系统和生长条件，可大量扩增和制备重组表达载体。如本文所述，可用的表达载体包括但不限于以下载体或它们的衍生物：人或动物病毒，例如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒，例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ)和质粒及粘粒DNA载体，等等。
“载体”指用于将核酸克隆和/或传递入宿主细胞的任何运载体。载体可以是可与另一DNA区段相连从而复制所连区段的复制子。“复制子”指用作DNA体内复制的自主单元，即能在其本身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括用于在体外、离体或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒运载体。本领域已知的大量载体可用于操作核酸、经反应元件和启动子掺入基因，等等。可能的载体包括，例如质粒或修饰的病毒，包括，例如噬菌体，如λ衍生物，或质粒，如pBR322或pUC质粒衍生物，或Bluescript载体。可用于本发明的载体的另一例子是如通过引用纳入本文的WO 2007/038276所述的弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司(Intrexon Corp.，Blacksburg，VA)的UltraVectorTM产生系统。例如，可通过将合适DNA片段连接入具有互补粘性末端的所选载体实现将对应于反应元件和启动子的DNA片段插入合适载体。或者，可对DNA分子的两端作酶促修饰，或者可通过将核苷酸序列(接头)连接入DNA末端来产生任何位点。这种载体可经工程改造而含有可选择标记基因以供选择已将标记掺入细胞基因组的细胞。这种标记能鉴定和/或选择掺入标记并表达其所编码蛋白质的宿主细胞。
病毒载体，特别是逆转录病毒载体已用于细胞以及活的动物对象中的各种基因递送应用。可用的病毒载体包括但不限于：逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、E-B病毒、腺病毒、双粒病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、荷电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。除核酸外，载体还可包含一个或多个调控区域和/或用于选择、检测和监测核酸传递结果(传递至何种组织、表达持续时间等)的可选择标记。
术语“质粒”指常携带基因的染色体外元件，其不是细胞中心代谢的一部分，通常是环状双链DNA分子的形式。这种元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA，线形、环状或超螺旋的自发复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列连接或重组入独特构建物中，该构建物能将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3’非翻译序列引入细胞。
“克隆载体”指“复制子”，其是单位长度的核酸，优选DNA，其顺序复制并包含复制起点，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一核酸区段可与其相连从而能复制所连接的区段。克隆载体能在一种细胞类型中复制，在另一种中表达(穿梭载体)。克隆载体可包含一条或多条序列以便用于选择包含该载体的细胞和/或一个或多个多克隆位点以便插入感兴趣序列。
术语“病毒载体”指载体、质粒或运载体，其设计成能在转化入宿主后表达所插入的核酸序列。克隆的基因，即，插入的核酸序列通常置于调控元件，例如启动子、最小启动子、增强子等的控制下。可用于驱动核酸在所需宿主细胞中表达的启动调控区或启动子多种多样，并为本领域技术人员所熟悉。基本上能驱动这些基因表达的任何启动子可用于病毒载体，包括但不限于：病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、病因或疾病相关启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、光调节启动子(light regulated promoter)；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、碱性磷酸酶启动子(用于在酵母(Saccharomyces)中表达)；AOX1启动子(用于在毕赤酵母(Pichia)中表达)；β-内酰胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc启动子(用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达)；光调节-、种子特异性-、花粉特异性-、子房特异性的、花椰菜花叶病毒35S、CMV 35S最低、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、枝条-特异性、根特异性几丁质酶、应激诱导型、水稻东格鲁杆状病毒、植物超级启动子、马铃薯亮氨酸氨肽酶、硝酸盐还原酶、甘露碱合酶、胭脂碱合酶、泛素、玉米蛋白和花青甙启动子(可用于在植物细胞中表达)；本领域已知的动物和哺乳动物启动子，包括但不限于SV40早期(SV40e)启动子区域、劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复(LTR)中所含的启动子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子的调控序列和转录调控区、遍在启动子(ubiquitouspromoter)(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间丝的启动子(索蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)、治疗基因的启动子(MDR、CFTR或VIII型因子等的)、病因或疾病相关启动子、和显示组织特异性并已用于转基因动物中的启动子，例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区；白蛋白基因、在肝中有活性的Apo AI和ApoAII调控区、在肝中有活性的α-胎蛋白基因调控区、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因调控区、在骨髓细胞中有活性的β-球蛋白基因调控区、在大脑的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱蛋白基因调控区、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区、和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因调控区、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白的启动子、平滑肌细胞α-肌动蛋白的启动子，等等。此外，可通过加入增强子或调节序列等来修饰这些表达序列。
可通过本领域已知的方法，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(脂质体融合)、利用基因枪或DNA载体运输蛋白将载体引入所需的宿主细胞(参见，例如Wu等，J.Biol.Chem.267：963(1992)；Wu等，J.Biol.Chem.263：14621(1988)；和Hartmut等，加拿大专利申请号2,012,311)。
还可通过脂质转染体内引入本发明的多核苷酸。在过去10年，利用脂质体在体外包装和转染核酸逐渐增多。可利用合成的阳离子脂质制备用于体内转染编码标记的基因的脂质体，该脂质设计成能减少脂质体介导转染遇到的困难和危险(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：7413(1987)；Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8027(1988)；和Ulmer等，Science 259：1745(1993))。使用阳离子脂质可促进包装带负电的核酸，还促进与带负电细胞膜融合(Felgner等，Science 337：387(1989))。WO95/18863、WO96/17823和U.S.5,459,127描述了传递核酸特别有用的脂质化合物和组合物。采用脂质转染将外源性基因体内引入特定生物体具有一定实际优点。脂质体分子靶向特定细胞代表了一类优点。直接转染特定细胞类型明显在具有细胞异质性的组织，例如胰腺、肝脏、肾脏和脑中特别理想。出于靶向的目的，可将脂质与其它分子化学偶连(Mackey等，1988，同上)。可将靶向的肽，例如激素或神经递质和蛋白质，例如抗体，或非肽分子化学偶联于脂质体。
其它分子也可用于促进核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(如WO95/21931)、衍生自DNA结合蛋白质的肽(如WO96/25508)或阳离子聚合物(如WO95/21931)。
还可能将载体作为裸DNA质粒体内引入(参见，美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。还可采用受体介导的DNA递送方法(Curiel等，Hum.Gene Ther.3：147(1992)；和Wu等，J.Biol.Chem.262：4429(1987))。
术语“转染”指细胞摄取外源性或异源的RNA或DNA。当这种RNA或DNA被引入细胞，称该细胞被外源性或异源的RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA实现表型改变时，称细胞被外源性或异源RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA可以整合(共价相连)入构成细胞基因组的染色体DNA。
“转化”指将核酸片段传递入宿主生物体的基因组，从而导致遗传学稳定的遗传性。含有转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因”或“重组”或“转化”的生物体。
此外，包含本发明多核苷酸的重组载体可包含它们要在其中扩增或表达的细胞宿主的一个或多个复制起点，标记或可选择标记。
术语“可选择标记”指鉴定因子，通常是能基于标记基因的作用而选择的抗生素或化学耐受基因(即耐受抗生素、耐受除草剂)、比色标记、酶、荧光标记等，其中该作用用于示踪感兴趣核酸的遗传性和/或鉴定遗传了该感兴趣核酸的细胞或生物体。本领域已知并使用的可选择标记的例子包括：提供氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨酰膦除草剂、磺酰胺等耐受性的基因；和用作表型标记的基因，即，花青甙调节基因、异戊烯转移酶基因(isopentanyl transferase gene)等.
术语“报道基因”指编码能依据报道基因的作用而得到鉴定的鉴定因子的核酸，其中该作用用于示踪感兴趣核酸的遗传性，鉴定已遗传了感兴趣核酸的细胞或生物体，和/或检测基因表达诱导或转录。本领域已知并使用的报道基因的例子包括但不限于：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。可选择标记基因也可视作报道基因。
“启动子”和“启动子序列”可互换使用，指能控制核酸转录的DNA序列。启动子可以完全衍生自天然基因，或由衍生自天然发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应知道不同启动子可在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段，或对不同环境或生理条件起反应而指导基因表达。导致基因在大多数细胞类型中，在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。导致基因在特定细胞类型中表达的启动子通常称为“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。导致基因在特定发育或细胞分化阶段表达的启动子通常称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。在用诱导启动子的药剂、生物分子、化学品、配体、光等或用这些物质接触或处理细胞后得到诱导并导致基因表达的启动子通常称为“诱导型启动子”或“可调节启动子”。还应知道，由于在大多数情况中，调控序列的确切边界并未完全限定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
启动子序列在其3’末端通常结合有转录起始位点并向上延伸(5’方向)，从而包含在可检测背景水平启动转录所需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列中可发现转录起始位点(通过，例如核酸酶S1作图不难限定)以及负责转录因子的蛋白质结合结构域(共有序列)，该因子募集RNA聚合酶介导的转录。
“诊断开关启动子”指这样一种启动子，其活性受到某因素的调节，而调节方式可以用作本发明的诊断方法。该术语包括在疾病或病症期间增加或降低编码序列表达的启动子，启动子活性在任一方向的改变将是诊断性的。该术语包括但不限于：疾病-特异性启动子、对特定生理或病理状况起反应的启动子和对特定生物分子起反应的启动子。诊断开关启动子可包含天然产生启动子的序列、衍生自天然产生启动子的修饰序列或合成序列(例如，将反应元件插入启动子序列来改变启动子的反应性)。
“编码序列”是编码多肽的DNA序列或RNA(例如，功能性RNA)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成RNA时，称编码序列受到转录和翻译调控序列的“控制”。如果编码序列是蛋白质编码序列，原始RNA转录物随后经进一步加工(例如，反式-RNA剪接(如果编码序列含有内含子)和多聚腺苷酸化)，运输至胞质，翻译成该编码序列所编码的蛋白质。非蛋白质编码性生物活性RNA分子(包括但不限于RNAi或小RNA)可在核中起到原始转录物、剪接转录物(含或不含多聚腺苷酸化)和/或离体内含子的作用；或者可作为从核中输出的任何RNA形式在核外区域施加生物活性。
“转录和翻译调控序列”指在宿主细胞中表达编码序列的DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等。在真核细胞中，多聚腺苷酸化信号是调控序列。
术语“反应元件”指一个或多个顺式作用的DNA元件，其赋予受与转录因子的DNA结合结构域相互作用介导的启动子反应性。该DNA元件的序列可以是回文的(完美或不完美的)，或者其由被数量不同的核苷酸隔开的序列基序或半位点构成。半位点可以是相似或相同的，排列成正向或反向重复或排列成一个半位点或串联的毗连半位点的多聚体。依据要掺入反应元件的细胞或生物体的性质，反应元件可包含从不同生物体分离的最小启动子。有或没有配体存在下，转录因子的DNA结合结构域结合反应元件的DNA序列以启动或阻遏受该反应元件调节的下游基因转录。天然蜕皮素受体的反应元件的DNA序列的例子包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO：1)(参见Cherbas等，Genes Dev.5：120(1991))；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是一个或多个间隔核苷酸(SEQ ID NO：2)(参见D′Avino等，Mol.Cell.Endocrinol.113：1(1995))；和GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID NO：3)(参见Antoniewski等，Mol.Cell Biol.14：4465(1994))。
术语“操作性连接”指核酸序列与一个核酸片段的结合，因此一个的功能受另一个的影响。例如，当启动子能影响编码序列的表达时(即，该编码序列受启动子的转录控制)，称该启动子操作性连接于该编码序列。编码序列可以有义或反义方向操作性连接于调节序列。
本文所用的术语“表达”指通过转录核酸或多核苷酸而产生RNA(例如，有义RNA、反义RNA、小RNA、信使RNA、异源核RNA、核糖体RNA、小干扰RNA、核酶等)。表达还可包括将mRNA翻译成蛋白质或多肽。
术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”指可插入核酸或多核苷酸特定位点的DNA区段，或通过同源重组获得。DNA区段包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且将盒和限制性位点设计成能确保该盒插入合适的读框以供转录和翻译。“转化盒”指包含编码感兴趣多肽的多核苷酸，并且除该多核苷酸外，还具有有助于转化具体宿主细胞的元件的特定载体。本发明盒、表达盒、基因表达盒和转化盒还可包含能增强编码感兴趣多肽的多核苷酸在宿主细胞中表达的元件。这些元件可包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、反应元件、终止序列、多聚腺苷酸化序列等。
出于本发明的目的，术语“基因开关”指启动子相关反应元件和基于配体依赖性转录因子的系统的组合，有一种或多种配体存在时，其调节反应元件和启动子所掺入的基因表达。
对于基因开关，术语“基于蜕皮素的”指至少包含天然产生或合成蜕皮素受体配体结合结构域的功能部分的基因开关，其对结合蜕皮素受体配体结合结构域的配体起反应而调节基因表达。
术语“调节”表示诱导、降低或抑制核酸或基因表达，从而分别导致蛋白质或多肽产生的诱导、降低或抑制。
本发明的多核苷酸或载体还可包含适合驱动基因在宿主细胞中表达的至少一个启动子。
可用于本发明实施方式中的增强子包括但不限于：SV40增强子、巨细胞病毒(CMV)增强子、延伸因子1(EF1)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子等。
终止调控区，即终止子或多聚腺苷酸化序列还可衍生自对优选宿主而言各种天然的基因。任选地，终止位点可不是必需的，但最好包含。在本发明的一个实施方式中，终止调控区可以由以下组分构成或衍生自它们：合成序列、合成多聚腺苷酸化信号、SV40晚期多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号、病毒终止子序列等。
术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，可包含多聚腺苷酸化[多聚(A)]识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多聚腺苷酸化信号的特征通常在于在nRNA前体的3’端加上多聚腺苷酸束。
“调控区”指调节第二核酸序列表达的核酸序列。调控区可包含天然负责特定核酸表达的序列(同源区域)，或者可包含负责表达不同蛋白质，甚至合成蛋白质的不同区域的序列(异源区域)。具体地说，所述序列可以是以特异性或非特异性方式并以诱导型或非诱导型方式刺激或阻遏基因转录的原核生物、真核生物或病毒基因的序列或衍生序列。调控区包含复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和引导多肽加入靶细胞的分泌途径的信号序列。
“异源来源”的调控区指不与所表达核酸天然结合的调控区。异源调控区包括不同物种的调控区、不同基因的调控区、杂交调节序列和天然不产生，而是由本领域普通技术人员设计的调节序列。
“RNA转录物”指RNA聚合酶催化DNA序列转录得到的产物。当RNA转录物是该DNA序列的完美互补拷贝时，其称为原始转录物，或者其可以是衍生自原始转录物的转录后加工的RNA序列并称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子并可由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补，并衍生自其的双链DNA。“有义”RNA指包括mRNA的RNA转录物，因此可由细胞翻译成蛋白质。“反义RNA”指与靶原始转录物或mRNA的全部或一部分互补并阻断靶基因表达的RNA转录物。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分互补，即，在5′非编码序列、3′非编码序列或编码序列。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA、或不被翻译但对细胞过程仍有影响的其它RNA。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指由共价连接的氨基酸残基构成的多聚化合物。
“分离的多肽”、“分离的肽”或“分离的蛋白质”指基本上不含天然状态下与其正常结合的那些组分(例如，其它蛋白质或多肽、核酸、碳水化合物、脂质)的多肽或蛋白质。“分离的”不表示排除含其它化合物，或存在杂质的人工或合成混合物，所述杂质不干扰生物学活性，其存在可能是因为，例如纯化不完全、加入稳定剂或混入药学上可接受的制品。
“取代突变型多肽”或“取代突变体”应理解成表示与野生型或天然产生的多肽相比，在至少一个野生型或天然产生的氨基酸处包含不同氨基酸取代的突变型多肽。取代突变型多肽可仅包含一个野生型或天然产生的氨基酸取代，可称为“点突变型”或“单点突变型”多肽。或者，与野生型或天然产生的多肽相比，取代突变型多肽可包含用两个或更多个氨基酸取代两个或更多个野生型或天然产生的氨基酸。根据本发明，与野生型或天然产生的H组核受体配体结合结构域多肽相比，包含取代突变的H组核受体配体结合结构域多肽包含用不同氨基酸取代至少一个野生型或天然产生的氨基酸。
当取代突变型多肽包含两个或更多个野生型或天然产生氨基酸的取代时，该取代可包含相等数量的野生型或天然产生氨基酸缺失，即两个非野生型或天然产生的氨基酸替代两个野生型或天然产生的氨基酸，或者非相等数量的野生型氨基酸缺失，即一个非野生型氨基酸替代两个野生型氨基酸(取代+缺失突变)，或三个非野生型氨基酸替代两个野生型氨基酸(取代+插入突变)。
可利用缩写的术语体系描述取代突变体以表明参比多肽序列中被替代的氨基酸残基和编号以及新取代的氨基酸残基。例如，多肽的第20个氨基酸残基被取代的取代突变体可以缩写为“x20z”，其中“x”是待替代的氨基酸，“20”是该多肽中的氨基酸残基位置或编号，“z”是新取代的氨基酸。因此，可互换地缩写成“E20A”或“Glu20Ala”的取代突变体表示该突变体在多肽20位的谷氨酸(本领域中常缩写成“G”或“Glu”)位置包含丙氨酸残基(本领域中常缩写成“A”或“Ala”)。
可由本领域已知的任何诱变技术制作取代突变，所述技术包括但不限于：体外定点诱变(Hutchinson等，J.Biol.Chem.253：6551(1978)；Zoller等，DNA3：479(1984)；Oliphant等，Gene 44：177(1986)；Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：710(1986))、利用法玛西亚公司(Pharmacia)的
接头、限制性内切酶消化/片段缺失和取代、PCR-介导的/寡核苷酸-指导的诱变等。定点诱变优选基于PCR的技术(参见Higuchi，1989，″Using PCR toEngineer DNA(采用PCR工程改造DNA)″，刊于PCR Technology：Principlesand Applications for DNA Amplification(PCR技术：DNA扩增的原理和应用)，H.Erlich等，斯托克顿出版社(Stockton Press)，第6章，第61-70页)。
应用于多肽的术语“片段”指氨基酸序列短于参比多肽，并在这些参比多肽的完整部分上包含相同氨基酸序列的多肽。这种片段可以适当地包含在作为其一部分的较大多肽中。本发明多肽的这种片段的长度可以是至少2、3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240或300个或更多个氨基酸。
多肽或蛋白质的“变体”指衍生自多肽或蛋白质的任何类似物、片段、衍生物或突变体，其保留了该多肽或蛋白质的至少一种生物学特性。多肽或蛋白质可天然存在不同变体。这些变体可以是特征在于编码蛋白质的结构基因的核苷酸序列不同的等位基因变体，或者可包括差别剪接或翻译后修饰。技术人员可制备具有一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或替代的变体。这些变体可包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸取代的变体，(b)其中在多肽或蛋白质中加入一个或多个氨基酸的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包含取代基的变体，和(d)其中多肽或蛋白质与另一多肽，例如血清白蛋白融合的变体。获得这些变体的技术是本领域普通技术人员已知的，包括遗传学(抑制、缺失、突变等)、化学和酶学技术。在一个实施方式中，变体多肽包含至少约14个氨基酸。
术语“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。可通过本领域已知的技术测定一个部分的序列与另一部分的序列之间的对应性。例如，可通过比对序列信息并利用不难获得的计算机程序来直接比较两个多肽分子之间的序列信息从而测定同源性。或者，可通过同源性区域之间能形成稳定双链体的条件下使得多核苷酸杂交，然后用单链同源性核酸酶消化并测定消化片段的大小来测定同源性。
本文所用的术语“同源性”的所有语法形式和拼写变化形式指具有“共同进化起源的”蛋白质之间的关系，包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白质和不同物种的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)(Reeck等，Cell50：667(1987))。高度序列相似性反映出这种蛋白质(和它们的编码基因)具有序列同源性。然而，在常规应用和本申请中，当术语“同源”用副词，例如“高度”修饰时，可指序列相似性而不指共同的进化起源。
因此，术语“序列相似性”的所有语法形式指可能具有或不具有共同进化起源的核酸和蛋白质的氨基酸序列之间的相同性或对应性程度(参见Reeck等，Cell 50：667(1987))。在一个实施方式中，当DNA序列的规定长度上有至少约50％(例如，至少约75％、90％或95％)的核苷酸匹配时，称两条DNA序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。可利用序列数据库中可得的标准软件，或在，例如特定体系所规定的严谨性条件下采用Southern杂交实验来比较序列，从而鉴定基本上同源的序列。本领域技术人员知道如何确定合适的杂交条件(参见例如，Sambrook等，1989，同上)。
本文所用的“基本上相似”指这样一种核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的改变导致一个或多个氨基酸取代，但不影响该DNA序列所编码蛋白质的功能特性。“基本上相似”还指这样一种核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基中的改变不影响该核酸片段通过反义或共-阻遏技术介导基因表达改变的能力。“基本上相似”还指本发明核酸片段的修饰物，例如缺失或插入不实质性影响所得转录物功能特性的一个或多个核苷酸碱基。因此，应该知道本发明包括多个具体的示范性序列。所提出的各种修饰是本领域的常规技术，与测定编码产物的生物学活性的保留程度一样。
此外，技术人员知道还可通过在严谨性条件下(0.1X SSC，0.1％ SDS，65℃和用2X SSC，0.1％ SDS，然后用0.1X SSC，0.1％ SDS洗涤)与本文示例的序列杂交的能力来限定本发明所包括的基本上相似的序列。本发明的基本上相似的核酸片段是其DNA序列与本文报道的核酸片段的DNA序列有至少约70％、80％、90％或95％相同的那些核酸片段。
当大于约40％的氨基酸是相同的，或者大于60％是相似的(功能上相同)时，称两条氨基酸序列“基本上同源”或“基本上相似”。优选利用，例如GCG(Genetics Computer Group(遗传学计算机课题组)，ProgramManual for the GCG Package(GCG软件包的程序手册)，第7版，麦迪逊，威斯康星州)堆积程序，通过比对鉴定相似或同源的序列。
本文利用术语“对应于”指相似或同源序列，而无论检测相似性或同源性的分子的确切位置是相同还是不同。核酸或氨基酸序列比对可包括空格。因此，术语“对应于”指序列相似性，而不指氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
氨基酸或核苷酸序列的“实质性部分”包含足够的多肽氨基酸序列或基因核苷酸序列，从而可由本领域技术人员通过手工评估序列，或利用诸如BLAST(局部序列比对基本检索工具；Altschul等，J.Mol.Biol.215：403(1993))；可从ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得)等算法进行计算机自动序列比较和鉴定来推测性鉴定该多肽或基因。通常，10个或更多个毗连的氨基酸或30个或更多个核苷酸的序列是推测性鉴定与已知蛋白质或基因同源的多肽或核酸序列所需。此外，对于包含20-30个毗连核苷酸的核苷酸序列、基因特异性寡核苷酸探针可用于基因鉴定(例如，Southern杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬菌体噬斑的原位杂交)的序列依赖性方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物以获得包含引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“实质性部分”包含足够的序列以特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
本领域已知的术语“相同性百分比”是通过比较序列测定的两条或更多条多肽序列或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度，例如通过这些序列诸链之间的匹配测定的。不难通过已知的方法计算“相同性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下描述的：Computational Molecular Biology(计算分子生物学)(Lesk，A.M.编)牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(生物计算：信息和基因组项目)(Smith，D.W.编)学术出版社(Academic Press)，纽约(1993)；ComputerAnalysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编)休玛娜出版社(Humana Press)，新泽西州(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学的序列分析)(von Heinje，G.编)学术出版社(1987)；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)(Gribskov，M.和Devereux，J.编)斯托克顿出版社，纽约(1991)。测定相同性的优选方法设计成能给出所测试序列之间的最佳匹配。测定相同性和相似性的方法编成公众可得的计算机程序。可利用序列分析软件，例如威斯康星州麦迪逊市DNA星公司的激光基因生物信息学计算套件的大型比对程序(Megalign program of the LASERGENE bioinformatics computing suite，DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行序列算法和相容性百分比计算。可利用参数默认(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)的群集比对方法(Clustal method of alignment)(Higgins等，CABIOS.5：151(1989))进行序列的多重比对。利用群集方法进行成对比对的默认参数可以选择为：KTUPLE1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以商品化购得或独立开发的。典型的序列分析软件包括但不限于：GCG程序套件(威斯康星软件包(Wisconsin Package)9.0版，遗传学计算机课题组(GCG)，麦迪逊，威斯康星州)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403(1990))和DNASTAR(DNA星公司，圣帕克街1228号(S.Park St.)，麦迪逊，威斯康星州，53715美国)。在本申请的内容中，应该知道除非另有规定，利用序列分析软件进行分析时，分析的结果将依据引用的程序的“默认值”。本文所用的“默认值”表示首次启动时，软件原始加载的任何一组数值或参数。
与DNA序列相关的“化学合成”表示该组分核苷酸在体外装配。可采用已良好确立的方法手工化学合成DNA，或者利用多种可商品化规定的机器之一进行自动化学合成。因此，可依据反映宿主细胞的密码子偏爱的核苷酸序列优化来改进基因以便优化基因表达。技术人员应知道如果密码子选择偏向宿主所喜爱的那些密码子，则基因表达有成功的可能。可依据衍生自有序列信息可用的宿主细胞基因调查来测定优选的密码子。
如本文所用的，当有以下情况时，称两种或更多种可单独操作的基因调节系统是“正交的”：a)利用其各自配体在选择浓度调节各给定系统导致该系统的基因表达幅度中有可检测的改变，和b)该改变在统计学上显著不同于细胞、组织或生物体中可同时操作的所有其它系统的表达改变，而无论实际调节是同时或顺次进行的。各可单独操作的基因调节系统的调节在基因表达中实现的改变优选比在相比、组织或是其他中所有其它可操作系统的至少高2-倍，例如至少高5-倍、10-倍、100-倍、或500-倍。利用其各自配体在选择浓度调节各给定系统导致该系统的基因表达幅度有可检测的改变，而在细胞、组织或生物体中可操作的所有其它系统没有可检测的表达改变是理想的。在这种情况中，称多重诱导型基因调节系统是“完全正交的”。本发明可用于检索正交配体和基于受体的正交基因表达系统，例如通过引用全文纳入本文的US 2002/0110861A1所述那些。
术语“外源性基因”表示对象的外来基因，即，通过转化方法引入对象的基因，内源性突变基因的未突变形式或内源性未突变基因的突变形式。转化方法不是本发明至关重要的，可以是本领域技术人员已知适合于对象的任何方法。外源性基因可以是以DNA或RNA形式引入对象的天然或合成基因和治疗性基因，它们可通过DNA中间体，例如通过逆转录酶起作用。可将这些基因引入靶细胞，可通过直接引入对象，或通过将转化细胞传递入对象而间接引入。术语“治疗性基因”表示赋予这种基因在其中表达的宿主细胞有益功能的基因。
术语“蜕皮素受体复合物”通常指具有核受体家族的至少两个成员，蜕皮素受体(“EcR”)和超螺旋(ultraspiracle)(“USP”)蛋白的异源二聚蛋白质复合物(参见Yao等，Nature 366：476(1993))；Yao等，Cell 71：63(1992))。功能性EcR复合物还可包含其它蛋白质，例如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1或其它昆虫同源物)也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖性伴侣。EcR复合物还可以是EcR蛋白和超螺旋蛋白的脊椎动物同源物，视黄酸-X-受体(“RXR”)蛋白的异源二聚体。术语EcR复合物还包括EcR蛋白或USP的同源二聚复合物。
可通过进化该复合物的蛋白质之一的活性蜕皮类固醇或非类固醇配体活化EcR复合物，包括EcR，但不排除该复合物的其它蛋白质。应用于基于EcR的基因开关的本文所用术语“配体”描述了小的可溶性分子，其具有活化基因开关以刺激其中所编码多肽表达的能力。配体的例子包括但不限于：蜕皮类固醇，例如蜕皮素、20-羟基蜕皮素、松甾酮A、米乐甾酮(muristerone A)等，9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N，N′-二酰基肼，例如美国专利号6,013,836；5,117,057；5,530,028；和5,378,726及美国申请公布号2005/0209283和2006/0020146公开的那些；美国申请公布号2004/0171651描述的噁二唑啉(oxadiazoline)；二苯甲酰基烷基氰基肼，例如欧洲申请号461,809公开的那些；N-烷基-N，N′-二芳酰基肼，例如美国专利号5,225,443公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼，例如欧洲申请号234,994公开的那些；N-芳酰基-N-烷基-N′-芳酰基肼，例如美国专利号4,985,461描述的那些；酰氨基酮，例如美国申请公布号2004/0049037描述的那些；这些文献各自通过引用纳入本文，和其它类似的材料，包括3，5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈帕苷、氧基类固醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆固醇-3-硫酸酯、金合欢醇(famesol)、胆汁酸、1，1-二膦酸酯、保幼激素III等。可用于本发明的二酰基肼配体的例子包括：RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)、RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115932((R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见美国申请号12/155,111。
EcR复合物包含作为核受体超家族成员的蛋白质，其中所有成员的特征在于存在由绞链区隔开的氨基-末端反式激活域(″TA″)、DNA结合结构域(“DBD”)和配体结合结构域(“LBD”)。该家族的一些成员可在LBD的羧基末端侧还具有另一反式激活域。DBD的特征在于存在两个半胱氨酸锌指，在其间是两个氨基酸基序，P-盒和D-盒，其赋予蜕皮素反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或是异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。
构成外源性基因、反应元件和EcR复合物的DNA序列可掺入古细菌、原核细胞，例如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，或其它肠细菌，或真核细胞，例如植物或动物细胞。然而，基因表达的许多蛋白质在细菌中加工不正确，因此优选真核细胞。细胞可以是单细胞或多细胞生物体的形式。外源性基因、反应元件和受体复合物的核苷酸序列也可作为RNA分子掺入，优选功能性病毒RNA的形式，例如烟草花叶病毒。真核细胞中优选脊椎动物细胞，因为它们天然缺乏对EcR的本发明配体起反应的分子。所以，它们对于本发明配体“基本上不敏感”。因此，可用于本发明的配体对转化细胞或整个生物体的生理学或其它影响可以忽略。因此，细胞可生长并表达所需产物，而基本上不受其配体存在的影响。
术语“对象”表示完整的昆虫、植物或动物。还可预计，当对象是真菌或酵母菌时，配体可同等良好地起作用。当对象是完整的动物，该动物优选脊椎动物，最优选哺乳动物。
当EcR配体与EcR复合物联用，EcR复合物进而结合与外源性基因(例如，报道基因)相连的反应元件时，为外在瞬时调节外源性基因表达提供了方法。各种组分彼此结合，即，配体与受体复合物以及受体复合物与反应元件结合的顺序不重要。通常，外源性基因表达的调节是对EcR复合物与特异性控制或调节性DNA元件结合的反应。与核受体家族的其它成员相似，EcR蛋白具有至少三个结构域：反式激活域、DNA结合结构域和配体结合结构域。与核受体家族的亚组相似，该受体负责异源二聚特性的区域也未良好确定。USP或RXR蛋白异源二聚后，配体与EcR蛋白的配体结合结构域结合使得该异源二聚蛋白的DNA结合结构域能结合活性形式的反应元件，因此导致外源性基因的表达或阻遏。该机制不排除配体结合EcR或USP，以及导致活性同源二聚体复合物(例如EcR+EcR或USP+USP)形成的可能性。在一个实施方式中，可改变一个或多个受体结构域从而产生嵌合型基因开关。该三个结构域中的一个或多个通常可从与其它结构域来源不同的来源选择，从而能在所选宿主细胞或生物体内为反式激活活性、与配体互补结合和识别特异性反应元件而优化嵌合型受体。此外，可用其它DNA结合蛋白质结构域，例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature 335：563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell 43：729(1985))的反应元件修饰或取代反应元件本身来容纳嵌合型EcR复合物。嵌合型系统的另一优点是它们能根据所需的最终结果选择用于驱动外源性基因的启动子。这种双重控制在基因治疗领域尤其重要，特别是当产生细胞毒性蛋白时，因为既可控制表达的时机又可控制发生表达的细胞。当操作性连接于合适启动子的外源性基因引入对象的细胞时，该外源性基因的表达受到本发明配体存在的控制。启动子可以是组成型或诱导型调节的，或者可以是组织-特异性的(即，只在特定细胞类型中表达)或是生物体的某些发育阶段特异性的。
编码各种多肽的许多基因组和cDNA核酸序列，例如转录因子和报道基因是本领域熟知的。本领域技术人员可获得几乎所有已知基因的核酸序列信息，可从公共保藏机构(公布序列的研究机构)直接获得核酸分子，或采用常规方法制备该分子。
对于体内应用，本文所述配体可以吸收入药学上可接受的运载体，例如溶液、悬液、片剂、胶囊、软膏、酏剂和可注射组合物。药物组合物可含有0.01重量％到99重量％的配体。组合物可以是单剂量或多剂量形式。任何具体的药物组合物中配体的含量应取决于有效剂量，即，引发所需基因表达或阻遏的所需剂量。
给予药物制品的合适途径包括口服、直肠、局部(包括经皮肤、口腔含化和舌下)、经阴道、胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外)和经鼻胃管。本领域技术人员应理解优选的给药途径取决于所诊断的病症，可能会因，例如受者的病症等因素而有所不同。
本发明的一个实施方式包括诊断对象的疾病或病症的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示所述对象具有所述疾病、病症或病状。
在一个实施方式中，所述诊断方法在从所述对象分离的细胞中离体进行。
在一个实施方式中，通过将本发明组合物引入细胞来实施诊断方法，所述细胞是从所述对象分离从而产生修饰细胞，并将所述修饰细胞重新引入所述对象。
在一个实施方式中，所述诊断方法在体内进行。
在不同的实施方式中，可利用非自体细胞，例如对象的同种异体或异种细胞替代对象的自体细胞来实施诊断方法。可将多核苷酸离体引入非自体细胞从而产生修饰的细胞，然后将该修饰的细胞引入对象。非自体细胞可以是在移植入对象后能存活的任何细胞，包括但不限于干细胞(例如胚胎干细胞或造血干细胞)和成纤维细胞。
本发明的一个实施方式涉及诊断对象的疾病或病症的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示所述对象具有所述疾病或病症。
在一个实施方式中，编码基因开关的多核苷酸和编码与启动子相连的报道基因的多核苷酸是一较大多核苷酸，例如载体的一部分。在另一实施方式中，编码基因开关的多核苷酸和编码与启动子相连的报道基因的多核苷酸是不同的多核苷酸。
所述诊断方法所施加的对象可以是需要诊断的任何对象。例如，对象可以是表现出疾病或病症的一种或多种症状的对象。对象还可以是因为，例如遗传、家族史或环境接触而易患某疾病或病症的对象。对象可以是普通群众的一员，例如作为筛选疾病或病症在人群中流行程度的一部分。
本发明方法诊断的疾病或病症可以是有一种或多种诊断开关启动子可用的任何疾病或病症。可由本发明方法诊断的疾病或病症的例子包括但不限于：过度增生性疾病(例如，癌症)、心血管疾病、神经疾病、自身免疫疾病、移植物抗宿主病、移植排斥、骨疾病、胃肠道疾病、血液病、代谢疾病、炎性疾病、和感染。
本发明的一个实施方式涉及制备修饰细胞的方法，所述修饰细胞用于诊断对象的疾病或病症，包括将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的另一实施方式涉及诊断对象的疾病或病症的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(b)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示所述对象具有所述疾病或病症；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的诊断开关启动子可以是可用于诊断特定疾病或病症，监测疾病进展或监测治疗效力或毒性的任何启动子。例子包括但不限于：只在特定疾病或病症期间显示表达增加或降低的基因的启动子和在特定细胞条件下(例如，增殖、凋亡、pH改变、氧化状态、氧水平)显示表达增加或降低的基因的启动子。在基因开关包含多条转录因子序列的一些实施方式中，可通过组合疾病或病症-特异性启动子与组织或细胞类型特异性启动子以限制进行诊断检测的组织从而增加该诊断方法的特异性。因此，诊断开关启动子的定义包括组织-或细胞类型-特异性启动子。
作为疾病特异性启动子的例子，诊断癌症有用的启动子包括致癌基因的启动子。致癌基因类别的例子包括但不限于：生长因子、生长因子受体、蛋白激酶、程序性细胞死亡调节剂和转录因子。致癌基因的具体例子包括但不限于：sis、erb B、erb B-2、ras、abl、myc和bcl-2及TERT。其它癌症相关基因的例子包括肿瘤相关抗原基因和在肿瘤细胞中过表达的其它基因(例如，MAGE-1、癌胚抗原、酪氨酸酶、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn和汤普森-弗莱德里系抗原(Thompson-Friedenreich antigen)(TF))。
表1和2所列参考文献公开了本领域已知并可用作本发明诊断开关启动子的启动子序列和其它调节元件(例如增强子)，以及各启动子相关的疾病/病症(表1)或组织特异性(表2)。这些参考文献中公开的启动子序列通过引用全文纳入本文。
表1
| 启动子序列 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| Her-2/neu(ERBB2/c-erbB-2) | 癌症 | 5,518,885 |
| 骨钙蛋白 | 钙化肿瘤 | 5,772,993 |
| 溶基质素-1 | 癌症 | 5,824,794 |
| 前列腺特异性抗原 | 前列腺癌 | 5,919,652 |
| 人碘化钠共运输体 | 甲状腺癌 | 6,015,376 |
| H19，IF-1，IGF-2 | 癌症 | 6,306,833 |
| 胸腺素β15 | 乳腺，胰腺，前列腺癌 | 6,489,463 |
| T细胞因子 | 癌症 | 6,608,037 |
| 软骨衍生的视黄酸-敏感蛋白 | 软骨肉瘤，乳腺肿瘤 | 6,610,509 |
| 胰岛素 | 胰腺癌 | 6,716,824 |
| PEG-3 | 癌症 | 6,737,523 |
| 端粒酶逆转录酶 | 癌症 | 6,777,203 |
| 黑色素瘤分化相关基因-7 | 癌症 | 6,841,362 |
| Prostasin(前列腺分泌的一种丝氨酸蛋白水解酶) | 癌症 | 6,864,093 |
| 端粒酶催化亚基细胞周期蛋白-A | 癌症 | 6,936,595 |
| 中期因子；c-erbB-2 | 癌症 | 7,030,099 |
| 前列腺特异性膜抗原 | 前列腺癌 | 7,037,647 |
| p51 | 癌症 | 7,038,028 |
| 端粒酶RNA | 癌症 | 7,084,267 |
| 前列腺酸性磷酸酶 | 前列腺癌 | 7,094,533 |
| PCA3dd3 | 前列腺癌 | 7,138,235 |
| DF3/MUC1 | 癌症 | 7,247,297 |
| hex II | 癌症 | 2001/0011128 |
| 环加氧酶-2 | 癌症 | 2002/0107219 |
| 超级PSA | 前列腺癌 | 2003/0078224 |
| skp2 | 癌症 | 2003/0109481 |
| PRL-3 | 转移性结肠癌 | 2004/0126785 |
| CA125/M17S2 | 卵巢癌 | 2004/0126824 |
| IAI.3B | 卵巢癌 | 2005/0031591 |
| CRG-L2 | 肝癌 | 2005/0124068 |
| TRPM4 | 前列腺癌 | 2006/0188990 |
| RTVP | 神经胶质瘤 | 2006/0216731 |
| TARP | 前列腺癌，乳腺癌 | 2007/0032439 |
| 端粒酶逆转录酶 | 癌症 | 2007/0059287 |
| A4淀粉样蛋白 | 阿尔茨海默病 | 5,151,508 |
| 淀粉样β-蛋白前体 | 阿尔茨海默病 | 5,643,726 |
| 阿尔茨海默病A4淀粉样蛋白的前体 | 阿尔茨海默病 | 5,853,985 |
| 神经肽FF | CNS病 | 6,320,038 |
| 内质网应激元件 | 应激 | 7,049,132 |
| 尿可汀II(urocortin II) | 精神病 | 7,087,385 |
| 酪氨酸羟化酶 | 神经病 | 7,195,910 |
| 补体因子3；血清淀粉样蛋白A3 | 炎症 | 5,851,822 |
| 金属蛋白酶的组织抑制剂-3(TIMP-3) | 风湿病，癌症，自身免疫疾病，炎症 | 5,854,019 |
| p75肿瘤坏死因子受体 | 自身免疫疾病 | 5,959,094 |
| 肿瘤坏死因子-α | 炎症 | 6,537,784 |
| 过氧化物酶体增殖子活化的受体/IIA-1非胰腺分泌的磷脂酶A2 | 炎症 | 6,870,044 |
| SOCS-3 | 生长疾病，自身免疫疾病，炎症 | 2002/0174448 |
| SR-BI | 脂质病 | 5,965,790 |
| Ob | 肥胖症 | 5,698,389 |
| 位点-1蛋白酶 | 肥胖症，糖尿病 | 7,045,294 |
| TIGR | 青光眼 | 7,138,511 |
| VL30 | 缺氧 | 5,681,706 |
| 兴奋性氨基酸运载体-2 | 神经系统缺血 | 2004/0171108 |
| MDTS9 | 肾衰竭 | 2006/0014931 |
| LIM，吡咯啉5-羧酸还原酶，SIM2 | 前列腺疾病 | 2006/0134688 |
| Bax | 凋亡 | 5,744,310 |
| fas | 凋亡 | 5,888,764 |
| bbc3 | 凋亡 | 7,202,024 |
| PINK-1 | PI-3激酶/Akt途径疾病 | 2006/0228776 |
表2
| 启动子序列 | 组织特异性 | 专利/申请公布号 |
| 肌钙蛋白T | 骨骼肌 | 5,266,488 |
| 启动子序列 | 组织特异性 | 专利/申请公布号 |
| myoD | 肌肉 | 5,352,595 |
| 肌动蛋白 | 肌肉 | 5,374,544 |
| 平滑肌22α | 动脉平滑肌 | 5,837,534 |
| 肌养相关蛋白 | 肌肉 | 5,972,609 |
| 筒箭毒碱(myostatin) | 肌肉 | 6,284,882 |
| 平滑肌肌球蛋白重链 | 平滑肌 | 6,780,610 |
| 心脏锚蛋白重复蛋白 | 心肌 | 7,193,075 |
| MLP | 肌肉 | 2002/0042057 |
| 平滑肌蛋白 | 平滑肌 | 2003/0157494 |
| MYBPC3 | 心肌细胞 | 2004/0175699 |
| Tα1α-微管蛋白 | 神经元 | 5,661,032 |
| 细胞间粘附分子-4(ICAM-4) | 神经元 | 5,753,502 |
| γ-氨基丁酸A型受体β1亚基 | 海马 | 6,066,726 |
| 神经元烟碱乙酰胆碱受体β2-亚基 | 神经元 | 6,177,242 |
| 早老素-1 | 神经元 | 6,255,473 |
| 钙-钙调节蛋白依赖性激酶IIα | 前脑 | 6,509,190 |
| CRF2α受体 | 脑 | 7,071,323 |
| 神经生长因子 | 神经元 | 2003/159159 |
| GLP-2受体 | 肠，脑 | 2002/0045173 |
| I型转谷氨酰胺酶 | 角质形成细胞 | 5,643,746 |
| 启动子序列 | 组织特异性 | 专利/申请公布号 |
| K14 | 角质形成细胞 | 6,596,515 |
| 硬脂酰-CoA去饱和酶 | 皮肤 | 2002/0151018 |
| 麦格星(megsin) | 肾细胞 | 6,790,617 |
| 催乳素 | 垂体 | 5,082,779 |
| GDF-9 | 卵巢，睾丸，下丘脑，垂体，胎盘 | 7,227,013 |
| PSP94 | 前列腺 | 2003/0110522 |
| NRL；NGAL | 乳腺 | 5,773,290 |
| 长乳清酸性蛋白 | 乳腺 | 5,831,141 |
| 乳腺相关淀粉样蛋白A | 乳腺管上皮细胞 | 2005/0107315 |
| 内皮素-1 | 内皮细胞 | 5,288,846 |
| 丝甘蛋白 | 造血细胞 | 5,340,739 |
| 血小板-内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1) | 血小板，白细胞，内皮细胞 | 5,668,012 |
| Tie受体酪氨酸激酶 | 内皮细胞，骨髓 | 5,877,020 |
| KDR/flk-1 | 内皮细胞 | 5,888,765 |
| 内皮糖蛋白 | 内皮细胞 | 6,103,527 |
| CCR5 | 骨髓和淋巴细胞 | 6,383,746 |
| CD11d | 骨髓细胞 | 6,881,834 |
| 血小板糖蛋白IIb | 造血细胞 | 6,884,616 |
| 前内皮素原-1 | 内皮细胞 | 7,067,649 |
| 启动子序列 | 组织特异性 | 专利/申请公布号 |
| 白介素-18结合蛋白 | 单核的细胞 | 2006/0239984 |
| CD34 | 造血干细胞 | 5,556,954 |
| Tec酪氨酸激酶 | 造血干细胞，肝脏 | 6,225,459 |
| AC133 | 干细胞 | 2005/0125849 |
在特定疾病或病症期间显示表达水平改变，因此可用于本发明的其它基因包括但不限于表3所列的基因(连同相关的疾病/病症)。
表3
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| MLH1，MSH2，MSH6，PMS1，APC | 结肠直肠癌 | 7,148,016 |
| LEF-1 | 结肠癌 | 2002/0169300 |
| F2受体 | 结肠癌 | 2002/0187502 |
| TGF-βII型受体 | 结肠癌 | 2004/0038284 |
| EYA4 | 结肠癌 | 2005/0003463 |
| PCA3 | 前列腺癌 | 7,138,235 |
| K2 | 前列腺癌 | 6,303,361 |
| PROST03 | 转移性前列腺癌 | 2002/0009455 |
| PCAM-1 | 前列腺癌 | 2002/0042062 |
| PCADM-1 | 前列腺癌 | 2003/0100033 |
| PCA3dd3 | 前列腺癌 | 2003/0165850 |
| PCAV | 前列腺癌 | 2006/0275747 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| PAcP | 雄激素不敏感的前列腺癌 | 2006/0294615 |
| 通过引用纳入本文的专利5,866,329的SEQ ID NO：1 | 肝癌 | 5,866,329 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0115094的SEQ ID NO：1，3 | 肝细胞癌 | 2002/0115094 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2005/0037372的SEQ ID NO：1 | 肝细胞癌 | 2005/0037372 |
| ATB0 | 肝细胞癌 | 2006/0280725 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0042420的SEQ ID NO：1，3 | 肝癌 | 2007/0042420 |
| CSA-1 | 软骨肉瘤 | 2001/0016649 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2001/0016651的SEQ ID NO：1-15 | 胰腺癌 | 2001/0016651 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0212264的SEQ ID NO：1-15 | 胰腺癌 | 2003/0212264 |
| SYG972 | 乳腺癌 | 2002/0055107 |
| Urb-ctf | 乳腺癌 | 2003/0143546 |
| BCU399 | 乳腺癌 | 2003/0180728 |
| TBX2 | 乳腺癌 | 2004/0029185 |
| Cyr61 | 乳腺癌 | 2004/0086504 |
| DIAPH3 | 乳腺癌 | 2005/0054826 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0134669的SEQ ID NO：1-24 | 乳腺癌 | 2007/0134669 |
| 人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶 | CNS癌症 | 2002/0102263 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| BEHAB | CNS癌症 | 2003/0068661 |
| IL-8 | 卡波西肉瘤 | 2003/0096781 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0198362的SEQ ID NO：1-278 | 血液学癌症 | 2002/0198362 |
| BLSA | B-细胞癌症 | 2003/0147887 |
| BP1 | 白血病 | 2003/0171273 |
| DAP-激酶，HOXA9 | 非小细胞肺癌 | 2003/0224509 |
| ARP | 透明细胞肾癌，炎性疾病 | 2004/0010119 |
| Nbk | 肾癌 | 2005/0053931 |
| CD43 | 卵巢癌 | 2006/0216231 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0054268的SEQ ID NO：1-84 | 卵巢癌 | 2007/0054268 |
| β7-hcG，β6-hCG，β6e-hCG，β5-hCG，β8-hcG，β3-hCG | 子宫肿瘤 | 2006/0292567 |
| MTA1s | 激素不敏感性癌症 | 2006/0204957 |
| Old-35，Old-64 | 肿瘤增殖 | 2003/0099660 |
| LAGE-1 | 癌症 | 6,794,131 |
| CIF150/hTAFII150 | 癌症 | 6,174,679 |
| P65癌胚蛋白 | 癌症 | 5,773,215 |
| 端粒酶 | 癌症 | 2002/0025518 |
| CYP1B1 | 癌症 | 2002/0052013 |
| 14-3-3σ | 癌症 | 2002/0102245 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| NES1 | 癌症 | 2002/0106367 |
| CAR-1 | 癌症 | 2002/0119541 |
| HMGI，MAG | 癌症 | 2002/0120120 |
| ELL2 | 癌症 | 2002/0132329 |
| 肝配蛋白B2 | 癌症 | 2002/0136726 |
| WAF1 | 癌症 | 2002/0142442 |
| CIF130 | 癌症 | 2002/0143154 |
| C35 | 癌症 | 2002/0155447 |
| BMP2 | 癌症 | 2002/0159986 |
| BUB3 | 癌症 | 2002/0160403 |
| 聚合酶κ | 癌症 | 2003/0017573 |
| EAG1，EAG2 | 癌症 | 2003/0040476 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0044813的SEQ ID NO：18，20，22 | 癌症 | 2003/0044813 |
| HMG I | 癌症 | 2003/0051260 |
| HLTF | 癌症 | 2003/0082526 |
| Barx2 | 癌症 | 2003/0087243 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0108920的SEQ ID NO：18，20，22，32，34，36 | 癌症 | 2003/0108920 |
| Cables | 癌症 | 2003/0109443 |
| Pp32r1 | 癌症 | 2003/0129631 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| BMP4 | 癌症 | 2003/0134790 |
| TS10q23.3 | 癌症 | 2003/0139324 |
| 核纺锤体相关蛋白 | 癌症 | 2003/0157072 |
| PFTAIRE | 癌症 | 2003/0166217 |
| SEMA3B | 癌症 | 2003/0166557 |
| MOGp | 癌症，多发性硬化症，炎性疾病 | 2003/0166898 |
| Fortilin(一种抗凋亡蛋白) | 癌症 | 2003/0172388 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0215833的SEQ ID NO：1 | 癌症 | 2003/0215833 |
| IGFBP-3 | 癌症 | 2004/0005294 |
| 多同源异型(Polyhomeotic)2 | 癌症 | 2004/0006210 |
| PNQALRE | 癌症 | 2004/0077009 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0086916的SEQ ID NOS：1，3 | 癌症 | 2004/0086916 |
| SCN5A | 癌症 | 2004/0146877 |
| miR15，miR16 | 癌症 | 2004/0152112 |
| Headpin | 癌症 | 2004/0180371 |
| PAOh1/SMO | 癌症 | 2004/0229241 |
| Hippo，Mst2 | 癌症 | 2005/0053592 |
| PSMA-样 | 癌症，神经性疾病 | 2005/0064504 |
| JAB1 | 癌症 | 2005/0069918 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| NF-AT | 癌症 | 2005/0079496 |
| P28ING5 | 癌症 | 2005/0097626 |
| MTG16 | 癌症 | 2005/0107313 |
| ErbB-2 | 癌症 | 2005/0123538 |
| HDAC9 | 癌症 | 2005/0130146 |
| GPBP | 癌症 | 2005/0130227 |
| MG20 | 癌症 | 2005/0153352 |
| KLF6 | 癌症 | 2005/0181374 |
| ARTS1 | 癌症 | 2005/0266443 |
| Dock 3 | 癌症 | 2006/0041111 |
| 膜联蛋白8 | 癌症 | 2006/0052320 |
| MH15 | 癌症 | 2006/0068411 |
| DELTA-Np73 | 癌症 | 2006/0088825 |
| RapR6 | 癌症 | 2006/099676 |
| StarD10 | 癌症 | 2006/0148032 |
| Cizl | 癌症 | 2006/0155113 |
| HLJ1 | 癌症 | 2006/0194235 |
| RapR7 | 癌症 | 2006/0240021 |
| A34 | 癌症 | 2006/0292154 |
| Sef | 癌症 | 2006/0293240 |
| Killin | 癌症 | 2007/0072218 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| SGA-1M | 癌症 | 2007/0128593 |
| TGFβII型受体 | 癌症 | 2002/0064786 |
| GCA-相关基因 | 巨细胞动脉炎 | 6,743,903 |
| PRV-1 | 真性红细胞增多症 | 6,686,153 |
| 通过引用纳入本文的美国专利5,948,637的SEQ ID NO：2，4 | 缺血 | 5,948,637 |
| Vezf1 | 血管疾病 | 2002/0023277 |
| MLP | 扩张性心肌病(Dilatativecardiomyopathy) | 2002/0042057 |
| VEGI | 病理性血管生成 | 2002/0111325 |
| PRO256 | 心血管疾病 | 2002/0123091 |
| AOP2 | 动脉粥样硬化 | 2002/0142417 |
| 重塑蛋白(Remodelin) | 动脉再狭窄，纤维化 | 2002/0161211 |
| 磷酸二酯酶4D | 中风 | 2003/0054531 |
| 前列腺素受体亚型EP3 | 外周动脉阻塞疾病 | 2003/0157599 |
| CARP | 心脏病 | 2004/0014706 |
| HOP | 先天性心脏病 | 2004/0029158 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0087784的SEQ ID NO：1-4 | 卒中 | 2004/0087784 |
| PLTP | 动脉粥样硬化，血管疾病，高胆固醇血症，低α-脂蛋白血症，家族性HDL缺乏疾病 | 2006/0252787 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0160996的SEQ ID NO：1，3-8，15，16 | 血栓形成 | 2007/0160996 |
| UCP-2 | 中风 | 2002/0172958 |
| FLJ11011 | 范康尼贫血 | 2006/0070134 |
| Codanin-1(新型红细胞分化因子) | 贫血 | 2006/0154331 |
| 通过引用纳入本文的美国专利5,763,591的SEQ ID NO：1，6，8 | 胰岛素依赖性糖尿病 | 5,763,591 |
| 抗性蛋白 | II型糖尿病 | 2002/0161210 |
| Archipelin | 糖尿病 | 2003/0202976 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0053397的SEQ ID NO：2，7，16，27 | 糖尿病，高脂血症 | 2004/0053397 |
| Neuronatin | 代谢病 | 2004/0259777 |
| Ncb5or | 糖尿病 | 2005/0031605 |
| 7B2 | 内分泌病症 | 2005/0086709 |
| PTHrP，PEX | 代谢性骨疾病 | 2005/0113303 |
| KChIP1 | II型糖尿病 | 2005/0196784 |
| SLIT-3 | II型糖尿病 | 2006/0141462 |
| CX3CR1 | II型糖尿病 | 2006/0160076 |
| SMAP-2 | 糖尿病 | 2006/0210974 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2006/0228706的SEQ ID NO：2，8，12，16，22，26，28，32 | II型糖尿病 | 2006/0228706 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| IC-RFX | 糖尿病 | 2006/0264611 |
| E2IG4 | 糖尿病，胰岛素耐受，肥胖症 | 2007/0036787 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0122802的SEQ ID NO：2，8，10，14，18，24，26，30，34，38，44，50，54，60，62，68，74，80，86，92，98，104，110 | 糖尿病 | 2007/0122802 |
| UCP2 | 体重紊乱 | 2002/0127600 |
| Ob受体 | 体重紊乱 | 2002/0182676 |
| Ob | 体重紊乱 | 2004/0214214 |
| Dp1 | 神经变性疾病 | 2001/0021771 |
| NRG-1 | 精神分裂症 | 2002/0045577 |
| 突触蛋白III | 精神分裂症 | 2002/0064811 |
| NRG1AG1 | 精神分裂症 | 2002/0094954 |
| AL-2 | 神经疾病 | 2002/0142444 |
| 脯氨酸脱氢酶 | 双相性精神障碍，严重的抑郁性障碍，精神分裂症，强制性障碍 | 2002/0193581 |
| MNR2 | 慢性神经变性疾病 | 2002/0197678 |
| ATM | 共济失调性毛细血管扩张症 | 2004/0029198 |
| Ho-1 | 痴呆性疾病 | 2004/0033563 |
| CON202 | 精神分裂症 | 2004/0091928 |
| 失济蛋白-1 | 神经变性疾病 | 2004/0177388 |
| NR3B | 运动神经元疾病 | 2005/0153287 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| NIPA-1 | 遗传性痉挛性截瘫 | 2005/0164228 |
| DEPP，肾上腺髓质素，csdA | 精神分裂症 | 2005/0227233 |
| Inf-20 | 神经变性疾病 | 2006/0079675 |
| EOPA | 脑发育和变性疾病 | 2007/0031830 |
| SERT | 孤独症 | 2007/0037194 |
| FRP-1 | 青光眼 | 2002/0049177 |
| 血清淀粉样蛋白A | 青光眼 | 2005/0153927 |
| BMP2 | 骨质疏松症 | 2002/0072066 |
| BMPR1A | 幼年性息肉病 | 2003/0072758 |
| ACLP | 腹裂 | 2003/0084464 |
| 抗性蛋白样分子β | 家族性腺瘤性息肉病，糖尿病，胰岛素耐受，结肠癌，炎性肠病 | 2003/0138826 |
| Dlg5 | 炎性肠病 | 2006/0100132 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0119452的SEQ ID NO：1-82 | 骨关节炎 | 2002/0119452 |
| TRANCE | 免疫系统疾病 | 2003/0185820 |
| 胞外基质蛋白-3 | 骨关节炎 | 2003/0203380 |
| Synoviol in | 类风湿性关节炎 | 2004/0152871 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0028314的SEQ ID NO：9，35 | 骨关节炎 | 2007/0028314 |
| HIV LTR | HIV感染 | 5,627,023 |
| SHIVA | HIV感染 | 2004/0197770 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| EBI 1，EBI 2，EBI 3 | E-B病毒感染 | 2002/0040133 |
| NM23家族 | 皮肤/肠道疾病 | 2002/0034741 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0169127的SEQ ID NO：1 | 银屑病 | 2002/0169127 |
| Eps8 | 皮肤疾病，伤口愈合 | 2003/0180302 |
| β-10 | 甲状腺病 | 2002/0015981 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2003/0207403的SEQ ID NO：2 | 甲状腺病 | 2003/0207403 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2007/0020275的SEQ ID NO：3 | 甲状腺疾病 | 2007/0020275 |
| 发囊生长因子 | 脱发 | 2003/0036174 |
| 角化粒(Corneodesmosin) | 脱发 | 2003/0211065 |
| GCR9 | 哮喘，淋巴瘤，白血病 | 2003/0166150 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2004/0002084的SEQ ID NO：1-71 | 哮喘 | 2004/0002084 |
| Bg | 切-东二氏综合征 | 2002/0115144 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2002/0127555的SEQ ID NO：1-16 | 子宫内膜异位 | 2002/0127555 |
| FGF23 | 血磷酸盐过少疾病 | 2005/0156014 |
| BBSR | 巴-比二氏综合征 | 2003/0152963 |
| MIC-1 | 胎儿畸形，癌症，炎性疾病，流产，早产 | 2004/0053325 |
| MIA-2 | 肝脏损伤 | 2004/0076965 |
| IL-17B | 软骨变性疾病 | 2004/0171109 |
| 基因 | 疾病/病症 | 专利/申请公布号 |
| 甲酰甘氨酸产生酶 | 多发性硫酸脂酶缺乏症 | 2004/0229250 |
| LPLA2 | 肺泡蛋白沉积症 | 2006/0008455 |
| CXCL1O | 呼吸性疾病 | 2006/0040329 |
| 通过引用纳入本文的美国专利申请公布2006/0140945的SEQ ID NO：1，2 | 肾病 | 2006/0140945 |
| HFE2A | 铁代谢疾病 | 2007/0166711 |
一旦鉴定到表达模式在疾病或病症期间受调节的基因，该基因的启动子可用于本发明的基因开关中。许多基因的序列，包括启动子区域是本领域已知的并可从公开数据库，例如GenBank获得。因此，一旦鉴定到合适的基因，则不难鉴定和获得启动子序列。本发明的另一方面涉及鉴定可分离其启动子并置于基因开关中的合适基因。因此，基因的身份对于本发明的具体实施方式不是至关重要的，只要该启动子能分离并可用于随后的配置和环境中。因此，本发明包括利用尚未鉴定的基因的启动子。一旦鉴定了合适的基因，那么测定启动子功能所需的遗传序列只是常规技术或实验的问题。实际上，有几种可商品化购得的方法协助测定感兴趣基因的启动子区域。例如，Ding等最近通过使得人Sprouty4基因的5′-侧接序列逐渐缺失而阐明了新型Sprouty4基因的启动子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287：L52(2004)，其通过引用纳入本文)。简言之，一旦测定了转录起始位点，则利用普通PCR引物产生PCR片段，从而以单向方式克隆5’-侧接区段的区段。将产生的区段克隆入萤光素酶受体载体，检测萤光素酶活性来测定人Sprouty4基因的启动子区域。
获取和验证基因启动子的另一示范性方法包括以下步骤：(1)获得组织类型相似/相同的患病和未患病细胞/组织样品；(2)分离该样品的总RNA或mRNA；(3)对患病和未患病RNA实施差别微阵列分析；(4)鉴定候选疾病-特异性转录物；(5)鉴定疾病特异性转录物相关的基因组序列；(6)获得或合成该疾病特异性DNA的预计转录起点上游和下游的DNA序列；(7)利用步骤6所得不同长度的DNA设计和产生启动子报道载体；和(8)检验患病和未患病细胞/组织以及无关细胞/组织中的启动子报道载体。
插入基因开关的启动子的来源可以是天然或合成的，启动子的来源应不限于本文所述的本发明范围。换言之，可从细胞直接克隆启动子，或者早已从不同来源克隆的启动子，或者可以合成启动子。
基因开关可以是通过加入或除去特定配体而调节基因表达的任何基因开关。在一个实施方式中，基因开关是其中基因表达水平依赖于存在的配体水平的基因开关。可用于本发明基因开关中的配体依赖性转录因子的例子包括但不限于：由其各自配体活化的核受体超家族的成员(例如，糖皮质激素、雌激素、妊娠素、类视黄醇、蜕皮素及其类似物和模拟物)和四环素活化的rTTA。在本发明的一方面。基因开关是基于EcR的基因开关。这种体系的例子包括但不限于：美国专利号6,258,603、7,045,315、美国专利申请公布号2006/0014711、2007/0161086和国际申请公布号WO 01/70816所述的系统。嵌合型蜕皮素受体系统的例子描述于美国专利号7,091,038、美国专利申请公布号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416和国际申请公布号WO 01/70816、WO 02/066612、WO02/066613、WO 02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO2005/108617，各自通过引用全文纳入本文。非类固醇蜕皮素激动剂-调节的系统的例子是马萨诸塞州伊普斯威奇市新英格兰生物实验室的
哺乳动物诱导型表达系统(Mammalian InducibleExpression System，New England Biolabs，Ipswich，MA)。
在一个实施方式中，基因开关包含在诊断开关启动子控制下编码配体依赖性转录因子的一条转录因子序列。该转录因子序列可编码天然产生的配体依赖性转录因子或人工转录因子。人工转录因子是其中转录因子的天然序列被改变，例如通过序列突变或通过组合不同转录因子的结构域获得的转录因子。在一个实施方式中，转录因子包含H组核受体LBD。在一个实施方式中，H组受体LBD来自EcR、遍在受体(ubiquitous receptor)、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝脏X受体α、类法呢醇X受体、受体相互作用蛋白14、或法呢醇受体。在另一实施方式中，H组核受体LBD来自蜕皮素受体。
EcR和其它H组核受体是核受体超家族的成员，其中所有成员的特征通常在于由绞链区隔开的氨基-末端反式激活域(TD)、DNA结合结构域(DBD)和LBD。本文所用的术语“DNA结合结构域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列，到最多DNA结合蛋白的全长，只要DNA结合结构域能起到结合特定反应元件的作用。核受体超家族的成员的特征还在于存在4或5个结构域：A/B、C、D、E，和在一些实施成员中的F(参见US 4,981,784和Evans，Science 240：889(1988))。“A/B”结构域对应于反式激活域，“C”对应于DNA结合结构域，“D”对应于绞链区，和“E”对应于配体结合结构域。该家族的一些成员还可在LBD的羧基末端侧具有对应于“F”的另一反式激活域。
DBD的特征在于存在两个半胱氨酸锌指，在其间是两个氨基酸基序，P-盒和D-盒，其赋予反应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或是异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。与该核受体家族的亚组相似，EcR还具有未良好确定的负责异源二聚特性的区域。因为核受体的结构域在自然界中是模块，LBD、DBD和TD可互换。
在另一实施方式中，转录因子包含TD、识别与要调节其表达的报道基因结合的反应元件的DBD和H组核受体LBD。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
在另一实施方式中，基因开关包含第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物，即，“双重开关”或“双杂交体”基因开关。第一和第二诊断开关启动子可以相同或不同。在该实施方式中，基因开关中存在受体基因表达所需两种不同诊断开关启动子提高了诊断方法的特异性(图3)。图3还证明通过插入合适的诊断开关启动子能修饰诊断基因开关从而简单地检测任何疾病或病症。
在进一步的实施方式中，第一转录因子序列在诊断开关启动子(例如，图1中的P2或P3)的控制下，而第二转录因子序列在组成型启动子(例如，图1中的P1)的控制下。在该实施方式中，如果对象患有疾病或病症，配体依赖性转录因子的一部分是组成型存在的，而第二部分只是合成的。
在另一实施方式中，第一转录因子序列在第一诊断开关启动子(例如，图2中的P1)的控制下，而两个或更多个不同的第二转录因子序列在不同的诊断开关启动子(例如，图2中的P2和P3)的控制下。在该实施方式中，第二转录因子序列各自可具有识别不同诱导型启动子序列的不同DBD(例如，DBD-A结合诱导型启动子A，DBD-B结合诱导型启动子B)。各诱导型启动子可操作性连接于产生独特信号的不同受体基因。以次方式，可同时作出多个诊断，或者可在两种或更多种可能的疾病之间作出差别诊断。
在一个实施方式中，第一转录因子序列编码包含TD、识别与要调节其表达的报道基因结合的反应元件的DBD和H组核受体LBD的多肽，第二转录因子序列编码包含核受体LBD的转录因子，所述LBD选自下组：脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD、超螺旋蛋白LBD、和包含两个多肽片段的嵌合型LBD，其中第一多肽片段来自脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD或超螺旋蛋白LBD，第二多肽片段来自不同脊椎动物RXRLBD、无脊椎动物RXR LBD或超螺旋蛋白LBD。
在另一实施方式中，基因开关包含编码第一多肽的第一转录因子序列和编码第二多肽的第二转录因子序列，所述第一多肽包含核受体LBD和识别与要调节其表达的报道基因结合的反应元件的DBD，而所述第二多肽包含TD和核受体LBD，其中核受体LBD之一是H组核受体LBD。在优选的实施方式中，所述第一多肽基本上不含TD，所述第二多肽基本上不含DBD。出于本发明的目的，“基本上不含”表示所述蛋白含有的所述结构域的序列不足以提供活化或结合活性。
在本发明的另一方面，第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和TD的蛋白，第二转录因子序列编码包含DBD和LBD的蛋白。
如果只有一个受体LBD是H组LBD，另一核受体LBD可以来自与H组LBD构成二聚体的任何其它核受体。例如，当H组核受体LBD是EcRLBD时，另一核受体LBD“伴侣”可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超螺旋蛋白(USP)、或包含至少两个不同核受体LBD多肽片段的嵌合型核受体，所述片段选自：脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP(参见通过引用全文纳入本文的WO 01/70816A2，国际专利申请号PCT/US02/05235和US 2004/0096942A1)。“伴侣”核受体配体结合结构域还可包含截短突变、缺失突变、取代突变或另一修饰。
在一个实施方式中，脊椎动物RXR LBD来自智人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、鸡(Gallus gallus)、家猪(Susscrofa domestica)、蛙(爪蟾(Xenopus laevis))、斑马鱼(zebrafish)(Danio rerio)、被囊动物海鞘(Polyandrocarpa misakiensis)、或水母(Tripedalia cysophora)RXR。
在一个实施方式中，无脊椎动物RXR配体结合结构域来自蝗虫(Locusta migratoria)超螺旋多肽(“LmUSP”)、硬蜱(美洲钝眼蜱(Amblyommaamericanum))RXR同源物1(“AmaRXR1”)、硬蜱(美洲钝眼蜱)RXR同源物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹(Celuca pugilator)RXR同源物(“CpRXR”)、甲虫(黄粉甲虫(Tenebrio molitor))RXR同源物(“TmRXR”)、蜜蜂(Apis mellifera)RXR同源物(“AmRXR”)、蚜虫(Myzus persicae)RXR同源物(“MpRXR”)、或非-双翅类/非-鳞翅类RXR同源物。
在一个实施方式中，嵌合型RXR LBD包含至少两个选自下组的多肽片段：脊椎动物物种RXR多肽片段、无脊椎动物物种RXR多肽片段和非-双翅类/非-鳞翅类无脊椎动物物种RXR同源物多肽片段。本发明所用的嵌合型RXR配体结合结构域可包含至少两个不同物种的RXR多肽片段，或者当物种相同时，两个或更多个多肽片段可以来自该物种RXR多肽片段的两种或更多种不同的同种型。
在一个实施方式中，嵌合型RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物物种的RXR多肽片段和一个无脊椎动物物种的RXR多肽片段。
在另一实施方式中，嵌合型RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物物种的RXR多肽片段和一个非-双翅类/非-鳞翅类无脊椎动物物种的RXR同源物多肽片段。
当配体与核受体的LBD联用，受体进而结合与报道基因相连的反应元件时，其能外在瞬时调节外源性基因表达。本发明各种组分彼此结合的结合机制或顺序，即，例如配体与LBD结合，DBD与反应元件结合、TD与启动子结合等不重要。
在具体的实例中，配体结合H组核受体的LBD及其核受体LBD伴侣使得报道基因表达。该机制不排除配体结合H组核受体(GHNR)或其伴侣，以及导致活性同源二聚体复合物(例如GHNR+GHNR或伴侣+伴侣)形成的可能性。优选改变受体结构域中的一个或多个从而产生杂交基因开关。该三个结构域，DBD、LBD和TD中的一个或多个通常可从与其它结构域来源不同的来源选择，从而能在所选宿主细胞或生物体内为反式激活活性、与配体互补结合和识别特异性反应元件而优化中基因和得到的杂交蛋白。此外，可用其它DNA结合蛋白质结构域，例如酵母的GAL-4蛋白(参见Sadowski等，Nature335：563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell 43：729(1985))的反应元件或与蛋白质靶向相互作用的特异性合成反应元件来修饰或取代反应元件本身来容纳杂交受体，所述蛋白质是为这种特异性相互作用而设计、修饰和选择的(参见，例如Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：3616(1997))。
功能性EcR复合物还可包含其它蛋白质，例如亲免蛋白。称为转录因子的核受体家族蛋白的其它成员(例如，DHR38，βFTZ-1)也可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非依赖性伴侣。此外，可能需要其它辅因子，例如通常称为辅助活化物(也称为衔接头或介导物)的蛋白质。这些蛋白质不序列特异性地结合DNA，也不涉及基础转录。它们可通过各种机制对转录活化施加其影响，包括刺激活化物的DNA-结合，通过影响染色质结构，或通过介导活化物启动复合物相互作用。这种辅助活化物的例子包括RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB1/RAC3/pCIP以及泛宿主性共活化物C第一元件B结合蛋白，CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.Cell Biol.9：222(1997))。蛋白质辅助活化物通常也称为辅阻遏物(也称为阻遏物、沉寂子或沉默介导物)，其可能是没有配体存在下有效抑制转录活化所需。这些辅阻遏物可与未结合配体(unliganded)的EcR相互作用以使得反应元件活性沉默。目前的证据提示配体结合改变了受体的构象，从而导致辅阻遏物释放和上述共活化物募集，藉此消除它们的沉默活性。辅阻遏物的例子包括N-CoR和SMRT(综述参见Horwitz等，Mol Endocrinol.10：1167(1996))。这些辅因子可以是细胞或生物体内源性的，或者可以是作为转基因而外源性加入从而待以调节或未调节的方式表达。
报道基因可以是编码可检测蛋白的任何基因。蛋白质可以是分泌或未分泌的。在一个实施方式中，蛋白质是可采用各种标准试验方法，例如免疫测定(如那些免疫荧光抗体)、比色测定、荧光测定或发光测定来测试的蛋白质。合适报道基因的例子包括但不限于：萤光素酶、绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、胸苷激酶、和氯霉素乙酰转移酶。
报道基因操作性连接于包含至少一个反应元件的启动子，所述反应元件由检验开关编码的配体依赖性转录因子的DBD识别。在一个实施方式中，启动子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多拷贝的反应元件。包含所需反应元件的启动子可以是天然产生的启动子或采用本领域熟知的技术制备的人工启动子，例如一个或多个反应元件操作性连接于最小启动子。
为将多核苷酸引入细胞，可利用载体。载体可以是，例如质粒载体或单链或双链RNA或DNA病毒载体。可通过将DNA和RNA引入细胞的熟知技术将这种载体引入细胞。病毒载体可以是能复制的或复制缺陷型。在后一情况中，病毒通常只在互补宿主细胞(complementing host cell)中增殖。本文所用的术语“宿主细胞”或“宿主”用于表示含有一个或多个本发明多核苷酸的本发明细胞。
因此，载体至少必须包含本发明多核苷酸。载体的其它组分可包括但不限于：可选择标记、染色质修饰结构域、也可存在于载体中的驱动其它多肽(例如，致死性多肽)表达的额外启动子、基因组整合位点、重组位点和分子插入支点(molecular insertion pivot)。载体可在或不在该多核苷酸内包含任何数量的这些额外元件，从而该载体可为所需诊断方法的特定目标而作改进。
在本发明的一个实施方式中，引入细胞的载体还包含“可选择标记基因”，当其表达时，表示本发明的诊断基因开关构建物已整合入宿主细胞的基因组。在此方式中，选择者基因(selector gene)可以是基因组整合的正标记物。虽然对于本发明方法不是至关重要的，但选择者基因的存在使得实施者能选择载体构建物已整合入细胞基因组的活细胞群。因此，本发明的某些实施方式包括选择载体已成功整合的细胞。当本文所用的术语“选择”或其改变形式与细胞联用时，其应表示选择具有特定遗传组成或表型的细胞的标准熟知方法。典型的方法包括但不限于：在有抗生素，例如G418、新霉素和氨苄青霉素存在下培养细胞。可选择标记基因的其它例子包括但不限于：赋予对二氢叶酸还原酶、潮霉素或霉酚酸耐受性的基因。选择的其它方法包括但不限于：允许利用胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶或腺嘌呤磷酸核糖转移酶作为选择剂的可选择标记基因。然后包含含有一种或多种抗生素耐受性基因的载体构建物的细胞能耐受培养基中的抗生素。类似地，不包含含有一种或多种抗生素耐受性基因的载体构建物的细胞不能耐受培养基中的抗生素。
本文所用的“染色质修饰结构域”(CMD)指与维持和/或改变染色质结构相关的各种蛋白质相互作用的核苷酸序列，例如但不限于DNA绝缘子。参见通过引用纳入本文的Ciavatta等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.，103：9958(2006)。CMD的例子包括但不限于：鸡β-球蛋白绝缘子和鸡超敏位点4(cHS4)。例如，利用在一个或多个基因程序(gene program)之间不同的CMD(即，启动子、编码序列和3’调控区)有助于联用差别CMD DNA序列作为“最小同源臂”与各种微生物或体外重组技术，从而在现有多基因和单基因穿梭载体之间“交流”基因程序。染色质修饰结构域的其它例子是本领域已知的或者不难鉴定。
本发明所用的具体载体是编码蛋白质或其诸部分的表达载体。这种载体通常包含操作性连接于待表达多核苷酸的顺式-作用调控区以便在宿主中有效表达。由宿主、互补载体(complementing vector)或在引入宿主后由载体本身提供合适的反式作用因子。
可利用各种表达载体表达蛋白质。这种载体包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒，例如腺伴随病毒、慢病毒、杆状病毒、乳多空病毒，例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，以及衍生自它们组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件，例如粘粒和噬菌粒的那些载体。按照本发明的该方面，所有载体可用于表达。就此而言，适于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸或蛋白质的任何载体通常可用于表达。
表达载体中的DNA序列操作性连接于合适的表达控制序列，包括例如指导mRNA转录的启动子。其它代表性启动子包括但不限于：组成型启动子和组织特异性或诱导型启动子。组成型真核生物启动子的例子包括但不限于：小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1：273(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，Nature 290：304(1981))；和牛痘病毒启动子。上述所有参考文献通过引用纳入本文。可用于驱动蛋白质表达的启动子的其它例子包括但不限于组织特异性启动子和特定蛋白质的其它内源性启动子，例如白蛋白启动子(肝细胞)、胰岛素原启动子(胰腺β细胞)等。表达构建物通常含有转录、起始和终止位点以及在转录区域中用于翻译的核糖体结合位点。构建物表达的成熟转录物的编码部分可包含开始处的转录起始AUG，和适当位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
此外，构建物可含有调节以及引起表达的调控区。这些区域通常通过控制转录起作用，例如阻遏物结合位点和增强子等。
真核生物载体的例子包括但不限于：斯特拉塔基因公司(Stratagene)的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT 1和pSG；APB公司(Amersham PharmaciaBiotech)的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和克隆技术公司(Clontech)的pCMVDsRed2-表达、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFP。许多其它载体是熟知且可商品化购得的。
包含分子插入支点以供快速插入和除去基因程序元件的尤其有用载体描述于：美国专利申请公布号2004/0185556、美国专利申请号11/233,246和国际申请公布号WO 2005/040336和WO 2005/116231，所有这些通过引用纳入本文。这种载体的例子是通过引用纳入本文的WO 2007/038276所述的弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司的UltraVectorTM产生系统。本文所用的“基因程序”是包含启动子(P)、表达序列(E)和3′调控序列(3)的遗传元件的组合，例如“PE3”是基因程序。该基因程序内的诸元件不难在侧接该基因程序各元件的分子支点之间交流。本文所用的分子支点定义为包含至少两个以线形方式排列的不可变罕有或稀有限制性位点的多核苷酸。在一个实施方式中，分子支点包含至少三个以线形方式排列的不可变罕有或稀有限制性位点。通常，任一分子支点不会包含同一基因程序中任何其它分子支点的罕有或稀有限制性位点。给定限制性酶在其上起作用的大于6个核苷酸的同源序列称为“罕有”限制性位点。然而，有的6bp限制性位点比统计学预计的更罕见，这些位点和切割它们的核酸内切酶称为“稀有”限制性位点。罕有或稀有限制性位点的例子包括但不限于：AsiS I、Pac I、Sbf I、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、SdaI、Sgf I、SrfI、和Sse8781 I。
载体还可包含第二类限制性酶，称为归巢核酸内切酶(HE)的限制性位点。HE酶具有大的不对称限制性位点(12-40个碱基对)，它们的限制性位点是天然罕见的。例如，称为I-SceI的HE具有18bp的限制性位点(5′TAGGGATAACAGGGTAAT3′(SEQ ID NO：4))，预计在随机序列的每7×1010个碱基对中产生一个。这种发生率等于在大小是哺乳动物基因组的20倍的基因组中只有一个位点。如果克隆载体质粒的适当位置包含HE位点，则HE位点的罕有特性极大增加了遗传工程师切割某基因程序而不破坏该基因程序完整性的可能性。
选择合适的载体和启动子在宿主细胞中表达是熟知的方法，载体构建和引入宿主及其在宿主中表达的必需技术是本领域的常规技术。
将多核苷酸引入细胞可以是瞬时转染、稳定转染，或者可以是基因座特异性插入载体。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法实现载体瞬时而稳定地转染入宿主细胞。通过引用纳入本文的许多标准实验室手册描述了这些方法，例如Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基本方法)(1986)；Keown等，1990，Methods Enzymol.185：527-37；Sambrook等，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆-实验室手册)，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约。这些稳定的转染方法导致载体随机插入细胞的基因座。此外，载体的拷贝数量和取向一般也是随机的。
在本发明的一个实施方式中，载体插入基因组的生物中立位点(bio-neutral site)。生物中立位点是基因组中多核苷酸的插入极少干扰(如果有的话)细胞正常功能的位点。可采用可得的生物信息学方法分析生物中立位点。许多生物中立位点是本领域已知的，例如ROSA-等价基因座。可采用本领域熟知的常规技术鉴定其它生物中立位点。采用本领域已知的方法表征基因组插入位点。为控制将载体引入细胞时多核苷酸的位置、拷贝数量和/或取向，可采用基因座特异性插入的方法。基因座特异性插入方法是本领域熟知的，包括但不限于：同源重组和重组酶介导的基因组插入。当然，如果本发明方法中要采用基因座特异性插入方法，载体可包含有助于这种基因座特异性插入，例如但不限于同源重组的元件。例如，载体可包含1、2、3、4或更多个基因组整合位点(GIS)。本文所用的“基因组整合位点”定义为载体序列的一部分，其核苷酸序列与允许在基因组中插入载体的细胞的基因组诸部分相同或几乎相同。特别是，载体可包含至少侧接多核苷酸的两个基因组插入位点。当然，GIS可侧接其它元件，甚至载体上存在的所有元件。
在另一实施方式中，可通过重组酶位点特异性基因插入进行基因座特异性插入。简言之，细菌重组酶，例如但不限于PhiC31整合酶可作用于人基因组内的“伪”重组位点。这些伪重组位点可以是利用重组酶的基因座特异性插入的靶点。重组酶-位点特异性基因插入描述于通过引用纳入本文的Thyagarajan等，Mol.Cell Biol.21：3926(2001)。重组酶的其它例子和它们可用于重组酶-位点特异性基因插入的各位点包括但不限于丝氨酸重组酶，例如R4和TP901-1和通过引用纳入本文的WO 2006/083253描述的重组酶。
在进一步的实施方式中，载体可包含化学耐受性基因，例如多元抗药性基因mdr1、二氢叶酸还原酶或O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。化学耐受性基因可以在组成型(例如，CMV)或诱导型(例如，
)启动子的控制下。在该实施方式中，如果需要治疗在对象中诊断到的疾病而同时将修饰细胞维持在该对象中，临床医师可应用化疗剂来破坏患病细胞，而修饰细胞因表达合适的化学耐受性基因而免遭该化疗剂作用并且可继续用于监测疾病进展或疗效。将化学-耐受性基因置于诱导型启动子控制下，可避免该化学耐受性基因不必要的表达，但在治疗期间需要持续诊断的情况中，其仍可用。如果修饰细胞本身变得患病，也可通过诱导致死性多肽表达来破坏它们，如下所述。
通过将编码基因开关和报道基因的多核苷酸引入对象的细胞来实施本发明方法。可采用将多核苷酸引入本领域已知的细胞的任何已知方法，例如上述那些。
在其它实施方式中，编码基因开关和报道基因的多核苷酸引入非自体细胞，例如对象的同种异体或异种细胞。
当要将多核苷酸离体引入细胞时，可通过本领域已知的任何技术获得对象的细胞，包括但不限于：活检、刮除术和外科组织取出。可以培养分离的细胞足够时间以使多核苷酸引入细胞，例如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小时或更长时间。短期培养原代细胞的方法是本领域熟知的。例如，可在平板(例如，微孔平板)中粘附或悬浮培养细胞。
对于离体诊断方法，从对象分离细胞并在适于将多核苷酸引入细胞的条件下培养。一旦多核苷酸引入细胞，将该细胞温育足够的时间以使配体依赖性转录因子表达，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18、或24小时或更长时间。如果与对照水平相比，配体依赖性转录因子的表达升高或降低(即，如果该对象具有疾病或病症并且控制转录因子表达的启动子活化或失活)，通过加入配体导致报道基因表达，其表达水平对应于配体依赖性转录因子的水平，从而检测该配体依赖性转录因子的存在和/或水平。配体可在多核苷酸引入细胞之前、期间或之后的任何时候加入细胞。可仅采用常规技术测定各类型细胞和疾病或病症的最佳配体给予时机。在一个实施方式中，可加入配体，测定报道基因表达，除去配体并重复该过程一次或多次以获得细胞的多个诊断测量结果。在另一实施方式中，配体始终存在，并定期检测报道基因表达。
当利用分离细胞的离体方法不充分，例如当诊断开关启动子活性产生需要循环因子时，可采用本发明的第一个体内诊断实施方式中(修饰分离的细胞，然后将该细胞重新引入对象)。在该实施方式中，如上所述，从对象分离细胞，并将多核苷酸引入培养中的细胞。在多核苷酸引入细胞后的某时，将该细胞引回该对象。可通过本领域已知的任何方法实施重新引入，例如静脉内输注或直接注射入组织或体腔。在一个实施方式中，先测定细胞中是否存在多核苷酸，再将该细胞引回对象。在另一实施方式中，选择含有多核苷酸的细胞(例如，根据多核苷酸中可选择标记的存在)，只将含有该多核苷酸的那些细胞重新引入对象。细胞重新引入对象后，将配体给予对象，并检验报道基因表达。可通过任何合适的方法，全身性(例如，口服、静脉内)或局部(例如，腹膜内、鞘内、心室内、直接注射入重新引入细胞的组织或器官)给予配体。可仅采用常规技术测定各类型细胞和疾病或病症的最佳配体给予时机。在一个实施方式中，可给予配体，测定报道基因表达，除去配体并重复该过程一次或多次以获得细胞的多个诊断测量结果。在另一实施方式中，配体持续给予，并定期检测报道基因表达。给予配体后，可在体内或离体检测报道基因表达。例如，如果报道基因编码在血液中循环的分泌型蛋白，可在从患者中取出的血液样品中检测该蛋白。如果报道基因编码产生发光或荧光信号的蛋白，可在体内检测该信号。在另一实施方式中，可取出修饰细胞的样品，离体检测报道基因的表达。
本发明的第二种体内诊断实施方式涉及将多核苷酸直接体内引入对象的细胞。可将多核苷酸全身性或局部引入对象(例如，在怀疑患病的部位)。一旦将多核苷酸引入对象，可给予配体并检验报道基因表达。可通过任何合适的方法，全身性(例如，口服、静脉内)或局部(例如，腹膜内、鞘内、心室内、直接注射入怀疑正患病的组织或器官)给予配体。可仅采用常规技术测定各类型细胞和疾病或病症的最佳配体给予时机。在一个实施方式中，可给予配体，测定报道基因表达，除去配体并重复该过程一次或多次以获得含有该多核苷酸的细胞的多个诊断测量结果。在另一实施方式中，配体持续给予，并定期检测报道基因表达。给予配体后，可在体内或离体检测报道基因表达。例如，如果报道基因编码在血液中循环的分泌型蛋白，可在从患者中取出的血液样品中检测该蛋白。如果报道基因编码产生发光或荧光信号的蛋白，可在体内检测该信号。在另一实施方式中，可取出修饰细胞的样品，离体检测报道基因的表达。
当诊断方法利用非自体细胞时，可从任何来源获得该细胞，例如其它对象、细胞系或动物。非自体细胞可以是在移植后能存活的任何细胞，例如成纤维细胞或干细胞(例如胚胎干细胞、造血干细胞)。如上所述，分离非自体细胞，并将多核苷酸引入培养中的该细胞。在多核苷酸引入细胞后的某时，将该细胞引入对象。可通过本领域已知的任何方法实施引入，例如静脉内输注或直接注射入组织或体腔。在一个实施方式中，先测定细胞中是否存在多核苷酸，再将该细胞引回对象。在另一实施方式中，选择含有多核苷酸的细胞(例如，根据多核苷酸中可选择标记的存在)，只将含有该多核苷酸的那些细胞引入对象。细胞引入对象后，将配体给予对象，并检验报道基因表达。可通过任何合适的方法，全身性(例如，口服、静脉内)或局部(例如，腹膜内、鞘内、心室内、直接注射入引入细胞的组织或器官)给予配体。可仅采用常规技术测定各类型细胞和疾病或病症的最佳配体给予时机。在一个实施方式中，可给予配体，测定报道基因表达，除去配体并重复该过程一次或多次以获得细胞的多个诊断测量结果。在另一实施方式中，配体持续给予，并定期检测报道基因表达。给予配体后，可在体内或离体检测报道基因表达。例如，如果报道基因编码在血液中循环的分泌型蛋白，可在从患者中取出的血液样品中检测该蛋白。如果报道基因编码产生发光或荧光信号的蛋白，可在体内检测该信号。在另一实施方式中，可取出修饰细胞的样品，离体检测报道基因的表达。
在所有体内实施方式中，多核苷酸或含有多核苷酸的载体可包含编码致死性多肽的序列，开启该序列可表达杀伤含有该多核苷酸或载体的细胞的产物。致死性多肽表达可用于从对象中消除修饰细胞，因为不再需要诊断测试或者因为修饰细胞出了问题(例如，过度增殖或毒性)。本文所用的致死性多肽是在表达时对于表达该多肽的细胞有致死性的多肽，因为该多肽本身是致死性的或者该多肽产生致死性的化合物。本文所用的致死性多肽包括以任何方式诱导细胞死亡的多肽，包括但不限于：坏死、凋亡和细胞毒性。致死性多肽的例子包括但不限于：凋亡诱导型肿瘤阻遏基因，例如但不限于p53、Rb和BRCA-1，毒素，例如白喉毒素(DTA)、志贺菌神经毒素、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、霍乱毒素、CSE-V2和蝎子蛋白毒素的其它变体等等，自杀基因，例如胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶，以及细胞毒素基因，例如肿瘤坏死因子、干扰素-α。本发明不限于致死性多肽的身份，只要该多肽对表达其的细胞有致死性即可。如果修饰细胞是短寿细胞，例如寿命有限的细胞(例如，约10天或更短，如树突细胞)，可能无需在多核苷酸或载体中包含致死性多肽，因为该细胞自然会在短期内除去。
本发明另一方面涉及通过给予对象本发明的诊断基因开关并检测报道基因表达来监测疾病或病症进展的方法。在一个实施方式中，本发明涉及监测对象中疾病或病症进展的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表示所述对象中所述疾病或病症的进展。
根据诊断开关启动子是否对该疾病或病症期间增加或降低的因子起反应，通过报道基因表达的升高或降低表示进展。可采用上述诊断方法的任何改变形式实施这些方法(即，离体细胞，离体或体内修饰细胞，然后体内重新引入该细胞)。通过检测报道基因表达至少两次作为疾病或病症状态的标志，并注意表达水平的任何改变来监测疾病或病症。在一个实施方式中，可将细胞与配体持续接触并间歇检测报道基因表达来实施监测。在另一实施方式中，可将细胞与配体间歇接触并在各接触期间检测报道基因表达来实施监测。
本发明的一个实施方式涉及制备修饰细胞的方法，所述修饰细胞用于监测对象中疾病或病症的进展，包括将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的另一实施方式涉及监测对象的疾病或病症进展的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(b)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达表明所述对象中所述疾病或病症的进展；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
在进一步的实施方式中，利用非自体细胞，例如对象的同种异体或异种细胞实施监测疾病或病症进展的方法，并且将修饰的非自体细胞引入该对象。本发明的一个实施方式涉及监测对象中疾病或病症进展的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表明所述对象中所述疾病或病症的进展。
本发明的另一方面涉及监测对象中疾病或病症治疗效力的方法，包括给予该对象某种治疗并实施本发明的诊断方法至少两次以测定报道基因的表达是增加、降低还是维持原样。在一个实施方式中，本发明涉及监测对象中疾病或病症治疗的效力的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表示所述治疗的效力。
治疗给予后报道基因表达水平的改变表明该治疗的效力。如果诊断开关启动子对该疾病或病症期间升高的因子起反应，则报道基因表达降低表明治疗有效。如果诊断开关启动子对该疾病或病症期间降低的因子起反应，则报道基因表达增加表明治疗有效。如果治疗给予后报道基因表达不变，可表明该治疗使得该疾病或病症的进展停滞。可采用上述诊断方法的任何改变形式实施这些方法(即，离体细胞，离体或体内修饰细胞，然后体内重新引入该细胞)。
对于本发明的离体实施方式，可在治疗前从对象中分离细胞以测定报道基因表达的基线水平。给予该对象治疗后，可在各种时间间隔分离对象的细胞以测定报道基因表达。
对于本发明的体内实施方式，可在给予治疗之前、期间或之后将修饰细胞或多核苷酸引入对象。如果在治疗之前给予细胞或多核苷酸，可以获得报道基因表达的基线水平。
可以离体或在体内检测报道基因表达。在一个实施方式中，可将细胞与配体持续接触并间歇检测报道基因表达来实施监测。在另一实施方式中，可将细胞与配体间歇接触并在各接触期间检测报道基因表达来实施监测。
在一个实施方式中，编码基因开关和报道基因的多核苷酸之一或二者可以是给予对象的治疗性载体(例如，编码治疗性蛋白或用于基因治疗的核酸的载体)的一部分。在该实施方式中，治疗性治疗和监测治疗效力的诊断性测试在一个单位中一起给予，从而确保接受治疗的所有细胞也接受诊断基因开关。
本发明的一个实施方式涉及制备修饰细胞的方法，所述修饰细胞用于监测治疗对于对象中疾病或病症的效力，包括将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的另一实施方式涉及监测治疗对对象中疾病或病症的效力的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(b)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表明所述治疗的效力；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
在进一步的实施方式中，利用非自体细胞，例如对象的同种异体或异种细胞实施监测治疗对疾病或病症效力的方法，并且将修饰的非自体细胞引入该对象。在一个实施方式中，本发明涉及监测治疗对对象中疾病或病症效力的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表明所述治疗的效力。
本发明的另一方面涉及监测所给予的疾病或病症的治疗在对象中的潜在毒性的方法。在一个实施方式中，本发明涉及监测所给予的疾病或病症的治疗在对象中的潜在毒性的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的该细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表示所述治疗的毒性。
在一个实施方式中，该方面包括其中转录因子序列在启动子控制下的多核苷酸，所述启动子受到在接触毒性条件的细胞，例如受应激或濒死细胞中发现的因子的调节。例子包括但不限于：对凋亡信号、坏死信号、缺氧、活性氧中间体、DNA或染色质修饰、蛋白质降解、氧化/还原状态、pH改变等起反应的启动子。合适的应激启动子包括美国申请公布号2003/0027127(通过引用纳入本文)所述那些，包括但不限于以下基因的启动子：CYP1A1、GST Ya、GADD45、GRP78、JUN、FOS、XHF、HSP70、MT IIA、GADD153、ALDH1、HMO、CRE、XRE、NFκBRE、RARE、ThRE、PPRE、TRE、ERE、和p53RE。合适的凋亡反应性启动子包括但不限于：Fas/CD95、TRAMP、TNFRI、DR1、DR2、DR3、DR4、DR5、DR6、FADD、RIP、TNFα、Fas配体、TRAILR1、TRAILR2、TRAILR3、Bcl-2、p53、BAX、BAD、Akt、CAD、PI3激酶、PP1、和胱冬酶蛋白。给予治疗后检测到报道基因表达增加表明该治疗对细胞有害。使得基因开关对应激或死亡信号有反应可用于监测治疗效力并早在对象表现出明显毒性症状之前在细胞水平检测毒性作用。
可采用上述诊断方法的任何改变形式实施这些方法(即，离体细胞，离体或体内修饰细胞，然后体内重新引入该细胞)。
对于本发明的离体实施方式，可在治疗前从对象中分离细胞以测定报道基因表达的基线水平。给予该对象治疗后，可在各种时间间隔分离对象的细胞以测定报道基因表达。
对于本发明的体内实施方式，可在给予治疗之前、期间或之后将修饰细胞或多核苷酸引入对象。如果在治疗之前给予细胞或多核苷酸，可以获得报道基因表达的基线水平。
可以离体或在体内检测报道基因表达。在一个实施方式中，可将细胞与配体持续接触并间歇检测报道基因表达来实施监测。在另一实施方式中，可将细胞与配体间歇接触并在各接触期间检测报道基因表达来实施监测。
本发明的一个实施方式涉及制备修饰细胞的方法，所述修饰细胞用于监测所给予的疾病或病症的治疗在对象中的潜在毒性，包括将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的该细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的另一实施方式涉及监测所给予的疾病或病症的治疗在对象中的潜在毒性的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平改变表明所述治疗的毒性；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的该细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
在进一步的实施方式中，利用非自体细胞，例如对象的同种异体或异种细胞实施监测所给予的疾病或病症的治疗的潜在毒性的方法，并且将修饰的非自体细胞引入该对象。在一个实施方式中，本发明涉及监测所给予的疾病或病症的治疗在对象中的潜在毒性的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的该细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表明所述治疗的毒性。
在本发明的另一实施方式中，多核苷酸包含在启动子控制下的转录因子序列，所述启动子由作为治疗(例如，用治疗性蛋白质或核酸进行基因治疗)给予的因子活化。使得基因开关对给予的治疗有反应可用于监测基因治疗的表达并早在对象表现出治疗因子过表达或表达不足的明显症状之前检测有害的高或低水平治疗。在一个实施方式中，本发明涉及监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达水平表示所给予以供治疗的因子的水平。
可采用上述诊断方法的任何改变形式实施这些方法(即，离体细胞，离体或体内修饰细胞，然后体内重新引入该细胞)。
对于本发明的离体实施方式，可在治疗前从对象中分离细胞以测定报道基因表达的基线水平。给予该对象治疗后，可在各种时间间隔分离对象的细胞以测定报道基因表达。
对于本发明的体内实施方式，可在给予治疗之前、期间或之后将修饰细胞或多核苷酸引入对象。如果在治疗之前给予细胞或多核苷酸，可以获得报道基因表达的基线水平。
可以离体或在体内检测报道基因表达。在一个实施方式中，可将细胞与配体持续接触并间歇检测报道基因表达来实施监测。在另一实施方式中，可将细胞与配体间歇接触并在各接触期间检测报道基因表达来实施监测。
本发明的一个实施方式涉及制备修饰细胞的方法，所述修饰细胞用于监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平，包括将以下多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的另一实施方式涉及监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的方法，包括：
(a)给予所述对象所述治疗；
(b)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达水平改变表明给予以供治疗的因子水平；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
在进一步的实施方式中，利用非自体细胞，例如对象的同种异体或异种细胞实施监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的方法，并且将修饰的非自体细胞引入该对象。监测给予对象以供治疗对象的疾病或病症的因子水平的方法包括：
(a)将以下多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达水平表明给予以供治疗的因子的水平。
本发明的另一方面涉及检测接受器官或组织移植的对象中移植排斥的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表明检测到移植排斥。
本发明的另一实施方式涉及监测接受器官或组织移植的对象中移植排斥进展的方法，包括：
(a)将以下多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞；(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平表明所述对象中所述移植排斥的进展。
可采用检测和监测移植物受者中移植排斥的方法监测所移植器官或组织的活力。能检测移植排斥的发作使得医学工作者能据此调整移植患者的治疗方法，例如调整免疫抑制治疗的水平。与采取定期组织活检来寻找组织损伤的目前方法相比，本发明方法的灵敏度能更早检测排异。更早检测对象中排异发生可更快作出反应并避免进一步损伤移植器官或组织。这些方法可用于任何器官或组织移植，包括但不限于：心脏、肾脏、肺、肝脏、胰腺、小肠和大肠、皮肤、角膜、骨髓、韧带、肌腱、神经组织和干细胞移植。
在本发明的方法中，基因开关包含一个或多个移植期间活化的诊断开关启动子，即排异启动子。排异启动子是当排异过程开始发生时在移植的器官或组织中活化的任何启动子。可用于本发明的排异启动子的例子包括但不限于：表4所列基因的启动子，连同排异期间检测到其中表达增加的器官。
表4
| 基因 | 器官/组织 |
| 解联蛋白和金属蛋白酶17(ADAM17) | 肾脏 |
| 解联蛋白和金属蛋白酶19(ADAM19) | 肾脏 |
| AGT | 肾脏 |
| 同种异体移植物炎性因子-1(AIF-1) | 肝脏 |
| 血管紧张素II型1受体(AGTR1) | 心脏 |
| APAF1 | 肠 |
| β2-防卫素 | 肺 |
| 脑钠尿肽 | 心脏 |
| C-反应活性蛋白(CRP) | 肝脏 |
| C3 | 肾脏 |
| 基因 | 器官/组织 |
| CCL1 | 心脏 |
| CCL3 | 心脏 |
| CCL4 | 心脏 |
| CCL5 | 心脏 |
| CCR5 | 心脏 |
| CD3 | 肾脏 |
| CD95 | 肝脏 |
| CD95配体 | 肝脏，心脏 |
| CD103 | 肾脏 |
| 免疫反应的细胞介质(MIR) | 心脏 |
| CFLAR | 心脏 |
| 趋化因子(C-X-C基序)配体9(CXCL9) | 心脏 |
| 胶原IX型α3 | 肾脏 |
| 胶原酶 | 肺 |
| 结缔组织生长因子(CTGF) | 肾脏 |
| CX3CR1 | 心脏 |
| CXCR3 | 胰腺，心脏，肾脏 |
| 环加氧酶-2(COX-2) | 肾脏，心脏 |
| 早期生长反应基因-1(EGR-1) | 肺，心脏 |
| ENA 78 | 心脏 |
| 基因 | 器官/组织 |
| 嗜伊红粒细胞趋化蛋白 | 角膜 |
| 表皮生长因子受体(EGFR) | 肾脏 |
| EPST11 | 肠 |
| Fas | 心脏 |
| Fas配体 | 肾脏，心脏，胰腺 |
| Fork-Head活化素信号转导蛋白-1(FAST-1) | 心脏 |
| FOXP3 | 肾脏 |
| CX3C趋化因子 | 肾脏，心脏 |
| γ2 | 肾脏 |
| 颗粒溶素 | 肾脏 |
| 粒酶B | 肾脏，胰腺，肠，心脏，肺 |
| 热激蛋白-60(HSP-60) | 肠 |
| 热激蛋白-70(HSP-70) | 肠 |
| 肝细胞生长因子(HGF) | 心脏 |
| IF127 | 肠 |
| 整联蛋白-α4(ITGA4) | 心脏 |
| 干扰素-γ | 肾脏，肠，心脏 |
| 干扰素-诱导型蛋白10(IP-10；CXCL10) | 肾脏，心脏，胰腺 |
| 白介素-2(IL-2) | 心脏 |
| 白介素-2受体(IL-2R) | 肠 |
| 基因 | 器官/组织 |
| 白介素-4(IL-4) | 肾脏 |
| 白介素-15(IL-15) | 心脏，肺 |
| 白介素-18(IL-18) | 肾脏 |
| 胞间粘附分子-1(ICAM-1) | 肾脏 |
| 层粘连蛋白 | 肾脏 |
| LAP3 | 肠 |
| 巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2) | 角膜 |
| MADCAM-1 | 肠 |
| 基质金属蛋白酶-2(MMP-2) | 肠，肾脏 |
| 基质金属蛋白酶-9(MMP-9) | 肾脏，肠 |
| 基质金属蛋白酶-11(MMP-11) | 肾脏 |
| 基质金属蛋白酶-12(MMP-12) | 肾脏 |
| 基质金属蛋白酶-14(MMP-14) | 肾脏 |
| MDK | 肠 |
| MIG | 胰腺，心脏 |
| MIP-1α | 角膜，胰腺，心脏，肾脏 |
| MIP-1β | 角膜，心脏 |
| 单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) | 角膜，胰腺，心脏 |
| 单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2) | 心脏 |
| MUC2 | 肠 |
| 基因 | 器官/组织 |
| MUC4 | 肠 |
| NKG2D | 肾脏 |
| p16(INK4a) | 肾脏 |
| p21(WAF/CIP1) | 肾脏 |
| p27(Kip1) | 肾脏 |
| 穿孔素 | 肾脏，胰腺，肠，心脏 |
| 程序性细胞死亡(PDCD1) | 心脏 |
| RANTES | 角膜，胰腺，肾脏，心脏 |
| RAS同源基因家族，成员U(RHOU) | 心脏 |
| 脑信号蛋白7A(SEMA7A) | 心脏 |
| 丝氨酸蛋白酶抑制剂-9(PI-9) | 肾脏 |
| SOD2 | 心脏 |
| STK6 | 肠 |
| 表面活性蛋白-C(SP-C) | 肾脏 |
| TIAF-1 | 肾脏，肝脏 |
| TIM-3 | 肾脏 |
| 金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1) | 肾脏 |
| 金属蛋白酶-2的组织抑制剂(TIMP-2) | 肾脏 |
| 转化生长因子-β1(TGF-β1) | 肠，肾脏，心脏 |
| 转化生长因子I型受体 | 肠 |
| 基因 | 器官/组织 |
| 肿瘤坏死因子-α(TNF-α) | 肠，心脏，肾脏 |
| 尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA) | 肾脏 |
| 尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体(uPAR) | 肾脏 |
| 血管细胞粘附分子-1(VCAM-1) | 肾脏，肺 |
| 血管活性肠肽(VIP) | 肠 |
| WD重复结构域40A(WDR40A) | 心脏 |
| XCL1 | 心脏 |
在本发明的一个实施方式中，先将包含排异启动子的多核苷酸给予待移植的器官或组织，再进行移植。用于移植的器官和组织通常必须在自供者取出后的24-48小时内移植入受者。在一个实施方式中，在自供者取出的48小时内，例如自供者取出的36、24、18、12或6小时内将本发明的多核苷酸给予器官或组织。在另一实施方式中，在移植入受者前至少48小时，例如在移植前至少36、24、18、12或6小时将多核苷酸给予器官或组织。可将多核苷酸引入待移植的器官或组织内的一个位置或多个位置，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位置。
在另一实施方式中，在器官或组织移植入对象后，例如移植后2、4、6、8、10、12、或18小时，1、2、3、4、5、或6天，或1、2、3、或4周或更长时间给予多核苷酸。
可通过上述的任何方式，包括直接注射、电穿孔、病毒递送等将多核苷酸给予器官或组织。在其它实施方式中，可将多核苷酸作为转基因细胞，例如转基因干细胞的一部分给予。可从移植物供者或移植物受者分离细胞。例如，可从需要移植物的患者分离干细胞，并将本发明多核苷酸引入该干细胞。然后可保存(例如，冷冻)转基因细胞直至器官或组织用于移植。然后可在移植前或后将转基因细胞给予器官或组织。
在进一步的实施方式中，可通过将本发明多核苷酸引入非自体细胞，例如所移植器官或组织的同种异体或异种细胞来实施检测移植排斥的方法，并先将该修饰的非自体细胞引入器官或组织，再移植。
在本发明的一个实施方式中，基因开关包含操作性连接于转录因子序列的一个排异启动子。在另一实施方式中，基因开关包含操作性连接于共同编码配体-依赖性转录因子的两个不同转录因子序列的两个排异启动子。这两个排异启动子可以相同或不同。
在另一实施方式中，基因开关还包含调节调控蛋白质表达的启动子，该蛋白可用于监测基因开关的功能，即，显示基因开关在其环境中适当操作，例如未发生基因沉默。调控蛋白的表达可用于减少诊断开关的假阴性结果。在一个实施方式中，连接于调控蛋白的启动子是组成型启动子，因此该调控蛋白总得到表达。在不同的实施方式中，连接于调控蛋白的启动子是不同于基因开关中存在的排异启动子的开关启动子。调控蛋白可以是结合启动子的配体-依赖性转录因子，所述启动子操作性连接于不同于第一报道基因的第二报道基因。例如，调控蛋白可以是一种配体-依赖性转录因子，其DNA结合结构域不同于排异启动子表达的转录因子并识别操作性连接于第二报道基因的启动子中的反应元件，如图4所示。
在检测或监测移植排斥的一个实施方式中，报道基因是上述任何报道基因。在另一实施方式中，报道基因编码分泌型蛋白质，例如不难在移植物受者的血液或尿液样品中检测的蛋白质。在另一实施方式中，报道基因编码移植物受者的内源性蛋白质，例如通常在低水平表达的蛋白质，从而能在排异发作后检测到报道基因表达升高。
一旦将本发明多核苷酸给予器官或组织移植物，可通过检测报道基因表达实施检测或监测移植排斥的方法。在一个实施方式中，可一次检测报道基因表达的水平。在另一实施方式中，可多次检测报道基因表达水平，例如通常是每1、2、3、4、5、6天，1、2、3、4周或每1、2、3、4、5、6或更多个月一次。在要检测的各时间点，没有配体存在时检测报道基因表达可获得表达的背景水平，有配体存在时检测可获得报道基因因排异启动子的活化作用所致的表达水平。在一个实施方式中，在移植后不久(例如，在1、2、3、4、5、6天或1、2、3或4周内)测定有配体存在下的报道基因表达水平，从而在任何移植排斥发生前获得报道基因的配体-诱导的基线表达水平。可利用初始时间点(或任何随后的时间点)测定必须给予对象多少配体以及配体必须存在多长时间以获得可检测的报道基因表达。可视需要为各对象调节剂量和时间。然后可常规监测配体诱导的报道基因表达来检测报道基因表达中的任何增加，其表示移植排斥。
如果基因开关中存在编码调控蛋白的多核苷酸(组成型或诱导型)，可同时检测调控蛋白或调控蛋白诱导的报道基因的水平以证实基因开关适当起作用。如果基因开关作用不佳，可能需要增加配体浓度或配体给予和报道基因检测之间的时间以增加基因开关的信号。在另一实施方式中，如果基因开关不再起作用，可给予器官或组织移植物额外的多核苷酸，从而能继续监测移植排斥。
在进一步的实施方式中，一旦检测到表示存在移植排斥的报道基因表达中增加，可采用常规方法证实该诊断，例如获得移植组织的活检样品。
本发明的一个实施方式涉及制备器官或组织移植物以供检测对象中移植排斥的方法，包括将以下多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的另一实施方式涉及检测接受器官或组织移植物的对象中移植排斥的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象；和
(b)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表明检测到移植排斥；和
其中所述器官或组织移植物包含含有以下多核苷酸的一个或多个细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明的一个实施方式涉及制备器官或组织移植物以供监测对象中移植排斥进展的方法，包括将以下多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
本发明另一实施方式涉及监测接受器官或组织移植物的对象中移植排斥进展的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象；和
(b)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平表明所述对象中所述移植排斥的进展；和
其中所述器官或组织移植物包含含有以下多核苷酸的一个或多个细胞：(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个操作性连接于诊断开关启动子的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
在进一步的实施方式中，可通过将本发明多核苷酸引入非自体细胞，例如所移植器官或组织的同种异体或异种细胞来实施监测移植排斥的方法，并先将该修饰的非自体细胞引入器官或组织，再移植。
在上述方法的一个实施方式中，编码基因开关和报道基因的多核苷酸之一或二者可以是给予对象的治疗性载体(例如，用于基因治疗的编码治疗性因子(蛋白或核酸)的载体)的一部分。在该实施方式中，因子和监测该因子水平的诊断性测试在一个单位中一起给予，从而确保接受治疗的所有细胞也接受诊断基因开关。
对于上述各方法，在一个实施方式中，编码基因开关的多核苷酸和编码与启动子相连的报道基因的多核苷酸是较大多核苷酸，例如载体的一部分。在另一实施方式中，编码基因开关的多核苷酸和编码与启动子相连的报道基因的多核苷酸是不同的多核苷酸。
在一方面，本发明涉及可用于本发明方法的多核苷酸。在一个实施方式中，该多核苷酸编码基因开关，所述基因开关包含至少一个操作性连接于诊断开关启动子的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受到调节。在另一实施方式中，该多核苷酸还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。在一个实施方式中，基因开关是基于EcR的基因开关。在另一实施方式中，基因开关包含第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。在一个实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。在另一实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。在另一实施方式中，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。在进一步的实施方式中，所述多核苷酸还编码致死性多肽，所述致死性多肽的编码序列操作性连接于诱导型启动子。
在一方面，本发明涉及编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的该细胞中发现的因子的调节。在另一实施方式中，该多核苷酸还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。在一个实施方式中，基因开关是基于EcR的基因开关。在另一实施方式中，基因开关包含第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。在一个实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。在另一实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。在另一实施方式中，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。在进一步的实施方式中，所述多核苷酸还编码致死性多肽，所述致死性多肽的编码序列操作性连接于诱导型启动子。
在一方面，本发明涉及编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节。在另一实施方式中，该多核苷酸还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。在一个实施方式中，基因开关是基于EcR的基因开关。在另一实施方式中，基因开关包含第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。在一个实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。在另一实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。在另一实施方式中，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。在进一步的实施方式中，所述多核苷酸还编码致死性多肽，所述致死性多肽的编码序列操作性连接于诱导型启动子。
在一方面，本发明涉及编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节。在另一实施方式中，该多核苷酸还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。在一个实施方式中，基因开关是基于EcR的基因开关。在另一实施方式中，基因开关包含第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。在一个实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。在另一实施方式中，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。在另一实施方式中，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。在进一步的实施方式中，所述多核苷酸还编码致死性多肽，所述致死性多肽的编码序列操作性连接于诱导型启动子。
本发明的另一方面涉及包含上述多核苷酸的载体。在一个实施方式中，所述载体是质粒载体或病毒载体。在一个实施方式中，所述多核苷酸存在于同一载体上。在进一步的实施方式中，所述多核苷酸各自处于不同载体上。所述不同载体可以是相同载体(例如，相同质粒)、相同类型的载体(例如，均是质粒，但不是相同的质粒)或是不同类型的载体(例如，一个载体是质粒，另一载体是病毒)。
在另一方面，本发明提供可与本发明方法联用的试剂盒。本发明该方面的试剂盒可装有一个或多个容器，其可包含一种或多种选自下组的组分：一种或多种核酸分子、限制性酶和一种或多种包含这种核酸分子的细胞。本发明试剂盒还可装有一个或多个含有适于培养本发明细胞的细胞培养基的容器，一个或多个含有适合在本发明培养细胞中使用的抗生素的容器，一个或多个含有缓冲液的容器，一个或多个含有转染试剂的容器，一个或多个含有酶反应底物和/或基因开关活化的配体的容器。
本发明试剂盒可装有各种可用于本发明的核酸分子。本发明试剂盒中提供的核酸分子的例子包括含有以下的那些核酸分子：启动子、编码基因开关的序列、增强子、阻遏子、选择标记、转录信号、翻译信号、引物杂交位点(例如，用于测序或PCR)、重组位点、限制性位点和聚合接头、在有阻遏tRNA存在下阻止翻译终止的位点、阻遏tRNA编码序列、编码结构域和/或区域的序列，复制起点、端粒酶、着丝粒，等等。在一个实施方式中，试剂盒可装有包含基因开关而没有任何诊断开关启动子的多核苷酸，该多核苷酸适于插入任何感兴趣的诊断开关启动子。除上述多核苷酸外，本发明核酸分子可包含这些元件中的任一种或多种。
本发明试剂盒可装有细胞。这些细胞可包含本发明的多核苷酸，或者所述细胞和多核苷酸可装在不同容器中。在一个实施方式中，所述细胞可以是自体细胞，例如为特定对象设计的试剂盒的一部分。在另一实施方式中，所述细胞可以是非自体细胞，例如为任何对象设计的试剂盒的一部分。
本发明试剂盒可装有包含一种或多种重组蛋白的容器。合适的重组蛋白包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Cin、Tn3解离酶、ΦC31、TndX、XerC和XerD。其它合适的重组位点和蛋白质是可从加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)购得的GATEWAYTM克隆技术相关的那些，并描述于通过引用全文纳入本文的GATEWAYTM克隆技术的产品文献中(E版，2003年9月22日)。
本发明的试剂盒还可提供引物。通常将这些引物设计成能与具有特异性核苷酸序列的分子退火。例如，可将这些引物设计成用于PCR中以扩增特定核酸分子。试剂盒还可提供测序引物。
本发明试剂盒可提供一种或多种缓冲剂(例如，1、2、3、4、5、8、10、15种)。这些缓冲剂可以工作浓度提供或以浓缩形式提供，随后稀释至工作浓度。这些缓冲剂常含有盐、金属离子、辅因子、金属离子螯合剂等以便增强缓冲剂本身或缓冲剂分子的活性或稳定性。此外，这些缓冲剂可以干燥或水性形式提供。当缓冲剂以干燥形式提供时，通常先将它们通常溶解于水中再使用。
实际上，本发明试剂盒可含有上述或本文它处所述组分的任何组合。本领域技术人员应知道可依据试剂盒所需的应用来改变本发明试剂盒提供的组分。因此，可将试剂盒设计成能执行本申请所述的各种功能，而这种试剂盒的组分也据此而变。
本发明还涉及实施一种或多种本发明方法的使用说明书。这种使用说明书可指导用户适合实施本发明方法的条件。本发明的使用说明书可以是有形的，例如书面使用说明书(例如，打印在纸上)，或者可以是无形的，例如经由计算机磁盘或从因特网上获得。
应该知道无需提供利用试剂盒实施本发明方法的完整使用说明书或者使用说明书包括在试剂盒中。例如，本发明试剂盒未装有这种全长使用说明书的情况是所提供的指示告知试剂盒的用户从哪里可获得实施使用该试剂盒的方法的使用说明书。因此，可从因特网页，单独出售或分发的手册或其它产品文献等获得实施本发明方法的使用说明书。因此，本发明包括的试剂盒可指示试剂盒用户到一个或多个地点获得未随该试剂盒直接包装和/或分发的使用说明书。这种使用说明书可以是任何形式，包括但不限于电子或打印形式。
现在已完全描述了本发明，本领域普通技术人员应该知道可在广泛而等价的条件、制剂和其它参数中作出相同发明而不影响本发明或其任何实施方式的范围。本文引用的所有专利、专利申请和出版物通过引用全文纳入本文。
实施例
实施例1
图5所示载体包含IL-24/mda-7启动子(SEQ ID NO：5)。利用腺病毒穿梭载体产生的腺病毒用于转导从淋巴样品分离的细胞。将转导细胞分成两组，分别在有或没有活化配体存在下培养。然后破碎两组细胞，得到的细胞裂解液用于萤光素酶测定。
实施例2
图6所示载体包含TRPM4和TRGC1/TARP启动子(SEQ ID NO：6)。利用非病毒转导系统，用DNA载体转导前列腺活检样品。将转导的活检样品分成两组，分别在有或没有活化配体存在下培养。然后匀浆两组活检组织，得到的裂解液用于萤光素酶测定。
实施例3
图7所示载体包含ADAM-17启动子(SEQ ID NO：7)和CD95-ADAM8报道基因(SEQ ID NO：10-11)。利用腺病毒穿梭载体产生的腺病毒用于转导供者肾脏的一部分，然后移植。移植后，在医师规定的时期中检验血清样品的报道基因。试验方案包括检验未接触活化配体的样品的报道基因表达。抽取未活化组的血液后，立即给予配体，进行24小时，然后停止；在配体处理完成前1小时内抽取另一份血液样品。比较配体处理和未处理样品之间的报道基因试验结果。重复该过程之前必须等待60小时。
实施例4
图8所示载体包含CXCL9和SEMA7A启动子(SEQ ID NO：8)和CD40-CD3报道基因(SEQ ID NO：12-13)。该载体用于转导供者心脏的一部分，然后通过直接针头注射移植。移植后，在医师规定的时期中检验血清样品的报道基因。试验方案包括检验未接触活化配体的样品的报道基因表达。抽取未活化组的血液后，立即给予配体，进行24小时，然后停止；在配体处理完成前1小时内抽取另一份血液样品。比较配体处理和未处理样品之间的报道基因试验结果。重复该过程之前必须等待60小时。
实施例5
图9所示载体包含ADAM-17启动子和碱性磷酸酶-c末端CD40报道基因(SEQ ID NO：14)。利用腺病毒穿梭载体产生的腺病毒用于转导原代猪肾脏细胞。然后在移植前，将得到的细胞移植入供者肾脏。移植后，在医师规定的时期中检验血清样品的报道基因。试验方案包括检验未接触活化配体的样品的报道基因表达。抽取未活化组的血液后，立即给予配体，进行24小时，然后停止；在配体处理完成前1小时内抽取另一份血液样品。比较配体处理和未处理样品之间的报道基因试验结果。重复该过程之前必须等待60小时。
序列表
<110>英特瑞克斯顿股份有限公司(INTREXON CORPORATION)
R.P.比奇(BEECH，Robert P.)
T.D.里德(REED，Thomas D.)
R.帕特兹格(PATZIG，Robert)
<120>诊断疾病的方法和组合物
<130>2584.009PC03
<140>PCT/US2008/010040
<141>2008-08-25
<150>US 61/047,940
<151>2008-04-25
<150>US 61/014,654
<151>2007-12-18
<150>US 60/957,474
<151>2007-08-23
<160>23
<170>PatentIn 3.3版
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的蜕皮素受体
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>X是甘氨酸或苏氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>X是半胱氨酸或丙氨酸
<400>1
Arg Arg Gly Xaa Thr Cys Ala Asn Thr Gly Ala Xaa Cys Tyr Tyr
1 5 10 15
<210>2
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的蜕皮素受体
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n可以是任何核苷酸
<400>2
aggtcanagg tca 13
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的蜕皮素受体
<400>3
gggttgaatg aattt 15
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的归巢核酸内切酶(HE)，称为I-SceI
<400>4
tagggataac agggtaat 18
<210>5
<211>13028
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成启动子
<400>5
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 60
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca 120
agaaaattaa tcgcaccggt atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcag 180
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cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag aggaagtgaa atctgaataa 660
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agctaactat aacggtccta aggtagcgac cgcggagact aggtgtattt atctaagcga 780
tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt 840
tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca 900
aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta 960
tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct ccaattgcgg agtactgtcc 1020
tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc 1080
gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc 1140
tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg 1200
caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt 1260
ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt acaacaaatg tttgttcctg 1320
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cagcgccatt ctacccactc gaagacggga ccgctggcga gcagctgcac aaagccatga 1500
agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg cctttaccga cgcacatatc gaggtggaca 1560
ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg ttcggctggc agaagctatg aagcgctatg 1620
ggctgaatac aaaccatcgg atcgtggtgt gcagcgagaa tagcttgcag ttcttcatgc 1680
ccgtgttggg tgccctgttc atcggtgtgg ctgtggcccc agctaacgac atctacaacg 1740
agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca gccagcccac cgtcgtattc gtgagcaaga 1800
aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa agaagctacc gatcatacaa aagatcatca 1860
tcatggatag caagaccgac taccagggct tccaaagcat gtacaccttc gtgacttccc 1920
atttgccacc cggcttcaac gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac cgggacaaaa 1980
ccatcgccct gatcatgaac agtagtggca gtaccggatt gcccaagggc gtagccctac 2040
cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc atgcccgcga ccccatcttc ggcaaccaga 2100
tcatccccga caccgctatt ctcagcgtgg tgccatttca ccacggcttc ggcatgttca 2160
ccacgctggg ctacttgatc tgcggctttc gggtcgtgct catgtaccgc ttcgaggagg 2220
agctattctt gcgcagcttg caagactata agattcaatc tgccctgctg gtgcccacac 2280
tatttagctt cttcgctaag agcactctca tcgacaagta cgacctaagc aacttgcacg 2340
agatcgccag cggcggagcg cctctcagca aggaggtagg tgaggccgtg gccaaacgct 2400
tccacctacc aggcatccgc cagggctacg gcctgacaga aacaaccagc gccattctga 2460
tcacccccga aggggacgac aagcctggcg cagtaggcaa ggtggtgccc ttcttcgagg 2520
ctaaggtggt ggacttggac acaggtaaga ccctgggtgt gaaccagcgc ggcgagctgt 2580
gcgtccgtgg ccccatgatc atgagcggct acgtgaacaa ccccgaggct acaaacgctc 2640
tcatcgacaa ggacggctgg ctgcacagcg gcgacatcgc ctactgggac gaggacgagc 2700
acttcttcat cgtggaccgg ctcaagagcc tgatcaaata caagggctac caggtagccc 2760
cagccgaact ggagagcatc ctgctgcaac accccaacat cttcgacgcc ggggtcgctg 2820
gcctgcccga cgacgatgct ggcgagctgc ccgccgcagt cgtcgtgctg gaacacggta 2880
aaaccatgac cgagaaggag atcgtggact atgtggccag ccaggttaca accgccaaga 2940
agctgcgcgg tggtgttgtg ttcgtggacg aggtgcctaa aggactgacc ggcaagttgg 3000
acgcccgcaa gatccgcgag attctcatta aggccaagaa gggcggcaag atcgccgtgt 3060
aaatcgattg cgcaaagctt tcgcgatagg cgagaccaat gggtgtgtac gtagcggccg 3120
cgtcgacgat agcttgatgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc 3180
ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag ttgcatcatt 3240
ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt atggagcaag 3300
gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct attgggaacc aagctggagt 3360
gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct gggttcaagc gattctcctg 3420
cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga ccaggctcag ctaatttttg 3480
tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc tggtctccaa ctcctaatct 3540
caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg aaccactgct 3600
cccttccctg tccttctgat tttaaaataa ctataccagc aggaggacgt ccagacacag 3660
cataggctac ctggccatgc ccaaccggtg ggacatttga gttgcttgct tggcactgtc 3720
ctctcatgcg ttgggtccac tcagtagatg cctgttgaat tctgatttaa atcggtccgc 3780
gtacggcgtg gtaggtccga acgaatccat ggattaccct gttatcccta tccggagtta 3840
acctcgagga cttcggaact tctagaacca gaccgttcag tttaaacgct cttctccccc 3900
tcgagccata tggtctcagt cacaactact catctctgcc tctgtagcac gaaagcaatt 3960
agcaacaata tgtcaacaaa catatgtgac cccatgaaaa ctttatttat tatggatacg 4020
gaaacctgaa aataatgtct ttcttttgat tttttcccca atcattaaaa aacgtaaaaa 4080
ctactcttag gtcgcaaggt taagccattc tcagcttggc agtggcaggc tggatttggc 4140
ttgtgaccta cagttggcca atccctgatt cccaaaatgt attcctcagg gatgtgggca 4200
aatacttatg ggaagtgctg gattaaacag agttaagaag catcagacat ttccaggacg 4260
ggctagcaca tgccagggct ctctaactga cctcattgga ttcatctgtt tcatggagga 4320
tcttgcaaga caagaattcc tcaaacctag agtctgagga ctgtgctttg ggaaacactg 4380
ctctgcttga tgccctcact gggcacatgg tagaatctgg agctgagtgc cttgctagct 4440
ggagataggg tcagagctct tgactgccct ggcagtcttg acacatcacg ctgtctgtgt 4500
cccctgagtg gttcagagct acacaggcca agactagccc accagagcac caggcctccc 4560
agctttctgg gcttgtccat gcgtacattt ccttattctt cctggtttcc agaacctaag 4620
gagaggcaca ttttggttga gtgattataa ccctagggac catgggtagc tgcatgtcag 4680
gaaacactcc tcaacttcct ggccctgatg gattaaagga gaggtactta caggttattt 4740
cttcgctgtg gactactgtc ccagcatgaa tagggcatca ttattgaatt attttgacag 4800
gaaggagact ggtgtatgct gcacagtaat aatgtattta catgtgtaca gagtttacca 4860
agcacctctg tgttgttttt gcctttgttt attacacttg ggacaaattt ttaaaattta 4920
tacatgcaga gactgcagcg cagagaagct aagagacttg cccctgccca cacagccagt 4980
ggtagagcct gaactcaaac ccaggtctca tctcacctca ggggctgctt tccccatcgc 5040
tgtattgtcc ttaaagtgat gggtgactag gcaatgaagt aattctctag gaaagcatga 5100
ccaatttccc tttctccacc tccctctttt tcctccaccc ctcccccatc agcccccata 5160
tatatgccca aatctccaca aagccttgct tgcctgcaaa cctttacttc tgaaatgact 5220
tccacgcatg cggggggggg ggggggcaat tggccaccat gggccccaag aagaaaagga 5280
aggtggcccc ccccaccgac gtgagcctgg gcgacgagct gcacctggac ggcgaggacg 5340
tggccatggc ccacgccgac gccctggacg acttcgacct ggacatgctg ggcgacggcg 5400
acagccccgg ccccggcttc accccccacg acagcgcccc ctacggcgcc ctggacatgg 5460
ccgacttcga gttcgagcag atgttcaccg acgccctggg catcgacgag tacggcggcc 5520
atatggagat gcccgtggac aggattctgg aggccgaact cgccgtggag cagaaaagcg 5580
accagggcgt ggagggcccc ggcggaaccg gcggcagcgg cagcagcccc aacgaccccg 5640
tgaccaacat ctgccaggcc gccgacaagc agctgttcac cctggtggag tgggccaaga 5700
ggattcccca cttcagcagc ctgcccctgg acgaccaggt gatcctgctg agggccggat 5760
ggaacgagct gctgatcgcc agcttcagcc acaggagcat cgacgtgagg gacggcatcc 5820
tgctggccac cggcctgcac gtccatagga acagcgccca cagcgccgga gtgggcgcca 5880
tcttcgacag ggtgctgacc gagctggtga gcaagatgag ggacatgagg atggacaaga 5940
ccgagctggg ctgcctgagg gccatcatcc tgttcaaccc cgaggtgagg ggcctgaaaa 6000
gcgcccagga ggtggagctg ctgagggaga aggtgtacgc cgccctggag gagtacacca 6060
ggaccaccca ccccgacgag cccggcagat tcgccaagct gctgctgagg ctgcccagcc 6120
tgaggagcat cggcctgaag tgcctggagc acctgttctt cttcaggctg atcggcgacg 6180
tgcccatcga caccttcctg atggagatgc tggagagccc cagcgacagc tgagccggca 6240
actcgctgta gtaattccag cgagaggcag agggagcgag cgggcggcgg gctagggtgg 6300
aggagcccgg cgagcagagc tgcgctgcgg gcgtcctggg aagggagatc cggagcgaat 6360
agggggcttc gcctctggcc cagccctccc gctgatcccc cagccagcgg tgcgcaaccc 6420
tagccgcatc cacgaaactt tgcccatagc agcgggcggg cactttgcac tggaacttac 6480
aacacccgag caaggacgcg actctcccga cgcggggagg ctattctgcc catttgggga 6540
cacttccccg ccgctgccag gacccgcttc tctgaaaggc tctccttgca gctgcttaga 6600
cgctggattt ttttcgggta gtggaaaacc agcagcctcc cgcgaccaga tctgccacca 6660
tgaagctgct gagcagcatc gagcaggctt gcgacatctg caggctgaag aagctgaagt 6720
gcagcaagga gaagcccaag tgcgccaagt gcctgaagaa caactgggag tgcagataca 6780
gccccaagac caagaggagc cccctgacca gggcccacct gaccgaggtg gagagcaggc 6840
tggagaggct ggagcagctg ttcctgctga tcttccccag ggaggacctg gacatgatcc 6900
tgaagatgga cagcctgcaa gacatcaagg ccctgctgac cggcctgttc gtgcaggaca 6960
acgtgaacaa ggacgccgtg accgacaggc tggccagcgt ggagaccgac atgcccctga 7020
ccctgaggca gcacaggatc agcgccacca gcagcagcga ggagagcagc aacaagggcc 7080
agaggcagct gaccgtgagc cccgagtttc ccgggatcag gcccgagtgc gtggtgcccg 7140
agacccagtg cgccatgaaa aggaaggaga agaaggccca gaaggagaag gacaagctgc 7200
ccgtgagcac caccaccgtc gatgaccaca tgccccccat catgcagtgc gagccccccc 7260
cccccgaggc cgccaggatt cacgaggtcg tgcccaggtt cctgagcgac aagctgctgg 7320
tgaccaacag gcagaagaac atcccccagc tgaccgccaa ccagcagttc ctgatcgcca 7380
ggctgatctg gtatcaggac ggctacgagc agcccagcga cgaggacctg aaaaggatca 7440
cccagacctg gcagcaggcc gacgacgaga acgaggagag cgacaccccc ttcaggcaga 7500
tcaccgagat gaccatcctg accgtgcagc tgatcgtgga gttcgccaag ggcctgcccg 7560
gattcgccaa gatcagccag cccgaccaga tcaccctgct gaaggcttgc agcagcgagg 7620
tgatgatgct gagggtggcc aggaggtacg acgccgccag cgacagcatc ctgttcgcca 7680
acaaccaggc ttacaccagg gacaactaca ggaaggctgg catggccgag gtgatcgagg 7740
acctcctgca cttctgcaga tgtatgtaca gcatggccct ggacaacatc cactacgccc 7800
tgctgaccgc cgtggtgatc ttcagcgaca ggcccggcct ggagcagccc cagctggtgg 7860
aggagatcca gaggtactac ctgaacaccc tgaggatcta catcctgaac cagctgagcg 7920
gcagcgccag gagcagcgtg atctacggca agatcctgag catcctgagc gagctgagga 7980
ccctgggaat gcagaacagc aatatgtgta tcagcctgaa gctgaagaac aggaagctgc 8040
cccccttcct ggaggagatt tgggacgtgg ccgacatgag ccacacccag ccccccccca 8100
tcctggagag ccccaccaac ctgtgaatcg attagacatg ataagataca ttgatgagtt 8160
tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgctta atttgtgaaa tttgtgatgc 8220
tattgcttaa tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaataaaa catttgcatt 8280
cattttatgt ttcaggttca gggggagatg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 8340
tacaaatgtg gtatctagag ctcttccaaa tagatctgga aggtgctgag gtacgatgag 8400
acccgcacca ggtgcagacc ctgcgagtgt ggcggtaaac atattaggaa ccagcctgtg 8460
atgctggatg tgaccgagga gctgaggccc gatcacttgg tgctggcctg cacccgcgct 8520
gagtttggct ctagcgatga agatacagat tgaggtactg aaatgtgtgg gcgtggctta 8580
agggtgggaa agaatatata aggtgggggt cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca 8640
gccgccgccg ccatgagcac caactcgttt gatggaagca ttgtgagctc atatttgaca 8700
acgcgcatgc ccccatgggc cggggtgcgt cagaatgtga tgggctccag cattgatggt 8760
cgccccgtcc tgcccgcaaa ctctactacc ttgacctacg agaccgtgtc tggaacgccg 8820
ttggagactg cagcctccgc cgccgcttca gccgctgcag ccaccgcccg cgggattgtg 8880
actgactttg ctttcctgag cccgcttgca agcagtgcag cttcccgttc atccgcccgc 8940
gatgacaagt tgacggctct tttggcacaa ttggattctt tgacccggga acttaatgtc 9000
gtttctcagc agctgttgga tctgcgccag caggtttctg ccctgaaggc ttcctcccct 9060
cccaatgcgg tttaaaacat aaataaaaaa ccagactctg tttggatttg gatcaagcaa 9120
gtgtcttgct gtctttattt aggggttttg cgcgcgcggt aggcccggga ccagcggtct 9180
cggtcgttga gggtcctgtg tattttttcc aggacgtggt aaaggtgact ctggatgttc 9240
agatacatgg gcataagccc gtctctgggg tggaggtagc accactgcag agcttcatgc 9300
tgcggggtgg tgttgtagat gatccagtcg tagcaggagc gctgggcgtg gtgcctaaaa 9360
atgtctttca gtagcaagct gattgccagg ggcaggccct tggtgtaagt gtttacaaag 9420
cggttaagct gggatgggtg catacgtggg gatatgagat gcatcttgga ctgtattttt 9480
aggttggcta tgttcccagc catatccctc cggggattca tgttgtgcag aaccaccagc 9540
acagtgtatc cggtgcactt gggaaatttg tcatgtagct tagaaggaaa tgcgtggaag 9600
aacttggaga cgcccttgtg acctccaaga ttttccatgc attcgtccat aatgatggca 9660
atgggcccac gggcggcggc ctgggcgaag atatttctgg gatcactaac gtcatagttg 9720
tgttccagga tgagatcgtc ataggccatt tttacaaagc gcgggcggag ggtgccagac 9780
tgcggtataa tggttccatc cggcccaggg gcgtagttac cctcacagat ttgcatttcc 9840
cacgctttga gttcagatgg ggggatcatg tctacctgcg gggcgatgaa gaaaacggtt 9900
tccggggtag gggagatcag ctgggaagaa agcaggttcc tgagcagctg cgacttaccg 9960
cagccggtgg gcccgtaaat cacacctatt accgggtgca actggtagtt aagagagctg 10020
cagctgccgt catccctgag caggggggcc acttcgttaa gcatgtccct gactcgcatg 10080
ttttccctga ccaaatccgc cagaaggcgc tcgccgccca gcgatagcag ttcttgcaag 10140
gaagcaaagt ttttcaacgg tttgagaccg tccgccgtag gcatgctttt gagcgtttga 10200
ccaagcagtt ccaggcggtc ccacagctcg gtcacctgct ctacggcatc tcgatccagc 10260
atatctcctc gtttcgcggg ttggggcggc tttcgctgta cggcagtagt cggtgctcgt 10320
ccagacgggc cagggtcatg tctttccacg ggcgcagggt cctcgtcagc gtagtctggg 10380
tcacggtgaa ggggtgcgct ccgggctgcg cgctggccag ggtgcgcttg aggctggtcc 10440
tgctggtgct gaagcgctgc cggtcttcgc cctgcgcgtc ggccaggtag catttgacca 10500
tggtgtcata gtccagcccc tccgcggcgt ggcccttggc gcgcagcttg cccttggagg 10560
aggcgccgca cgaggggcag tgcagacttt tgagggcgta gagcttgggc gcgagaaata 10620
ccgattccgg ggagtaggca tccgcgccgc aggccccgca gacggtctcg cattccacga 10680
gccaggtgag ctctggccgt tcggggtcaa aaaccaggtt tcccccatgc tttttgatgc 10740
gtttcttacc tctggtttcc atgagccggt gtccacgctc ggtgacgaaa aggctgtccg 10800
tgtccccgta tacagacttg agaggcctgt cctcgaccga tgcccttgag agccttcaac 10860
ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc 10920
ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag 10980
gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg 11040
cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg cgagaagcag 11100
gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc gttcgcgacg 11160
cgaggctgga tggccttccc cattatgatt cttctcgctt ccggcggcat cgggatgccc 11220
gcgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc atcagggaca gcttcaaggc 11280
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 11340
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 11400
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 11460
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 11520
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 11580
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 11640
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 11700
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 11760
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 11820
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 11880
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 11940
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 12000
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 12060
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 12120
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 12180
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 12240
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 12300
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 12360
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc 12420
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 12480
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 12540
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 12600
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 12660
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca 12720
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 12780
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 12840
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 12900
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 12960
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 13020
tagaaaaa 13028
<210>6
<211>12454
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成启动子
<400>6
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
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agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200
ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260
cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380
ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440
tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860
cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920
cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
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tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400
tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460
ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520
ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580
gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640
cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atcaattggc 3000
cacccccccc cccccccccg catgctgtgc cacctgtctt cattcttaac ctgaagattt 3060
agtcttttag ggtttctttt gcacttgggg tacttaacat gccactatgc atattgtaga 3120
tttatagata cttttcaact gatactgctc ccacaggcaa acatgcctgg tgaaacactt 3180
gtttcttttt ggcaaacaag aaatgtttgc ataaaagact cgtgtctgga aaaatgtctt 3240
gagaaattga tatgctactc taagccccaa atctcctttt cacttacctt ccccctgctg 3300
caggatgaca atccatgggc ctgtgctttc tgatagtgaa agagaagaaa actcataaat 3360
atagtgtcta ccatgagtca ggcactaact atgcatttat ctctttctgc tttaccctat 3420
aaatggttat taccattaaa agtcatgtga ggaaacagaa ttagggagtt caaactgagc 3480
caggatttca gttcaagttt tccagatcct cgagtaggcg agaccaatgg gtgcgccatg 3540
ggctcttcca aaaatttagg tgacactata gggcaccgct cgcacctgcg cacaggcccg 3600
cggctacaaa ctacgaacga tcattctaga taccacattt gtagaggttt tacttgcttt 3660
aaaaaacctc ccacatctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa atgttttatt 3720
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaattaagca atagcatcac aaatttcaca 3780
aattaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 3840
tatcatgtct aatcgattca caggttggtg gggctctcca ggatgggggg gggctgggtg 3900
tggctcatgt cggccacgtc ccaaatctcc tccaggaagg ggggcagctt cctgttcttc 3960
agcttcaggc tgatacacat attgctgttc tgcattccca gggtcctcag ctcgctcagg 4020
atgctcagga tcttgccgta gatcacgctg ctcctggcgc tgccgctcag ctggttcagg 4080
atgtagatcc tcagggtgtt caggtagtac ctctggatct cctccaccag ctggggctgc 4140
tccaggccgg gcctgtcgct gaagatcacc acggcggtca gcagggcgta gtggatgttg 4200
tccagggcca tgctgtacat acatctgcag aagtgcagga ggtcctcgat cacctcggcc 4260
atgccagcct tcctgtagtt gtccctggtg taagcctggt tgttggcgaa caggatgctg 4320
tcgctggcgg cgtcgtacct cctggccacc ctcagcatca tcacctcgct gctgcaagcc 4380
ttcagcaggg tgatctggtc gggctggctg atcttggcga atccgggcag gcccttggcg 4440
aactccacga tcagctgcac ggtcaggatg gtcatctcgg tgatctgcct gaagggggtg 4500
tcgctctcct cgttctcgtc gtcggcctgc tgccaggtct gggtgatcct tttcaggtcc 4560
tcgtcgctgg gctgctcgta gccgtcctga taccagatca gcctggcgat caggaactgc 4620
tggttggcgg tcagctgggg gatgttcttc tgcctgttgg tcaccagcag cttgtcgctc 4680
aggaacctgg gcacgacctc gtgaatcctg gcggcctcgg gggggggggg ctcgcactgc 4740
atgatggggg gcatgtggtc atcgacggtg gtggtgctca cgggcagctt gtccttctcc 4800
ttctgggcct tcttctcctt ccttttcatg gcgcactggg tctcgggcac cacgcactcg 4860
ggcctcccga gtttcccggg atcgctcacg gtcagctgcc tctggccctt gttgctgctc 4920
tcctcgctgc tgctggtggc gctgatcctg tgctgcctca gggtcagggg catgtcggtc 4980
tccacgctgg ccagcctgtc ggtcacggcg tccttgttca cgttgtcctg cacgaacagg 5040
ccggtcagca gggccttgat gtcttgcagg ctgtccatct tcaggatcat gtccaggtcc 5100
tccctgggga agatcagcag gaacagctgc tccagcctct ccagcctgct ctccacctcg 5160
gtcaggtggg ccctggtcag ggggctcctc ttggtcttgg ggctgtatct gcactcccag 5220
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cccccccccc cgcatgctgc ttccagaccc gcccagagca aaccggatcc tccactttcc 5400
agcctagcct ggggcggggc gaggtctggg gggcggggag tcttggagac tccaaagcgg 5460
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gggtgcagag gtccgggcct gggggagaga gacacacagg ggagactcca agggcaagcg 5580
cgagatggga acagaaggag ttgggggcca gtggcggaga gggaacagac tcagaaagga 5640
ggatgccaga cagggagggg acaatttaac ccaaagaggg ggagacaaag acttagggga 5700
cagagaatca gaaggtgggg cagcagggac ccagggatag acagagagag agggggacag 5760
agacccacag agagaggggg acagagaccc agggagaggg gacagagacc cagagagagt 5820
gggacagaga cccagagaga gtgggacaga gacccacaga gagaggggga cagagaccca 5880
gggagaggag gacagagacc cagagagggg gggacagaga cccagagagg gggggacaga 5940
gacccaggga gggggggaca gagacccagg gagaggggac agagacccac ggagaggggg 6000
acagagaccc agggagaggg gacagagacc cagagagagg gggacagaga cccagagaga 6060
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gagagagggg aacagagacc cagagagaga ggaggacaga gacccagaga gagggggaca 6180
gagacccaga gagacaggga cagagaccca gagagagggg gacagagacc cagagagagg 6240
ggaacagaga cccagagaga gaggaggaca gagacccaga gagaggggga cagagaccca 6300
gagagggggg gacagagacc cagggatggg gggacagaga cccagggaga ggggacagag 6360
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cagagactct gagacagagg gggacagaga ccctgagaga gggggacaga gacccagaga 6480
gaggggaaca gagacccaga gagagagggg gacagagacc cacagagaga ggggaacaga 6540
gacccagaga gagggggaca gagatccaca gagagagggg gacagagacc cacagagaga 6600
ggggaacaga gacccagaga gagggggaca gagatccaca gagagagggg gacagagacc 6660
cagggagagg gggacagaga cccagagaga gggggacaga gacccaggga gaggtggaca 6720
gagactctga gacagagggg gacagagact ctgagagaga gtggggacag agacccagag 6780
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caaaaaccaa agaattgggg gaagggcagg aactcagaaa ggaggggcca gagatttagg 6900
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agcgatcgct taattaaggc cggccgccgc aataaaatat ctttattttc attacatctg 7320
tgtgttggtt ttttgtgtga atccatagta ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg 7380
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ctctatccat aatgcagggg taccgggtga tgacggtgaa aacctccaat tgcggagtac 7500
tgtcctccga gcggagtact gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt 7560
cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gagtccccgg 7620
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ccctgcaggg gcgcgccacg cgtcgaagaa ggtgagtaat cttaacatgc tctttttttt 7740
tttttttgct aatccctttt gtgtgctgat gttaggatga catttacaac aaatgtttgt 7800
tcctgacagg aaaaaccttg ctgggtacct tcgttgccgg acacttcttg tcctctactt 7860
tggaaaaaag gaattgagag ccgctagcgc caccatggaa gatgccaaaa acattaagaa 7920
gggcccagcg ccattctacc cactcgaaga cgggaccgct ggcgagcagc tgcacaaagc 7980
catgaagcgc tacgccctgg tgcccggcac catcgccttt accgacgcac atatcgaggt 8040
ggacattacc tacgccgagt acttcgagat gagcgttcgg ctggcagaag ctatgaagcg 8100
ctatgggctg aatacaaacc atcggatcgt ggtgtgcagc gagaatagct tgcagttctt 8160
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caacgagcgc gagctgctga acagcatggg catcagccag cccaccgtcg tattcgtgag 8280
caagaaaggg ctgcaaaaga tcctcaacgt gcaaaagaag ctaccgatca tacaaaagat 8340
catcatcatg gatagcaaga ccgactacca gggcttccaa agcatgtaca ccttcgtgac 8400
ttcccatttg ccacccggct tcaacgagta cgacttcgtg cccgagagct tcgaccggga 8460
caaaaccatc gccctgatca tgaacagtag tggcagtacc ggattgccca agggcgtagc 8520
cctaccgcac cgcaccgctt gtgtccgatt cagtcatgcc cgcgacccca tcttcggcaa 8580
ccagatcatc cccgacaccg ctattctcag cgtggtgcca tttcaccacg gcttcggcat 8640
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gcacgagatc gccagcggcg gagcgcctct cagcaaggag gtaggtgagg ccgtggccaa 8880
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cgctggcctg cccgacgacg atgctggcga gctgcccgcc gcagtcgtcg tgctggaaca 9360
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tcattttgtc tgactaggtg tccttctata atattatggg gtggaggggg gtggtatgga 9780
gcaaggggca agttgggaag acaacctgta gggcctgcgg ggtctattgg gaaccaagct 9840
ggagtgcagt ggcacaatct tggctcactg caatctccgc ctcctgggtt caagcgattc 9900
tcctgcctca gcctcccgag ttgttgggat tccaggcatg catgaccagg ctcagctaat 9960
ttttgttttt ttggtagaga cggggtttca ccatattggc caggctggtc tccaactcct 10020
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cacagcatag gctacctggc catgcccaac cggtgggaca tttgagttgc ttgcttggca 10200
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ggacatcatc cctttagtga gggttaattc acgcagtggg tacggaacta aaggcagcac 10380
acatcgtgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctacgtctct 10440
cccccgcagt aagggctaga ttaactcgtc tcgtgaatat ccggaactcc ctttagtgag 10500
ggttaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctta 10560
atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctaccggaaa cgcttccttc 10620
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 10680
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 10740
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 10800
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 10860
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 10920
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 10980
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 11040
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 11100
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 11160
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 11220
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 11280
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 11340
atgatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg catacgagta aacttggtct 11400
gacaccgctg catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 11460
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 11520
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 11580
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 11640
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 11700
gaagcgccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaact 11760
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcggagc gttgttgcca 11820
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 11880
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 11940
tcggtcctcc gatggttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 12000
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 12060
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cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggga 12180
agcgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 12240
aacccacacg agcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 12300
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 12360
gaatactcat acgcttcctt tttcaatagt attgaagcat ttatcagggt tattgtctcg 12420
ggagcgaata catatttgaa tgtatttaga aaaa 12454
<210>7
<211>12579
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成启动子
<400>7
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 60
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca 120
agaaaattaa tcgcaccggt atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcag 180
ctagcatcat caataatata ccttattttg gattgaagcc aatatgataa tgagggggtg 240
gagtttgtga cgtggcgcgg ggcgtgggaa cggggcgggt gacgtagtag tgtggcggaa 300
gtgtgatgtt gcaagtgtgg cggaacacat gtaagcgacg gatgtggcaa aagtgacgtt 360
tttggtgtgc gccggtgtac acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta ggcggatgtt 420
gtagtaaatt tgggcgtaac cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag 480
aggaagtgaa atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaatagtgc gccggtgtac 540
acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta ggcggatgtt gtagtaaatt tgggcgtaac 600
cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag aggaagtgaa atctgaataa 660
ttttgtgtta ctcattttgt ctagggagat ccggtaccga tatcctagac aacgatgctg 720
agctaactat aacggtccta aggtagcgac cgcggagact aggtgtattt atctaagcga 780
tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt 840
tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca 900
aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta 960
tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct ccaattgcgg agtactgtcc 1020
tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc 1080
gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc 1140
tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg 1200
caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt 1260
ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt acaacaaatg tttgttcctg 1320
acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact tcttgtcctc tactttggaa 1380
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gcacatgcct caccaatagc ctcgtgcctg agaaagagaa agacggaggc ggaggctccg 1500
gcggaggcgg aagcggaggc ggaggctccg agtccctgaa actgaggaga agggtgcatg 1560
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gcacaggcca aagaaaacag ggagccggag cccctaccgc tcccggaccc ggaggctccc 1680
ccggaggcta aatcgattgc gcaaagcttt cgcgataggc gagaccaatg ggtgtgtacg 1740
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agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg 2040
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taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct ggtctccaac 2160
tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt acaggcgtga 2220
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tggccgggct cggggctcgg ggctcggggc ccggagccgg ggggggcggg gggtccgtgc 3060
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cggtagaatc ttcccagtag gcggcgcggg agggaaaaga ggattgaggg catgcggggg 3660
gggggggggg caattggcca ccatgggccc caagaagaaa aggaaggtgg ccccccccac 3720
cgacgtgagc ctgggcgacg agctgcacct ggacggcgag gacgtggcca tggcccacgc 3780
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gcagatgttc accgacgccc tgggcatcga cgagtacggc ggccatatgg agatgcccgt 3960
ggacaggatt ctggaggccg aactcgccgt ggagcagaaa agcgaccagg gcgtggaggg 4020
ccccggcgga accggcggca gcggcagcag ccccaacgac cccgtgacca acatctgcca 4080
ggccgccgac aagcagctgt tcaccctggt ggagtgggcc aagaggattc cccacttcag 4140
cagcctgccc ctggacgacc aggtgatcct gctgagggcc ggatggaacg agctgctgat 4200
cgccagcttc agccacagga gcatcgacgt gagggacggc atcctgctgg ccaccggcct 4260
gcacgtccat aggaacagcg cccacagcgc cggagtgggc gccatcttcg acagggtgct 4320
gaccgagctg gtgagcaaga tgagggacat gaggatggac aagaccgagc tgggctgcct 4380
gagggccatc atcctgttca accccgaggt gaggggcctg aaaagcgccc aggaggtgga 4440
gctgctgagg gagaaggtgt acgccgccct ggaggagtac accaggacca cccaccccga 4500
cgagcccggc agattcgcca agctgctgct gaggctgccc agcctgagga gcatcggcct 4560
gaagtgcctg gagcacctgt tcttcttcag gctgatcggc gacgtgccca tcgacacctt 4620
cctgatggag atgctggaga gccccagcga cagctgagcc ggcaactcgc tgtagtaatt 4680
ccagcgagag gcagagggag cgagcgggcg gcgggctagg gtggaggagc ccggcgagca 4740
gagctgcgct gcgggcgtcc tgggaaggga gatccggagc gaataggggg cttcgcctct 4800
ggcccagccc tcccgctgat cccccagcca gcggtgcgca accctagccg catccacgaa 4860
actttgccca tagcagcggg cgggcacttt gcactggaac ttacaacacc cgagcaagga 4920
cgcgactctc ccgacgcggg gaggctattc tgcccatttg gggacacttc cccgccgctg 4980
ccaggacccg cttctctgaa aggctctcct tgcagctgct tagacgctgg atttttttcg 5040
ggtagtggaa aaccagcagc ctcccgcgac cagatctgcc accatgaagc tgctgagcag 5100
catcgagcag gcttgcgaca tctgcaggct gaagaagctg aagtgcagca aggagaagcc 5160
caagtgcgcc aagtgcctga agaacaactg ggagtgcaga tacagcccca agaccaagag 5220
gagccccctg accagggccc acctgaccga ggtggagagc aggctggaga ggctggagca 5280
gctgttcctg ctgatcttcc ccagggagga cctggacatg atcctgaaga tggacagcct 5340
gcaagacatc aaggccctgc tgaccggcct gttcgtgcag gacaacgtga acaaggacgc 5400
cgtgaccgac aggctggcca gcgtggagac cgacatgccc ctgaccctga ggcagcacag 5460
gatcagcgcc accagcagca gcgaggagag cagcaacaag ggccagaggc agctgaccgt 5520
gagccccgag tttcccggga tcaggcccga gtgcgtggtg cccgagaccc agtgcgccat 5580
gaaaaggaag gagaagaagg cccagaagga gaaggacaag ctgcccgtga gcaccaccac 5640
cgtcgatgac cacatgcccc ccatcatgca gtgcgagccc cccccccccg aggccgccag 5700
gattcacgag gtcgtgccca ggttcctgag cgacaagctg ctggtgacca acaggcagaa 5760
gaacatcccc cagctgaccg ccaaccagca gttcctgatc gccaggctga tctggtatca 5820
ggacggctac gagcagccca gcgacgagga cctgaaaagg atcacccaga cctggcagca 5880
ggccgacgac gagaacgagg agagcgacac ccccttcagg cagatcaccg agatgaccat 5940
cctgaccgtg cagctgatcg tggagttcgc caagggcctg cccggattcg ccaagatcag 6000
ccagcccgac cagatcaccc tgctgaaggc ttgcagcagc gaggtgatga tgctgagggt 6060
ggccaggagg tacgacgccg ccagcgacag catcctgttc gccaacaacc aggcttacac 6120
cagggacaac tacaggaagg ctggcatggc cgaggtgatc gaggacctcc tgcacttctg 6180
cagatgtatg tacagcatgg ccctggacaa catccactac gccctgctga ccgccgtggt 6240
gatcttcagc gacaggcccg gcctggagca gccccagctg gtggaggaga tccagaggta 6300
ctacctgaac accctgagga tctacatcct gaaccagctg agcggcagcg ccaggagcag 6360
cgtgatctac ggcaagatcc tgagcatcct gagcgagctg aggaccctgg gaatgcagaa 6420
cagcaatatg tgtatcagcc tgaagctgaa gaacaggaag ctgcccccct tcctggagga 6480
gatttgggac gtggccgaca tgagccacac ccagcccccc cccatcctgg agagccccac 6540
caacctgtga atcgattaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact 6600
agaatgcagt gaaaaaaatg cttaatttgt gaaatttgtg atgctattgc ttaatttgta 6660
accattataa gctgcaataa acaagttaat aaaacatttg cattcatttt atgtttcagg 6720
ttcaggggga gatgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatct 6780
agagctcttc caaatagatc tggaaggtgc tgaggtacga tgagacccgc accaggtgca 6840
gaccctgcga gtgtggcggt aaacatatta ggaaccagcc tgtgatgctg gatgtgaccg 6900
aggagctgag gcccgatcac ttggtgctgg cctgcacccg cgctgagttt ggctctagcg 6960
atgaagatac agattgaggt actgaaatgt gtgggcgtgg cttaagggtg ggaaagaata 7020
tataaggtgg gggtcttatg tagttttgta tctgttttgc agcagccgcc gccgccatga 7080
gcaccaactc gtttgatgga agcattgtga gctcatattt gacaacgcgc atgcccccat 7140
gggccggggt gcgtcagaat gtgatgggct ccagcattga tggtcgcccc gtcctgcccg 7200
caaactctac taccttgacc tacgagaccg tgtctggaac gccgttggag actgcagcct 7260
ccgccgccgc ttcagccgct gcagccaccg cccgcgggat tgtgactgac tttgctttcc 7320
tgagcccgct tgcaagcagt gcagcttccc gttcatccgc ccgcgatgac aagttgacgg 7380
ctcttttggc acaattggat tctttgaccc gggaacttaa tgtcgtttct cagcagctgt 7440
tggatctgcg ccagcaggtt tctgccctga aggcttcctc ccctcccaat gcggtttaaa 7500
acataaataa aaaaccagac tctgtttgga tttggatcaa gcaagtgtct tgctgtcttt 7560
atttaggggt tttgcgcgcg cggtaggccc gggaccagcg gtctcggtcg ttgagggtcc 7620
tgtgtatttt ttccaggacg tggtaaaggt gactctggat gttcagatac atgggcataa 7680
gcccgtctct ggggtggagg tagcaccact gcagagcttc atgctgcggg gtggtgttgt 7740
agatgatcca gtcgtagcag gagcgctggg cgtggtgcct aaaaatgtct ttcagtagca 7800
agctgattgc caggggcagg cccttggtgt aagtgtttac aaagcggtta agctgggatg 7860
ggtgcatacg tggggatatg agatgcatct tggactgtat ttttaggttg gctatgttcc 7920
cagccatatc cctccgggga ttcatgttgt gcagaaccac cagcacagtg tatccggtgc 7980
acttgggaaa tttgtcatgt agcttagaag gaaatgcgtg gaagaacttg gagacgccct 8040
tgtgacctcc aagattttcc atgcattcgt ccataatgat ggcaatgggc ccacgggcgg 8100
cggcctgggc gaagatattt ctgggatcac taacgtcata gttgtgttcc aggatgagat 8160
cgtcataggc catttttaca aagcgcgggc ggagggtgcc agactgcggt ataatggttc 8220
catccggccc aggggcgtag ttaccctcac agatttgcat ttcccacgct ttgagttcag 8280
atggggggat catgtctacc tgcggggcga tgaagaaaac ggtttccggg gtaggggaga 8340
tcagctggga agaaagcagg ttcctgagca gctgcgactt accgcagccg gtgggcccgt 8400
aaatcacacc tattaccggg tgcaactggt agttaagaga gctgcagctg ccgtcatccc 8460
tgagcagggg ggccacttcg ttaagcatgt ccctgactcg catgttttcc ctgaccaaat 8520
ccgccagaag gcgctcgccg cccagcgata gcagttcttg caaggaagca aagtttttca 8580
acggtttgag accgtccgcc gtaggcatgc ttttgagcgt ttgaccaagc agttccaggc 8640
ggtcccacag ctcggtcacc tgctctacgg catctcgatc cagcatatct cctcgtttcg 8700
cgggttgggg cggctttcgc tgtacggcag tagtcggtgc tcgtccagac gggccagggt 8760
catgtctttc cacgggcgca gggtcctcgt cagcgtagtc tgggtcacgg tgaaggggtg 8820
cgctccgggc tgcgcgctgg ccagggtgcg cttgaggctg gtcctgctgg tgctgaagcg 8880
ctgccggtct tcgccctgcg cgtcggccag gtagcatttg accatggtgt catagtccag 8940
cccctccgcg gcgtggccct tggcgcgcag cttgcccttg gaggaggcgc cgcacgaggg 9000
gcagtgcaga cttttgaggg cgtagagctt gggcgcgaga aataccgatt ccggggagta 9060
ggcatccgcg ccgcaggccc cgcagacggt ctcgcattcc acgagccagg tgagctctgg 9120
ccgttcgggg tcaaaaacca ggtttccccc atgctttttg atgcgtttct tacctctggt 9180
ttccatgagc cggtgtccac gctcggtgac gaaaaggctg tccgtgtccc cgtatacaga 9240
cttgagaggc ctgtcctcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc 9300
ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac 9360
tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga 9420
gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag 9480
ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca 9540
tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct 9600
tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc 9660
tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggccagcaa aaggccagga 9720
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 9780
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 9840
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 9900
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 9960
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 10020
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 10080
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 10140
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 10200
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 10260
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 10320
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 10380
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 10440
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 10500
ctgacagctc gagtatgtcc tacttttata aactttggtt gaactaaata aaacagcaac 10560
atgtacccaa cgtttttaga ctgttttatt cagtaccata aacattcact aaactataca 10620
gagctaaaat catgcaaaag attgcaaaac aaactgcctt gggaaatttc cagtctaagc 10680
taaatggacc aagtatagga ttgaatttta agaagttggt gggaagattc cagctcttgt 10740
actcacaggt aaggtcctag gattctattt gttgaagtgt ctgcagaccc tctccctaca 10800
gcaggggcgt ggagcaaatg tgcattcagg aagtgcttat tagtcccccc aaaacctttt 10860
tcgtgacgac agacggatgg aggcctcaga cgactccggc agtaggaccc tgaaccaaat 10920
gcctgagctg cgctcgaaag gctcgtcttg caggagctgg cgagtggcac gggcttcggt 10980
ggccgggctc ggggctcggg gctcggggcc cggagccggg gggggcgggg ggtccgtgcc 11040
cagggcgctc tgtggctcga ttcatgtccc cgccctccca cctgagcaca ctgggcagag 11100
agcctgcggc atcgggccag tcgcgcctcc tcgtccgccc tgggcgggtc gctgggcccc 11160
aggccgcttt ctacagctcc tttaataaaa tggacagcag gggtcctaac cagacgtggg 11220
catcaagaca aaggaggcgg ccagacgcgc ttgagggcct gctcgctagc tcccgccccc 11280
ccattccgcg gtcatccggg gacagaggcc aggccggact gggtggagtt gggactcata 11340
cgtctgcgtc caggaaggcg ccgggcgagc cccagctaga cgtgacgggc ggggccgaac 11400
acggcagcgg accagaggcc cgcggcgcac cggcgtgggg cggggcaagc ggagccttcc 11460
gggatgccgc gcggcagccg gcttccggct gtgggtggtg cgggggacag cggcggccgg 11520
aagctgactg agccggcctt tggtaacgcc gcctgcactt ctgggggcgt cgagcctggc 11580
ggtagaatct tcccagtagg cggcgcggga gggaaaagag gattgagggc atgcttacca 11640
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 11700
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 11760
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 11820
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 11880
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 11940
tgccattgct gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 12000
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 12060
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 12120
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 12180
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 12240
cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 12300
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 12360
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 12420
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 12480
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 12540
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaa 12579
<210>8
<211>11443
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成启动子
<400>8
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60
gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180
acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240
aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300
ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360
gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420
ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480
ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540
cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600
cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660
gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720
ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780
ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840
tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc 900
gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg 960
gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020
agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080
gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140
agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200
ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260
cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320
cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380
ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440
tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500
gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560
gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620
gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680
ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740
ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800
tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860
cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920
cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980
acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040
gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100
gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga 2160
atctgccggg ctcgtcgggg tgggtggtcc tggtgtactc ctccagggcg gcgtacacct 2220
tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca 2280
ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc 2340
tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400
tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460
ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520
ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580
gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640
cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700
ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760
cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820
cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880
cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940
ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atcaattggc 3000
cacccccccc cccccccccg catgcccggc gggtcaggga cgcgggcgcg cggtgcgctg 3060
ggggcggcac gtccgggcgg aggaggcgtc atcccgtggc cccaggagcg gcaatcagcc 3120
gagactgagc cagcgcccgg ccgcaggcag acccaagcgc caggaggcgg agccagcgct 3180
gaccccaccc cgcccctccc cccgcccctc gcagcctttt ctcacctcac tggctttcct 3240
gagcgagagc ggaactgctg ggggaacctt cgccaccctc tcccggacaa ctctacgggg 3300
aaagcccagc tgcggacaag ccagacttgt ggtcttctgc caggggcggc aggccctatc 3360
ccctctctgg gcctcagttc cactccccgc accccgtaaa aagattggcg tagaagtcgt 3420
ggaggacctc tctccaaggg cgcagaggag tccaacaccc aacaaccttg ctatggccag 3480
ctaagtggtt cgcaccctga ggactatggt cctcggagga tgcgttcgcc taagtggaca 3540
cggctccctg ccgagcctac cagcaggcac aacgatgata tgtggggagc actcagggac 3600
ccgctgttgc tttgcctggg agaacactgg aaatttttca tcttggcctg gctccttccc 3660
ctccctctcc tttctcctcc ctttcccagc cagcagcttt ctgggctgcc tccccccaag 3720
ccagctggtg tacgctcaga aaatccaaac tcatttccat gtgagtggag ggggatataa 3780
ttaggaaggc cccttcccca agtagagagg ggagcatccc ccgtgcccca ctcactgtgg 3840
gggagggagg gtcaaagcag cttaagggga tctctgcccg caaagtgcct agggctcaac 3900
tatctcaggc aacctgacca ttcagtgggg actcccttgg ggggtccagg cccagaccct 3960
ctgcagttac ctgagcagtc cagccagctc tgccatcagc tcctcctctc agaactacgt 4020
gcctgccctt tgtaaaaggg tctcctctct ctaaaccaga cagggcccag acctaccact 4080
tccacttgtg ccccagggaa ccatgaatgg aaaatccacc cagctcagta agtacttatc 4140
tagtgtttac tggatgtcta gctgcactga gaggagacag gccgaggaag gagtagaggt 4200
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aaaggcggtg ggctggctgc cctctgccct ctgccctgct ccatggggcc aggaccattt 4320
ggttgttgtt tttacctcct ggaaccagga aagttttgct accaagaagt ttggctttac 4380
cattctacat tttgcttcca gttgtcccct ccttcttccc tcagagtcct gaggcacccc 4440
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ttccaaaaat ttaggtgaca ctatagggca ccgctcgcac ctgcgcacag gcccgcggct 4620
acaaactacg aacgatcatt ctagatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 4680
acctcccaca tctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaaatgtt ttattaactt 4740
gtttattgca gcttataatg gttacaaatt aagcaatagc atcacaaatt tcacaaatta 4800
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caggctgata cacatattgc tgttctgcat tcccagggtc ctcagctcgc tcaggatgct 5040
caggatcttg ccgtagatca cgctgctcct ggcgctgccg ctcagctggt tcaggatgta 5100
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ggccatgctg tacatacatc tgcagaagtg caggaggtcc tcgatcacct cggccatgcc 5280
agccttcctg tagttgtccc tggtgtaagc ctggttgttg gcgaacagga tgctgtcgct 5340
ggcggcgtcg tacctcctgg ccaccctcag catcatcacc tcgctgctgc aagccttcag 5400
cagggtgatc tggtcgggct ggctgatctt ggcgaatccg ggcaggccct tggcgaactc 5460
cacgatcagc tgcacggtca ggatggtcat ctcggtgatc tgcctgaagg gggtgtcgct 5520
ctcctcgttc tcgtcgtcgg cctgctgcca ggtctgggtg atccttttca ggtcctcgtc 5580
gctgggctgc tcgtagccgt cctgatacca gatcagcctg gcgatcagga actgctggtt 5640
ggcggtcagc tgggggatgt tcttctgcct gttggtcacc agcagcttgt cgctcaggaa 5700
cctgggcacg acctcgtgaa tcctggcggc ctcggggggg gggggctcgc actgcatgat 5760
ggggggcatg tggtcatcga cggtggtggt gctcacgggc agcttgtcct tctccttctg 5820
ggccttcttc tccttccttt tcatggcgca ctgggtctcg ggcaccacgc actcgggcct 5880
cccgagtttc ccgggatcgc tcacggtcag ctgcctctgg cccttgttgc tgctctcctc 5940
gctgctgctg gtggcgctga tcctgtgctg cctcagggtc aggggcatgt cggtctccac 6000
gctggccagc ctgtcggtca cggcgtcctt gttcacgttg tcctgcacga acaggccggt 6060
cagcagggcc ttgatgtctt gcaggctgtc catcttcagg atcatgtcca ggtcctccct 6120
ggggaagatc agcaggaaca gctgctccag cctctccagc ctgctctcca cctcggtcag 6180
gtgggccctg gtcagggggc tcctcttggt cttggggctg tatctgcact cccagttgtt 6240
cttcaggcac ttggcgcact tgggcttctc cttgctgcac ttcagcttct tcagcctgca 6300
gatgtcgcaa gcctgctcga tgctgctcag cagcttcatg gtggccaatt gccccccccc 6360
ccccccgcat gccttgcact ccaatcagaa ccagcaagat gatgcccaag aggaaaagaa 6420
caccactttt cttcatagtg atagaatgga gttccaagtc actcctgtat tggattttga 6480
gcctgagaaa ttctttagag aacacatttt ggggatcata tttatttagg atattcattt 6540
ctctcctaaa ctctgattgg ctagtatctt tagccgagct aactaaattg accacaaact 6600
tgattgtgct gggggaaacc ctagtctcag atccaaggga atttctgcat gtttttattt 6660
ccatttcaca taaatgggtg gtttatagta agggatgtga aactagcaac actgatagcc 6720
tttggcacat tcacagttgc tcacctgtgt gaagaatagg ttatataatg aatatactaa 6780
tgttatacaa caaaggttgg agatgtggtt tccagatggg aaatattaaa gtccagataa 6840
ataatatact tttcaaattc ccttactatt tatggcatat tcttctgtat aatagatggc 6900
tacattgata ttttcttata ttgcccactt aacaacttaa agcaccttaa tttcctctgg 6960
gaccaggtca ttttctacta gtggtaagct cattctgtat cattcctgct acagtattat 7020
tttttaaact aataaattgg ttagaataag gggtcagttg catgtaagag acccaaatta 7080
acagtggcta agaaatgcaa taaaaatgaa gataaatagc tgggacctaa ttaaagagct 7140
tttgcacagc aaaaggaaca gtcagcagag taaacagaca acccacagag cgggagaaaa 7200
tcttcacaat ctatatacct gacaaaggac taatatccag aatccagaat gaattcaaac 7260
aaatcattaa gtaaaaaaca aacaatccca ttaaaaagtg ggctaaggac atcaatatac 7320
aattctcaaa agaagataca cgaatagcca acaaacatat gaaaaaatgc tcatcactaa 7380
tgatcaggga aatgcaaatc aaaaccacgg tgcgatacca ccttacaccc gcaagaatgg 7440
ccataatcaa aaaatcaaaa aacagcagat gttggtgtgg actcgagtgg taatacaatg 7500
gccggttccc atggacctgc atcgtggtgt aactataacg gtcctaaggt agcgaccgcg 7560
gagactaggt gtatttatct aagcgatcgc ttaattaagg ccggccgccg caataaaata 7620
tctttatttt cattacatct gtgtgttggt tttttgtgtg aatccatagt actaacatac 7680
gctctccatc aaaacaaaac gaaacaaaac aaactagcaa aataggctgt ccccagtgca 7740
agtccaggtg ccagaacatt tctctatcca taatgcaggg gtaccgggtg atgacggtga 7800
aaacctccaa ttgcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 7860
gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc 7920
ctccgagcgg agagtccccg gggacctaga gggtatataa tgggtgcctt agctggtgtg 7980
tgacctcatc ttcctgtacg cccctgcagg ggcgcgccac gcgtcgaaga aggtgagtaa 8040
tcttaacatg ctcttttttt ttttttttgc taatcccttt tgtgtgctga tgttaggatg 8100
acatttacaa caaatgtttg ttcctgacag gaaaaacctt gctgggtacc ttcgttgccg 8160
gacacttctt gtcctctact ttggaaaaaa ggaattgaga gccgctagcg ccaccatgat 8220
tagccctttc ctcgtgctcg ccattggcac atgcctcacc aatagcctcg tgcctggcgg 8280
aggcggaagc ggaggcggag gctccggcgg aggcggaagc tgtcagcctg tgacacagga 8340
ggacggaaag gaaagcagga tctccgtgca agagaggcag cctgccccta cccctagcaa 8400
tggctccccc aaagacggac ccgaaatccc tcccacaggc ggaaaggcta aggccaagcc 8460
cgtgacaaga ggagccggag ccaggagcgg aacccctccc caaaccggac tggaaaagcc 8520
taccggaacc ggatgaatcg attgcgcaaa gctttcgcga taggcgagac caatgggtgt 8580
gtacgtagcg gccgcgtcga cgatagcttg atgggtggca tccctgtgac ccctccccag 8640
tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat 8700
taagttgcat cattttgtct gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg 8760
tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg 8820
aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc 8880
aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc 8940
tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct 9000
ccaactccta atctcaggtg atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg 9060
cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg 9120
acgtccagac acagcatagg ctacctggcc atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct 9180
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cctactcaag gacatcatcc ctttagtgag ggttaattca cgcagtgggt acggaactaa 9360
aggcagcaca catcgtgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 9420
tacgtctctc ccccgcagta agggctagat taactcgtct cgtgaatatc cggaactccc 9480
tttagtgagg gttaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 9540
gccagcttaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc taccggaaac 9600
gcttccttca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 9660
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 9720
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 9780
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 9840
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 9900
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 9960
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 10020
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 10080
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 10140
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 10200
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 10260
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 10320
attttggtca tgatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc atacgagtaa 10380
acttggtctg acaccgctgc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 10440
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 10500
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 10560
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 10620
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 10680
agccagccgg aagcgccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 10740
ctattaactg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcggagcg 10800
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 10860
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 10920
ttagctcctt cggtcctccg atggttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 10980
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 11040
tgactggtga gtattcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 11100
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 11160
tcattgggaa gcgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 11220
gttcgatgta acccacacga gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 11280
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 11340
ggaaatgttg aatactcata cgcttccttt ttcaatagta ttgaagcatt tatcagggtt 11400
attgtctcgg gagcgaatac atatttgaat gtatttagaa aaa 11443
<210>9
<211>12844
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成启动子
<400>9
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 60
cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca 120
agaaaattaa tcgcaccggt atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcag 180
ctagcatcat caataatata ccttattttg gattgaagcc aatatgataa tgagggggtg 240
gagtttgtga cgtggcgcgg ggcgtgggaa cggggcgggt gacgtagtag tgtggcggaa 300
gtgtgatgtt gcaagtgtgg cggaacacat gtaagcgacg gatgtggcaa aagtgacgtt 360
tttggtgtgc gccggtgtac acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta ggcggatgtt 420
gtagtaaatt tgggcgtaac cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag 480
aggaagtgaa atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaatagtgc gccggtgtac 540
acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta ggcggatgtt gtagtaaatt tgggcgtaac 600
cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa actgaataag aggaagtgaa atctgaataa 660
ttttgtgtta ctcattttgt ctagggagat ccggtaccga tatcctagac aacgatgctg 720
agctaactat aacggtccta aggtagcgac cgcggagact aggtgtattt atctaagcga 780
tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt 840
tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca 900
aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta 960
tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct ccaattgcgg agtactgtcc 1020
tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc 1080
gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc 1140
tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg 1200
caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt 1260
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acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact tcttgtcctc tactttggaa 1380
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gaatcctgaa aggccaactg catcacaatc ccggagagga aaccaggctg gaaatggata 1680
agtttccctt tgtggctctg tccaagacat acaataccaa tgcccaagtg cctgactccg 1740
ccggaaccgc taccgcctac ctgtgcggag tgaaagccaa tgagggaacc gtcggcgtca 1800
gcgctgccac agagaggagc agatgcaata ccacacaggg aaacgaagtg acaagcattc 1860
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acgctacccc tagcgctgcc tatgcccata gcgctgacag ggactggtac tccgacaatg 1980
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acctcgtgga tacctggaag tccttcaaac ccaggtacaa acactcccac tttatctgga 2220
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ccctcaccgt cgtgacagcc gatcactccc acgtttttac attcggaggc tataccccta 2580
gaggaaactc catctttggc ctcgccccta tgctgtccga taccgataag aaacccttta 2640
ccgctatcct ctacggaaac ggacccggat acaaagtggt cggcggagag agggagaatg 2700
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tgctcctggc tctggctctg tatcccctga gcgtcctgtt tggcggaggc ggaagcggag 3000
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ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg 3300
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ataaaacagc aacatgtacc caacgttttt agactgtttt attcagtacc ataaacattc 4020
actaaactat acagagctaa aatcatgcaa aagattgcaa aacaaactgc cttgggaaat 4080
ttccagtcta agctaaatgg accaagtata ggattgaatt ttaagaagtt ggtgggaaga 4140
ttccagctct tgtactcaca ggtaaggtcc taggattcta tttgttgaag tgtctgcaga 4200
ccctctccct acagcagggg cgtggagcaa atgtgcattc aggaagtgct tattagtccc 4260
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ggcggggccg aacacggcag cggaccagag gcccgcggcg caccggcgtg gggcggggca 4860
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cgtcgagcct ggcggtagaa tcttcccagt aggcggcgcg ggagggaaaa gaggattgag 5040
ggcatgcggg gggggggggg ggcaattggc caccatgggc cccaagaaga aaaggaaggt 5100
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cttcgagttc gagcagatgt tcaccgacgc cctgggcatc gacgagtacg gcggccatat 5340
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cgacagggtg ctgaccgagc tggtgagcaa gatgagggac atgaggatgg acaagaccga 5760
gctgggctgc ctgagggcca tcatcctgtt caaccccgag gtgaggggcc tgaaaagcgc 5820
ccaggaggtg gagctgctga gggagaaggt gtacgccgcc ctggaggagt acaccaggac 5880
cacccacccc gacgagcccg gcagattcgc caagctgctg ctgaggctgc ccagcctgag 5940
gagcatcggc ctgaagtgcc tggagcacct gttcttcttc aggctgatcg gcgacgtgcc 6000
catcgacacc ttcctgatgg agatgctgga gagccccagc gacagctgag ccggcaactc 6060
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cccgagcaag gacgcgactc tcccgacgcg gggaggctat tctgcccatt tggggacact 6360
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ggattttttt cgggtagtgg aaaaccagca gcctcccgcg accagatctg ccaccatgaa 6480
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caagaccaag aggagccccc tgaccagggc ccacctgacc gaggtggaga gcaggctgga 6660
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gatggacagc ctgcaagaca tcaaggccct gctgaccggc ctgttcgtgc aggacaacgt 6780
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ggagagcccc accaacctgt gaatcgatta gacatgataa gatacattga tgagtttgga 7980
caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgcttaattt gtgaaatttg tgatgctatt 8040
gcttaatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta ataaaacatt tgcattcatt 8100
ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 8160
aatgtggtat ctagagctct tccaaataga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 8220
gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 8280
tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 8340
ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 8400
tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 8460
ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 8520
gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 8580
ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 8640
agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg 8700
actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 8760
acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 8820
ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 8880
atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 8940
cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 9000
cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 9060
acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 9120
gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 9180
ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt 9240
taagctggga tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt 9300
tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag 9360
tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact 9420
tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg 9480
gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt 9540
ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg 9600
gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg 9660
ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg 9720
gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc 9780
cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg ggtgcaactg gtagttaaga gagctgcagc 9840
tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt 9900
ccctgaccaa atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag 9960
caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa 10020
gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat 10080
ctcctcgttt cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag 10140
acgggccagg gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac 10200
ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct 10260
ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt 10320
gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc 10380
gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga 10440
ttccggggag taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca 10500
ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt 10560
cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc 10620
cccgtataca gacttgagag gcctgtcctc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag 10680
tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct 10740
ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc ggcgaggacc 10800
gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg 10860
ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca 10920
ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc gcgacgcgag 10980
gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg atgcccgcgt 11040
tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt caaggccagc 11100
aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 11160
ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 11220
aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 11280
cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 11340
cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 11400
aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 11460
cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 11520
ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 11580
ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 11640
gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 11700
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 11760
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 11820
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 11880
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 11940
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 12000
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 12060
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 12120
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 12180
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt 12240
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 12300
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 12360
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 12420
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 12480
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc gcgccacata 12540
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 12600
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 12660
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 12720
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 12780
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 12840
aaaa 12844
<210>10
<211>300
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD95-ADAM8报道子
<400>10
gctagcgcca ccatgattag ccctttcctc gtgctcgcca ttggcacatg cctcaccaat 60
agcctcgtgc ctgagaaaga gaaagacgga ggcggaggct ccggcggagg cggaagcgga 120
ggcggaggct ccgagtccct gaaactgagg agaagggtgc atgagacaga caaaaactgt 180
agatccggca caccccctca gaccggcctg gagaaaccca caggcacagg ccaaagaaaa 240
cagggagccg gagcccctac cgctcccgga cccggaggct cccccggagg ctaaatcgat 300
<210>11
<211>93
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD95-ADAM8报道子
<400>11
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1 5 10 15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg Arg
35 40 45
Val His Glu Thr Asp Lys Asn Cys Arg Ser Gly Thr Pro Pro Gln Thr
50 55 60
Gly Leu Glu Lys Pro Thr Gly Thr Gly Gln Arg Lys Gln Gly Ala Gly
65 70 75 80
Ala Pro Thr Ala Pro Gly Pro Gly Gly Ser Pro Gly Gly
85 90
<210>12
<211>339
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD40-CD3报道子
<400>12
gctagcgcca ccatgattag ccctttcctc gtgctcgcca ttggcacatg cctcaccaat 60
agcctcgtgc ctggcggagg cggaagcgga ggcggaggct ccggcggagg cggaagctgt 120
cagcctgtga cacaggagga cggaaaggaa agcaggatct ccgtgcaaga gaggcagcct 180
gcccctaccc ctagcaatgg ctcccccaaa gacggacccg aaatccctcc cacaggcgga 240
aaggctaagg ccaagcccgt gacaagagga gccggagcca ggagcggaac ccctccccaa 300
accggactgg aaaagcctac cggaaccgga tgaatcgat 339
<210>13
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD40-CD3报道子
<400>13
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1 5 10 15
Ser Leu Val Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg
35 40 45
Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln Pro Ala Pro Thr Pro Ser Asn Gly Ser
50 55 60
Pro Lys Asp Gly Pro Glu Ile Pro Pro Thr Gly Gly Lys Ala Lys Ala
65 70 75 80
Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Arg Ser Gly Thr Pro Pro Gln
85 90 95
Thr Gly Leu Glu Lys Pro Thr Gly Thr Gly
100 105
<210>14
<211>1692
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的碱性磷酸酶-c末端
<400>14
gctagcgcca ccatgattag ccctttcctc gtgctcgcca ttggcacatg cctcaccaat 60
agcctcgtgc ctgagaaaga gaaagaccct aagtattgga gggaccaagc ccaagagaca 120
ctgaaatacg ctctggaact gcaaaagctc aacacaaacg tcgccaaaaa cgtcatcatg 180
ttcctcggcg atggcatggg cgtcagcaca gtgacagccg ctagaatcct gaaaggccaa 240
ctgcatcaca atcccggaga ggaaaccagg ctggaaatgg ataagtttcc ctttgtggct 300
ctgtccaaga catacaatac caatgcccaa gtgcctgact ccgccggaac cgctaccgcc 360
tacctgtgcg gagtgaaagc caatgaggga accgtcggcg tcagcgctgc cacagagagg 420
agcagatgca ataccacaca gggaaacgaa gtgacaagca ttctgaggtg ggctaaggat 480
gccggaaagt ccgtgggaat cgtcaccaca accagggtga atcacgctac ccctagcgct 540
gcctatgccc atagcgctga cagggactgg tactccgaca atgagatgcc ccctgaggct 600
ctgtcccagg gatgcaaaga cattgcctat cagctcatgc acaacattag agacatcgac 660
gtgattatgg gaggcggaag aaaatatatg taccctaaga ataagacaga cgtggagtat 720
gagtccgacg aaaaggctag aggaaccagg ctggatggcc tcgacctcgt ggatacctgg 780
aagtccttca aacccaggta caaacactcc cactttatct ggaacaggac cgaactgctg 840
accctggacc ctcacaacgt cgattacctc ctgggactgt ttgagcctgg cgatatgcaa 900
tacgaactga atagaaataa cgtcaccgat ccctccctgt ccgagatggt ggtcgtggct 960
atccaaatcc tcagaaaaaa ccctaaggga ttctttctgc tcgtggaagg cggaagaatt 1020
gaccacggcc atcacgaagg caaagccaag caagctctcc acgaggctgt ggaaatggat 1080
agagctatcg gacaggctgg ctccctgaca agctccgagg ataccctcac cgtcgtgaca 1140
gccgatcact cccacgtttt tacattcgga ggctataccc ctagaggaaa ctccatcttt 1200
ggcctcgccc ctatgctgtc cgataccgat aagaaaccct ttaccgctat cctctacgga 1260
aacggacccg gatacaaagt ggtcggcgga gagagggaga atgtgagcat ggtggactat 1320
gcccataaca attaccaagc ccaaagcgct gtgcccctga gacacgaaac ccacggcgga 1380
gaggatgtgg ctgtgtttag caaaggccct atggcccacc tgttgcatgg cgtccacgaa 1440
cagaattacg tcccccatgt gatggcctat gccgcttgca ttggcgctaa cctcggccat 1500
tgcgctcccg ccagctccgc cggaagcctc gccgctggcc ctctgctcct ggctctggct 1560
ctgtatcccc tgagcgtcct gtttggcgga ggcggaagcg gaggcggagg ctccggcgga 1620
ggcggaagct gtcagcctgt gacacaggag gacggaaagg aaagcaggat ctccgtgcaa 1680
gagtaaatcg at 1692
<210>15
<211>557
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的碱性磷酸酶-c末端CD40
<400>15
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1 5 10 15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20 25 30
Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr
35 40 45
Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val
50 55 60
Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn
65 70 75 80
Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala
85 90 95
Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly
100 105 110
Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115 120 125
Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly
130 135 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
145 150 155 160
Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala
165 170 175
Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met
180 185 190
Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu
195 200 205
Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys
210 215 220
Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu
225 230 235 240
Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp
245 250 255
Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg
260 265 270
Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly
275 280 285
Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val
290 295 300
Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu
305 310 315 320
Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile
325 330 335
Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala
340 345 350
Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser
355 360 365
Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr
370 375 380
Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro
385 390 395 400
Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly
405 410 415
Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser
420 425 430
Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro
435 440 445
Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys
450 455 460
Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val
465 470 475 480
Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His
485 490 495
Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu
500 505 510
Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly
515 520 525
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gln Pro Val Thr
530 535 540
Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu
545 550 555
<210>16
<211>354
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD28-CD3报道子
<400>16
gctagcgcca ccatgattag ccctttcctc gtgctcgcca ttggcacatg cctcaccaat 60
agcctcgtgc ctagatccga cgtgaactcc agaacaggcc ctagcggagc cacaccccct 120
agcggaaacc cttacacaat cacaggctcc cagcaactgc aagtgtatag caaaaccgga 180
ttcaatcccg ctcccacacc ctccaacgga agccctaagg atggccctga gattccccct 240
accggaggct ccggcggagg cggaagcgga ggcggaggct ccaaggctaa ggccaagccc 300
gtgacaagag gagccggagc cggacccgga ggctcccccg gaggctaaat cgat 354
<210>17
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD28-CD3报道子
<400>17
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1 5 10 15
Ser Leu Val Pro Arg Ser Asp Val Asn Ser Arg Thr Gly Pro Ser Gly
20 25 30
Ala Thr Pro Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Thr Ile Thr Gly Ser Gln Gln
35 40 45
Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr Gly Phe Asn Pro Ala Pro Thr Pro Ser
50 55 60
Asn Gly Ser Pro Lys Asp Gly Pro Glu Ile Pro Pro Thr Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ala Lys Ala Lys Pro
85 90 95
Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Pro Gly Gly Ser Pro Gly Gly
100 105 110
<210>18
<211>375
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD28-CD40报道子
<400>18
gctagcgcca ccatgattag ccctttcctc gtgctcgcca ttggcacatg cctcaccaat 60
agcctcgtgc ctagatccga cgtgaactcc agaacaggcc ctagcggagc cacaccccct 120
agcggaaacc cttacacaat cacaggctcc cagcaactgc aagtgtatag caaaaccgga 180
ttcaatcccg ctcccacacc ctccaacgga agccctaagg atggccctga gattccccct 240
accggaggct ccggcggagg cggaagcgga ggcggaggct cctgccaacc cgtcacccag 300
gaggacggca aagagtccag aattagcgtc caggaaagac aaggccctgg cggaagccct 360
ggcggatgaa tcgat 375
<210>19
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的CD28-CD40报道子
<400>19
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1 5 10 15
Ser Leu Val Pro Arg Ser Asp Val Asn Ser Arg Thr Gly Pro Ser Gly
20 25 30
Ala Thr Pro Pro Ser Gly Asn Pro Tyr Thr Ile Thr Gly Ser Gln Gln
35 40 45
Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr Gly Phe Asn Pro Ala Pro Thr Pro Ser
50 55 60
Asn Gly Ser Pro Lys Asp Gly Pro Glu Ile Pro Pro Thr Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gln Pro Val Thr Gln
85 90 95
Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln Gly Pro
100 105 110
Gly Gly Ser Pro Gly Gly
115
<210>20
<211>1737
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的碱性磷酸酶-氨基末端CD40
<400>20
gctagcgcca ccatgattag ccctttcctc gtgctcgcca ttggcacatg cctcaccaat 60
agcctcgtgc cttgccaacc cgtcacccag gaggacggca aagagtccag aattagcgtc 120
caggaaggcg gaggcggaag cggaggcgga ggctccggcg gaggcggaag cgaaaaggaa 180
aaggacccca aatactggag agatcaggct caggaaaccc tcaagtatgc cctggaactc 240
cagaaactga ataccaatgt ggctaagaat gtgattatgt ttctgggcga cggcatggga 300
gtgtccaccg tcaccgctgc cagaatcctg aagggacagc tccaccacaa ccccggcgag 360
gagacaagac tggagatgga caaattccct ttcgtcgccc tgtccaaaac ctataacaca 420
aacgctcagg tccccgatag cgctggcaca gccacagcct atctgtgtgg cgtcaaggct 480
aacgaaggca cagtgggagt gtccgccgct accgaaagat ccagatgtaa cacaacccaa 540
ggcaatgagg tcacctccat cctcagatgg gccaaagacg ctggcaaaag cgtcggcatt 600
gtgacaacca caagagtcaa ccatgccaca ccctccgccg cttacgctca ctccgccgat 660
agagattggt atagcgataa cgaaatgcct cccgaagccc tgagccaagg ctgtaaggac 720
atcgcttacc aactgatgca caatatcagg gacattgacg ttatcatggg cggaggcagg 780
aagtatatgt atcccaaaaa caaaaccgat gtggaatacg aaagcgatga gaaagccagg 840
ggcacaagac tcgacggact ggatctggtg gatacatgga agtccttcaa gcctagatat 900
aagcatagcc atttcatttg gaatagaaca gagcttctga cactggaccc ccataacgtg 960
gactatctgc tcggcctgtt cgagcccgga gacatgcagt atgagctgaa caggaacaat 1020
gtgacagacc ctagcctgag cgaaatggtc gtggtcgcca ttcagattct gaggaagaat 1080
cccaaaggct ttttcctcct ggtcgaggga ggcagaatcg accacggcca ccacgaggga 1140
aaggccaagc aagccctcca cgaagccgtc gagatggaca gggccattgg ccaagccgga 1200
agcctcacct ccagcgagga tacactgaca gtggtcaccg ctgaccatag ccatgtgttt 1260
acctttggcg gatacacacc caggggcaat agcattttcg gactggctcc catgctgtcc 1320
gacacagaca aaaagccttt cacagccatt ctgtatggca atggccctgg ctataaggtc 1380
gtgggaggcg aaagagaaaa cgtcagcatg gtggattacg ctcacaataa ctatcaggct 1440
cagtccgccg tccccctcag acatgagaca cacggaggcg aggacgtggc cgtgttctcc 1500
aagggaccta tggcccatct gctccacggc gtccatgagc aaaactatgt gcctcacgtc 1560
atggcttacg ctgcctgtat cggagccaat ctgggacact gtgcccctgc ctccagcgct 1620
ggctccctgg ctgccggacc cctcctgctc gccctcgccc tctaccctct gtccgtgctg 1680
ttcggaggcg gaggctccgg cggaggcgga agcggaggcg gaggctcctg aatcgat 1737
<210>21
<211>572
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的碱性磷酸酶-氨基末端CD40
<400>21
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1 5 10 15
Ser Leu Val Pro Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser
20 25 30
Arg Ile Ser Val Gln Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
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65 70 75 80
Thr Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly
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100 105 110
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210 215 220
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275 280 285
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340 345 350
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Ser Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val
465 470 475 480
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485 490 495
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530 535 540
Leu Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe Gly Gly Gly
545 550 555 560
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<210>22
<211>1677
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的碱性磷酸酶-c末端CD28
<400>22
gctagcgcca ccatgattag ccctttcctc gtgctcgcca ttggcacatg cctcaccaat 60
agcctcgtgc ctgagaaaga gaaagaccct aagtattgga gggaccaagc ccaagagaca 120
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ttcctcggcg atggcatggg cgtcagcaca gtgacagccg ctagaatcct gaaaggccaa 240
ctgcatcaca atcccggaga ggaaaccagg ctggaaatgg ataagtttcc ctttgtggct 300
ctgtccaaga catacaatac caatgcccaa gtgcctgact ccgccggaac cgctaccgcc 360
tacctgtgcg gagtgaaagc caatgaggga accgtcggcg tcagcgctgc cacagagagg 420
agcagatgca ataccacaca gggaaacgaa gtgacaagca ttctgaggtg ggctaaggat 480
gccggaaagt ccgtgggaat cgtcaccaca accagggtga atcacgctac ccctagcgct 540
gcctatgccc atagcgctga cagggactgg tactccgaca atgagatgcc ccctgaggct 600
ctgtcccagg gatgcaaaga cattgcctat cagctcatgc acaacattag agacatcgac 660
gtgattatgg gaggcggaag aaaatatatg taccctaaga ataagacaga cgtggagtat 720
gagtccgacg aaaaggctag aggaaccagg ctggatggcc tcgacctcgt ggatacctgg 780
aagtccttca aacccaggta caaacactcc cactttatct ggaacaggac cgaactgctg 840
accctggacc ctcacaacgt cgattacctc ctgggactgt ttgagcctgg cgatatgcaa 900
tacgaactga atagaaataa cgtcaccgat ccctccctgt ccgagatggt ggtcgtggct 960
atccaaatcc tcagaaaaaa ccctaaggga ttctttctgc tcgtggaagg cggaagaatt 1020
gaccacggcc atcacgaagg caaagccaag caagctctcc acgaggctgt ggaaatggat 1080
agagctatcg gacaggctgg ctccctgaca agctccgagg ataccctcac cgtcgtgaca 1140
gccgatcact cccacgtttt tacattcgga ggctataccc ctagaggaaa ctccatcttt 1200
ggcctcgccc ctatgctgtc cgataccgat aagaaaccct ttaccgctat cctctacgga 1260
aacggacccg gatacaaagt ggtcggcgga gagagggaga atgtgagcat ggtggactat 1320
gcccataaca attaccaagc ccaaagcgct gtgcccctga gacacgaaac ccacggcgga 1380
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cagaattacg tcccccatgt gatggcctat gccgcttgca ttggcgctaa cctcggccat 1500
tgcgctcccg ccagctccgc cggaagcctc gccgctggcc ctctgctcct ggctctggct 1560
ctgtatcccc tgagcgtcct gtttggcgga ggcggaagcg gaggcggagg ctccggcgga 1620
ggcggaagct cccagcaact gcaagtgtat agcaaaaccg gattcaactg aatcgat 1677
<210>23
<211>552
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的碱性磷酸酶-c末端CD28
<400>23
Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn
1 5 10 15
Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln
20 25 30
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Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val
115 120 125
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130 135 140
Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser
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420 425 430
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Val Tyr Ser Lys Thr Gly Phe Asn
545 550
Claims (170)
1.一种诊断对象的疾病或病症的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示所述对象具有所述疾病或病症。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在从所述对象分离的细胞中离体进行。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述多核苷酸引入从所述对象分离的细胞从而产生修饰细胞，并将所述修饰细胞重新引入所述对象。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在体内进行。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮素受体(EcR)的基因开关。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
16.一种制备用于诊断对象的疾病或病症的修饰细胞的方法，包括将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
17.一种诊断对象的疾病或病症的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(b)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示所述对象具有所述疾病或病症；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含(1)多核苷酸，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
18.一种诊断对象的疾病或病症的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示所述对象具有所述疾病或病症。
19.一种监测对象中疾病或病症进展的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述对象中所述疾病或病症的进展。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法在从所述对象分离的细胞中离体进行。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述多核苷酸引入从所述对象分离的细胞从而产生修饰细胞，并将所述修饰细胞重新引入所述对象。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法在体内进行。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
28.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
32.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
33.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
34.一种制备用于监测对象中疾病或病症进展的修饰细胞的方法，包括将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
35.一种监测对象中疾病或病症进展的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(b)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述对象中所述疾病或病症的进展；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含多核苷酸，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
36.一种监测对象中疾病或病症进展的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述对象中所述疾病或病症的进展。
37.一种监测对象中疾病或病症的治疗效力的方法，包括：
(a)将所述治疗给予所述对象；
(b)将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述治疗的效力。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，步骤(b)在步骤(a)之前进行。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前先测定报道基因表达的基线水平。
40.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述方法在从所述对象分离的细胞中离体进行。
41.如权利要求37所述的方法，其特征在于，将所述多核苷酸引入从所述对象分离的细胞从而产生修饰细胞，并将所述修饰细胞重新引入所述对象。
42.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述方法在体内进行。
43.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
48.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
51.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
52.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
53.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
54.一种制备用于监测对象中疾病或病症的治疗效力的修饰细胞的方法，包括将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
55.一种监测对象中疾病或病症的治疗效力的方法，包括：
(a)将所述治疗给予所述对象；
(b)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述治疗的效力；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含多核苷酸，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
56.一种监测对象中疾病或病症的治疗效力的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述对象的所述疾病或病症期间受调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述治疗的效力。
57.一种监测所给予的疾病或病症治疗在对象中的潜在毒性的方法，包括：
(a)将所述治疗给予所述对象；
(b)将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述治疗的毒性。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，步骤(b)在步骤(a)之前进行。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前先测定报道基因表达的基线水平。
60.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述方法在从所述对象分离的细胞中离体进行。
61.如权利要求57所述的方法，其特征在于，将所述多核苷酸引入从所述对象分离的细胞从而产生修饰细胞，并将所述修饰细胞重新引入所述对象。
62.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述方法在体内进行。
63.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
67.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
68.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
70.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
71.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
72.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
73.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
74.一种制备用于监测所给予的疾病或病症治疗在对象中的潜在毒性的修饰细胞的方法，包括将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
75.一种监测所给予的疾病或病症治疗在对象中的潜在毒性的方法，包括：
(a)将所述治疗给予所述对象；
(b)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述治疗的毒性；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含多核苷酸，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
76.一种监测所给予的疾病或病症治疗在对象中的潜在毒性的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的细胞中发现的因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述治疗的毒性。
77.一种监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的方法，包括：
(a)将所述治疗给予所述对象；
(b)将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达水平表示所给予以供治疗的因子的水平。
78.如权利要求77所述的方法，其特征在于，步骤(b)在步骤(a)之前进行。
79.如权利要求78所述的方法，其特征在于，在步骤(a)之前先测定报道基因表达的基线水平。
80.如权利要求77所述的方法，其特征在于，还包括根据步骤(d)中检测到的报道基因表达水平调整因子的给予量的步骤。
81.如权利要求77所述的方法，其特征在于，所述方法在从所述对象分离的细胞中离体进行。
82.如权利要求77所述的方法，其特征在于，将所述多核苷酸引入从所述对象分离的细胞从而产生修饰细胞，并将所述修饰细胞重新引入所述对象。
83.如权利要求77所述的方法，其特征在于，所述方法在体内进行。
84.如权利要求77所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
85.如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
86.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
88.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
89.如权利要求77所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
90.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
91.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
92.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
93.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
94.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
95.一种制备用于监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的修饰细胞的方法，包括将多核苷酸引入所述对象的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
96.一种监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的方法，包括：
(a)将所述治疗给予所述对象；
(b)将配体给予所述对象的修饰细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达水平表示给予以供治疗的因子的水平；和
其中所述对象的所述修饰细胞包含多核苷酸，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
97.一种监测给予对象以供治疗疾病或病症的因子水平的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入非自体细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予以供治疗的所述因子的调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将所述修饰的细胞引入所述对象；
(c)将配体给予所述修饰的细胞；和
(d)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平表示给予以供治疗的因子的水平。
98.一种检测接受器官或组织移植物的对象中移植排斥的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示检测到移植排斥。
99.如权利要求98所述的方法，其特征在于，先将所述多核苷酸引入所述细胞再进行移植。
100.如权利要求98所述的方法，其特征在于，移植后将所述多核苷酸引入所述细胞。
101.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮素(EcR)的基因开关。
102.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
103.如权利要求102所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
104.如权利要求103所述的方法，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
105.如权利要求102所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
106.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
107.如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
108.如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
109.如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
110.如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
111.如权利要求98所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
112.一种制备器官或组织移植物以供检测对象中移植排斥的方法，包括将多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
113.一种检测接受器官或组织移植物的对象中移植排斥的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象；和；
(b)检测报道基因表达；
其中所述报道基因的表达表示检测到移植排斥；和
其中所述器官或组织移植物包含含有多核苷酸的一个或多个细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
114.一种监测接受器官或组织移植物的对象中移植排斥进展的方法，包括：
(a)将多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化；
(b)将配体给予所述修饰的细胞；和
(c)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因表达水平的改变表示所述对象中所述移植排斥的进展。
115.如权利要求114所述的方法，其特征在于，先将所述多核苷酸引入所述细胞再进行移植。
116.如权利要求114所述的方法，其特征在于，移植后将所述多核苷酸引入所述细胞。
117.如权利要求114所述的方法，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮素(EcR)的基因开关。
118.如权利要求117所述的方法，其特征在于，所述配体结合EcR配体结合结构域。
119.如权利要求118所述的方法，其特征在于，所述配体是二酰基肼。
120.如权利要求119所述的方法，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115830或RG-115932。
121.如权利要求118所述的方法，其特征在于，所述配体是酰氨基酮或噁二唑啉。
122.如权利要求114所述的方法，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
123.如权利要求122所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
124.如权利要求122所述的方法，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
125.如权利要求122所述的方法，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
126.如权利要求122所述的方法，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
127.如权利要求114所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
128.一种制备器官或组织移植物以供监测对象中移植排斥进展的方法，包括将多核苷酸引入所述器官或组织移植物的细胞从而产生修饰的细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
129.一种监测接受器官或组织移植物的对象中移植排斥进展的方法，包括：
(a)将配体给予所述对象；和；
(b)检测报道基因表达至少两次；
其中所述报道基因的表达水平表示所述对象中所述移植排斥的进展；和
其中所述器官或组织移植物包含含有多核苷酸的一个或多个细胞，其中所述多核苷酸编码基因开关，其中所述多核苷酸包含(1)至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节，和(2)编码与某启动子相连的报道基因的多核苷酸，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
130.一种编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子操作性相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在所述疾病或病症期间受到调节。
131.如权利要求130所述的多核苷酸，其特征在于，还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
132.如权利要求130所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
133.如权利要求130所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
134.如权利要求133所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
135.如权利要求133所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
136.如权利要求133所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
137.如权利要求133所述的多核苷酸，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
138.如权利要求130所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
139.一种编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到接触毒性条件的细胞中发现的因子的调节。
140.如权利要求139所述的多核苷酸，其特征在于，还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
141.如权利要求139所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
142.如权利要求139所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
143.如权利要求142所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
144.如权利要求142所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
145.如权利要求142所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
146.如权利要求142所述的多核苷酸，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
147.如权利要求139所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
148.一种编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性受到给予对象以供治疗的因子的调节。
149.如权利要求148所述的多核苷酸，其特征在于，还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
150.如权利要求148所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
151.如权利要求148所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
152.如权利要求151所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
153.如权利要求151所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
154.如权利要求151所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
155.如权利要求151所述的多核苷酸，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
156.如权利要求148所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
157.一种编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个与诊断开关启动子相连的转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，其中所述启动子的活性在移植排斥期间受到调节。
158.如权利要求157所述的多核苷酸，其特征在于，还编码与某启动子相连的报道基因，该启动子由所述配体依赖性转录因子活化。
159.如权利要求157所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
160.如权利要求157所述的多核苷酸，其特征在于，所述基因开关包含在第一诊断开关启动子控制下的第一转录因子序列和第二诊断开关启动子控制下的第二转录因子序列，其中所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白质相互作用从而形成起到配体依赖性转录因子作用的蛋白质复合物。
161.如权利要求160所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是不同的。
162.如权利要求160所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一诊断开关启动子和第二诊断开关启动子是相同的。
163.如权利要求160所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一转录因子序列编码包含异源二聚体伴侣和反式激活域的蛋白质。
164.如权利要求160所述的多核苷酸，其特征在于，所述第二转录因子序列编码包含DNA结合结构域和配体结合结构域的蛋白质。
165.如权利要求157所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸之一还编码操作性连接于诱导型启动子的致死性多肽。
166.一种载体，其包含权利要求130、139、148或157中任一项所述多核苷酸。
167.如权利要求166所述的载体，其特征在于，所述载体是质粒载体。
168.如权利要求166所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。
169.一种试剂盒，其装有权利要求130、139、148或157中任一项所述多核苷酸。
170.一种试剂盒，其装有权利要求166所述的载体。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100915 |