KR20190076993A - 동족 항원과 t-세포 수용체 상호작용의 발견 및 특징규명을 위한 조작된 2-부분 세포 디바이스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2-부분 디바이스에 관한 것이며, 여기서 제1 부분은 조작된 항원-제시 세포 시스템(eAPCS)이고, 제2 부분은 조작된 TCR-제시 세포 시스템(eTPCS)이다.
Description
본 발명은 2 부분을 포함하는 조작된 세포 디바이스의 작제 및 사용에 관한 것이며, 여기서 각각의 부분은 시스템의 작동 시에 나머지 것과 상호작용하는 별개의 조작된 세포 시스템을 포함한다. 2-부분 세포 디바이스의 제1 부분은 APC(antigen-presenting cell)를, 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen: HLA) 분자, HLA-유사 분자 및 항원-제시 분자 및 항원성 분자의 별개의 형태의 세포 표면 제시에 대해서 널(null)로 만들기 위해서 게놈 편집에 의해서 조작된 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC) 시스템이다. 또한, 조작된 APC 시스템(engineered APC system: eAPCS)은 항원-제시 분자 암호화 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 삽입, 및 선택적으로 유전적으로 암호화된 분석물 항원의 삽입을 위한 게놈 통합 부위를 함유한다. 분석물 항원 분자- 및/또는 항원-제시 복합체 암호화 ORF를 신속하게 전달하기 위해서 APC의 게놈 통합 부위를 표적으로 하도록 설계된 유전자 공여자 벡터가 eAPCS를 완성한다. 2-부분 세포 디바이스의 제2 부분은 세포를 TCR 쇄의 표면 발현에 대해서 널로 만들기 위해서 게놈 편집에 의해서 조작된 T-세포 수용체(T-cell Receptor: TCR)-제시 세포 시스템이다. 이러한 조작된 TCR-제시 세포 시스템(engineered TCR-presenting cell system: eTPCS)은 TCR-암호화 ORF의 도입 시에 CD3 복합체로 세포 표면 상에 TCR 이종이량체 복합체를 발현하기 위한 수용성을 보유하고, 또한 검출 가능한 방식으로 TCR 결찰에 응답하기에 수용성이다. 분석물 TCR ORF를 신속하게 전달하기 위해서 TCR-제시 세포의 게놈 통합 부위를 표적으로 하도록 설계된 유전자 공여자 벡터가 eTPCS를 완성한다. 이러한 조작된 2-부분 세포 디바이스는 세포-세포 상호작용의 본래 기능성 맥락에서 TCR/항원 상호작용의 표준화된 분석을 위해서 설계된다.
T 림프구(T-세포)에 의한 면역 감시는 모든 턱이 있는 척추동물의 획득 면역(adaptive immunity)에서의 핵심적인 기능이다. T-세포에 의한 면역 감시는 T-세포 하위유형 전체에서 풍부한 기능적인 다양성을 통해서 달성되는데, 이것은 병원체-감염된 세포 및 신생물 세포를 제거하고, 침입한 병원체, 공생 미생물, 공생 비자가 인자, 예컨대, 식품의 분자 성분에 대한 획득 면역 반응을 조직하고, 심지어는 자신의 면역 관용을 유지시키기 위해서 제공된다. 다양한 외부 인자 및 자가 인자에 반응하기 위해서, T-세포는 이러한 외부 인자 및 자가 인자의 분자 구성요소를 특이적으로 검출할 수 있어야 한다. 따라서 T-세포는, 병원성 유기체 및 병이 걸린 자신에 대해서는 효율적인 반응을 시작하지만, 건강한 자신에 대해서는 이러한 반응을 시작하는 것을 회피하기에 충분한 특이성으로, 개체가 접하는 자가 분자 및 비-자가 분자의 큰 단면을 검출할 수 있어야 한다. 이러한 작업의 상당히 복잡한 본성은, 외부 분자 및 자가 분자 둘 모두의 실질적으로 비제한된 다양성을 고려하고, 병원성 유기체가 진화 압력 하에 존재하여 T-세포에 의한 검출을 회피한다는 것을 고려할 때 명백해진다.
T-세포 수용체(TCR)
T-세포는 T-세포 수용체(TCR)의 발현에 의해서 주로 한정된다. TCR은 T-세포 획득 면역의 표적과 상호작용하여, 이를 감지하는 책임이 있는 T-세포의 성분이다. 일반적인 용어에서, TCR은 세포 표면 상에 제시된 이종이량체 단백질 복합체로 구성된다. 2개의 TCR 쇄 각각은 2개의 세포외 도메인으로 구성되는데, 이것은 가변(V)-영역 및 불변(C)-영역이고, 면역글로불린 슈퍼패밀리(IgSF) 도메인 둘 모두는 역평행 β-시트를 형성한다. 이들은 타입-I 막관통 도메인에 의해서 세포막에 고정되고, 이것은 짧은 세포질 꼬리에 결합한다. 다양한 분자 구성요소를 획득 및 검출하는 T-세포의 품질은 T-세포 발생 동안 생성된 TCR 쇄에서의 변화로부터 초래한다. 이러한 변화는 B-세포에서 항체 발생과 유사한 방식으로 체세포 재조합에 의해서 발생된다
TCR 쇄 다양성
T 세포 풀(T cell pool)은 기능적으로 그리고 표현형적으로 이종인 몇몇 하위집단으로 이루어진다. 그러나, T 세포는, 그것이 표면에서 발현하는 체세포적으로 재배열된 TCR에 따라서 αβ 또는 γδ로 광범위하게 분류될 수 있다. 2개의 TCR 쇄 쌍 형태; TCR 알파(TRA) 및 TCR 베타(TRB) 쌍; 및 TRC 감마(TRG) 및 TCR 델타(TRD) 쌍이 존재한다. TRA:TRB 쌍을 발현하는 T-세포는 αβ T-세포라 지칭되는 반면, TRG:TRD 쌍을 발현하는 T-세포는 종종 γδ T-세포라 지칭된다.
αβ 형태 및 γδ 형태 둘 모두의 TCR은 다양한 리간드 또는 '항원'의 인식에 대한 책임이 있고, 각각의 T-세포는 T-세포 성숙 동안 αβ 또는 γδ 수용체 쇄를 신생(de novo)으로 생성한다. 이러한 신생 TCR 쇄 쌍은 체세포 V(D)J 재조합이라고 불리는 과정에서 수용체 서열 다양성의 생성을 통해서 인식의 다양성을 달성하고, 그 후 각각의 T-세포는 단일의 명백하게 재배열된 TCR의 카피를 발현한다. TRA 및 TRG 유전자좌, 다수의 개별 가변(V) 및 기능성(J) 유전자 분절은 재조합에 사용 가능하고, 불변(C) 유전자 분절에 병치되어, VJ 재조합이라 지칭된다. TRB 및 TRD 유전자좌에서의 재조합은 추가로 다양성(D) 유전자 분절을 포함하고, 이것은 VDJ 재조합이라 지칭된다.
각각의 재조합된 TCR은, αβ T-세포의 경우에는 α 쇄 및 β 쇄에 의해서 또는 γδ T-세포의 경우에는 γ 쇄 및 δ 쇄에 의해서 형성된 리간드-결합 부위의 구조에 의해서 결정되는, 고유한 리간드 특이성에 대한 가능성을 보유한다. TCR의 구조적 다양성은 상보성-결정 영역(CDR)이라 불리는, 각각의 쇄 상의 3개의 짧은 헤어핀 루프에 상당히 국한된다. 3개의 CDR은 수용체 쇄 쌍의 각각의 쇄로부터 기여되고, 총괄적으로 이러한 6개의 CDR 루프는 TCR 세포외 도메인의 막-윈위 단부에 위치하여 항원-결합 부위를 형성한다.
각각의 TCR 쇄에서의 서열 다양성은 두 방식으로 달성된다. 첫 번째로, 재조합을 위한 유전자 분절의 무작위 선택이 기본적인 서열 다양성을 제공한다. 예를 들어, TRB 재조합은 47 고유 V, 2 고유 D 및 13 고유 J 생식계열 유전자 분절 사이에서 일어난다. 일반적으로, V 유전자 분절은 CDR1 및 CDR2 루프 둘 모두에 기여하고, 따라서 암호화된 생식계열이다. 서열 다양성을 생성시키는 두 번째 모드는 초가변 CDR3 루프 내에서 일어나는데, 이것은 재조합 V, (D) 및 J 유전자 분절 사이의 접합부에서, 주형 뉴클레오타이드의 무작위 결실 및 비-주형 뉴클레오타이드의 첨가에 의해서 생성된다.
TCR:CD3 복합체
성숙 αβ 및 γδ TCR 쇄 쌍은 ε, γ, δ 및 ζ라 지칭되는 다수의 액세서리 CD3 소단위를 갖는 복합체로 세포 표면에 제시된다. 이러한 소단위는 αβ 또는 γδ TCR과 3종의 이량체(εγ, εδ, ζζ)로서 회합한다. 이러한 TCR:CD3 복합체는 αβ 또는 γδ TCR과 동족 항원의 결속 시에 세포 신호전달 반응의 개시를 위한 단위를 형성한다. TCR:CD3 복합체로서 회합된 CD3 액세서리는 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(ITAM)라고 불리는 신호전달 모티프에 기여한다. CD3ε, CD3γ 및 CD3δ 각각은 단일 ITAM에 기여하는 반면, CD3ζ 동종이량체는 3개의 ITAM을 함유한다. 따라서 TCR과 조립되는 3개의 CD3 이량체(εγ, εδ, ζζ)는 10개의 ITAM에 기여한다. 동족 항원과의 TCR 결찰 시, 탠덤 타이로신 잔기의 인산화는 Src 상동 2(Src homology 2: SH2) 도메인, 예컨대, 중요한 70kDa의 ζ-쇄-연관된 단백질(ZAP-70)을 함유하는 단백질을 위한 짝지워진 도킹(docking) 부위를 생성한다. 이러한 단백질의 모집은 T-세포 활성화 및 분화에 궁극적인 책임이 있는 TCR:CD3 신호전달 복합체의 형성을 개시한다.
αβ T-세포
αβ T-세포는 일반적으로 γδ T-세포 반대부분보다 인간에서 더 풍부하다. 대부분의 αβ T-세포는 세포 표면 상에서 HLA 복합체에 의해서 제시된 펩타이드 항원과 상호작용한다. 이들 펩타이드-HLA(pHLA)-인식 T-세포는 처음으로 기술되었고, 가장 양호하게 특징규명되어 있다. αβ T-세포의 보다 희귀한 형태가 또한 기술되어 있다. 점막-연관된 불변요소 T(Mucosal-associated invariant T: MAIT) 세포는 비교적 제한된 α 및 β 쇄 다양성을 갖는 것으로 보이며, 단백질 단편이 아닌 박테리아 대사산물을 인식한다. 불변 자연 살해 T-세포(iNK T-세포) 및 생식계열-암호화된 마이콜릴-반응성 T-세포(GEM T-세포)는 비-HLA 분자에 의해서 교차 제시되는 당지질의 인식에 제한된다. iNK T-세포는 CD1d-제시된 당지질과 상호작용하는 것으로 광범위하게 간주되는 반면, GEM T-세포는 CD1b-제시된 당지질과 상호작용한다. T-세포의 추가 형태는 CD1a 및 CD1c와 관련하여 당지질과 상호작용한다고 생각되지만, 이러한 세포는 아직 상당히 상세하게 특징규명되어 있지 않다.
종래의 αβ T-세포
대부분의 αβ T-세포의 주요 특징은 HLA 분자와 관련하여 펩타이드 항원의 인식이다. 이것은 종종 '종래의' αβ T-세포라 지칭된다. 개체 내에서, 자가-HLA 분자는 자가 단백질 및 외부 단백질로부터의 펩타이드를 T-세포에 제공하여, 악성종양 및 외부 병원체에 대항하는 획득 면역, 공생 유기체, 식품 및 자신에 대한 획득 관용에 대한 본질적인 기준을 제공한다. HLA 단백질을 암호화하는 HLA 유전자좌는 인간 게놈의 가장 유전자 조밀하고, 다형성인 영역이며, 인간에서 기술된 12,000개 초과의 대립유전자가 존재한다. HLA 유전자좌에서의 고도의 다형성은 개체들 간의 펩타이드 항원 제시의 다양성을 보장하며, 이것은 집단 수준에서 면역에 중요하다.
HLA 클래스 I 및 II
전통적인 HLA 복합체의 2가지 형태가 존재한다: HLA 클래스 I(HLAI) 및 HLA 클래스 II(HLAII). 3종의 전통적인 HLAI 유전자가 존재한다: HLA-A, HLA-B, HLA-C. 이러한 유전자는 불변 β2-마이크로글로불린(β2M) 쇄와 회합된 막-연장 α-쇄를 암호화한다. HLAI α-쇄는 면역글로불린 폴드: α1, α2 및 α3를 갖는 3개의 도메인으로 구성된다. α3 도메인은 막-근위이고, 상당히 불변성인 반면, α1 도메인 및 α2 도메인은 함께 다형성 막-윈위 항원-결합 틈(cleft)을 형성한다. 6종의 전통적인 HLAII 유전자가 존재한다: HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA 및 HLA-DRB1. 이러한 유전자는 α-쇄 및 β-쇄를 포함하는 짝지워진 DP, DQ 및 DR 이종이량체 HLA 복합체를 암호화한다. 각각의 쇄는 면역글로불린 폴드를 갖는 2개의 주요 구조 도메인을 가지며, 여기서 α2 및 β2 도메인은 HLAI α3 도메인의 것과 유사한 막-근위이고, 상당히 불변인 모듈을 포함한다. HLAII α2 도메인 및 β2 도메인은 함께 막-윈위 항원-결합 틈을 형성하며, 이것은 고도로 다형성인 영역이다.
HLAI 및 HLAII의 항원-결합 틈은 8개의 역평행 β-시트의 플랫폼 상에 2개의 역평행 α-헬릭스를 포함한다. 이러한 틈에서 펩타이드 항원은 연장된 입체배좌 내에 결합되고, 제시된다. HLAI 및 HLAII 내의 펩타이드-접촉 잔기는 대부분의 서열 다형성의 위치이며, 이것은 상이한 HLA 대립유전자에 의해서 제시된 다양한 펩타이드 레퍼토리의 분자 기준을 구성한다. 이러한 펩타이드는 항원-결합 틈과의 광범위한 접촉을 만들고, 그 결과, 각각의 HLA 대립유전자는 제시된 펩타이드에 대한 별개의 서열 제약 및 선호를 부여한다. 따라서 주어진 펩타이드는 제한된 수의 HLA에만 결합할 것이고, 상반되게 각각의 대립유전자는 주어진 단백질로부터의 펩타이드 수집물의 특정 분율 만을 수용한다. 각각의 개체에 제시된 HLAI 및 HLAII 대립유전자의 세트는 HLA 일배체형이라 지칭된다. HLAI 및 HLAII 유전자의 다형성 및 유전된 대립유전자의 공우성(co-dominant) 발현은 인간 집단 전체에서 HLA 일배체형의 매우 높은 다양성을 유도하는데, 이것은 αβ TCR의 막대한 서열 다양성과 커플링되는 경우, 이러한 HLA-항원-TCR 상호작용의 분석의 표준화에 대한 상당한 장애를 제공한다.
HLAI 및 HLAII의 αβ TCR 결속
αβ TCR은 HLA 및 펩타이드 항원(변경된 자가) 둘 모두의 잔기에 의해 형성된 혼합된 pHLA 결합 계면의 부분으로서 펩타이드를 인식한다. HLAI 복합체는 거의 모든 유핵 세포의 표면 상에 제시되며, 일반적으로 내인성 단백질로부터 유래된 펩타이드를 제공하는 것으로 간주된다. 따라서 T-세포는, 상호작용 세포의 pHLAI 복합체를 샘플링함으로써 HLAI-제시 세포의 내인성 세포 프로테옴에서 정보를 얻을 수 있다. HLAI의 결속은, 상호작용 T-세포에 의한 TCR 공동수용체 CD8의 발현을 요구하고, 따라서, HLAI 샘플링은 CD8+ αβ T-세포에 제한된다. 이에 반해서, HLAII 복합체의 표면 제시는 전문적인 APC에 상당히 제한되고, 일반적으로 제시 세포에 외인성인 단백질로부터 유래된 펩타이드를 제공한다고 간주된다. 따라서 상호작용 T-세포는, 제시 세포가 존재하는 세포외 미세환경의 프로테옴에서 정보를 얻을 수 있다. HLAII의 결속은, 상호작용 T-세포에 의한 TCR 공동수용체 CD4의 발현을 요구하고, 따라서 HLAII 샘플링은 CD4+ αβ T-세포에 제한된다.
αβ TCR의 흉선 선택
상기에 기술된 바와 같은 αβ TCR의 역할은 pHLA 복합체의 검출이어서, TCR-제시 T-세포는 면역의 확립에서 T-세포의 역할과 밀접한 관련이 있는 반응을 증가시킬 수 있다. 개체 내에서 생성된 αβ TCR 레퍼토리는, 특이적 일배체형과 관련하여 그리고 이의 실제 발생 이전에 마주할 가능성이 있는 모든 외부 항원의 상당하고 예측하지 못한 다양성을 처리해야 한다고 고려될 것이다. 이러한 결과는, 매우 다양하고, 상당한 수의 αβ TCR이 비특이적 pHLA 복합체를 인식할 가능성을 가지면서 유사-무작위화된 방식으로 생성되고, 자가 pHLA와의 강한 상호작용을 회피하도록 단지 특이적으로 지시된다는 배경으로 달성된다. 이것은 프로세스 호출 흉선 선택에서 T-세포 성숙 동안 신중하게 조직된다.
흉선에서 T-세포 성숙의 제1 단계 동안, 충분한 친화성으로 자가-pHLA 복합체와 상호작용할 수 없는 αβ TCR을 보유한 T-세포는 생존 신호가 박탈되고, 제거된다. 이러한 단계 호출된 양성 선택은, 살아남은 T-세포가 적절한 HLA 맥락으로 제공된 외부 또는 변경된 펩타이드를 적어도 잠재적으로 인식할 수 있는 TCR 레퍼토리를 보유한다는 것을 보장한다. 그 다음, 자가-pHLA와 강하게 상호작용하고, 따라서 자가면역을 유도할 가능성을 갖는 αβ TCR은 음성 선택의 과정을 통해서 능동적으로 제거된다. 양성 선택과 음성 선택의 이러한 조합은, 주변에 존재하는 자가-pHLA에 대해서 낮은 친화성을 갖는 αβ TCR을 보유하는 T-세포 만을 생성시킨다. 이것은 자가-제한적이지만, 자가-반응성이 아닌 αβ T-세포 레퍼토리를 확립한다. HLA 일배체형에 대한 T-세포 발생의 이러한 고도로 개별화된 특성은 αβ TCR-항원-HLA 상호작용의 표준화된 분석에서의 도전을 강조한다. 더욱이, 그것은 이식 거부 및 이식편대숙주병 둘 모두, 및 하나의 개체에서 식별된 αβ TCR이 제2 개체에서 완전히 상이한 효과를 가질 수 있다는 일반적인 원리(이것은 임상 실험에서 나타나는 TCR-기반 및 T-세포 기반 치료 및 진단 전략에 대한 명백한 영향을 가짐)의 이유가 된다.
비종래의 αβ T-세포
αβ T-세포의 비-HLA-제한된, 또는 '비종래의' 형태는 매우 상이한 분자 항원 표적을 갖는다. 이러한 비종래의 αβ T-세포는 전통적인 HLA 복합체와 결속하지 않지만, 보존된 HLA-유사 단백질, 예컨대, CD1 패밀리 또는 MR1과 결속한다. CD1 패밀리는 항원 교차-제시에 관여된 4종의 형태(CD1a, b, c 및 d)를 포함한다. 이러한 세포 표면 복합체는 α-쇄 유사 HLAI를 갖는데, 이것은 β2-M과 이종이량체를 형성한다. α-쇄의 막 윈위 표면에 제공된 작은 소수성 포켓은 병원체-유래된 지질-기반 항원에 대한 결합 부위를 형성한다. 선천적 유사 NK T-세포(iNK T-세포)는 또 다른 중요한 예를 나타내는 GEM T-세포와 함께 지질/CD1 패밀리 인식의 가장 잘 이해되는 예를 형성한다. '타입 I' iNK T-세포는 CD1d와 관련하여 지질 α-GalCer과 강하게 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 iNK T-세포는 고정된 TCR α-쇄(Vα10/Jα18) 및 제한된 수의 β-쇄(제한된 vβ 사용)로 매우 제한된 TCR 다양성을 나타내고, 이것은 선천적 병원체-연관된 분자 패턴(PAMPS) 인식 수용체, 예컨대, Toll-유사 및 Nod-유사 수용체에 비유되어 왔다. 이에 반해서, '타입 II' NK T-세포는 보다 다양한 TCR 레퍼토리를 제공하고, CD1d-지질 복합체 결속의 보다 다양한 모드를 갖는 것으로 보인다. GEM T-세포는 CD1b에 의해서 제공된 마이코박테리아-유래된 당지질을 인식하지만, CD1a, b 및 c에 의한 항원 제시의 분자 상세사항뿐만 아니라 이의 T-세포 인식은 단지 이해되는 초기 단계이다.
MAIT 세포는 불변 TCR α-쇄(TRAJ33, TRAJ20 또는 TRAJ12에 결찰된 TRAV1-2)를 과량으로 발현하는데, 이것은 TCR β-쇄의 어레이와 짝을 이룰 수 있다. 펩타이드 또는 지질 대신에 MAIT TCR은 HLAI-유사 분자, MR1에 의해서 제공된 병원체-유래된 엽산(folate)- 및 리보플라빈-기반 대사산물에 결합할 수 있다. MAIT TCR 상에서 관찰되는 TCR에서의 제한적이지만 상당한 다양성은 보존된 MR1과 관련하여 다양하지만 관련된 대사산물의 인식을 가능하게 하는 것으로 보인다.
비-전통적인 HLA-제한된 αβ T-세포 TCR이 성숙 동안 흉선에서 선택되는 방법은 양호하게 이해되어 있지 않다. 그러나, 상기에 제시된 음성 선택 및 양성 선택의 기본적인 과정이 여전히 적용되고, 일부 증거는 이것이 흉선 내에서의 특화된 틈새(niche)에서 일어난다는 것을 시사한다.
γδ T-세포
αβ TCR 발생 및 pHLA 결속의 상세한 기전적 이해에 비해서, 항원 표적 및 이의 γδ T-세포 반대부분의 내용에 대해서는 비교적 적게 공지되어 있다. 이것은 부분적으로는 순환하는 T-세포 구획에서의 이의 비교적 낮은 풍부도로 인한 것이다. 그러나, γδ T-세포는 엄격히 HLA 제한되지 않는다고 광범위하게 간주되며, 항체와 다르지 않게 표면 항원을 더 자유롭게 인식하는 것으로 보인다. 추가로, 보다 최근에, γδ T-세포는 외부 항원과 면역계의 주요 상호작용부위인, 상피 조직의 존재하는 T-세포 구획에 우세하게 존재할 수 있다는 것이 인식되었다. 또한, γδ T-세포 종양 면역감시 및 이상조절된-자가의 다른 형태의 감시에 대한 다양한 기전이 문헌에 출현하기 시작하고 있다. 선천적-유사 및 획득 γδ T-세포 둘 모두의 특이적 항원 표적은, 저조하게 정의되어 있지만, PAMP의 조직 분포 및 신속한 인식은 외부 항원에 대한 반응 초기에서뿐만 아니라 획득 면역계가 여전히 성숙하고 있는 삶의 초기 둘 모두에 γδ T-세포에 대한 근본적인 역할을 시사한다.
γδ T-세포의 다양한 기능은 상이한 Vγ Vδ 유전자 분절 사용을 기반으로 하는 것으로 보이며, 상당한 불변 TCR을 갖는 γδ T-세포가 감염 동안 매우 초기에 PAMP의 선천적-유사 인식을 매개한다는 2개의 주요 카테고리로 광범위하게 이해될 수 있다. PAMP을 넘어서서, 이러한 유형의 γδ T-세포는 세포 스트레스, 감염 및 잠재적인 신생물 발달의 매우 초기 특징을 제공할 수 있는 인항원을 비롯한, 자가-분자를 인식한다고 추가로 여겨진다. PAMP의 인식 및 이러한 소위 위험 연관된 분자 패턴(danger associated molecular patterns: DAMPS)뿐만 아니라 다수의 조직-제한된 선천적-유사 γδ T-세포는, 이러한 세포가 이전 활성화, 귀소 및 클론성 확장에 대한 필요성 없이 항원 시험감염에 신속하게 반응하기에 적합하다는 것을 강하게 시사한다.
γδ T-세포의 제2 형태는 본래 보다 획득성이라고 간주되며, 상당히 다양한 γδ TCR 레퍼토리 및 림프 조직 주변을 순환하고, 림프 조직에 직접 접근하는 능력을 갖는다. 공통 인간 병원체 예컨대, CMV에 대한 이러한 항원-특이적 γδ T-세포가 기술되어 있고, 그것은 기억 반응을 형성하는 것으로 보인다. 그러나, γδ T-세포는 활성화 후 단지 비교적 제한된 클론성 증식을 나타낸다는 것이 관찰되어 있고, 말초 순환 또는 조직에서 TCR 다양성 및 γδ T-세포의 특이적 반응의 정도에 대한 데이터는 거의 입수 가능하지 않다. 추가로, γδ TCR은 pHLA 복합체와 상호작용하지 않고, 따라서 이와 관련하여 펩타이드 항원과 결속하지 않는 것으로 일반적으로 간주되지만, γδ T-세포의 단지 소수의 항원 표적이 특징규명되어 있고, 기본적인 분자 프레임워크는 단지 저조하게 이해된다.
인간에서 말초 γδ T-세포의 낮은 빈도 및 조직-존재 T-세포의 연구 어려움으로 인해서, T-세포의 이러한 중요하고 다양한 유형이 획득 면역 반응에 어떻게 참여하는지에 대한 지식은 제한적이다. 이러한 최근 연구 분야는 희귀한 γδ T-세포를 포획 및 특징규명하고, 이의 TCR 쌍을 단리하고, 이의 동족 항원을 식별하는 매우 신뢰할 만한 기술을 필요로 한다.
항원 및 항원-제시 세포
T-세포 및 TCR과 관련하여, 항원은 TCR에 의해서 결속되어, T-세포 내에서 변환될 신호를 생성할 수 있는 임의의 분자로서 정의될 수 있다. 가장 잘 특징규명된 T-세포 항원은 HLAI 및 HLAII 복합체에서 제시되고, 종래의 αβ T-세포에 의해서 결속되는 펩타이드이다. 그러나, 최근에, 비-종래의 αβ T-세포 및 γδ T-세포가 지질, 지질펩타이드, 당펩타이드, 당지질 및 다양한 대사산물 및 이화산물(catabolite)을 비롯한, 항원으로서 광범위한 생물분자를 결속할 수 있다는 것이 명백해졌다. 또한, γδ T-세포가 완전히 폴딩된 단백질을 항체-유사 방식으로 직접 결속할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, HLA-제시된 펩타이드에 대해 상당히 제한될 T-세포 항원의 관점은 지난 이십년에 걸쳐서 대부분의 임의의 생물분자를 포함하도록 확장되었다. 이러한 개념을 염두하여, 그것은 항원-제시 세포(APC)로 간주될 수 있는 것을 정의하는 것에 관련된다.
상기 섹션에 정의된 바와 같이, HLAI 및 HLAII는 세포 유형에 걸쳐서 이질적인 발현 프로파일을 갖는다. 거의 모든 유핵 세포는 세포 표면 상에 HLAI 복합체를 제시하고, 따라서 T-세포 샘플링을 위한 펩타이드 항원을 제시하기에 유능하다고 널리 허용된다. 이에 반해서, HLAII는 제한된 발현 프로파일을 갖고, 적어도 정상 상태에서의 조건은 수지상 세포(DC), 대식세포 및 B-세포를 비롯한, 항원 제시에서 전문가 역할을 갖는 세포의 표면 상에서만 발현된다. 이러한 전문가 세포 유형을 종종 전문적인 APC라 지칭한다. 이러한 내용의 목적을 위해서, 용어 APC는 αβ 또는 γδ T-세포에 의한 샘플링을 위해서 항원을 제시할 수 있는 임의의 유핵 세포를 기술하는 데 사용된다. 이러한 항원은 특이적 항원-제시 복합체, 예컨대, HLA 및 HLA-유사 분자에서 '카고(cargo)'로서 제시된 것에 제한되지 않고, αβ 또는 γδ TCR-보유 세포에 결속할 수 있는 임의의 세포-표면 제시된 모이어티를 또한 포함할 수 있다.
TCR의 치료 용도
일차 T-세포의 입양 전달이 1990년대 초기에 임상 실험에서 먼저 시도되었고, 생체외 면역손상된 환자에서 바이러스 면역을 부여하기 위해서 바이러스 항원에 대해서 분극화된 생체외 확장된 T-세포에서 시작되었다. 특이적 암 항원에 대해서 생체외에서 확장된 일차 T-세포를 사용한 유사한 접근은 곧 악성종양의 치료에 시도되었다. 현재 도전으로 남아있는 이러한 초기 접근법에서의 하나의 제한은, 치료 제품에서 조성을 정밀하게 최적화할 필요성과 충돌하는, T-세포의 특성 및 다양성의 이해 부족이다. 현재, 생체외에서 확장된 일차 T-세포의 사용은, 바이러스 항원에 대해서 특이성을 갖는 일차 T-세포를 사용하는 소수의 계획을 제외하고는, 약제학적 분야에서 상당히 포기되었다.
최근, 일차 인간 세포에 유전 물질을 신뢰할 수 있게 도입하는 능력이 다양한 실험적인 유전적으로 변형된 T-세포 치료제에서 인지되었다. 이러한 치료 세포 생성물은, T-세포 반응의 능력을 견고하게 하고, 질환-연관된 항원 표적, 예를 들어, 악성 세포에 의해서 고유하게 발현되는 항원에 대해서 T-특이성을 재지향시키는 것을 목표로 한다. 이것은, 실제 TCR 쇄 쌍이 아니라 키메라 항원 수용체(CAR)의 수령자 T-세포의 전달에 상당히 좌우된다. CAR은 CD3-TCR 기능을 모방하는 합성 키메라 수용체를 생산하기 위해서, 신호 수용체 요소, 예컨대, CD3 복합체의 ζ-쇄에 그래프팅된 표적화 모이어티(가장 자주는 악성 세포의 표면 발현된 단백질을 표적화 하는 단일-쇄 항체 요소)를 나타낸다. 이러한 소위 CAR T-세포(CAR-T) 산물은 지금까지 임상 시험에서 혼합된 성공을 거뒀지만, 그럼에도 불구하고 이러한 가능성은 내재하는 고유한 분자 표적을 갖는 종양, 예컨대, B-세포 악성종양을 능가하는 것으로 해석되기에 용이하지 않다. 대안적으로, 전장 TCR 쇄 쌍 ORF의 T-세포 내로의 전달이 관심 대상이다. 이러한 TCR-조작된 T-세포 치료제는 현재 제조 공정의 문제점, CAR-T 산물과 유사하게, 검증된 항원 표적 및 표적화 작제물의 부족에 의해서 제한된다. 지금까지, 악성 세포 상의 HLAI에 의해서 제시된 펩타이드 항원의 인식을 위해서 αβ TCR을 사용하는 것에 초점이 맞춰져 있었고, 이러한 접근법의 기본적인 문제점은 악성 세포에 특이적인 항원에 대한 필요성이다.
TCR-pHLA 상호작용은 비교적 낮은-친화성을 갖기 때문에, 네이티브 TCR은 TCR-조작된 T-세포 치료제를 위한 최선이 아닌 것으로 간주되어 왔다. 몇몇 접근법은 단일-쇄 항체 친화성 성숙과 상당히 유사한 방식으로, 생체내에서 친화성-성숙 TCR을 고안하였다. 이러한 TCR 친화성 성숙 접근법은 일반적으로 또한 단일-쇄 포맷을 활용하는데, 여기서 하나의 쇄의 V-영역이 또 다른 쇄의 V-영역에 융합되어 단일 폴리펩타이드 작제물을 제조한다. 이어서 이러한 단일 폴리펩타이드가, 항체 조작 작업 흐름으로부터 개작되고, 표적 결합을 기준으로 몇몇 라운드의 선택을 통과한 파지- 또는 효모- 디스플레이 시스템에 사용될 수 있다. 2개의 내재하는 제한이, 기능성 TCR 쇄 쌍을 산출하는 것과 관련하여 이러한 단일-쇄 TCR 접근법에 존재한다. 먼저, 선택은 표적에 대한 결합 친화성을 기초로 한다. 그러나, TCR 친화성은 TCR 신호전달 산출물의 강도 또는 역량과 항상 상관관계가 있는 것은 아니라는 것이 양호하게 문헌화되어 있다. 두 번째로, 친화성을 기초로 하는 단일-쇄 작제물의 선택은 전장 수용체로서 재구성된 후 항상 동등한 친화성으로 번역되는 것은 아니다.
치료 관점에서, 친화성-성숙된 TCR 쌍에서의 추가적이고 결정적인 제한이 존재한다. 즉, 이의 서열이 변경되었음을 고려하면, 정의에 의해서 생성된 작제물은 흉선 선택에 더 이상 지배를 받지 않는데, 여기서 자가-항원에 강하게 반응하는 TCR은 레퍼토리로부터 결실된다. 따라서, 이러한 변형된 TCR은, 현재 방법을 사용하여 시험관내에서 제외시키기에 매우 어려운 자가-반응성인 내재하는 위험을 보유한다. 동일한 이유로 인해서, 치료 응용을 위한 임의의 선택된 또는 조작된 TCR은 개별화될 필요가 있다. TCR이 개체 전체에 적용되는 인공적으로 조작된 TCR 또는 네이티브 TCR인 경우, 교차 반응성은 잠재적으로 파국적인 자가면역을 회피하기 위해서, 각각의 특정 개체의 HLA 일배체형 및 제시된 펩타이드 레퍼토리를 기초로 제외되어야 한다. 이는, 흉선 선택이 주어진 개체의 것에만 특이적인 모든 사용 가능한 HLA 분자의 배경 상에서 수행된다는 사실로 인한 것이다. 이러한 교차 반응의 가능성은 불명확하다. 그러나, 동일한 종의 다른 개체의 pHLA 복합체를 외부물질로서 인식하는 TCR 레퍼토리의 능력은 획득 면역의 기본적인 특성이고, 이식 거부 및 이식편대숙주병을 뒷받침한다. 암-특이적 흑색종 연관된 항원(MAGE)에 대항하여 성숙된 TCR 쇄 쌍을 사용한 최근 임상 시험은 흉선 선택을 우회하는 잠재적인 문제를 강조하였다. 성숙된 TCR을 보유하는 자가유래 T-세포를 2명의 암 환자에게 다시 주입하였을 때, 이 환자는 치명적인 심장 질환이 신속하게 발달하였다. 후속 연구는, MAGE-특이적인 성숙된 TCR이 심장 단백질 티틴(titin)으로부터의 HLAI-제시된 펩타이드와 교차 작용성이었다고 결정하였다. 이는, 교차 작용성이 TCR의 치료 용도에서 구별되는 가능성이라는 것을 강하게 시사한다.
치료 목적을 위해서 TCR을 활용하는 별개의 방안은, 항체 치료 물질과 상당히 동일한 방식으로 친화성 시약으로서 이를 사용하는 것이다. 단일-쇄 TCR 분자를, 접합된 약물 물질의 특이적 HLA-항원 발현 세포 집단에 대한 전달에 대해서 시험하였다. 이러한 접근법은 일반적으로 CAR-T 또는 TCR 조작된 T-세포 치료제보다 안전한 것으로 간주되었는데, 그 이유는 약물 물질의 투여가 단순히 중단될 수 있기 때문이다. 그러나, 예측하기 어려운 교차 반응성 및 오프 타깃 효과에 대한 가능성이 이러한 설정에서 잠재적인 제한으로 존재한다.
임상 진단에서의 TCR 레퍼토리 검출
관련된 양상에서, 임상 진단 목적을 위해서 특이적 TCR 서열의 풍부도의 검출을 사용하는 것이 흥미로워지고 있다. 특히 딥(deep)-서열결정의 발달로 인해서, 특이적 맥락에서 개체 내에서의 완전 TCR 다양성을 광범위하게 그리고 매칭된 αβ 쌍에 대해서 이해하는 것이 가능하다. 이는, 환자에서 질환-연관된 항원에 대한 확립된 면역 반응에 대한 대용 판독물로서, 확장된 T-세포 클론의 풍부도를 단순히 검출함으로써, 특정 병태 및 질환 상태를 진단하기 위한 수단을 잠재적으로 나타낸다. 그러나, 이러한 포괄적인 접근법은 확립된 임상 시점에서 현재 매우 강한 면역 반응으로 제한되며, 서열결정을 통해서 식별된 임의의 특정 TCR의 특이적 항원 표적을 식별하는 데 있어서 근본적인 어려움을 겪는다.
T-세포 항원의 치료 및 진단 용도
획득 면역 반응을 사용한 근본적인 영향력은, TCR-항원 상호작용의 정교한 특이성이 각각의 병원체, 암 세포 또는 자가면역 질환과 특이적으로 연관된 항원의 상세한 지식을 필요로 한다는 점에서, 중추적인 기술적 도전으로 번역된다. 추가로, 각각의 항원은 특이적 항원 제시 복합체, 또는 이의 대립유전자에 의해서 제시될 수 있어서, 항원 발견이 각각의 관련된 HLA 유전자 및 대립유전자에 대해서 수행되었다. 강한 획득 면역 반응과 연관되고, 일반적으로 보존된 에피토프 반응 체계를 나타내는 몇몇 감염성 질환, 예컨대, HIV, 인플루엔자 및 CMV의 경우, 대부분의 중요한 에피토프는 일부 공통 HLA과 관련하여 맵핑되었다. 유사하게, 암, 알레르기 및 자가면역 분야는 연관된 T-세포 항원을 맵핑하기 위한 증가되고 조직적인 노력이 인지되었다. 그러나, 이것은 도전적인 절차이며, 상이한 임상 맥락과 연관된 T-세포 항원을 체계적으로 기술하기 위한 노력은 효율적이고, 강력하고, 신속하고 규모 확장 가능한 프로토콜의 부재에 의해서 방해된다.
구체적으로, 암 세포는 도전적이고 중요한 양상을 나타내는데, 그 이유는 악성 세포의 표면 상에 제시된 펩타이드 대부분이 자가 항원 또는 자가 항원과 매우 유사하기 때문이다. 따라서, 흉선 선택은 이러한 펩타이드를 강하게 인식할 수 있는 결실된 TCR을 가질 것이며, 동시에 종양은 면역 인식을 회피하도록 발달되었다. 이는, 확립된 종양에 대한 강력한 면역 반응은 비교적 희귀하고, 표적을 예측 또는 발견하기가 어렵다는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 반응은 존재하고, 중요하게는 더 양호한 결과와 일반적으로 연관된다. 이러한 반응의 표적, 종양-연관된-항원(TAA)은 대부분의 경우 자가로부터 구별되는 특징을 가질 것이고, 암 발달 동안 과발현되는 단백질로부터 유래되며, 그렇지 않았으면 이것은 이러한 발달 단계에서 세포 유형으로부터 존재하지 않았거나 유전자 돌연변이 또는 번역후 변형, 예컨대, 인산화를 통해 특이적으로 변경되었을 것이다.
입수 가능한 경우, 이러한 에피토프의 지식은 기본적인 발견, 진단 목적을 위해서 그리고 예를 들어 백신 효능의 시험으로서 연관된 T-세포 반응에서 정보를 얻는 것을 가능하게 한다. 중요하게는, 이것은 또한 알레르기 및 자가면역에서, 그리고 중요하게는, 특이적 면역요법에 대한 유용한 표적에 대한 지점에서 그리고 악성 세포에 대해서 T-세포 관용 유도(tolerization)를 위한 고도로 특이적인 표적을 제공한다. 악성종양은 세포 면역요법의 가능성으로서 특히 가치있는 표적을 나타내고, T-세포 조작에서의 진전은 암의 유형에 대한 특이적 마커가 입수 가능해지는 몇몇 경우를 넘어선 검증된 표적 TAA의 결핍에 의해서 둔화된다.
세포 요법의 가능성 및 검증된 표적의 결핍에 비추어, 특히 암을 치료하려는 노력에서, TCR-기반 면역요법의 가장 시급한 장애 중 하나는 유망한 TCR 항원의 식별이다.
TCR 및 T-세포 항원 분석의 기술적 양상
총괄적으로, TCR-기반 요법의 발달은 여전히 초기 단계이며, 성공은 제한적이었다. 진단 접근법은 엄청난 가능성을 갖지만, 환자 질환 상태 또는 치료에 대한 반응을 평가하는 것을 목표로 하는 제어된 임상 연구에 거의 적용되지 않는다. 네이티브 TCR 쇄 쌍의 믿을 수 있는 포획 및 높은 처리량 및 세포-세포 소통의 기능성 맥락에서의 TCR-항원 상호작용의 체계적인 분석을 위한 부족하게 개발된 기술은 TCR-기반 요법 및 진단법의 발달에 대한 주요 장애였다.
딥 서열결정 접근법은 건강한 상태 및 질환 상태에서 T-세포 수용체 다양성의 개선된 이해로 이어졌다. 그러나, 이러한 접근법은 일반적으로 주로 TCR β-쇄의 CDR3 영역을 연장하는 짧은 스트레치에 초점을 맞추고 있다. 대부분의 연구는 TCR α-쇄의 기여를 무시하였으며, 몇몇이 짝지워진 αβ 쇄뿐만 아니라 흥미로울 것으로 결정된 TCR의 항원 특이성을 분석하려고 하였다. 단일 세포 캡슐화 및 유전자 바코딩을 사용한 최근 작업 흐름은 네이티브 TCR αβ 또는 γδ 쇄 쌍의 짝지움 및 전장 서열의 분석을 가능하게 하였지만, 이러한 작업 흐름은 실험적인 것으로 남아있다.
단리된 TCR 쇄 쌍은 항원 특이성의 관점에서 생물물리학 또는 기능성 모드로 분석될 수 있다. 생물물리학 분석은 TCR뿐만 아니라 분석물 항원 둘 모두의 재조합 생산을 가용성 형태로 필요로 한다. HLA-제한된 TCR의 경우에, 따라서 이것은 모든 개별 TCR뿐만 아니라 동족 pHLA 복합체의 생성을 요구한다. 이것은 기술적으로 매우 도전적이고, 느리고 매우 낮은-처리량이다. 추가로, 이러한 분석은 상호작용 친화성을 단지 제공할 것인데, 이것은 기능성 특징과 예측 가능한 방식으로 양호하게 관련되지 않는다.
최근까지, 세포 맥락에서 단리된 TCR 서열의 상세한 기능성 분석은 분석물 TCR 쇄 쌍을 일차 T-세포 또는 불멸 T-세포주 내로 형질주입하는 실험적 프로토콜, 및 세포 활성화의 전통적인 유세포 분석에 의한 세포 반응의 검출 또는 항원 시험감염 시 형질주입된 세포로부터의 분비된 인자의 검출로 제한되었다. 구오(Guo) 등에 의한 최근 간행물에서, 단일-세포로부터의 짝지워진 TCR 쇄의 신속한 클로닝, 발현 및 기능성 특징규명이 보고되었다(Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3:15054). 이러한 연구에서, 분석물 인간 αβ TCR 쌍은 αβ TCR 발현이 결핍되고, TCR 자극 시 활성화되는 Nur77 프로모터에 연결된 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 시스템을 함유한 리포터 세포주에서 발현되었다. 이러한 시스템은 리포터 세포주 게놈 내에서의 표준화된 TCR 통합의 결핍으로 인해서 비효율적이며, APC 요소에 의한 세포-결합된 항원 시험감염을 위한 체계적인 방식을 제공하지 않는다.
공지된 T-세포 항원에 대한 TCR의 식별을 위한 작업 흐름과 유사하게, 건강한 상태 및 질환 상태에서 신규 T-세포 항원의 신생 발견은 매우 도전적이다. 대부분의 접근법은 본래 생물물리학적이며, 면역화 프로토콜로 또는 상기에 다룬 바와 같은 동족 TCR의 식별을 통해서 시험될 수 있는 후보물질 항원을 생산하는 것을 목적으로 한다. T-세포 항원 발견 분야에는 표준화가 거의 또는 전혀 존재하지 않으며, 이 분야는 학문적 연구로 상당히 제한된다.
치료 및 진단 용도 둘 모두에서 TCR 및 이의 동족 항원에서의 축적된 관심 및 상당한 수의 네이티브 TCR αβ 및 γδ 쇄 쌍을 포획하는 수단의 출현으로, TCR-항원 상호작용의 체계적인 분석을 위한 신뢰할 만한 높은-처리량 및 표준화된 기술이 부족하다. 중요하게는, TCR 및 항원 둘 모두가 생존 가능한 세포에 의해서 제시되는 세포-세포 소통의 본래 맥락에서 TCR 쇄 쌍의 기능성 분석에 대한 표준화된 시스템이 부족하다. 더욱이, 세포-세포 소통의 관련된 맥락에서, TCR 후보물질 선택 및/또는 TCR 쇄 쌍의 친화성 성숙을 달성할 수 있는 시스템이 부족하다.
기술된 바와 같이, 네이티브 세포 맥락에서 발현된 TCR 쌍을 갖는 세포를 높은 처리율로 생성시키기 위한 표준화된 기술이 현재 부족하다. 전장 TCR 쌍이 TCR-제시 세포의 게놈 내에 단일 카피로서 삽입되어 상기 TCR이 분석 및 선택을 위한 네이티브 CD3 세포-표면 복합체로 제시될 수 있는 시스템을 보유하는 것이 상당히 바람직하다. CD3 복합체-제시된 TCR 쌍은, 친화성 분석이 실제 네이티브 TCR 조성을 반영하는 것을 보장하며, 이것은 단일-쇄 TCR 및 다른 비-네이티브 TCR-디스플레이 기술에 대한 경우에는 그렇지 않다. 더욱이, 생존 가능한 세포 상의 CD3 복합체로의 TCR 쌍의 제시는 TCR 쌍의 기능성 분석에 대한 절대적인 요건이다. TCR 신호전달 산출물의 분석을 의미하는 기능성 분석은 TCR 선택 및 작업 흐름 조작에 상당히 중요하며, 여기서 신호 산출물은 세포 치료제의 맥락에서의 용도에 일반적으로 가장 중요하고, 다른 디스플레이 플랫폼 내에서 결정되는 바와 같은 TCR과 동족 항원/HLA의 친화성과 양호하게 상관관계가 없는 파라미터이다.
본 발명은 상기에 언급된 요구를 다룬다. 특히, 본 발명은 TCR 및 T-세포 항원의 발견 및 특징규명을 위한 2-부분 세포 디바이스의 작제 및 용도에 관한 것이다. 전체 세포 디바이스의 2 부분은 디바이스의 작동에서 나머지 것과 접촉되는 별개의 조작된 세포 유형으로 구성된다. 디바이스는 분석물 항원에 대한 분석물 TCR의 응답성의 표준화된 기능성 분석을 위해서 사용된다. 이러한 응답성의 판독치는 TCR의 식별 및 선택, T-세포 항원, TCR/항원 상호작용의 상세한 기능성 특징규명을 위해서 사용된다. 디바이스는 eAPC 시스템(eAPCS)을 사용하여 제조된 조작된 항원 제시 세포(engineered antigen-presenting cell: eAPC)인 제1 세포 집단을 통해서 분석물 항원을 제시한다. 디바이스는 eTPC 시스템(eTPCS)을 사용하여 제조된 조작된 TCR-제시 세포(engineered TCR-presenting cell: eTPC)인 제2 세포 집단을 통해서 분석물 TCR을 제시한다.
본 발명의 2-부분 디바이스는 분석물 TCR 및 T-세포 항원 수집물의 복잡성을 상당히 제한하고, 높은 정도의 표준화, 재현성을 가능하게 하는 특징을 갖는다. 주로, 이러한 표준화는, eAPC의 게놈에 대한 분석물 항원-제시 복합체 및 항원의 정의되고 고도로 제어된 통합, 및 eTPC의 게놈에 대한 TCR의 정의되고 고도로 제어된 통합을 통해서 달성된다. 이는 분석물 세포 집단을 생성하기 위한 신속한 사이클 시간을 허용하고, 현재 무작위-통합 및 바이러스 벡터 플랫폼의 비용을 크게 감소시킨다. 더욱이, 본 발명은 eAPC- 및 eTPC- 둘 모두의 중심 방식으로 분석물 엔티티의 세포-기반 어레이의 생성을 허용하는데, 이는 벡터의 큰 라이브러리가 세포 집단에 통합되고, 세포당 단일 분석물 엔티티를 발현하는 세포의 라이브러리로서 검정될 수 있다는 것을 의미한다. eAPC 및 eTPC의 게놈 내에 조작될 단일-카피 게놈 수용자 부위는, 이를 통해서 달성되어, 매칭된 공여자 벡터 내에 ORF(HLA의 경우, 항원 또는 TCR 쇄)에 의해서 제공되는 경우, 단지 ORF의 단일 카피만 벡터 풀로부터 통합될 수 있다. 이는, 벡터 풀이 혼합된 아이덴티티의 ORF를 포함하는 경우, 각각의 통합된 세포는 단일 아이덴티티를 단지 통합하여; 박테리오파지와 유사한 다른 디스플레이 플랫폼과 유사한 세포-기반 어레이를 본질적으로 생성할 것이라는 것을 의미한다. 이러한 높은 수준의 표준화 및 복잡성의 감소는 일차 또는 불멸 세포 배양물 및 연장된 과성장 및 내인성 신호전달 반응을 사용하여 출력물 또는 APC- 또는 T-세포- 중심 입력물의 부분적인 체계화를 달성하는 현재 방법과 상반된다. 중요하게는, 본 발명이 나타내는 2-부분 조작된 세포 디바이스는 세포-세포 상호작용과 관련하여 관련된 기능성 반응의 표준화를 달성한다. 이는, 생체내에서 효과의 예측성을 증가시킴으로써 새로운 TCR 및 T-세포 항원 후보물질의 발견 및 임상 시험의 시간 및 비용을 감소시키는 데 중요하다.
본 발명은 2-부분 디바이스의 제공 및 작동에 관한 것이며, 여기서 제1 부분은 조작된 항원-제시 세포 시스템(eAPCS)이고, 제2 부분은 조작된 TCR-제시 세포 시스템(eTPCS)이다. 종합적으로, 이 디바이스는 T-세포 항원의 TCR 인식의 기능성 분석을 위한 조작된 인간 세포의 2개의 상이한 유형으로 구성된 다세포 분석 시스템을 나타낸다. 이 디바이스의 주요 산출물은 분석물 항원 또는 분석물 TCR을 발현하는 세포인데, 이것은 그 다음 디바이스의 최종 산출물을 각각 특이적 T-세포 항원 또는 TCR 서열로서 결정하는 데 사용될 수 있다(도 1).
2-부분 디바이스는 하기를 포함하는 2 단계로 작동되며:
i. 단계 1, 분석물 항원 및 분석물 TCR 보유 세포 집단 및 이의 조립물을 조합된 시스템으로 제조하고 2종의 분석물 세포 집단과 접촉시킴,
ii. 단계 2, 조합된 시스템의 접촉된 세포 집단 중 어느 것에 내재하는 반응을 판독하여 디바이스의 산출물을 수득함,
여기서 eAPCS 및 eTPCS는 각각 분석물 eAPC 및 eTPC 집단을 제조하여, 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로 조립하기 위한 수단을 제공한다(도 1, 단계 i 및 ii).
eAPCS는 조합된 eAPC:eTPC 시스템에 제공된 분석물 eAPC 집단의 다양한 형태를 제조하기 위한 시스템으로서 정의되며, 여기서 분석물 eAPC 집단은 하기 중 하나로서 정의되고:
i. eAPC-p,
ii. eAPC-a,
iii. eAPC-pa,
iv. 이의 라이브러리,
여기서 조합된 eAPC:eTPC 시스템에 대한 입력 분석물 eAPC 집단의 선택은 디바이스의 작동의 대상인 항원의 특성에 의해서 결정된다. 즉, eAPC:eTPC 시스템으로 조합된 요구되는 eAPC 집단은 디바이스로부터의 요구되는 일차 산출물, 및/또는 디바이스로부터의 요구되는 최종 산출물에 의해서 정의된다(도 1, 단계 i).
eTPCS는 조합된 eAPC:eTPC 시스템에 제공된 분석물 eTPC 집단을 제조하기 위한 시스템으로서 정의되며, 여기서 분석물 eTPC집단은 하기 중 하나로서 정의되고:
i. eTPC-t,
ii. eTPC-t의 라이브러리,
여기서 조합된 eAPC:eTPC 시스템에 대한 입력 분석물 eTPC 집단의 선택은 디바이스의 작동의 대상인 TCR의 특성에 의해서 결정된다. 즉, eAPC-eTPC 시스템으로 조합된 요구되는 eTPC 집단은 디바이스로부터의 요구되는 일차 산출물, 및/또는 디바이스로부터의 요구되는 최종 산출물에 의해서 정의된다(도 1, 단계 ii).
디바이스로부터의 일차 산출물은 선택된 세포 집단인데, 이것은 eAPC:eTPC 시스템에 제공된 상호 세포에 의해서 제시된 분석물에 대한 응답하거나 또는 응답하지 않았다. 즉, 이러한 일차 산출물은 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내의 보고된 반응의 존재 및 부재에 대해서 선택된, 단일 세포 또는 세포의 풀로서 표현될 수 있다(도 1 단계 v). 분석물 eAPC 내에서의 반응은 접촉한 eTPC에 의해서 제시되는 동족 TCR의 결속에 의해서 단지 유발된다. 분석물 eTPC 내에서의 반응은 접촉한 eTPC에 의해서 제시되는 동족 항원의 결속에 의해서 단지 유발된다(도 1 단계 iv).
조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터의 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC의 선택은 접촉한 세포에서의 반응을 기초로 수행될 수 있다. 즉, 분석물 eAPC는 접촉한 분석물 eTPC에서, 보고된 반응, 또는 이의 결핍을 기초로 선택될 수 있다. 이에 반해서, 분석물 eTPC는 접촉한 분석물 eAPC에서, 보고된 반응, 또는 이의 결핍을 기초로 선택될 수 있다.
디바이스로부터의 일차 eAPC 산출물은 선택된 세포이며, 여기서 선택은 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재를 기초로 하고, 이러한 세포는 하기 중 1종 이상을 포함할 수 있고:
i. eAPC-p,
ii. eAPC-a,
iii. eAPC-pa,
여기서 선택된 세포는 단일 세포, 동일한 아이덴티티의 세포의 풀, 상이한 아이덴티티의 세포의 풀을 포함할 수 있다(도 1 단계 v).
디바이스로로부터의 일차 eTPC 산출물은 선택된 세포이며, 여기서 선택은 분석물 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재를 기초로 수행되며, 이러한 세포는 eTPC-t를 포함하고, 여기서 선택된 세포는 단일 세포, 동일한 아이덴티티의 세포의 풀, 상이한 아이덴티티의 세포의 풀을 포함할 수 있다(도 1 단계 v).
2-부분 세포 디바이스가 작동되는 경우, eAPC:eTPC 시스템을 제조하고 조합하기 위한 분석물 세포 집단의 선택은 eAPC 및 eTPC 집단 각각이 제시하는 분석물의 특성에 의해서 결정된다.
eAPC-p는 세포 표면 상에서 항원-제시 복합체(aAPX)를 발현하는 것으로서 정의된다. aAPX는 항원 카고로서 적재된 카고 분자(CM)를 가질 수 있다. 항원 카고에 적재된 aAPX는 aAPX:CM 복합체라고 정의된다.
eAPC-a는 분석물 항원 분자(aAM)를 발현하는 것으로 정의된다. 이러한 aAM은 세포 표면 상에 제시되고/거나 세포내에서 발현 또는 가공될 수 있어서, 그것은 aAPX 내에 적재될 수 있는 카고 aAM을 나타낸다.
eAPC-pa는 aAPX 및 aAM 둘 모두를 발현하는 것으로 정의된다. aAM은 세포내에서 발현 또는 가공될 수 있어서 그것은 aAPX 내에 적재될 수 있는 카고 aAM을 나타낸다. 따라서 eAPC-pa는 세포 표면에서 aAPX를 발현하고, 또한 상기 aAPX 내에서 카고로서 적재된 aAM을 발현할 수 있는데, 이것은 aAPX:aAM 복합체라고 정의된다. eAPC-pa는 aAPX 내에 카고로서 aAM을 적재하지 않고 aAPX:aAM 복합체를 형성하는 것이 가능하다. 더욱이, 생물학적 시스템의 특성으로 인해서, aAPX:CM 복합체가 또한 aAPC-pa 내에 존재하는 것은 불가피하다.
eTPC-t는 CD3과 복합체를 이룬 TCR 표면 단백질로서 발현되는 TCR 쇄의 분석물 쌍(TCRsp)을 보유하는 것으로 정의되며, 여기서 CD3은 TCR 이종이량체 쌍이 존재하고, 이것은 3종의 이량체로서 상보성 TCR 쇄의 쌍과 회합된 ε, γ, δ 및 ζ 소단위를 보유하는 것으로 정의되는 표면 복합체(εγ, εδ, ζζ)를 나타낸다. CD3의 발현 및 한 쌍의 상보성 TCR 쇄는 세포 표면에서의 제시를 위해서 요구되며, 따라서 TCR 또는 CD3의 발현의 부재는 상호가 세포 표면 상에 제시되는 것을 예방할 것이다. eTPC-t의 제조 시에, αβ 또는 γδ TCR 쌍 및/또는 CD3의 발현은 양성 선택으로서 사용된다. 따라서, eTPC-t를 제조하는 데 사용되는 TCR α, β, γ 또는 δ 쇄 조합과 관계없이, CD3과 복합체를 이룬 세포의 표면 상에 제시된 한 쌍의 상보성 TCR 쇄를 갖는 세포만 단지 eTPC-t라고 지정된다.
상기 일차 산출물 모두는 조합된 eAPC:eTPC 시스템에서 이의 보고된 반응을 기초로 실시된 선택으로부터 유래된 세포 집단을 나타낸다. 각각의 분석물 eAPC는 잠재적인 분석물 항원, 내재하는 카고 분자 및/또는 분석물 항원 제시 복합체의 세트를 제시하지만, eTPC는 분석물 TCRsp를 제시한다. 그것은 선택된 분석물 분자가 최종 디바이스 산출물로서 수득될 수 있는 선택된 분자로부터 유래된다(도 1, 단계 vi).
eAPC-p는 세포 표면에서 aAPX를 제시하는 것으로 정의되며, 세포 표면에서 aAPX:CM 복합체를 제시할 수 있다. 따라서, 보고된 반응을 기초로 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터 선택된 eAPC-p를 사용하여 aAPX, CM 및/또는 aAPC:CM 최종 디바이스 산출물을 결정할 수 있고, 여기서 이러한 산출물 아이덴티티는 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내의 선택된 eAPC-p와 접촉된 분석물 eTPC-t에 의해서 제시된 분석물 TCRsp와 복합체를 형성하고/거나 이것에 의해서 자극된 신호 반응을 보고하는, 결정된 분석물 항원의 능력에 따라서 선택되었다.
eAPC-a는 세포 표면 또는 세포 내에 aAM을 제시하는 것으로 정의된다. 따라서, 보고된 반응을 기초로 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터 선택된 eAPC-a를 사용하여 AM 최종 디바이스 산출물을 결정할 수 있고, 여기서 이러한 산출물 아이덴티티는 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내의 선택된 eAPC-a와 접촉된 분석물 eTPC-t에 의해서 제시된 분석물 TCRsp와 복합체를 형성하고/거나 이것에 의해서 자극된 신호 반응을 보고하는, 결정된 분석물의 능력에 따라서 선택되었다.
eAPC-pa는 세포 표면에서 aAPX, aAM, aAPX, aAPX:aM 또는 aAPX:CM을 제시하는 것으로 정의된다. 따라서, 보고된 반응을 기초로 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터 선택된 eAPC-pa를 사용하여 AM, aAPX, aAPX:aM 및/또는 aAPX:CM 최종 디바이스 산출물을 결정할 수 있고, 여기서 이러한 산출물 아이덴티티는 조합된 eAPC-pa 시스템 내의 선택된 eAPC-a와 접촉된 분석물 eTPC-t에 의해서 제시된 분석물 TCRsp와 복합체를 형성하고/거나 이것에 의해서 자극된 신호 반응을 보고하는, 결정된 분석물의 능력에 따라서 선택되었다.
상기에서 다룬 바와 같이, 분석물 eAPC의 선택은 접촉한 eTPC에서 보고된 반응을 기초로 수행될 수 있다. 따라서, eTPCS에 대한 TCRsp 입력물(들)이 분석물 eTPC-t의 제조 이전에 공지되어 있다면, eAPC-p, eAPC-a 및 eAPC-pa 중 임의의 것을 사용하여 TCRsp 산출물을 간접적으로 수득할 수 있다.
본 발명에서 eTPC-t는 TCRsp를 제시하는 것으로서 정의된다. 따라서, 보고된 반응을 기초로 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터 선택된 eTPC-t를 사용하여 TCRsp 최종 디바이스 산출물을 결정할 수 있고, 여기서 이러한 산출물 아이덴티티는 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내의 선택된 eTPC와 접촉된 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원과 복합체를 형성하고/거나 이것에 의해서 자극된 신호 반응을 보고하는, 결정된 분석물 TCRsp의 능력에 따라서 선택되었다.
상기에서 다룬 바와 같이, 분석물 eTPC의 선택은 접촉한 eAPC에서 보고된 반응을 기초로 수행될 수 있다. 따라서, eAPCS에 대한 그러한 분석물 항원 입력물(들)이 분석물 eAPC의 제조 이전에 공지되어 있다면, eTPC를 사용하여 분석물 항원 산출물, aAM, aAPX, aAPX:aM 및/또는 aAPX:CM 중 임의의 것을 간접적으로 수득할 수 있다.
eAPCS의 설명
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명은 2-부분 세포 디바이스를 제공하는 것에 관한 것이며, 여기서 각각의 부분은 조작된 세포 시스템이다. 제1 조작된 세포 시스템은 디바이스 내의 2-부분 eACP:eTPC 시스템으로 조합하기 위해서 분석물 eAPC를 제조하는 데 사용되는 조작된 다성분 eAPCS이다.
eAPCS의 최소 형태는 다성분 시스템인데, 여기서 제1 성분은 게놈 수용자 부위인 성분 B로서 제2 성분을 함유하는, 성분 1A라고 지정된 eAPC이고, 제3 성분은 성분 1C라고 지정된 유전자 공여자 벡터이다(도 2).
eAPC는 시스템의 모든 다른 성분이 관련된 eAPCS의 기본 성분을 나타낸다. 따라서, eAPC는 eAPC를 eAPCS 및 조합된 2-성분 디바이스 둘 모두에서 사용하기에 적합하게 만드는, 네이티브이거나 또는 조작된 특정 특징부를 함유한다.
본 발명에서 eAPC, 성분 1A는,
i. aAPX의 적어도 1종의 패밀리 및/또는 aAM의 내인성 표면 발현이 결핍되어 있고,
ii. 성분 1B라고 지정된 적어도 하나의 게놈 수용자 부위를 함유하며,
여기서 i)은 aAPX 및/또는 aAM의 상기 발현이 결핍된 자연 발생 세포 집단의 선택에 의해서 수득될 수 있거나, 또는 이러한 발현이 결핍되도록 조작될 수 있고, ii) 이것은 합성적이고, 이것은 유도된 또는 비유도된 게놈 통합에 의해서 도입될 수 있다.
자연 발생 세포 집단으로부터의 목적하는 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 eAPC 세포 후보물질의 선택은 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해서 달성될 수 있다. 이는, 표적 세포를, eAPC로부터 결핍되는 것이 바람직한 aAPX 및/또는 aAM에 대해서 특이적인 친화성 시약으로 표적 세포를 염색하고, 표적 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 직접 달성될 수 있다.
aAPX 및/또는 aAM 발현을 결핍시키기 위한 세포의 조작은 비표적화 수단 및 표적화 수단에 의해서 달성될 수 있다. 세포의 비표적화 돌연변이발생은, 세포에 화학적, 방사선학적 또는 다른 돌연변이원을 제공하고, 이어서 표적 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다. 게놈 유전자좌의 표적화된 돌연변이는,
i. 아연-핑거 뉴클레아제,
ii. CRISPR/Cas9 매개된 표적화,
iii. 합성 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)
를 통한 부위 지향된 돌연변이 발생을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 상이한 수단을 통해서 달성될 수 있고, 여기서 상기 부위-지향된 뉴클레아제는 표적 유전자좌에서 부위-특이적 DNA-수선 오류 돌연변이발생(비-상동 말단-연결(non-homologous end-joining)이라고도 공지됨)을 유도하고, 그 후 표적 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 돌연변이된 세포가 수득된다.
성분 1A인 eAPC는 추가적인 T-세포 공자극 수용체를 선택적으로 포함할 수 있는데, 여기서 이러한 특징부는 분석물 eTPC에 대한 분석물 eAPC의 소통의 견고하거나 다양한 형태를 허용하며, 여기서 조정 가능한 소통은 특이적 분석물 TCRsp 및/또는 분석물 항원의 식별 또는 특징규명과 관련된다. 본 발명에서, eTPC에 대한 CD28 결찰의 상이한 형태는 CD80, CD86 및/또는 추가의 B7 패밀리 단백질 중 하나 이상의 포함에 의해서 촉진될 수 있다.
성분 1A인 eAPC는 분석물 eTPC와의 eAPC 결속 및 면역학적 시냅스의 형성을 촉진시키기 위해서, 또는 각각 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서의 강한 결합 및 유해한 세포 클러스터링의 형성을 방지하기 위해서, 도입된 세포 표면 접착 분자 성분, 또는 내인성 세포 표면 접착 분자의 절제를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 ORF로서 성분 1A에 도입되거나, 1A로부터 유전적으로 절제될 수 있는 이러한 접착 분자는 접착 단백질의 인테그린 패밀리로부터 선택될 수 있다.
eAPC는 네이티브 가공 및 적재 머시너리에 의해서, aAPX 내에 항원을 카고로서 가공 및 적재하는 능력을 선택적으로 보유할 수 있다. 네이티브 가공 및 적재 머시너리에 의해서 항원을 카고로서 aAPX 내에서 가공 및 적재하는 능력을 보유하는 eAPC는 또한 eAPC 또는 그것이 함유된 배양계에 고유한 카고 분자(CM)를 가공 및 적재할 것이며, 여기서 CM이 적재된 aAPX는 aAPX:CM 복합체로서 지정된다.
최소 다성분 eAPCS의 제2 성분은 유전자 공여자 벡터인 성분 1C이며, 이것은 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF의 통합을 위해서 사용된다(도 2).
성분 1C는 eAPC인 성분 1A의 게놈 내에 함유된 성분 1B의 게놈 수용자 부위와 커플링된 유전자 공여자 벡터이다. 성분 1C는, 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된, aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 1종 이상의 ORF를 게놈 수용자 부위, 1B에 통합시키도록 설계되며, 여기서 통합은 표적 eAPC에 의한 aAPX 및/또는 aAM의 발현을 초래한다.
본 발명에서, 짝지워진 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 통합 커플로서 기술된다.
확장된 형태 또는 다성분 eAPCS에서, 성분 1A eAPC는 성분 1D라고 지정된 제2 게놈 수용자 부위를 추가로 함유할 수 있는데, 이것은 시스템에 또한 첨가되는, 제2 게놈 공여자 벡터인 지정된 성분 1E에 커플링된다(도 3).
다성분 eAPCS는 1종 이상의 추가적인 통합 커플을 추가로 포함할 수 있다.
eAPC 및 하나 또는 2개의 통합 커플 중 하나를 포함하는, 다성분 eAPCS가 하기 유도체 eAPC 형태의 제조를 위해서 사용되며,
i. eAPC-p,
ii. eAPC-a,
iii. eAPC-pa,
여기서 각각의 유전자 공여자 벡터는, i)이 적어도 1종의 aAPX를 발현하고, ii)이 적어도 1종의 aAM을 발현하고, iii)이 적어도 1종의 aAPX 및 적어도 1종의 aAM을 발현하도록, 상기 ORF를 커플링된 게놈 수용자 부위에 통합하기 위한, 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 1종 이상의 ORF를 함유할 수 있다(도 4).
유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 eAPCS의 통합 커플 서브시스템으로서 작동한다. 유전자 공여자 벡터는 먼저 표적 ORF와 조합되어야 하며, 기본 공여자 벡터는 이제 이러한 표적 ORF를 암호화한다. 이어서, 이러한 조립된 프라이밍된 공여자 벡터는 표적 eAPC에 도입되어 게놈 수용자 부위에 대한 표적 ORF(들)를 교환함으로써, 표적 ORF를 표적 세포의 커플링된 수용자 부위에 통합한다(도 5).
유전자 공여자 벡터 성분 1C 및/또는 1E를 포함하는 다성분 eAPCS는 적어도 1종의 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 적어도 1종의 ORF와 조합되어 성분 1C' 및/또는 1E'를 수득할 수 있고, 여기서 조합은 유전자 공여자 벡터의 적절한 암호화 프레임(correct coding frame)(들) 내로의 그리고 적절한 배향(들)으로의 유전 물질의 결찰로서 정의된다.
1종 이상의 ORF의 유전자 공여자 벡터 1C 및/또는 1E 내로의 조합은,
i. 다수의 ORF를 암호화하는 1C' 및/또는 1E' 벡터의 개별 라이브러리를 수득하기 위한 단일 개별 반응
ii. 다수의 ORF를 암호화하는 1C' 및/또는 1E' 벡터의 풀링된 라이브러리를 수득하기 위한 단일 반응
으로서 고유한 ORF의 라이브러리를 사용하여 수 회 수행될 수 있으며, 여기서 개별 라이브러리는 고유한 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 고유한 ORF를 갖는 eAPC의 개별 라이브러리를 수득하도록 성분 1A와 수 회 조합될 수 있거나, 또는 풀링된 라이브러리는 고유한 aAPX 및/또는 aAM을 암호화하는 고유한 ORF를 각각 갖는 eAPC의 풀링된 라이브러리를 수득하도록 단일 사례로서 성분 1A와 조합될 수 있다.
1종 이상의 ORF의 예측 가능한 카피 수의, 게놈 수용자 부위 내로의 효율적인 통합은, 분석물 eAPC 집단이 신속하게 제조 및 특징규명될 수 있는 표준화된 eAPC의 작동에 상당히 이롭다. 따라서, 게놈 수용자 부위(들) 및 커플링된 공여자 벡터(들)는 eAPC의 기능에 중요하다. 추가로, 성분 1B 및 1D가 서로 격리되어, 공여자 벡터 성분 1C가 성분 1B에서 통합할 수 없거나, 그 역인, eAPC를 갖는 것이 상당히 바람직하다. 또한, 성분 1B 및/또는 1D는, 분석물 항원의 도입이 aAPX 및/또는 aAM의 목적하는 카피 수의 정확한 통합 및 전달의 높은 가능성으로, 신속하고, 반복 가능한, eAPC의 제조 방법에서 처리될 수 있는 것이 또한 바람직하다.
게놈 수용자 부위는 하기로부터 선택될 수 있고:
i. 리콤비나제 매개된 카세트 교환(recombinase mediated cassette exchange: RMCE)을 위해 설계된 합성 작제물,
ii. 부위 지향된 상동 재조합을 위해 설계된 합성 작제물,
iii. 부위 지향된 상동 재조합을 위한 네이티브 게놈 부위,
여기서 i)이 바람직하다. RMCE 방법은, 개별 리콤비나제 효소에 특이적인 선택된 이종특이적 부위를 사용할 수 있어서, 각각의 성분 1B 및 1D는 격리된 특이성을 보유한다.
본 발명에서, 게놈 수용자 부위인 성분 1B 및/또는 성분 1D는 하기 유전 요소 중 적어도 하나로 구성된다:
i. 이종특이적 리콤비나제 부위,
ii. 상동 아암,
iii. 진핵생물 프로모터,
iv. 진핵생물 조건 조절 요소(eukaryotic conditional regulatory element),
v. 진핵생물 종결인자,
vi. 선택 마커,
vii. 스플라이스 수용자 부위,
viii. 스플라이스 공여자 부위,
ix. 비-단백질 암호 유전자,
x. 인설레이터(insulator),
xi. 이동성 유전 요소,
xii. 메가뉴클레아제 인식 부위,
xiii. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
xiv. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
xv. 코작 공통 서열.
바람직한 게놈 수용자 부위는 이전에 언급된 요소 목록으로부터의 하기 선택된 요소를 사용하는 2종의 상이한 배열로 구성될 것이다. 제1 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 하나 이상의 aAM 쇄 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 단일 ORF를 수용하기 위한 것이며, 여기서 배열은
5' -[A] [B] [C] [D] [E] [F]- 3'이고,
여기서;
A)는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고,
B)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
C)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
D)는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커이고,
E)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
F)는 요소 v) 진핵생물 종결인자이다.
제2 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 1종 이상의 aAM 및/또는 통합의 선택 마커를 암호화하는 2종의 ORF를 수용하기 위한 것이며, 여기서 배열은
5' -[A] [B] [C] [D] [E] [F] [G] [H] [I]- 3'이고,
여기서;
A)는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고,
B)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
C)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
D)는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커 1이고,
E)는 요소 v) 진핵생물 양방향성 전사 종결인자이고,
F)는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커 2이고,
G)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
H)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
I)는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고,
추가로, 이러한 제2 배열에서 요소 F, G 및 I는 안티센스 방향으로 암호화된다.
성분 1C 및/또는 1E는 하기 유전 요소 중 적어도 하나로 구성된다:
i. 이종특이적 리콤비나제 부위,
ii. 상동 아암,
iii. 진핵생물 프로모터,
iv. 진핵생물 조건 조절 요소,
v. 진핵생물 종결인자,
vi. 선택 마커,
vii. 스플라이스 수용자 부위,
viii. 스플라이스 공여자 부위,
ix. 비-단백질 암호 유전자,
x. 인설레이터,
xi. 이동성 유전 요소,
xii. 메가뉴클레아제 인식 부위,
xiii. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
xiv. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
xv. 코작 공통 서열,
xvi. 통합의 선택 마커,
xvii. 항생제 내성 카세트,
xviii. 박테리아 복제 기점,
xix. 효모 복제 기점,
xx. 클로닝 부위.
유전자 공여자 벡터의 바람직한 실시형태에서, 성분 1C 및/또는 성분 1E는 이전에 언급된 요소 목록으로부터의 하기 선택된 요소를 사용하는 2종의 상이한 가능한 배열을 포함할 것이다.
제1 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 1종 이상의 aAM 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 단일 ORF의 전달을 위한 것이며, 여기서 배열은
5' - [A] [B] [C] [D] [E] - 3'이고,
여기서;
A)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
B)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
C)는 요소 xx) 1종 이상의 aAPX 및/또는 1종 이상의 aAM을 암호화하는 단일 ORF의 클로닝 부위 및/또는 요소 xvi) 통합의 선택 마커이고,
D)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
E)는 요소 xvii) 항생제 내성 카세트 및 요소 xviii) 특정 배향이 아닌 박테리아 복제 기점이고,
추가로, 요소 viii 및/또는 xiv는 다수의 aAPX 및/또는 1종 이상의 aAM 및/또는 요소 xvi을 함께 연결하기 위해서 사용될 수 있다.
제2 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 2종의 ORF의 전달을 위한 것이며, 여기서 배열은
5' - [A] [B] [C] [D] [E] [F]- 3'이고,
여기서;
A)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
B)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
C)는 요소 xx) 1종 이상의 aAPX 및/또는 1종 이상의 aAM을 암호화하는, 진핵생물 종결인자를 갖는, 2종 이상의 ORF의 도입을 위한 클로닝 부위 및/또는 요소 xvi) 통합의 선택 마커이고,
D)는 요소 xv) 코작 공통 서열(안티센스 방향)이고,
E)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
F)는 요소 xvii) 항생제 내성 카세트 및 요소 xviii) 특정 배향이 아닌 박테리아 복제 기점이고,
추가로, 요소 viii 및/또는 xiv는 각각의 ORF 내에서 다수의 aAPX 및/또는 aAM 및/또는 요소 xvi을 함께 연결하기 위해서 사용될 수 있다.
eAPCS에서의 분석물 eAPC 집단의 제조
상기에 기술된 eAPCS 시스템을 다양한 방식으로 사용하여, 2-부분 디바이스의 작동 시에 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서 eTPC에 분석물 aAPX, aAM, aAPX:aAM 및 aAPX:CM을 제시하기 위해서 제공되는, 분석물 eAPC의 별개의 형태, 또는 이의 라이브러리를 제조할 수 있다.
단일 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, aAPX에 대한 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-p를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면에 존재한다(도 6).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, aAPX에 대한 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-p를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면에 존재한다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 7).
단일 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, aAM에 대한 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAM이 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-a를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM을 발현하고, 세포 표면에 존재하거나 또는 세포내에 유지된다(도 8).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, aAM에 대한 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAM이 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-a를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM을 발현하고, 세포 표면에 존재하거나 또는 세포내에 유지된다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 9).
단일 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, 2종의 ORF(하나는 aAPX를 암호화하고, 나머지는 aAM을 암호화함)와 조합된 성분 1C'를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX 및 aAM을 발현하고, 세포 표면에서 aAPX:aAM을 제시할 수 있다(도 10).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, 2종의 ORF(하나는 aAPX를 암호화하고, 나머지는 aAM을 암호화함)와 조합된 성분 1C'를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX 및 aAM을 발현하고, 세포 표면에서 aAPX:aAM을 제시할 수 있다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 11).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, aAPX 또는 aAM을 암호화하는 하나의 ORF와 각각 조합된 성분 1C' 및 1E'를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 1B 또는 1D에 통합되어, 1B' 및 1D'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX 및 aAM을 발현하고, 세포 표면에서 aAPX:aAM을 제시할 수 있다(도 12).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, 먼저 aAPX를 암호화하는 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면에 존재한다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 1E'가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터가 aAM을 암호화하는 ORF와 조합되어 이러한 aAM이 부위 1E에 통합되어, 1E'를 생성한다. 생성된 세포주는 제공된 aAM을 발현하고, 이것은 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 13).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, 먼저 aAM을 암호화하는 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAM이 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM(eAPC-a 중간체)을 발현한다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 1E'가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터가 aAPX을 암호화하는 ORF와 조합되어 이러한 aAPX가 부위 1E에 통합되어, 1E'를 생성한다. 생성된 세포주는 제공된 aAPX를 발현하고, 이것은 세포 표면 상에 제시된다. 제1 단계에서 통합된 aAM은 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 14).
eAPC로부터 분석물 eAPC-p, eAPC-a 및 eAPC-pa 집단을 제조하는 상기에 언급된 예에서, eAPCS 시스템을 사용하여 정의된 방식으로 공지된 aAPX 및 aAM 후보물질을 제공하여 정의된 aAPX 및/또는 aAM을 발현하는 분석물 eAPC의 개별 집단을 제조한다. 이러한 공정은 수 회 반복되어 eAPC-p, eAPC-a 및 eAPC-pa의 라이브러리를 제조하여 디바이스의 작동 시에 조합된 eAPC:eTPC 시스템을 제공할 수 있다. 대안적인 접근법은 유전자 공여자 벡터와 조합된 후보물질 aAPX 및/또는 aAM ORF의 풀링된 라이브러리를 취하고, 이것을 단일 반응으로 통합하여 다수의 aAPX, aAM 및/또는 aAPX:aAM을 발현하는 분석물 eAPC-p, eAPC-a 또는 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 수득하는 것이다. 벡터의 풀을 eAPC-p, -a, 및/또는 -pa의 풀로 전환시키는 공정은 샷건 통합이라 지칭될 것이다. 이것은, 고정된 aAPX에 대한 고정된 후보물질 aAM의 큰 라이브러리 또는 그 역을 분석하는 경우 특히 유용하다.
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, 먼저 aAPX를 암호화하는 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAPX가 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 세포 표면 상에서 제공된 aAPX를 발현한다(eAPC-p 중간체). 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 다수의 1E'의 라이브러리가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터의 라이브러리는 aAM을 암호화하는 단일 ORF와 각각 조합된 벡터의 풀을 포함하여 각각의 aAM이 부위 1E에 통합되어, 단일 세포 내에 1E'를 생성한다. 세포의 생성된 풀은 세포의 수집물을 함유하는데, 여기서 각각의 세포는 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAM ORF를 통합하였다. 제2 단계에서 통합된 aAM은 제1 단계에서 통합된 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 15).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, 먼저 aAM을 암호화하는 ORF와 조합된 성분 1C'를 제공하여, 이러한 aAM이 부위 1B에 통합되어, 1B'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 2 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 aAM(eAPC-a 중간체)을 발현한다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 다수의 1E'의 라이브러리가 제공되는데, 여기서 공여자 벡터의 라이브러리는 aAPX를 암호화하는 단일 ORF와 각각 조합된 벡터의 풀을 포함하여 각각의 aAPX가 부위 1E에 통합되어, 단일 세포 내에 1E'를 생성한다. 세포의 생성된 풀은 세포의 수집물을 함유하는데, 여기서 각각의 세포는 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAPX ORF를 통합하였다. 제1 단계에서 통합된 aAM은 제2 단계에서 통합된 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다(도 16).
2개의 통합 커플을 포함하는 eAPCS를 사용하여, aAPX의 라이브러리 또는 aAM의 라이브러리를 암호화하는 ORF의 라이브로리와 각각 조합된 성분 1C' 및 1E'를 제공하여, aAPX 및 aAM 둘 모두가 부위 1B 또는 1D에 통합되어, 1B' 및 1D'를 생성하도록 함으로써, 성분 1A로부터 1 단계로 eAPC-pa를 제조할 수 있다. 세포의 생성된 풀은 세포의 수집물을 함유하는데, 여기서 각각의 세포는 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAPX ORF 및 단일 부작위 aAM ORF를 통합하였다. 풀링된 라이브러리에서 각각의 세포 내에서, 통합된 aAM은 동일한 세포 내에 통합된 aAPX에서 카고로서 가공 및 적재되어 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 풀링된 라이브러리는 제공된 aAPX 및 aAM의 세트로부터의 aAPX:aAM의 모든 가능한 조합을 함유할 것이다(도 17).
eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 제공하는 상기에 언급된 샷건 통합 방법에서, 시스템의 견고성은 게놈 수용자 부위의 단일 카피에 관련된다. 이는 단지 단일 분석물이 통합 커플을 통해서 각 세포에 도입될 수 있음을 보장하기 위한 것이다. 이러한 단일-카피 게놈 수용자 부위는 eAPC의 선택적인 양상인데, 그 이유는 동일한 게놈 수용자25 부위의 다수의 카피가, 제공된 벡터의 라이브러리로부터의 다수의 '대립유전자'가 제조된 eAPC에서 수득될 수 있는 통합 단계를 제공하기에 이로울 수 있기 때문이다.
본 발명에서, aAPX는 하기 중 하나로부터 선택될 수 있다:
i. HLA 클래스 I의 1종 이상의 구성원,
ii. HLA 클래스 II의 1종 이상의 구성원,
iii. 1종 이상의 비-HLA 항원-제시 복합체.
aAPX는 하기 중 하나로부터 선택될 수 있다:
i. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
ii. 분석물 항원으로서 제공된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
iii. 분석물 항원으로서 제공된 펩타이드,
iv. 분석물 항원으로서 제공된 대사산물,
v. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
vi. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
vii. 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 펩타이드,
viii. 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 폴리펩타이드,
ix. 성분 A 대사체를 변경시킴으로써 유래된 대사산물.
eTPCS의 설명
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명은 2-부분 세포 디바이스를 제공하는 것에 관한 것이며, 여기서 각각의 부분은 조작된 세포 시스템이다. 제1 조작된 세포 시스템은 상기에 기술된 바와 같은 eAPCS이다. 제2 조작된 세포 시스템은 디바이스 내의 2-부분 eACP:eTPC 시스템으로 조합하기 위해서 분석물 eTPC를 제조하는 데 사용되는 조작된 다성분 eTPCS이다.
eTPCS의 최소 형태는 다성분 시스템인데, 여기서 제1 성분은 성분 2A라고 지정된 eTPC이고, 제2 성분은 성분 2C라고 지정된 유전자 공여자 벡터이다(도 18).
eTPC는 시스템의 모든 다른 성분이 관련된 eTPCS의 기본 성분을 나타낸다. 따라서, eTPC는 eTPC를 eTPCS 및 조합된 2-부분 디바이스 둘 모두에서 사용하기에 적합하게 만드는, 네이티브이거나 또는 조작된 특정 특징부를 함유한다.
eTPC인 성분 2A는,
i. TCR 쇄 알파, 베타, 델타 및 감마의 내인성 발현이 결핍되어 있고,
ii. 상기 세포가 TCR 쇄의 상보성 쌍을 발현하는 경우에만 상기 세포의 표면 상에 조건부로 제시되는 CD3 단백질을 발현하고,
iii. 알파, 베타, 델타 또는 감마의 적어도 1종의 분석물 TCR 쇄를 암호화하는 단일 ORF 및/또는 한 쌍의 분석물 TCR 쇄를 암호화하는 2종의 ORF의 통합을 위한 2B라고 지정된 추가 성분인 게놈 수용자 부위를 함유하고,
여기서 i은 상기 발현이 결핍된 자연 발생 세포 집단의 분비에 의해서 수득될 수 있거나, 또는 이러한 발현이 결핍되도록 조작될 수 있고; ii는 상기 발현을 포함하는 자연 발생 세포 집단의 선택에 의해서 수득될 수 있거나, 또는 이러한 발현을 포함하도록 조작될 수 있고; iii은 유전자 조작의 수단에 의해서 게놈에 도입될 수 있다.
자연 발생 세포 집단으로부터 TCR 쇄 알파, 베타, 델타 및 감마가 결핍된 eTPC 세포 후보물질의 선택은 관련 기술 분야에 널리 공지된 방법에 의해서 달성될 수 있다. 표적 세포를 TCR 쇄 알파, 베타, 델타 및 감마에 대해서 특이적인 친화성 시약으로 염색하고, 세포 TCR 쇄 알파, 베타, 델타 및 감마를 선택하여 이것을 직접 달성할 수 있다.
TCR 쇄 알파, 베타, 델타 및 감마 발현을 결핍시키기 위한 eTPC의 조작은 비표적화 수단 및 표적화 수단에 의해서 달성될 수 있다. 세포의 비표적화 돌연변이발생은, 세포에 화학적, 방사선학적 또는 다른 돌연변이원을 제공하고, 이어서 표적 aAPX 및/또는 aAM 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다. 게놈 유전자좌의 표적화된 돌연변이는
i. 아연-핑거 뉴클레아제,
ii. CRISPR/Cas9 매개된 표적화(정확한 것 및 두문자어),
iii. 합성 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)
를 통한 부위 지향된 돌연변이 발생을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 상이한 수단을 통해서 달성될 수 있고, 여기서 상기 부위-지향된 뉴클레아제는 표적 유전자좌에서 부위-특이적 DNA-수선 오류 돌연변이발생을 유도하고, 그 후 TCR 알파, 베타, 델타 및 감마 발현이 결핍된 세포를 선택함으로써 돌연변이된 세포가 수득된다.
CD3 및 성분 B 및/또는 D의 통합에 대한 선택은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있지만, 상동 유도 재조합(homology directed recombination: HDR) 및/또는 무작위 통합 방법을 포함할 수 있고, 여기서 HDR은 HDR이 일어날 게놈 유전좌의 표적화된 돌연변이에 의해서 촉진될 수 있고,
i. 아연-핑거 뉴클레아제,
ii. CRISPR/Cas9 매개된 표적화,
iii. 합성 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)
를 통한 부위 지향된 돌연변이 발생을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 상이한 수단을 통해서 달성될 수 있고, 여기서 상기 부위-지향된 뉴클레아제는 표적 유전자좌에서 부위-특이적 DNA-수선을 유도한다. 이러한 사건 이후에, 세포의 일부는 도입된 HDR 벡터를 가질 것이고, 하기의 임의의 조합을 통해서 선택 및/또는 결정될 수 있고:
iv. 비파괴적 표현형 발현 분석,
v. 파괴적 표현형 발현 분석,
vi. 유전학적 분석,
여기서 iv 및 vi이 성공적인 게놈 통합 사건의 선택 및 결정을 위한 바람직한 방법이다.
대안적으로, 바이러스 벡터를 사용하여 부위 지향된 방식 또는 비지향된 방식으로 요구되는 성분을 전달할 수 있다.
eTPC 성분 2A가 TCR 및 T-세포 항원 상호작용의 분석의 목적을 위해서(도 1), 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서, 상기에 기술된 eAPC 성분 1A와 함께 사용되도록 설계된다는 것을 고려하여, 바람직한 양상에서 eTPC는 이러한 분석에서 방해될 eTPC 제시 요소를 최소화하는 특징부를 함유한다.
eTPC 성분 2A는 aAPX의 적어도 1종의 패밀리 및/또는 aAM의 내인성 표면 발현이 선택적으로 결핍되어 있고, 여기서 표면 발현의 결핍은 표적 분석물 항원의 매칭된 분석에서 간섭을 최소화하도록 선택된다.
aAPX의 패밀리는 하기 중 임의의 것일 수 있다:
i. HLA 클래스 I,
ii. HLA 클래스 II,
iii. 비-HLA 항원-제시 복합체.
aAM은 하기로부터 선택된다:
i. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 복합체,
ii. 분석물 항원성 분자 ORF(들)로부터 번역된 폴리펩타이드로부터 유래된 펩타이드,
iii. 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 펩타이드,
iv. 성분 A 프로테옴을 변경시킴으로써 유래된 폴리펩타이드,
v. 성분 A 대사체를 변경시킴으로써 유래된 대사산물.
성분 2A인 eTPC는 T-세포 공-수용체를 선택적으로 추가로 포함할 수 있는데, 여기서 이러한 특징부는 분석물 eAPC에 대한 분석물 eTPC의 소통의 견고하거나 다양한 형태를 허용하며, 여기서 조정 가능한 소통은 특이적 분석물 TCRsp 및/또는 분석물 항원의 식별 또는 특징규명과 관련된다.
eTPC 성분 2A는 CD4 및/또는 CD8을 선택적으로 발현할 수 있고, 여기서 CD4 또는 CD8의 발현은 eTPC가 각각 타입 HLAII 및 HLAI의 aAPX에 관여하는 것을 제한한다.
본 발명에서, eTPC 성분 2A는 CD28 및/또는 CD45를 선택적으로 발현할 수 있고, 여기서 CD28 및 CD45는 신호전달에 대한 양성 피드 포워드(positive feed forward) 효과를 통해서 신호 민감성에 기여하는 반면, 이것은 또한 신호전달에 대한 음성 피드 백 효과를 통해서 신호 특이성에 기여할 수 있는데, 이는 그것이 발현된 분석물 TCRsp를 통한 신호전달에 관련되기 때문이다.
성분 2A eTPC는 분석물 eAPC와의 eTPC 결속 및 면역학적 시냅스의 형성을 촉진시키기 위해서, 또는 각각 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서의 강한 결합 및 유해한 세포 클러스터링의 형성을 방지하기 위해서, 도입된 세포 표면 접착 분자 성분, 또는 내인성 세포 표면 접착 분자의 절제를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
추가적인 ORF로서 성분 2A에 도입되거나, 2A로부터 유전적으로 절제될 수 있는 이러한 접착 분자는 접착 단백질의 인테그린 패밀리로부터 선택될 수 있다.
최소 다성분의 제2 성분은 유전자 공여자 벡터인 성분 2C이며, 이것은 적어도 1종의 TCR 쇄를 암호화하는 적어도 1종의 ORF의 통합을 위해서 사용된다(도 18).
성분 2C는 eTPC인 성분 2A의 게놈 내에 함유된 2B의 게놈 수용자 부위와 커플링된 유전자 공여자 벡터이다. 성분 2C는, 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된, 분석물 TCR 쇄를 암호화하는 1종 이상의 ORF를 게놈 수용자 부위, 2B에 통합시키도록 설계되며, 여기서 통합은 표적 eTPC에 의한 분석물 TCR 쇄의 발현을 초래한다.
짝지워진 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 통합 커플로서 기술된다.
eTPC는 조합된 eAPC:eTCP 시스템 내의 eAPC에 의해서 제시된 바와 같은, 동족 항원에 의한 자극에 응답하도록 설계된다. 따라서 발현된 TCRsp의 자극으로부터의 신호전달 반응을 위해서 표준화된 리포터 판독을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서, eTPC 성분 2A는, 하기로부터 선택된 합성 게놈 TCR-자극 반응 요소인 성분 2F로 지정된 성분을 추가로 함유하고:
i. 적어도 1종의 네이티브 프로모터 및/또는 적어도 1종의 합성 프로모터 및 적어도 1종의 리포터를 함유하는 단일 성분 합성 작제물,
ii. 적어도 1종의 네이티브 프로모터 및/또는 적어도 1종의 합성 프로모터 및 적어도 1종의 리포터를 사용하여 설계된 다성분 합성 작제물,
여기서 i 및/또는 ii의 활성화는 합성 경로, 네이티브 경로 또는 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 1종의 신호 전달 경로에 의존적이다.
eTPC는 제시된 TCRsp와 분석물 항원의 결속을 검정하도록 설계된다. 결속의 판독은 TCRsp 결속에 반응하는 합성 리포터 요소의 도입을 통해서 달성될 수 있다. 따라서, eTPC는 하기로부터 선택된 합성 게놈 TCR-자극 반응 요소인 2F로 지정된 성분을 추가로 함유할 수 있다:
i. 적어도 1종의 네이티브 프로모터 및/또는 적어도 1종의 합성 프로모터 및 적어도 1종의 리포터를 함유하는 단일 성분 합성 작제물,
ii. 적어도 1종의 네이티브 프로모터 및/또는 적어도 1종의 합성 프로모터 및 적어도 1종의 리포터를 사용하여 설계된 다성분 합성 작제물,
여기서 i 및/또는 ii의 활성화는 합성 경로, 네이티브 경로 또는 이들의 조합으로부터 선택된 적어도 1종의 신호 전달 경로에 의존적이다.
네이티브 프로모터와 상반되게 합성인 합성 TCR-자극 반응 요소(성분 2F)는 자연 TCR 자극 반응을 모방할 가능성이 적어서, 자연 T-세포 자극에 대해서 보다 동떨어진 근사를 나타낸다. 그러나, 합성 프로모터는 분석물 항원과 생산적으로 관련된 eTPC-t 제시 TCRsp의 견고한 식별을 위해서 리포터 반응을 조절 및 조정하는 데 더 큰 유연성을 제공한다.
단일 성분 합성 작제물은 신호 리포터 반응의 증폭 및 조정에 대한 제한된 공간을 제공하지만, 결과를 구현 및 예측하기가 더 간단하다. 다성분 작제물은 복잡한 반응 네트워크를 작제하기 위해서 사실상 비제한된 공간을 갖는다는 이점을 갖지만, 이것은 구현 및 예측하기 더 어렵고 비용이 동반된다. 네트워크는 또한 이차 반응 리포터의의 억제 및 활성화, 피드백 루프를 개시하기 위한 예를 제공한다.
합성 프로모터는 초기 자연 TCR 신호전달 경로의 하류일 수 있거나 그것을 교체할 수 있는 인공 합성 신호전달 성분에 연결될 수 있다. 이러한 예에서, CD3 복합체는 인공 합성 신호전달 경로 및 반응 네트워크에 부분적으로 또는 전체적으로 커플링될 수 있다. 이러한 인공 경로는 반응의 보다 큰 미세한 조정 또는 증가된 다양성을 위한, 매우 모듈식이고, 개작 가능한 이점을 제공한다.
바람직한 실시형태는 합성 프로모터 및 적어도 부분적인 합성 신호전달 경로를 갖는 다성분 합성 작제물을 사용한다. 이것은 제한된 휴지 상태 신호 반응을 보장하기 위한 가장 견고한 수단을 제공하지만, TCRsp에 대한 분석물 항원의 결찰이 일어나는 경우 높은 커플링된 리포터 신호를 제공한다.
TCRsp 자극을 성분 2F에 커플링하는 정확한 구성에도 불구하고, 목적하는 최종 결과는 검출 가능한 리포터이다. 바람직한 실시형태에서, 형광 검출(즉, FACS) 및/또는 물리적 선택 방법, 예컨대, 자성 활성화 세포 분류(MACS)가 가능한 리포터가 바람직하다. 대안적으로, 리포터는 바람직하게는 비파괴적 특징으로, 분광계, 형광 또는 발광 검정에 의해서 검출하기 위한 분비된 또는 세포내 분자일 수 있고, 여기서 집단을 그 다음에 리포터 분자의 존재 또는 부재를 기초로 선택될 수 있다. 또한, 반응은 단일 리포터 유형에 제한되지 않지만, 1종 이상의 상이한 리포터의 조합물일 수 있다.
관련하여, 합성 프로모터 및 부분적인 합성 신호전달 경로를 갖는 다성분 합성 작제물(드라이버-활성인자/억제인자 + 증폭인자-리포터)은 하기로 구성될 것이며:
드라이버-활성인자/억제인자:
a) 합성 프로모터,
b) 코작 서열,
c) 전사 인자,
d) 제1 종결인자,
증폭인자-리포터:
e) 제2 합성 프로모터,
f) 코작 서열,
g) 리포터,
h) 제2 종결인자,
여기서 a)는 분석물 항원에 대한 TCRsp 결찰에 의해서 생성된 초기 자연 신호전달 경로에 커플링되도록 설계된 합성 프로모터(드라이버)를 나타낸다. 최소 드라이버는 1종 이상의 전사 인자 결합 부위 및 코어 프로모터로 구성되며, 여기서 코어 프로모터는, 최소한, TATA 박스(Box), 개시인자 요소(Inr) 및 전사 시작 부위로 구성되고; b)는 전사 인자의 효율적인 번역 개시를 위한 코작 서열을 나타내고; c)는 제2 합성 프로모터의 DNA 서열에 결합할 수 있는 합성 또는 자연 전사 인자(활성인자 또는 억제 인자)를 암호화하는 ORF를 나타내고; d)는 전사 인자 mRNA 전사체의 효율적인 전사 및 폴리아데닐화를 위한 전사 종결인자, 및 선택적인 미번역된 3' 유전 요소(들)를 나타낸다. 이러한 유전 요소는 전사물 안정화 또는 탈안정화 요소 및 고유한 식별인자 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않고; e)는 c) 전사 인자 및 코어 프로모터(여기서 코어 프로모터는 최소한, TATA 박스, Inr 및 전사 시작 부위로 구성됨)의 결합을 위한 하나 이상의 인식 부위를 암호화하는 제2 합성 프로모터(증폭인자)를 나타내고; f)는 리포터의 효율적인 번역 개시를 위한 코작 서열을 나타내고; g) 리포터 단백질을 암호화하는 ORF를 나타내고; h)는 리포터 mRNA 전사체 및 선택적인 1종 이상의 미번역된 3' 유전 요소(들)의 효율적인 전사 및 폴리아데닐화를 위한 전사 종결인자를 나타낸다. 이러한 유전 요소는 전사물 안정화 또는 탈안정화 요소, 및 고유한 식별인자 서열을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
증폭인자-리포터 파라다임에 커플링된 드라이버-활성인자/억제인자가 추가적인 드라이버-활성인자/억제인자 및 증폭인자-리포터 쌍 및/또는 추가적인 증폭인자-리포터 단위를 포함하도록 연장될 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 추가로, 활성인자는 음성 선택 방법 및/또는 음성-피드백 루프를 위해서, 증폭인자-리포터 단위 및/또는 드라이버-활성인자/억제인자 단위를 셧다운시키기 위해서 억제인자로 대체될 수 있다.
제2 맥락에서, 합성 프로모터(드라이버-리포터)를 갖는 단일-성분 합성 작제물은 하기로 이루어질 것이며:
a) 합성 프로모터,
b) 코작 서열,
c) 리포터,
d) 종결인자,
여기서 a)는 분석물 항원에 대한 TCRsp 결찰에 의해서 생성된 초기 자연 신호전달 경로에 커플링되도록 설계된 합성 프로모터(드라이버)를 나타낸다. 최소 드라이버는 1종 이상의 전사 인자 결합 부위 및 코어 프로모터로 구성되며, 여기서 코어 프로모터는, 최소한, TATA 박스, Inr 및 전사 시작 부위로 구성되고; b)는 리포터의 효율적인 번역 개시를 위한 코작 서열을 나타내고; c)는 리포터 단백질을 암호화하는 ORF를 나타내고; d)는 리포터 mRNA 전사체의 효율적인 전사 및 폴리아데닐화를 위한 전사 종결인자, 및 선택적인 미번역된 3' 유전 요소(들)를 나타낸다. 이러한 유전 요소는 전사물 안정화 또는 탈안정화 요소, 및 고유한 식별인자 서열을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
확장된 형태 또는 다성분 eTPCS에서, 성분 2A eTPC는 성분 2D라고 지정된 제2 게놈 수용자 부위를 추가로 함유할 수 있는데, 이것은 시스템에 또한 첨가되는, 제2 게놈 공여자 벡터인 지정된 성분 2E에 커플링된다(도 19).
eTPCS 성분 2A는 1종 이상의 추가적인 통합 커플을 추가로 포함할 수 있다.
eTPC 및 하나 또는 2개의 통합 커플 중 하나를 포함하는 eTPCS가 조합된 eAPC:eTPC의 조립을 위해서 사용되는 eTPC-t의 제조를 위해서 사용된다.
eTPC-t는 2개의 상보성 TCR 쇄의 통합에 의해서 제조되어 TCRsp를 형성할 수 있거나, 또는 각각의 상보성 쇄를 순차적으로 제공함으로써 2 단계로 제조될 수 있다(도 20).
유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 eTPCS의 통합 커플 서브시스템으로서 작동한다. 유전자 공여자 벡터는 먼저 표적 ORF와 조합되어야 하며, 기본 공여자 벡터는 이제 이러한 표적 ORF를 암호화한다. 이어서, 이러한 조립된 프라이밍된 공여자 벡터는 표적 eTPC에 도입되어 게놈 수용자 부위에 대한 표적 ORF(들)를 교환함으로써, 표적 ORF를 표적 세포의 커플링된 수용자 부위에 통합한다(도 21).
유전자 공여자 벡터 성분 2C 및/또는 2E를 포함하는 eTPCS는 적어도 1종의 분석물 TCR 쇄를 암호화하는 적어도 1종의 ORF와 조합되어 성분 2C' 및/또는 2E'를 수득할 수 있고, 여기서 조합은 유전자 공여자 벡터의 적절한 암호화 프레임임(들) 내로의 그리고 적절한 배향(들)으로의 유전 물질의 결찰로서 정의된다.
1종 이상의 ORF의 유전자 공여자 벡터 2C 및/또는 2E 내로의 조합은,
i. 다수의 ORF를 암호화하는 2C' 및/또는 2E' 벡터의 개별 라이브러리를 수득하기 위한 단일 개별 반응,
ii. 다수의 ORF를 암호화하는 2C' 및/또는 2E' 벡터의 풀링된 라이브러리를 수득하기 위한 단일 반응
으로서 고유한 ORF의 라이브러리를 사용하여 수 회 수행될 수 있으며, 여기서 개별 라이브러리는 고유한 TCR 쇄를 암호화하는 고유한 ORF를 갖는 eTPC의 개별 라이브러리를 수득하도록 성분 2A와 수 회 조합될 수 있거나, 또는 풀링된 라이브러리는 eTPC-t의 풀링된 라이브러리를 수득하도록 성분 2A와 1회 이상 조합될 수 있고, 여기서 각각의 eTPC-t는 본래 벡터 풀로부터 유래된 분석물 TCR 쇄를 암호화하는 무작위화된 ORF를 통합하여, 각각의 eTPC-t는 단일의 무작위 고유 TCRsp를 발현한다.
1종 이상의 ORF의 예측 가능한 카피 수의, 게놈 수용자 부위 내로의 효율적인 통합은, 분석물 eTPC 집단이 신속하게 제조 및 특징규명될 수 있는 표준화된 eTPC의 작동에 상당히 이롭다. 따라서, 게놈 수용자 부위(들) 및 커플링된 공여자 벡터(들)는 eTPC의 기능에 중요하다. 추가로, 성분 2B 및 2D가 서로 격리되어, 공여자 벡터 성분 2C가 성분 2B에서 통합할 수 없거나, 그 역인, eTPC를 갖는 것이 상당히 바람직하다. 또한, 성분 2B 및/또는 성분 2D는, 상보성 TCR 쇄의 단일 쌍의 도입이 단지 단일 쌍의 정확한 통합 및 전달의 높은 가능성으로, 신속하고, 반복 가능한, eAPC의 제조 방법에서 처리될 수 있는 것이 또한 바람직하다.
게놈 수용자 부위는 하기로부터 선택될 수 있고:
i. 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해 설계된 합성 작제물,
ii. 부위 지향된 상동 재조합을 위해 설계된 합성 작제물,
여기서 i)은 RCME에 대한 바람직한 게놈 수용자 부위이다. RMCE 방법은, 개별 리콤비나제 효소에 특이적인 선택된 이종특이적 부위를 사용할 수 있어서, 각각의 성분 2B 및 2D는 격리된 특이성을 보유한다.
게놈 수용자 부위인 성분 2B 및/또는 성분 2D는 하기 유전 요소 중 적어도 하나로 구성된다:
i. 이종특이적 리콤비나제 부위,
ii. 상동 아암,
iii. 진핵생물 프로모터,
iv. 진핵생물 조건 조절 요소,
v. 진핵생물 종결인자,
vi. 선택 마커,
vii. 스플라이스 수용자 부위,
viii. 스플라이스 공여자 부위,
ix. 비-단백질 암호 유전자,
x. 인설레이터,
xi. 이동성 유전 요소,
xii. 메가뉴클레아제 인식 부위,
xiii. 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
xiv. 코작 공통 서열.
바람직한 게놈 수용자 부위는 이전에 언급된 요소 목록으로부터의 하기 선택된 요소를 사용하는 2종의 상이한 배열로 구성될 것이다.
제1 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 TCR 쇄 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 단일 ORF를 수용하기 위한 것이며, 여기서 배열은,
5' -[A] [B] [C] [D] [E] [F]- 3'이고,
여기서;
A)는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고
B)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
C)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
D)는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커이고
E)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
F)는 요소 v) 진핵생물 종결인자이다.
제2 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 TCR 쇄 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 2종의 ORF를 수용하기 위한 것이며, 여기서 배열은,
5' -[A] [B] [C] [D] [E] [F] [G] [H] [I]- 3'이고,
여기서;
A) 는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고,
B) 는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
C) 는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
D) 는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커 1이고,
E) 는 요소 v) 진핵생물 양방향성 전사 종결인자이고,
F) 는 요소 vi) FACS 및/또는 MACS 상용성 암호화된 단백질 마커 2이고,
G) 는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
H) 는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
I) 는 요소 iii) 구성적 또는 유도성 진핵생물 프로모터이고,
추가로, 이러한 제2 배열에서 요소 F, G 및 I는 안티센스 방향으로 암호화된다.
성분 2C 및/또는 성분 2E는 하기 유전 요소 중 적어도 하나로 구성된다:
i. 이종특이적 리콤비나제 부위,
ii. 상동 아암,
iii. 진핵생물 프로모터,
iv. 진핵생물 조건 조절 요소,
v. 진핵생물 종결인자,
vi. 선택 마커,
vii. 스플라이스 수용자 부위,
viii. 스플라이스 공여자 부위,
ix. 비-단백질 암호 유전자,
x. 인설레이터,
xi. 이동성 유전 요소,
xii. 메가뉴클레아제 인식 부위,
xiii. 내부 리보솜 유입 부위(IRES),
xiv. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소,
xv. 코작 공통 서열,
xvi. 통합의 선택 마커,
xvii. 항생제 내성 카세트
xviii. 박테리아 복제 기점,
xix. 효모 복제 기점,
xx. 클로닝 부위.
바람직한 유전자 공여자 벡터인 성분 C 및/또는 성분 E는 이전에 언급된 요소 목록으로부터의 하기 선택된 요소를 사용하는 2종의 상이한 가능한 배열을 포함할 것이다.
제1 배열은 RMCE 통합을 통해서, 1종 이상의 TCR 쇄 및/또는 통합의 선택 마크를 암호화하는 단일 ORF를 수용하기 위한 것이며, 여기서 배열은,
5' - [A] [B] [C] [D] [E] - 3'이고,
여기서;
A)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
B)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
C)는 요소 xx) 1종 이상의 TCR 쇄를 암호화하는 단일 ORF의 클로닝 부위 및/또는 요소 xvi) 통합의 선택 마커이고,
D)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
E)는 요소 xvii) 항생제 내성 카세트 및 요소 xviii) 특정 배향이 아닌 박테리아 복제 기점이고,
추가로, 요소 viii 및/또는 xiv는 다수의 TCR 쇄 및/또는 요소 xvi을 함께 연결하기 위해서 사용될 수 있다.
5' - [A] [B] [C] [D] [E] [F]- 3'이고,
여기서;
A)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 1이고,
B)는 요소 xv) 코작 공통 서열이고,
C)는 요소 xx) 1종 이상의 TCR 쇄를 암호화하는, 진핵생물 종결인자를 갖는, 2종 이상의 ORF의 도입을 위한 클로닝 부위 및/또는 요소 xvi) 통합의 선택 마커이고,
D)는 요소 xv) 코작 공통 서열(안티센스 방향)이고,
E)는 요소 i) 이종특이적 리콤비나제 부위 2이고,
F)는 요소 xvii) 항생제 내성 카세트 및 요소 xviii) 특정 배향이 아닌 박테리아 복제 기점이고,
추가로, 요소 viii 및/또는 xiv는 각각의 ORF 내에서 다수의 TCR 쇄 및/또는 요소 xvi을 함께 연결하기 위해서 사용될 수 있다.
eTPCS에서의 분석물 eTPC 집단의 제조
상기에 기술된 eTPCS 시스템을 다양한 방식으로 사용하여, 2-부분 디바이스의 작동 시에 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서 eAPC에 분석물 TCRsp를 제시하기 위해서 제공되는, 분석물 eTPC 집단의 별개의 형태, 또는 이의 라이브러리를 제조할 수 있다.
생성된 eTPC-t 집단은 후보 항원을 분석하는 특정 공급원으로부터의 분석물 TCR 쇄를 유도하는 것이 필요하다.
분석물 TCR 쇄 암호화 서열의 공급원은 하기로부터 유래될 수 있고:
i. 일차 T-세포로부터의 TCR 쇄 ORF 서열(들)의 짝지워진 클로닝,
ii. 일차 T-세포로부터의 TCR 쇄 ORF 서열(들)의 짝지워지지 않은 클로닝,
iii. 합성 TCR 쇄 ORF 서열(들),
여기서 i은 흉선 선택으로 인해서 자가 aAPX 및/또는 aAPX 카고에 대해서 일반적으로 교차 반응성이지 않을 네이티브 TCRsp의 발견에 바람직하고; ii는 후보 TCR 친화성 시약을 식별하기 위해서 사용될 수 있고; iii은 TCR 친화성 시약의 친화성 성숙에 사용될 수 있다.
단일 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, TCR 쇄의 상보성 쌍에 대한 ORF와 조합된 성분 2C'를 제공하여, 이러한 분석물 TCR 쌍이 부위 2B에 통합되어, 2B'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 1 단계로 eTPC-t를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 TCR 쌍을 발현하고, 이것은 TCRsp로서 세포 표면에 존재한다(도 21).
2개의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, TCR 쇄의 상보성 쌍에 대한 ORF와 조합된 성분 2C'를 제공하여, 이러한 분석물 TCR 쌍이 부위 2B에 통합되어, 2B'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 1 단계로 eTPC-t를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 TCR 쌍을 발현하고, 이것은 TCRsp로서 세포 표면에 존재한다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 22).
2종의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, 상보성 TCR 쇄 쌍의 하나의 쇄를 암호화하는 하나의 ORF와 각각 조합된 성분 2C' 및 2E'를 제공하여, 분석물 TCR 쇄 둘 모두가 부위 2B 또는 2D에 통합되어, 2B' 및 2D'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 1 단계로 eTPC-t를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 TCR 쌍을 발현하고, 이것은 TCRsp로서 세포 표면에 존재한다(도 23).
2개의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, 단일 분석물 TCR 쇄에 대한 ORF와 조합된 성분 2C'를 제공하여, 이러한 분석물 TCR 쇄가 부위 2B에 통합되어, 2B'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 1 단계로 eTPC-x를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 TCR 쇄를 발현하지만, 상보성 쇄가 결핍되어, 어떠한 표면 TCR도 발현하지 않는다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않고, 이것은 하류 통합 단계를 위해서 사용될 수 있다(도 24).
2개의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, 먼저 단일 분석물 TCR 쇄에 대한 ORF와 조합된 성분 2C'를 제공하여, 이러한 분석물 TCR 쇄가 부위 2B에 통합되어, 2B'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 2 단계로 eTPC-t를 제조할 수 있다. 생성된 세포주는 제공된 TCR 쇄를 발현하지만, 상보성 쇄가 결핍되어, 어떠한 표면 TCR도 발현하지 않는다(eTPC-x 중간체). 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않는다. 제2 단계에서 2E'가 제공되는데, 여기서 벡터가 이전에 통합된 TCR 쇄에 상보성인 제2 단일 분석물 TCR 쇄에 대한 ORF와 조합되어, 이러한 제2 상보성 분석물 TCR 쇄가 부위 2D에 통합되어, 2D'를 생성한다. 생성된 세포주는 제공된 상보성 분석물 TCR 쇄 쌍을 발현하고, 이것은 TCRsp로서 세포 표면에 존재한다(도 25).
eTPC로부터 분석물 eTPC-x 및/또는 eTPC-t 집단을 제조하는 상기에 언급된 예에서, eTPCS 시스템을 사용하여 정의된 방식으로 공지된 분석물 TCR 쇄를 제공하여 정의된 TCRsp를 발현하는 분석물 eTPC의 개별 집단을 제조한다. 이러한 공정은 수 회 반복되어 eTCP-x 및/또는 eTCP-t의 라이브러리를 제조하여 디바이스의 작동 시에 조합된 eAPC:eTPC 시스템을 제공할 수 있다. 대안적인 접근법은 분석물 eTPC-t의 풀링된 라이브러리를 취하는 것이며, 여기서 각각의 eTPC-t는 본래 벡터 풀로부터의 TCR ORF의 단일 무작위 쌍을 통합하고, 따라서 각각의 eTPC-t는 단일 무작위 TCRsp를 발현하지만, 총괄적으로 그 풀은 본래 벡터 풀에 나타난 TCRsp의 다수의 종을 암호화한다. 동일한 샷건 원리가 적용되어 eTPC-x의 풀을 생성시킬 수 있다. 이것은 분석물 항원에 대한 후보물질 TCRsp의 큰 라이브러리를 분석하는 경우 특히 유용하다.
하나의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, 분석물 TCR 쌍의 풀 분석물을 암호화하는 다수의 ORF의 라이브러리와 조합된 성분 2C'를 제공하여, 쌍이 B에 통합되어, 각각의 세포 내에, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 1 단계로 eTPC-t 풀을 제조할 수 있고, 여기서 각각의 eTPC-t는 본래 벡터 풀로부터의 TCR ORF의 단일 무작위 쌍을 통합하고, 따라서 각각의 eTPC-t는 단일 무작위 TCRsp를 발현하지만, 총괄적으로 그 풀은 본래 벡터 풀에 나타난 TCRsp의 다수의 종을 암호화한다. 세포의 생성된 풀은 다수의 분석물 TCRsp를 총괄적으로 발현하는 세포의 수집물을 함유한다(도 26).
2개의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, 분석물 TCR 쌍의 풀을 암호화하는 다수의 ORF의 라이브러리와 조합된 성분 2C'를 제공하여, 쌍이 B에 통합되어, 각각의 세포 내에, B'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 1 단계로 eTPC-t 풀을 제조할 수 있고, 여기서 각각의 eTPC는 본래 벡터 풀로부터의 TCR ORF의 단일 무작위 쌍을 통합하고, 따라서 각각의 eTPC-t는 단일 무작위 TCRsp를 발현하지만, 총괄적으로 그 풀은 본래 벡터 풀에 나타난 TCRsp의 다수의 종을 암호화한다. 세포의 생성된 풀은 다수의 분석물 TCRsp를 총괄적으로 발현하는 세포의 수집물을 함유한다. 제2 통합 커플 1D/1E는 변형되지 않는다(도 27).
2개의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여, 단일 분석물 TCR 쇄의 풀을 암호화하는 다수의 ORF의 라이브러리와 조합된 성분 2C'를 제공하여, 각각의 eTPC가 성분 2C'에 암호화된 단일 무작위화된 TCR 쇄 ORF를 부위 2B에 통합하여, 2B'를 생성하도록 함으로써, 성분 2A로부터 1 단계로 eTPC-t 풀을 제조할 수 있다. 동시에, 2C'에 제공된 제1 라이브러리에 상보성인 단일 분석물 TCR 쇄의 풀을 암호화하는 다수의 ORF의 라이브러리와 조합된 성분 2E'를 제공하여, 각각의 eTPC-t가 성분 2E'에 암호화된 단일 무작위화된 상보성 TCR 쇄를 부위 2D에 통합하여, 2D'를 생성한다. eTPC-t 풀에서 각각의 생성된 세포는 무작위화된 상보성 TCR 쇄 ORF의 단일 쌍을 가져서, 풀에서 각각의 세포는 무작위화된 TCRsp를 발현한다. 이러한 풀링된 라이브러리는 성분 2C' 및 2E'에 일어나는 세트로부터의 제공된 상보성 TCR 쇄의 모든 가능한 조합을 함유할 것이다(도 28).
본 발명에서, 2개의 통합 커플을 포함하는 eTPCS를 사용하여 이전에 수득된 e-TPC-x로부터 1 단계로 eTPC-t 풀을 제조할 수 있는데, 여기서 부위 2B는 2B'로 전환되었고, 단일 분석물 TCR 쇄를 함유한다. eTPC-t는 이미 통합된 쇄에 상보성인 단일 분석물 TCR 쇄의 풀을 암호화하는 다수의 ORF의 라이브러리와 조합된 성분 2E'를 제공하여, 각각의 eTPC-t가 제공된 2E' 라이브러리의 단일 무작위화된 TCR 쇄 ORF를 2D에 통합하여, 2D'를 생성함으로써 제조된다. eTPC-t 풀에서 각각의 생성된 세포는 출발 eTPC-x, 및 각각의 단일 상보성 분석물 TCR 쇄의 선택에 의해서 제공된 분석물 TCR 쇄를 가져서, 풀 내의 각각의 세포는 TCRsp로서 ORF의 무작위 쌍을 발현한다. 이러한 접근법은 상보성 TCR 쇄 쌍에서 고정된 쇄에 대한 단일 쇄의 변화 효과를 분석하는 경우에 사용된다(도 29).
eTPC-x는 추가의 통합 벡터, 성분 2Y 또는 2Z(이것은 통합의 마커를 암호화하고, ORF가 없음) 중 하나를 제공함으로써 eTPC-t로부터 제조될 수 있다. eTPC-t에 대한 성분 2Y 또는 2Z의 조합은 부위 중 하나를 교환하여 단일 TCR 쇄 발현 eTPC-x를 수득할 것이다.
eTPC-t의 eTPC-x로의 전환을 위한 바람직한 유전자 통합 벡터, 성분 2Y 및 성분 2Z는 임의의 TCR 쇄 ORF를 암호화하지 않고, 바람직하게는 통합 마커를 암호화하지 않고, 성분 2C 및 2E와 동일한 통합 벡터 요건을 포함할 것이다.
분석물 eAPC 및 eTPC의 접촉
본 발명은 조작된 2-부분 세포 디바이스를 제공하는 것에 관한 것이다. 디바이스의 2 부분, eAPCS 및 eTPCS를 사용하여 각각 분석물 eAPC 및 분석물 eTPC를 조립한다. 이어서 이러한 분석물 세포 집단은 디바이스 산출물이 수득될 수 있는 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로 조립된다. eAPC:eTPC 시스템은 상기에 기술된 바와 같이 제조된 분석물 eAPC 집단, 및 하나 이상의 eTPC 집단(도 1) 중 하나 이상의 선택으로 구성된다(도 4 내지 29). eAPC:eTPC 시스템은 분석물 eAPC와 분석물 eTPC 집단 간의 물리적 접촉을 허용하는 포맷으로 제공되는데, 여기서 이러한 접촉은 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 eTPC-t의 TCRsp 간의 복합체 형성을 허용하며, 여기서 분석물 항원은 분석물 eTPC에 의해서 제시된 분석물 TCRsp를 갖는, 분석물 eAPC에 의해서 제시된 하기 중 임의의 것이어서:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM 및/또는
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM,
복합체 형성은 이러한 복합체의 안정화로 이어질 수 있고, 여기서 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC는 보고 및 측정될 수 있다.
분석물 eAPC와 분석물 eTPC 간의 접촉은 관대한 세포 배양 또는 배양계 중에서 수행되는데, 여기서 상기 계는 eAPC 및 eTPC 세포 둘 모두의 기능에 관대한 세포 배양 배지를 포함한다.
조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터 수득된 분석물 eTPC는 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원에 대한, 분석물 TCRsp를 발현하는, 분석물 eTPC의 신호 반응의 특징규명을 위해서 사용되며, 여기서 이러한 신호 반응은 2진법적이거나 또는 등급화될 수 있고, eTPC(도 30)에 내재하는 것 또는 eAPC(도 31)에 내재하는 것으로서 측정될 수 있다.
1종 이상의 분석물 eTPC를 수득하기 위해서, 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터, 입력 분석물 eTPC 또는 분석물 eTPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 eTPC를 선택하는 방법(여기서 발현된 TCRsp는 분석물 eAPC에 의해서 제시된 1종 이상의 분석물 항원에 결합함)은,
i. 1종 이상의 분석물 eTPC를 1종 이상의 분석물 eAPC와 조합하여 TCRsp와 분석물 항원을 접촉시켜서, 하기 단계 중 적어도 하나의 측정하는 단계를 초래하는 단계:
ii. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
iii. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 분석물 eTPC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
iv. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 분석물 eAPC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계; 및
v. 단계 b, c 및/또는 d를 기초로 1종 이상의 분석물 eTPC를 선택하는 단계(여기서 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행됨)를 포함하며,
여기서 i, iii 및 v는 바람직한 배열을 포함한다.
조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터 수득된 분석물 eAPC는 분석물 eTPC에 의해서 제시된 TCRsp에 대한, 분석물 항원을 발현하는, 분석물 eAPC의 신호 반응의 특징규명을 위해서 사용되며, 여기서 이러한 신호 반응은 2진법적이거나 또는 등급화될 수 있고, eTPC(도 30)에 내재하는 것 또는 eAPC(도 31)에 내재하는 것으로서 측정될 수 있다.
1종 이상의 분석물 eAPC를 수득하기 위하여 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터, 입력 분석물 eAPC 또는 분석물 eAPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 eAPC를 선택하는 방법(여기서 발현된 분석물 항원은 분석물 eTPC에 의해서 제시된 1종 이상의 분석물 TCRsp에 결합함)은,
i. 1종 이상의 분석물 eAPC를 1종 이상의 분석물 eTPC와 조합하여, 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 eTPC의 분석물 TCRsp 간의 접촉을 초래하는 단계;
ii. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCRsp 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
iii. 존재하는 경우, 분석물 TCRsp와 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 eTPC에서 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
iv. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된 분석물 eAPC에 의한, 신호 반응을 측정하는 단계; 및
v. 단계 b, c 및/또는 d로부터 1종 이상의 분석물 eAPC를 선택하는 단계(여기서 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행됨)를 포함하되,
여기서 i, iii 및 v는 바람직한 배열을 포함한다.
eTPC 또는 eAPC의 선택은 2상 배양계를 포함하는 eAPC:eTPC 시스템으로부터 유래될 수 있고, 여기서 단일의 제조된 분석물 eAPC 집단 및 단일의 제조된 분석물 eTPC 집단이 제공되고, 응답한 eAPC 또는 eTPC는 eTPC(도 30) 및/또는 eAPC(도 31) 내에서의 2진법 또는 등급화된 반응을 기초로 선택된다.
eAPC:eTPC 시스템은 제조된 단일 분석물 eAPC 및 eTPC의 제조된 풀링된 라이브러리의 입력물을 포함할 수 있다(도 32).
eAPC:eTPC 시스템은 제조된 단일 분석물 eTPC 및 eAPC의 제조된 풀링된 라이브러리의 입력물을 포함할 수 있다(도 33).
조합된 eATP:eTPC 시스템에서, 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 eTPC 또는 1종 이상의 eAPC에서 신호 반응(이것은 분석물 TCRsp와 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도될 수 있음)을 측정하는 것은 일차 디바이스 산출물의 선택에 중요한데, 여기서 일차 디바이스 산출물은 하기 중 하나의 단일 세포 또는 하기 중 하나 이상의 세포의 풀이며:
i. eAPC-p,
ii. eAPC-a,
iii. eAPC-pa,
iv. eTPC-t,
여기서 세포의 선택은, 접촉된 분석물 eAPC 또는 분석물 eTPC 세포 중 하나 또는 둘 모두에서 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재 하에서 일어날 수 있다.
본 발명에서, eTPC 내에서의 보고된 신호 반응을 기초로 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터 분석물 eTPC 및/또는 분석물 eAPC를 선택하는 방법은 하기를 포함한다:
i. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
ii. eTPC가 성분 2F를 함유하는 경우 그리고 eAPC가 동등한 합성 리포터 요소를 함유하는 경우, 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계.
eAPC 및/또는 eTPC에 내재하는 유도된 네이티브 또는 합성 신호 반응은 하기 중 하나 이상에서의 증가 또는 감소를 검출함으로써 측정되며:
i. 분비된 생물분자,
ii. 분비된 화학물질,
iii. 세포내 생물분자,
iv. 세포내 화학물질,
v. 표면 발현된 생물분자,
vi. 분석물 eAPC에 대한 분석물 eTPC의 세포독성 작용,
vii. 신호 반응이 분석물 eAPC에 의해서 유도되고, a 내지 e 중 임의의 것의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되도록 하는 분석물 eAPC에 대한 분석물 eTPC의 파라크린 작용,
viii. 분석물 eTPC의 증식,
ix. 분석물 eTPC와 분석물 eAPC 간의 면역학적 시냅스,
여기서 상기 검출된 신호 반응은, 조합된 eAPC:eTPC 시스템 및/또는 평행한 조립된 조합된 시스템의 조립 이전에 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC에 내재하는 비-유도된 신호 반응 상태와 비교되고, 여기서 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC는 사용 시에 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서 신호 반응을 유도하지 않는 것으로 공지된 대조군 분석물 항원 및/또는 분석물 TCR을 제시할 수 있다.
eAPC:eTPC 시스템으로부터의 일차 디바이스 산출물의 수득
본 발명은 조작된 2-부분 세포 디바이스를 제공하는 것에 관한 것이다. 디바이스의 2 부분, eAPCS 및 eTPCS를 사용하여 각각 분석물 eAPC 및 분석물 eTPC를 조립한다. 이어서 이러한 분석물 세포 집단은 디바이스 산출물이 수득될 수 있는 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로 조립된다. eAPC:eTPC 시스템은 상기에 기술된 바와 같이 제조된 분석물 eAPC 집단, 및 하나 이상의 eTPC 집단(도 1) 중 하나 이상의 선택으로 구성된다(도 4 내지 29). eAPC:eTPC 시스템은 분석물 eAPC와 분석물 eTPC 집단 간의 물리적 접촉을 허용하는 포맷으로 제공되는데, 여기서 이러한 접촉은 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 eTPC-t의 TCRsp 간의 복합체 형성을 허용하며, 여기서 분석물 항원은 분석물 eTPC에 의해서 제시된 분석물 TCRsp를 갖는, 분석물 eAPC에 의해서 제시된 하기 중 임의의 것이어서:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM 및/또는
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM,
복합체 형성은 이러한 복합체의 안정화로 이어질 수 있고, 여기서 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC는 보고 및 측정될 수 있다.
유도된 신호 반응 보고의 모드는 상기에 기술되어 있고, 이것은 2-부분 디바이스의 일차 산출물을 수득하는 데 있어서 측정될 필요가 있는 이러한 보고된 반응이다.
디바이스로부터의 일차 산출물은 선택된 세포 집단인데, 이것은 eAPC:eTPC 시스템에 제공된 상호 세포에 의해서 제시된 분석물에 대한 응답하거나 또는 응답하지 않았다. 즉, 이러한 일차 산출물은 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내의 보고된 반응의 존재 및 부재에 대해서 선택된, 단일 세포 또는 세포의 풀로서 표현될 수 있다(도 1 단계 v). 분석물 eAPC 내에서의 반응은 접촉한 eTPC에 의해서 제시되는 동족 TCR의 결속에 의해서 단지 유발된다. 분석물 eTPC 내에서의 반응은 접촉한 eAPC에 의해서 제시되는 동족 항원의 결속에 의해서 단지 유발된다(도 1 단계 iv).
조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터의 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC의 선택은 접촉한 세포에서의 반응을 기초로 수행될 수 있다. 즉, 분석물 eAPC는 접촉한 분석물 eTPC에서, 보고된 반응, 또는 이의 결핍을 기초로 선택될 수 있다. 이에 반해서, 분석물 eTPC는 접촉한 분석물 eAPC에서, 보고된 반응, 또는 이의 결핍을 기초로 선택될 수 있다.
본 발명에서, 디바이스로부터의 일차 eAPC 산출물은 선택된 세포이며, 여기서 선택은 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재를 기초로 하고, 이러한 세포는 하기 중 1종 이상을 포함할 수 있고:
i. eAPC-p,
ii. eAPC-a,
iii. eAPC-pa,
여기서 선택된 세포는 단일 세포, 동일한 아이덴티티의 세포의 풀, 상이한 아이덴티티의 세포의 풀을 포함할 수 있다(도 1 단계 v).
디바이스로로부터의 일차 eTPC 산출물은 선택된 세포이며, 여기서 선택은 분석물 보고된 신호 반응의 존재 또는 부재를 기초로 수행되며, 이러한 세포는 eTPC-t를 포함하고, 여기서 선택된 세포는 단일 세포, 동일한 아이덴티티의 세포의 풀, 상이한 아이덴티티의 세포의 풀을 포함할 수 있다(도 1 단계 v).
조합된 eAPC:eTPC 시스템에서 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC에서의 보고된 신호를 사용하여 분석물 세포 집단을 선택하여 일차 산출물을 제공할 수 있다.
eAPC 및/또는 eTPC 유형의 일차 산출물은, 조합된 eAPC:eTPC 시스템이 2상 시스템으로부터 목적하는 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC 집단을 선택함으로써 2상 배양 특성을 갖는 예에서 달성될 수 있다(예를 들어, 도 30 및 도 31).
eAPC 및/또는 eTPC 유형의 일차 산출물은, 조합된 eAPC:eTPC 시스템이 고정된 eAPC 및 풀링된 라이브러리 분석물 eTPC 특성을 갖는 예(예를 들어, 도 32), 또는 조합된 eAPC:eTPC 시스템이 조합된 배양계로부터 목적하는 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC 집단을 선택함으로써 고정된 eTPC 및 풀링된 라이브러리 분석물 eAPC 특성을 갖는 예(예를 들어, 도 33)로부터 달성될 수 있다.
일차 산출물이 수득될 수 있는 몇몇 별개의 모드가 존재하는데, 여기서 각각의 모드는 세포 분류 단계를 수반한다. 세포 분류는 형광-활성화 세포 분류(FACS) 및/또는 자성-활성화 세포 분류(MACS) 및/또는 별개의 친화성-활성 세포 분류 방법을 통해서 달성될 수 있다.
일차 산출물 eAPC 및/또는 eTPC 세포는 단일 세포를 수득하기 위한 단일 세포 분류에 의해서 그리고/또는 세포의 풀을 수득하기 위한 풀로의 세포 분류에 의해서 수득될 수 있다.
일차 산출물 eAPC 및/또는 eTPC 세포는 단일 세포를 수득하기 위한 단일 세포 분류 및 후속으로 선택된 eAPC 또는 분석물 eTPC 세포의 단클론성 풀을 수득하기 위한 단일 세포의 과성장에 의해서 수득될 수 있다.
일차 산출물 eAPC 및/또는 eTPC 세포는 세포의 풀을 수득하기 위한 풀로의 세포 분류 및 후속으로 선택된 eAPC 및/또는 eTPC 세포의 풀을 수득하기 위한 세포의 풀의 과성장에 의해서 수득될 수 있다.
eAPC:eTPC 시스템으로부터의 최종 디바이스 산출물의 수득
일차 산출물을 수득하는 상기에 기술된 방법(여기서 일차 산출물은 측정된 신호 반응을 기초로 선택된, 선택된 분석물 eAPC 및/또는 분석물 eTPC 세포임) 이후에, 2 부분 세포 디바이스의 최종 산출물은 선택된 eAPCa 및/또는 eTPC 일차 산출물의 추가 가공을 통해 수득될 수 있다.
2-부분 세포 디바이스의 최종 산출물은 분석물 eAPC(i 내지 v) 또는 분석물 eTPC(vi)에 의해서 제시되고, 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로부터의 이의 선택에 의해서 2-부분 디바이스로부터 일차 산출물로서 수득된, 하기의 아이덴티티이이다:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM 및/또는
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM 및/또는
vi. TCRsp.
2-부분 세포 디바이스 내에서, 분석물 eAPC 및 분석물 eTPC에 의해서 제시된 분석물 분자가 유전적으로 암호화된 경우가 종종 존재한다. 따라서, 분석물 eAPC 또는 eTPC에 의해서 제시된 분석물 분자를 식별하기 위해서, eAPC 또는 eTPC로부터의 제조된 분석물 분자 eAPC, TC 및 NCBP의 유전자 서열결정이 수행될 수 있다.
APC는 유전자 서열이 분류된 및/또는 확장된 eAPC-p, eAPC-a 또는 eAPC-pa 세포의 성분 1B' 및/또는 성분 1D'를 위해서 수득되어 하기의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM,
여기서 수득된 아이덴티티는 2-부분 세포 디바이스로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
APC는 유전자 서열이 분류된 및/또는 확장된 eAPC-p, eAPC-a 또는 eAPC-pa 세포의 게놈을 위해서 수득되어 하기의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고:
i. aAPX 및/또는
ii. aAM 및/또는
iii. aAPX:aAM,
iv. CM 및/또는
v. aAPX:CM,
여기서 수득된 아이덴티티는 2-부분 세포 디바이스로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
eTPC는 유전자 서열이 분류된 및/또는 확장된 eTPC-t 세포의 성분 2B' 및/또는 성분 2D'를 위해서 수득되어 TCRsp의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고, 여기서 TCRsp의 수득된 아이덴티티는 2-부분 세포 디바이스로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
eTPC는 유전자 서열이 분류된 및/또는 확장된 eTPC-t 세포의 게놈을 위해서 수득되어 TCRsp의 아이덴티티를 결정하도록 가공될 수 있고, 여기서 TCRsp의 수득된 아이덴티티는 2-부분 세포 디바이스로부터의 최종 산출물을 나타낸다.
유전자 서열결정은 특별하게 가공하거나 가공하지 않고, 다양한 모드에 의해서 그리고 유전 물질 공급원의 배열로부터 달성될 수 있다.
본 발명에서, 서열결정 단계 이전에 하기 단계가 선행될 수 있다:
i. 게놈 DNA를 추출하는 단계 및/또는
ii. 성분 1B' 및/또는 1D' 및/또는 2B' 및/또는 2D' RNA 전사물을 추출하는 단계 및/또는
iii. 성분 1B' 및/또는 1D' 및/또는 2B' 및/또는 2D'의 DNA 및/또는 RNA 전사물을 PCR 및/또는 RT-PCR에 의해서 증폭시키는 단계.
서열결정 단계는 2-부분 디바이스로부터 일차 산출물로서 수득된, eAPC 또는 eTPC, 또는 이의 풀에 대해서 파괴적일 수 있다.
2-부분 디바이스로부터 일차 산출물을 수득하는 것이 바람직한 경우(여기서 서열결정 단계는 일차 산출물 eAPC 또는 eTPC에 대해서 파괴적임), 2-부분 디바이스의 최종 산출물로서 수득된 서열 정보를 사용하여 각각 eAPCS 및 eTPCS의 사용을 통해서 eAPC 또는 분석물 eTPC와 동등한 산출물 eAPC 및 eTPC를 제조할 수 있다.
유전적으로 암호화된 분석물 분자의 상기에 기술된 시나리오에서, 2-성분 디바이스의 최종 산출물은 성분 1B' 및/또는 1D' 및/또는 2B' 및/또는 2D'로부터, 그리고/또는 세포 게놈으로부터 서열 정보를 수득함으로써 수득될 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서 항원 정보는 유전적으로 암호화되지 않을 것이다. 번역후 변형된 항원인, 비-유전학적 수단을 통해서 조합된 eAPC:eTPC 시스템에 제공된 항원, 즉, eAPC:eTPC 시스템에 내재하는 분석물 eAPC 프로테옴 또는 대사산물 및 CM의 유도된 또는 변형된 상태로부터 기원한 항원은 유전학적 수단을 통해서 타당하게 식별될 수 없다.
비-유전학적 수단에 의해서 eACP:eTPC 시스템에 제공될 수 있는 aAM의 중요한 경우에서, eAPC-p 또는 eAPC-pa가 제공된 aAM을 aAPX:aAM 복합체로서 제시할 수 있는 2가지의 별개의 모드가 존재한다. 제1 시나리오에서, aAM은 aAPX에 직접 결합될 수 있는 형태로 제공되고, 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체를 형성한다(도 34). 이러한 aAM의 예는 HLA 복합체에 대한 펩타이드 항원일 것이다. 제2 시나리오에서, aAM은 분석물 eAPC에 의해서 취해질 수 있는 형태로 제공되고, 그것이 카고로서 aAPX 내에 적재되어 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체를 형성하도록 가공된다(도 35).
본 발명에서, aAM 카고 또는 CM 카고를 선택 및 식별하는 방법(여기서 카고는 2-성분 다비아스의 일차 산출물로서 선택 및 수득된 eAPC의 aAPX에 적재된, 대사산물 및/또는 펩타이드임)은,
i. aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 또는 카고 aM 또는 카고 CM을 단리하는 단계, 및
ii. 적재된 카고를 식별하는 단계를 포함하고,
여기서 식별된 적재된 카고는 2-부분 디바이스의 최종 산출물을 나타낸다.
일반적으로 카고 분자가 선택된 eAPC로부터 식별될 수 있는 2가지 모드가 존재한다. 첫 번째로, aAPX:aAM 또는 aAPX:CM로부터의 카고의 강제 방출은 후속 식별을 위해서 사용 가능한 aAM 또는 CM의 단리를 초래한다(도 36). 이의 예는 eAPC를 산 세척하여 HLA 복합체로부터 펩타이드 aAM을 해방시키는 것이다. 두 번째로, 예를 들어, 복합체의 해방 및 면역친화성 단리 방법에 의한, aAPX:aAM 또는 aAPX:CM의 포획은, aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 복합체의 단리를 초래하여, aAM 또는 CM이 식별될 수 있다(도 37).
단리된 aAM 및/또는 CM을 직접, 또는 단리된 aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 복합체로부터 식별하는 방법은,
i. 질량 분석법 분석,
ii. 펩타이드 서열결정 분석을 포함할 수 있고,
여기서 함유된 aAM 및/또는 CM 아이덴티티는 2-부분 세포 디바이스로부터의 최종 산출물이다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면에서 설명된다.
도 1 -eAPC 및 eTPC 시스템으로 구성된 2-부분 디바이스의 작동
2-부분 조작된 세포 디바이스는 2 다성분 세포 시스템인, eAPCS 및 eTPCS로 구성되며, 이것은 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로서 접촉된다. 전체 디바이스의 작동은 2 단계, 즉 제조 단계 및 분석 단계를 포함한다. 단계 1의 일 양상에서, eAPCS 시스템은 세포 표면에서 분석물 항원-제시 복합체(aAPX), 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 발현하는 세포를 제조하는 데 사용된다(단계 i). aAPX 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-p라고 지칭된다. aAM 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-a라고 지칭된다. aAPX에서 카고로서 제시된 aAM을 제시하는 eAPC는 eAPC-pa라고 지칭된다. 이러한 분석물은 총괄하여 분석물 항원이라고 지칭된다. 단계 1의 별개의 양상에서, eTPCS 시스템은 세포 표면에서 분석물 TCR 쇄 쌍(TCRsp)을 발현하는 세포를 제조하는 데 사용된다(단계 ii). 세포 표면에서 TCRsp를 제시하는 eTPC는 eTPC-t라고 지칭된다. 전체 시스템의 단계 2는 단계 1에서 제조된 분석물-보유 세포를 접촉시켜, 조합된 eAPC:eTPC 시스템을 형성한다(단계 iii). 접촉된 분석물 eAPC는 분석물 eTPC에 분석물 항원을 제시한다. 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서, 제공된 분석물 항원에 대한 분석물 TCR 쇄 쌍의 응답성은 이러한 보고 분석물 세포의 변경된 신호 상태를 나타내기 위해서 * 및 어두운 박스로 나타낸 바와 같이, 접촉-의존성 분석물 eAPC 및/또는 eTPC 반응의 판독에 의해서 결정된다 (단계 iv). eAPC:eTPC 시스템의 결과로서 특이적 eAPC 및/또는 eTPC-t가 다른 접촉하는 분석물 세포에서 반응을 유도하는 이의 반응 및/또는 능력을 기초로 선택될 수 있다. 따라서 그것은 디바이스 작동의 일차 산출물인 유형, eAPC-p, eAPC-a, eAPC-pa 및/또는 eTPC-t의, 선택된 단일 세포 또는 세포의 집단이다 (단계 v). 단계 v로부터 분석물 세포를 수득함으로써, 제시된 분석물 aAPX, aAM, aAPX:aAM, CM, aAPX:CM 및/또는 TCRsp가 이러한 세포로부터 디바이스 작동의 최종 산출물로서 식별될 수 있다(단계 vi).
도 2 - 단일 통합 커플 eAPCS의 성분의 설명.
3종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 1A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC 1A는 1종의 추가 성분 1B를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 1종의 추가적인 성분 1C는 부위 1B 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내며, 여기서 화살표는 커플링되는 특이성을 나타낸다. 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 3 - 이중 통합 커플 eAPCS의 성분의 설명
5종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 1A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC 1A는 2종의 추가 성분 1B 및 1D를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 2종의 추가적인 성분 1C 및 1E는 각각 부위 1B 및 1D 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내고, 여기서 화살표는 짝지워진 특이성을 나타낸다. 각각의 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 4 - 상이한 분석물 항원 제시 eAPC의 컴파일
eAPCS 시스템는 eAPC에서 시작하고, 공여자 벡터(들)를 사용하여 세포 표면에서 분석물 항원-제시 복합체(aAPX), 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 발현하는 세포를 생성시킨다. aAPX 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-p라 지칭되고, ORF(들)를 암호화하는 aAPX를 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 i). aAM 단독을 발현하는 eAPC는 eAPC-a라 지칭되고, 여기서 aAM은 세포 표면에서 발현될 수 있고, TCR 결속을 위해서 사용 가능하거나, 또는 카고로서 aAPX 내에 aAPX:aAM 복합체로서 가공 및 적재될 필요가 있다. eAPC 1A는 ORF(들)를 암호화하는 aAM을 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 ii). aAPX에서 aAM을 카고로서 제시하는 eAPC는 eAPC-pa라 지칭된다. eAPC-pa는 aAM 및 aAPX 암호화 ORF를 eAPC에 동시에 도입하는 것(단계 iii); aAM 암호화 ORF(들)를 eAPC-p에 도입하는 것(단계 iv); aAPX 암호화 ORF(들)를 eAPC-a에 도입하는 것(단계 v) 중 어느 하나에 의해서 생산될 수 있다.
도 5 - 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위 통합 커플의 작동
유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 통합 커플을 형성하는데, 여기서 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된 1종 이상의 ORF가 이의 커플링된 게놈 수용자 부위에 특이적으로 통합될 수 있다. 통합 커플의 작동에서의 단계 1은 1종 이상의 표적 ORF를 공여자 벡터에 도입하는 것이다. 초기 공여자 벡터는 X라 지정되고, 표적 ORF(들)의 도입에 의해서, 프라이밍된 공여자 벡터 X'로 변형된다. 단계 2는 프라이밍된 공여자 벡터 X'와, 게놈 수용자 부위 Y를 보유한 세포의 조합을 수반한다. 프라이밍된 공여자 벡터에 의해서 암호화된 ORF의 수용자 부위로의 도입은 통합된 부위 Y'를 보유한 세포의 생성을 초래한다.
도 6 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-p의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다.
도 7 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-p의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않는다.
도 8 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-a의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다.
도 9 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-a의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다.
도 10 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다.
1A eAPC는 공여자 벡터 1C'와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다.
도 11 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 공여자 벡터 1C'와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다.
도 12 - 2개의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 1E'는 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 공여자 1C' 및 1E'와 동시에 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 동시에, 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1E'의 ORF는 가져서 부위 1D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다.
도 13 - eAPC-p를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 1E'는 aAM을 암호화한다. 단계 1에서 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않는다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-p는 1E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E'를 가져서 부위 1D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 발현된 aAPX의 카고로서 세포 표면 상에서 aAM의 발현, 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 14 - eAPC-a를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAM을 암호화하고, 공여자 벡터 1E'는 aAPX를 암호화한다. 단계 1에서 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAM의 발현 및 eAPC-a의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-a는 1E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E'를 가져서 부위 1D'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 카고로서 aAM을 갖는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 15 - eAPC-p로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 컴파일
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 1D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1E' i 내지 iii의 풀은 1D에 커플링된다. 공여자 벡터 1E' i 내지 iii는 각각 단일 aAM 유전자를 암호화한다. eAPC-p는 동시에 공여자 벡터 1E' i, 1E' ii, 1E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAM 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAM 유전자 중 하나를 aAPX:aAM으로서 제시하는 1B'의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 16 - eAPC-p로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 컴파일
eAPC-a는 aAM을 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 1D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1E' i 내지 iii의 풀은 1D에 커플링된다. 공여자 벡터 1E' i 내지 iii는 각각 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC-a는 동시에 공여자 벡터 1E' i, 1E' ii, 1E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAPX 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 1B'에 암호화된 aAM과, 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAPX 유전자 중 어느 하나의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 17 - aAM 및 aAPX 유전자의 조합 짝지움을 함유하는 eAPC로부터의 풀링된 eAPC-pa 라이브러리의 샷건 컴파일
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 커플링된다. 공여자 벡터 1C' i 및 1C' ii는 각각 단일 aAM 유전자를 암호화하고, 공여자 벡터 1E' i 및 1E' ii는 각각 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC 1A는 공여자 벡터 1C' i, 1C' ii, 1E' i 및 1E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1C' i 또는 1C' ii를 가져서 각각 aAM에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1B' i 및 1B' ii를 생성한다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E i 또는 1E ii를 가져서 각각 APX에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1E' i 및 1E' ii를 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각의 유전자 중 하나로 구성된 표면에서 개별 무작위화된 aAPX:aAM 쌍을 발현하는 4종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 18 - 단일 통합 커플 eTPCS의 성분의 설명.
4종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 2A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eTPC 주 자체이다. eTPC 2A는 제2 성분, 2B를 함유하는데, 이것은 한 쌍의 상보성 분석물 TCR 쇄 ORF의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. eTPC, 2A에 포함된 제3 성분은 TCR 결찰 시에 유도된 합성 리포터 작제물, 2F이다. 1종의 추가적인 독립적인 성분 2C는 부위 2B 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내며, 여기서 화살표는 커플링되는 특이성을 나타낸다.
도 19 - 이중 통합 커플 eTPCS의 성분의 설명.
6종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 2A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eTPC 주 자체이다. eTPC 2A는 3종의 추가 성분을 함유하는데, 이들 중 둘은 2B 및 2D이고, 이들은 분석물 TCR 쇄 쌍의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. eTPC, 2A에 포함된 제3 성분은 TCR 결찰 시에 유도된 합성 리포터 작제물, 2F이다. 2종의 추가적인 독립적인 성분 2C 및 2E는 각각 부위 2B 및 2D 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내고, 여기서 화살표는 커플링된 특이성을 나타낸다. 각각의 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 상이한 수단에 의해서 분석물 TCR 쇄 쌍 발현을 도입할 수 있다.
도 20 - 상이한 분석물 TCRsp 제시 eTPC의 컴파일
eTPCS는 eTPC로 시작되고, 공여자 벡터(들)를 사용하여 분석물 TCRsp, 또는 단일 분석물 TCR 쇄를 발현하는 세포를 생성한다. TCRsp를 제시하는 eTPC는 eTPC-t라고 지칭되고, eTPC에 2개의 상보성 TCR 쇄 암호화 ORF의 도입에 의해서 생성될 수 있다(단계 i). 단일 분석물 TCR 쇄 단독을 발현하는 eTPC는 eTPC-x(여기서, a)라고 지칭되고, eTPC에 단일 TCR 쇄 암호화 ORF(들)를 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 ii). eTPC-t는 대안적으로 eTPCx로서 생성될 수 있고, 여기서 제2 상보성 TCR 쇄 암호화 ORF가 존재하는 eTPC-x에 도입된다(단계 iii).
도 21 - 1-단계 및 1-벡터 포맷을 사용한 eTPC 시스템의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C는 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2C는 TCR 쇄 쌍을 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 부위 2C'를 생성하고, TCR 쇄 쌍에 대한 2종의 ORF를 전달한다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 22 - 하나의 벡터 및 미사용된 수용자 부위를 사용한 1 단계로의 eTPC-t의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 TCR 쇄 쌍을 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C'를 가져서 부위 2B'를 생성하고, TCR 쇄 쌍에 대한 2종의 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 23 - 2개의 벡터 및 2개의 통합 커플을 사용한 1 단계로의 eTPC-t의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2C' 및 2E'는 각각 2B 및 2D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 단일 TCR 쇄를 암호화하고, 공여자 벡터 2E'는 제2 상호 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' 및 2E'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 부위 2B'를 생성하고, 제1 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 또한, 생성된 세포주는 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E'를 가져서 부위 2D'를 생성하고, 제2 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 24 - 하나의 벡터 및 미사용된 수용자 부위를 사용한 1 단계로의 eTPC-x의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 단일 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C'를 가져서 부위 2B'를 생성하고, 단일 TCR 쇄 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다. 이 세포는 단일 TCR 쇄 만을 발현하고, 따라서 eTPC-x라 지정된다.
도 25 - 2개의 벡터를 사용한 2 단계로의 eTPC-t의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2C' 및 2E'는 각각 2B 및 2D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 단일 TCR 쇄를 암호화하고, 공여자 벡터 2E'는 제2 상호 TCR 쇄를 암호화한다. 단계 1에서 eTPC 2A는 공여자 벡터 2C'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C'를 가져서 부위 2B'를 생성하고, 제1 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 이 세포는 단일 TCR 쇄 만을 발현하고, 따라서 eTPC-x라 지정된다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다. 단계 2에서, eTPC-x는 공여자 벡터 2E'와 조합된다. 생성된 세포는 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E'를 가져서 부위 2D'를 생성하고, 제2 상보성 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 26 - 선택된 TCR 쇄 쌍 라이브러리로부터 개별 TCR 쇄 쌍을 발현하기 위한 단일 복제 벡터 내에 짝지워진 분석물 TCR 쇄를 갖는 eTPC로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC 2A는 게놈 수용자 부위 2B를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2B에 커플링된다. 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii은 별개의 TCR 쇄 쌍을 암호화하고, 개별 TCR 쇄 쌍의 혼합된 벡터 라이브러리를 구성한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii과 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각 개별 TCR 쇄 쌍에 대해서 2종의 ORF를 전달하는 부위 2B' i, 2B' ii 및 2B' iii을 생성한다. 이러한 eTPC-t 세포 풀은 각각 TCRsp i, ii 및 iii이라고 지칭되는 별개의 TCR 쇄 쌍을 발현하는 3개의 별개의 세포 클론의 혼합된 집단을 포함하여, eTPC-t 풀링된 라이브러리를 형성한다.
도 27 - 선택된 TCR 쇄 쌍 라이브러리 및 미사용된 리시버 부위로부터 개별 TCR 쇄 쌍을 발현하기 위한 단일 복제 벡터 내에 짝지워진 분석물 TCR 쇄를 갖는 eTPC로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2B에 커플링된다. 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii은 별개의 TCR 쇄 쌍을 암호화하고, 개별 TCR 쇄 쌍의 혼합된 벡터 라이브러리를 구성한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii과 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각 개별 TCR 쇄 쌍에 대해서 2종의 ORF를 전달하는 부위 2B' i, 2B' ii 및 2B' iii을 생성한다. 이러한 eTPC-t 세포 풀은 각각 TCRsp i, ii 및 iii이라고 지칭되는 별개의 TCR 쇄 쌍을 발현하는 3개의 별개의 세포 클론의 혼합된 집단을 포함하여, eTPC-t 풀링된 라이브러리를 형성한다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다.
도 28 - 분비된 단일 TCR 쇄 라이브러리로부터 짝지워진 TCR 쇄 쌍의 무작위 조합물을 발현하기 위한 2개의 벡터를 사용한 eTPC로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2C' 및 2E'는 각각 2B 및 2D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 2C' i 및 2C' ii 각각은 단일 TCR 쇄를 암호화하고, 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii 각각은 상호 단일 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii, 2E' i 및 2E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C' i 또는 2C' ii를 가져서 각각 TCR 쇄에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 2B' i 및 2B' ii를 생성한다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E i 또는 2E ii를 가져서 각각 부위 2C'i 및 2C'ii에서의 것에 대해 상호적인 TCR 쇄에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 2E' i 및 2E' ii를 생성한다. 생성된 eTPC-t 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각의 상호 TCR 쇄 중 하나로 구성된 표면에서 개별 무작위화된 TCRsp를 발현하는 4종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 29 - 분비된 단일 TCR 쇄 라이브러리로부터 짝지워진 TCR 쇄 쌍의 무작위 조합물을 발현하기 위한 짝지워지지 않은 분석물 TCR 쇄를 사용한 eTPC-x로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC-x는 단일 TCR 쇄를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 2B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 2D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii는 각각 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii는 각각 단일 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC-x는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC-x는 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E' i 또는 2E' ii를 가져서 각각 TCR 쇄에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 2E' i 및 2E' ii를 생성한다. 생성된 eTPC-t 세포 풀은 초기 벡터 라이브러리에 함유된 TCR 쇄 중 하나와 짝지워진 2B'로부터 발현된 TCR 쇄로 구성된 표면에서 개별 TCRsp를 발현하는 2개의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 30 - 가능한 eTPC-t-산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:eTPC 시스템의 작동
분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 분석물 eTPC는 각각 표면에서 상호 TCRsp를 암호화하는 하나의 ORF와 통합된 부위 2C' 및 2E'를 함유한다. eTPC-t는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC-t 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 eTPC-t 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 eTPC-t의 휴지 상태이고, 2F 요소에서 어떠한 신호 강도도 없으며, 이는 eTPC-t 제시된 쇄 쌍을 자극하기 위한 eAPC aAPX:aAM 복합체의 실패를 나타낸다. 3종의 양성 상태는 2F로부터의 증가하는 신호 강도를 나타낸다. 상태 2F'+, 2F'++ 및 2F'+++는 각각 낮은, 중간 및 높은 신호 강도를 나타낸다. 6각형으로 나타낸 2F의 유전자 산물은 세포의 더 어두운 음영에 의해서 나타낸 바와 같이, 각각의 세포 상태의 신호 강도를 보고하도록 축적된다. 이것은, eAPC-pa에 의해서 제시된 분석물 aAPX:aAM에 대해서 eTPC-t 집단에 의해서 표현된 분석물 TCRsp의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 31 - 가능한 eAPC-pa 산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:eTPC 시스템의 작동
분석물 eAPC-pa는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 분석물 eTPC는 각각 표면에서 상호 TCRsp를 암호화하는 하나의 ORF와 통합된 부위 2C' 및 2E'를 함유한다. eTPC-t는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 분석물 eTPC 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 eAPC 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 분석물 eAPC에 의해 제시된 aAPX:aAM 복합체를 자극하기 위한 TCRsp 쇄 쌍의 실패를 나타내는 분석물 eAPC의 휴지 상태이다. 3종의 양성 상태는 접촉된 aAPX:aAM으로부터의 증가하는 신호 강도를 나타낸다. 각각의 세포 상태의 보고된 신호 강도를 *, ** 및 **에 의해서 나타내고, 세포의 더 어두운 음영에 의해서 나타낸다. 이것은 TCRsp 쇄 쌍에 대한 분석물 aAPX:aAM의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 32 - 개별 분석물 TCRsp 쇄 쌍을 발현하는 eTPC-t의 라이브러리로부터 분석물 aAPX:aAM과 반응성인 TCR 쇄 쌍을 식별하기 위한 2-부분 분석물 APC:eTPC 시스템의 조합된 작동
eTPC-t 풀은 부위 2C' i, ii 또는 ii를 보유하는 세포를 함유하며, 여기서 각각은 상호 TCR 쇄 쌍을 암호화하는 2종의 ORF와 통합되고, 따라서 집단 내의 각각의 세포 코호트는 표면에서 개별 TCRsp를 발현한다. eTPC-t는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 본 예에서, 2C' i로부터 발현된 TRC 쇄 쌍만 분석물 APC에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 대해서 특이적이어서, eTPC-t 풀 및 분석물 APC 집단이 접촉되는 경우, 단지 2C' i을 보유하는 eTPC-t의 세포 코호트만 상태 2F'를 통해서 TCRsp 결속을 보고한다.
도 33 - 개별 분석물 aAPX:aAM 복합체를 발현하는 분석물 eAPC의 라이브러리로부터 분석물 eTPC와 반응성인 aAM을 식별하기 위한 2-부분 eAPC:eTPC 시스템의 조합된 작동
분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF 각각의 별개의 세트와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 분석물 eTPC는 표면에서 TCRsp를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 2C'를 함유한다. 그것은 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 본 예에서, 복합체 aAPX:aAM i만 단지 분석물 eTPC에 의해서 제시된 TCR에 대해서 특이적이어서, 분석물 eAPC 풀 및 분석물 eTPC 집단이 접촉되는 경우, 단지 aAM i을 발현하는 세포 코호트만 별개의 신호 *를 발현한다.
도 34 - eAPC-p로부터의 eAPC-p + aAM의 생성 및 가용성의 제시 가능한 항원 aAM의 첨가
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'를 함유한다. 가용성의 직접 제시 가능한 항원 aAM은 eAPC-p와 조합된다. 이는 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체의 형성을 초래하고 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 35 - eAPC-p 및 가용성 aAM으로부터의 eAPC-p + aAM의 생성
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'를 함유한다. 가용성 항원 aAM은 eAPC-p와 조합되고, 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현, 세포내의 aAM의 존재, 및 따라서 세포 표면 상에서의 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재 및 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 36 - aAM의 강제 방출을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAM은 인큐베이션 및 식별을 위해서 사용 가능한 방출된 aAM을 통해서 aAPX:aAM 표면 복합체로부터 방출된다.
도 37 - aAPX:aAM 복합체의 포획을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAPX:aAM 표면 복합체는 적재된 aAM의 식별을 위해서 포획된다.
도 38 - HEK239 세포주에서 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌의 표적화된 돌연변이발생을 갖는 세포의 선택
a) HEK293 대조군 세포(점선 히스토그램)와 비교한 Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드 및 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 2개의 독립적인 세포 집단의 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). GFP 하위세트 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포가 다클론성 집단으로서 분류되었다. b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 세포 표면 HLA-ABC 신호(회색 히스토그램). 낮은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 39 - HLA-ABC 널 단클론의 표현형 분석: 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. 모든 3종의 단클론 주는, 각각의 주 결핍된 HLA-ABC 표면 발현을 입증하는 표지되지 않은 대조군과 매칭되는 형광 신호를 나타내었다.
도 40 - 표적화된 HLA 대립유전자에서 게놈 결실을 입증하는 표면 HLA-ABC 발현이 결핍된 단클론의 선택의 유전학적 특징규명. 특이적 HLA 대립유전자의 gRNA 게놈 표적 부위를 연장시킨 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 이의 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 야생형 HLA-A 앰플리콘의 예측된 크기는 1067bp이고, HLA-B 앰플리콘은 717bp이고, HLA-C 앰플리콘은 1221bp이다.
도 41 - 합성 성분 D이 존재하거나 또는 존재하지 않는 합성 성분 B의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 표적으로 하는 플라스미드 및 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 유전 요소를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. b) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 둘 모두 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 및 D를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. c) BFP는 유지되었지만, D1 분류된 다클론성 집단에서 어떠한 검출 가능한 RFP 신호도 관찰되지 않았다. 사분면 Q3에서 높은 BFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 단클론을 함유하는 eAPC를 확립하였다. d) BFP는 유지되었고, D2 분류된 다클론성 집단에서 RFP 신호가 관찰되었다. 사분면 Q2에서 높은 BFP 및 RFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 및 합성 성분 D를 함유하는 eAPC 단클론을 확립하였다.
도 42 - eAPC 단클론의 표현형 분석
유지된 BFP 발현을 나타내는 a 및 b) 단클론 집단은, 합성 성분 B의 통합을 시사한다. c) 유지된 BFP 및 RFP 발현을 나타내는 단클론 집단은 합성 성분 B 및 합성 성분 D 둘 모두의 통합을 시사한다.
도 43 - AAVS1 유전자좌에서 성분 B 또는 성분 B 및 D의 통합을 위한 단클론의 선택의 유전학적 특징규명
a) 성분 B 및/또는 D 내에 프라이밍된 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시키고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 380bp인데, 이는 성분 B 및/또는 D의 안정적인 통합을 나타낸다. b) 상동 아암에 의해서 암호화된 영역 및 성분 B 및/또는 D에 의해서 암호화된 SV40 pA 종결인자에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍되는 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 660bp인데, 이는 AAVS1 부위에서 일어난 성분 B 및/또는 D의 통합을 나타낸다.
도 44 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-A*24:02(좌측 패널) 또는 성분 C'HLA-B*-07:02(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단 ACL-303 또는 ACL-305로 분류되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 높은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주로부터 검출된 신호(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 45 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합체 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02 ORF를 발현하고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 46 - 게놈이 성분 C'에 통합되고, 그 통합이 AAVS1 게놈 수용자 부위에서 일어나서, 성분 B'를 생성시킨 것을 예증하는 단클론의 선택의 유전학적 특징규명
a) PCR 앰플리콘은 HLA 삽입부의 존재를 확인하고, 810bp의 밴드는 적절한 CMV 프로모터 앰플리콘을 나타내었고, 380bp는 SV40pA 종결인자로부터 생성된 앰플리콘이다. b) PCR 앰플리콘은 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대한 원위에 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍된 프라이머 및 분석물 HLA ORF에 연결된 SV40 pA 종결인자에 고유한 프라이머의 두 세트를 사용하여 생성되었다. 양성 앰플리콘 1kb 및 1.1kb의 예측된 크기는 성분 B'의 생성을 나타낸다.
도 47 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01(좌측 패널) 또는 성분 C' HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다.
b) 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 알렉사 647 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 알렉사 647 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)로부터 검출된 신호가 대조군으로서 제공되었다.
도 48 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 II 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-341 및 ACL-350 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01을 발현하였고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 49 - 분석물 HLA 클래스 I 단백질의 RMCE 통합에 의해서 생성된 eAPC-p 단클론
a) eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 BFP 형광을 손실하였다(회색 히스토그램). 이의 모 eAPC 세포주 ACL-385(흑색 선 히스토그램) 및 BFP 음성 ARH 야생형 세포주(점선 히스토그램)는 대조군으로서 제공되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색되는 경우 eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 HLA-A*02:01 발현을 얻었다(회색 히스토그램). 이의 모 ACL-385 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)는 각각 음성 및 양성 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지 대조군으로서 제공되었다.
이러한 결과는, ACL-421 및 ACL-422 세포주 둘 모두에서 BFP ORF와 HLA-A*02:01 ORF 사이에 일어난 성공적인 RMCE를 나타내었다.
도 50 - 단클론의 선택의 유전학적 특징규명은 RMCE에 의한 HLA-A*02:01 통합을 확인하였음
630bp의 앰플리콘은 단클론 ACL-421 및 422에서 HLA-A2의 존재를 나타내었지만, 대조군 주, ACL-128에서는 존재하지 않았다.
도 51 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-pa 단클론 및 aAM의 표현형 분석
a) eAPC-p 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 나타내었고, 따라서 eAPC-p 세포주였음을 예증하였다.
b) eAPC-pa 단클론 집단을 유세포 분석법에 의해서 GFP 형광에 대해서 평가하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-391 및 ACL-395 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 분석물 aAM 선택 마커를 발현하고, 따라서 각각 또한 HLA-LA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 발현하는 세포주에서 aAM 발현을 암시한다는 것을 예증하였다. 따라서 ACL-391 및 ACL-395는 eAPC-pa 주였다.
도 52 - 성분 1D 및/또는 1B를 함유하는 단클론의 유전학적 특징규명
각각 성분 1B, 또는 성분 1B 및 1D를 함유하도록 생성된 eAPC의 유전학적 특징규명을 요약한 2개의 표가 제공된다.
도 53 - 성분 1C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 1 단계로 작제된 eACP-p
HLA-A*02:01(V4.H.5) 또는 HLA-A*24:02(V4.H.6) 중 어느 하나로부터 선택된, aAPX를 암호화하는 하나의 성분 1C' 플라스미드와 함께, Tyr-리콤비나제, Flp(V4.1.8)의 발현을 암호화하는 플라스미드를 사용하여 세포주 ACL-402의 전기천공법에 의해서 RMCE를 통해서 eAPC-p를 생성시켰다. 전기천공법 10일 후, 성분 1B 선택 마커에 의해서 암호화된, HLAI 표면 발현에 대해서 양성이고, 형광 단백질 신호, RFP가 감소된 개별 세포를 분류하였다. 생성된 단클론성 eAPC-p 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 두 예를 제공한다: a) 개별 과성장된 단클론 주(ACL-900 및 ACL-963)를 RFP의 손실, BFP의 존재 및 HLA-ABC(aAPX)의 이득에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 좌측 플롯은 BFP 대 RFP를 나타내고, 모 세포는 BFP 및 RFP(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 모두를 갖는 반면, ACL-900(Q3, 중간 플롯, 99.7%) 및 ACL-963(Q3, 하단 플롯, 99.9%) 둘 모두는 RFP 신호가 결핍되었는데, 이는 성분 1B/1C' 간의 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. 우측 플롯은 BFP 대 HLA-ABC(aAPX)를 나타내는데, 여기서 ACL-900(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 및 ACL-963(Q2, 하단 플롯, 99.2%) 둘 모두는 HLA-ABC(aAPX)에 대한 강한 신호를 나타내며, 이는 1B/1C' 통합을 더 뒷받침한다. 중요하게는, ACL-900 및 ACL-963 둘 모두는 강한 BFP 신호를 갖는데, 이는 성분 1D가 개방적이고, 성분 1B/1C' 통합 커플로부터 격리되어 있음을 나타낸다. b) ACL-900 및 ACL-963, 및 a)에 제공되지 않은 제3 eAPC-p, ACL-907을 더 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 추출하고, 성분 1B'의 인접 및 내부를 표적으로 하는 프라이머(표 5, 8.B.3, 15.H.2)를 사용하여 PCR을 수행하여, 성공적인 통합 커플 사례 만을 선택적으로 증폭시켰다. 변형되지 않은 모체 주, ACL-3에 대한 비교를 수행하였는데, 여기서 성분 1B는 결핍되어 있다. 성분 1B'에 대해서 특이적인 앰플리콘 산물을 모든 3종의 eAPC-p 단클론에 대해서 생산하였지만, 어떠한 산물도 ACL-3 반응에서 검출되지 않았는데, 이는 성분 1B와 성분 1C' 사이에 특이적 통합 커플 사례가 발생하였음을 확인해 준다.
도 54 - 성분 1D'가 단일 분석물 항원 분자(aAM) ORF를 암호화하는, 1 단계로 eAPC-p로부터 작제된 eAPC-pa.
다수의 eAPC-pa를 동시에 모체 eAPC-p(ACL-905)로부터 작제하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 1D는, aAM을 암호화하는 단일 ORF로 구성된, 프라이밍된 유전자 공여자 벡터, 성분 1E'에 의한 통합에 대해서 표적화된다. eAPC-p(ACL-900, 실시예 8)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V9.E.6, V9.E.7 또는 V9.E.8의 각각의 성분 1E'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 전기천공법 10일 후에, 개별 eAPC-pa를 선택하고, 성분 1D에 의해서 암호화된, 통합의 선택 마커 BFP의 감소된 신호를 기초로 단일 세포 분류하였다(단클론). 생성된 단클론성 eAPC-pa 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 3개의 예를 제공한다. 또한, 생성된 단클론을 또한 유전적으로 특징규명하여 통합 커플 사례를 확인하였다. a) eAPC-pa에 대한 단클론, ACL-1219, ACL-1227 및 ACL-1233을 분석하였고, BFP 신호의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. BFP 대 SSC의 플롯을 BFP- 게이트로 나타낸다. 모체 eAPC-p에 비해서 BFP- 사례의 수의 증가가 관찰되며, 이는 성분 1D/1E' 간에 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. BFP- 게이트로부터의 단일 세포는 선택, 분류 및 과성장되었다. b) ACL-1219, ACL-1227, ACL-1233의 선택된 단클론을 유세포 분석법에 의해서 분석하여 BFP의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지를 확인하였다. BFP 대 HLA-ABC의 플롯을 제공하며, 여기서 모든 3종의 단클론은 모체 eAPC-p(가장 우측 플롯)에 비해서 BFP 신호가 손실된 것이 관찰될 수 있는데, 이는 성공적인 통합 커플 사례를 나타낸다. c) 단클론이 aAM ORF에 대한 적절한 단편 크기를 함유하였다는 것을 예증하기 위해서, AM ORF를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였고, 대표적인 아가로스 젤을 나타낸다. 각각의 aAM ORF를 나타내는 2종의 클론으로부터의 결과를 나타낸다. 레인 1: 2_log DNA 마커, 레인 2-3: pp28 ORF(예측된 크기 0.8kb), 레인 4: 2_log DNA 마커, 레인 5-6: pp52 ORF(예측된 크기 1.5kb), 레인 7: 2_log DNA 마커, 레인 8-9: pp65 ORF(예측된 크기 1.9kb), 레인 10: 2_log DNA 마커. 분석된 모든 단클론은 대표적인 aAM에 대해서 예측된 앰플리콘 크기를 가졌는데, 이는 통합 커플이 일어났음을 추가로 나타낸다.
도 55 - 단일 단계로 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키기 위한 eAPC-p 내로의 다수의 항원의 샷건 통합
모체 eAPC-p 내로의 단일 단계 통합에 의해서 총괄적으로 다수의 aAM ORF(HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65)를 암호화하는 프라이밍된 성분 1E 벡터(성분 1E')의 풀로부터 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 생성시켰는데, 여기서 각각의 개별 세포는 성분 1D'에서, 벡터의 본래 풀로부터 유래된 단일 무작위 분석물 항원 ORF를 통합하여, 각각의 생성된 eAPC-pa는 단일 무작위 aAM을 발현하지만, 총괄적으로 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리는 벡터의 본래 풀링된 라이브러리에 암호화된 aAM ORF의 전부를 나타낸다. eAPC-p(ACL-905, aAPX: HLA-A*02:01)를 HCMVpp28, HCMVpp52 또는 HCMVpp65 중 하나에 대한 ORF를 암호화하는 개별 벡터(V9.E.6, V9.E.7 및 V9.E.8)로 구성되고, 1:1:1로 혼합된 풀링된 벡터 라이브러리와 조합함으로써 전기천공법에 의해서 eAPC-pa의 라이브러리를 생성시켰다. 생성된 eAPC-pa 집단을 모체 eAPC-p 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. a) 전기천공법 10일 후에 추정 eAPC-pa 세포(형질주입체)를 유세포 분석법에 의해서, 모체 주(ACL-905)와 비교하여 분석 및 선택하였다. 플롯은 BFP- 집단에 대해서 게이팅된, 디스플레이 BFP 대 SSC를 나타내고, 여기서 BFP- 세포의 증가는 모체 주와 비교하여 BFP- 게이트에서 관찰된다. 벌크 세포를 BFP- 게이트를 기초로 형질주입체로부터 분류하였고, ACL-1050이라 지칭하였다. b) 과성장 후, ACL-1050 세포를 BFP의 손실에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 나타낸 플롯은 BFP 대 SSC이고, 여기서 ACL-1050은 약 4% BFP-인 모체 주에 비해서 96.4% BFP-가 풍부하였다. 그 다음, 단일 세포를 ACL-1050의 BFP- 오염물로부터 분류하였다. c) 다클론 ACL-1050이 HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65 암호화 세포의 혼합물로 구성되었다는 것을 입증하기 위해서, 12종의 단클론을 무작위로 선택하고, 과성장시키고, 이를 유전적 특징규명을 위해서 사용하였다. 세포를 aAM ORF(성분 1D')에 표적화된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해서 특징규명하여, 통합된 aAM을 증폭 및 검출하였다. PCR에 의해서 스크리닝된 모든 12종의 단클론은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 또는 pp65(1.9kb) 중 하나에 대해서 예측된 크기를 갖는 검출 가능한 앰플리콘을 갖는다. 또한, 모든 3종의 aAM을 12종의 단클론에 대해서 나타내었다. 비교 시에, aAM에서 공지된 3종의 개별 단클론으로부터의 앰플리콘을 대조군과 동시에 증폭시켰고; 모든 3종의 대조군은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb)의 적절한 크기의 앰플리콘을 생성시켰다. 따라서, 풀이 eAPC-pa로 구성되고, 여기서 각각의 세포는 3종의 벡터의 본래 풀의 단일 무작위로 선택된 aAM 형태를 갖는다는 것이 확인된다.
도 56 - 모체 eTPC로부터의 eTPC-t 생성의 입증
HLA-A*02:01로 제시된 HCMV 항원에 대해서 공지된 특이성을 갖는 모델 TCR 알파/베타 쌍(JG9-TCR)을 eTPC 모체 주에 대한 통합을 위해서 선택하였다. JG9-TCR-알파 ORF를 성분 2E' 맥락 내에 클로닝하였고, JG9-TCR-베타를 2C' 맥락 내에 클로닝하였다. eTPC-t를 성분 2C' 및 2E' 플라스미드 및 flp 리콤비나제를 암호화하는 작제물의 eTPC 주 ACL-488(이것은 각각 리포터 BFP 및 RFP를 암호화하는, 2개의 게놈 통합 부위, 2B 및 2D를 보유함) 내로의 형질주입에 의해서 RMCE를 통해서 생성시켰다. 형질 주입 10일 후, 성분 2B 및 2D 선택 마커에 의해서 암호화된, BFP 및 RFP 신호에 대해서 감소된 개별 세포를 단일 세포로서 분류하였다. 생성된 단 클론성 eTPC-t ACL-851를 모체 eTPC와 동시에 분석하였고, 단일 실시예를 제시하였다. a) 및 b) 모체 eTPC 세포주 ACL-488 및 실시예 단클론을 BFP 및 RFP 신호에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯은 BFP 대 RFP로서 살아있는 단일 세포를 나타내고, 이것은 eTPC 세포주가 성분 2B 및 2D에 존재하는 선택 마커에 대해서 양성이고(a), 생성된 단클론이 2B/2C와 2D/2E 간의 통합 커플 사건에 대해서 예측된 바와 같이 이들 마커를 손실하였음을 나타낸다(b). 백분율 값은 a)에서 이중 양성 세포의 백분율 및 b)에서 이중 음성 세포를 나타낸다. c) 내지 f) eTPC ACL-488 및 단클론 eTPC-t ACL-851을 CD3 및 TCR 알파/베타(TCRab)에 대한 항체 및 JG9-TCR에 대해서 특이적인 HLA 다량체 시약(Dex HLA-A*02:01-NLVP)으로 염색하였고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 살아있는 단일 세포에 대해서 게이팅하였다. 모체 eTPC 주는, 세포 표면 상의 CD3 또는 TCR에 대해서 양성 염색을 나타내지 않았고(c), 또한 HLA 다량체 시약으로의 염색에 대해서 음성이었다(d). 이에 반해서, 생성된 단클론은 세포 표면 상의 CD3 및 TCR 둘 모두에 대해서 양성 염색을 나타내었고(e), 발현된 JG9-TCR에 대해서 특이적인 다량체 시약을 사용하여 양성 염색을 나타내었다. 백분율 값은 c) 및 e)에서 CD3/TCRab 이중 양성 세포의 백분율을 나타내고 d) 및 f)에서 CD3/HLA-다량체 이중 양성 세포의 백분율을 나타낸다. g) 게놈 DNA를 단클론성 eTPC-t ACL-851로부터 제조하고, 성분 2D'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-알파 쇄에 대해서 특이적인 프라이머 및 성분 2B'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-베타 쇄에 대해서 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR에 적용하였다. PCR 산물을 아가로스 젤에 의해서 분할하고, 예측된 밴드 크기로서 관찰하였다. h) 게놈 DNA를 단클론성 eTPC-t ACL-851로부터 제조하고, 성분 2D'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-알파 쇄에 대해서 특이적인 프라이머 및 성분 2B'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-베타 쇄에 대해서 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 디지털 드롭 PCR에 적용하였다. TCR 알파 계수의 인트론에 대한 참조군 앰플리콘 프라이머/프로브 쌍(TRAC)을 포함시켰다. 표는 TCR 알파에 대한 참조군의 비 및 TCR 베타에 대한 참조군의 비를 나타낸다. 0.33에 가까운 비는, 각각의 TCR 알파 및 베타 쇄의 단일 카피가 3배체 주인 eTPC-t 주 ACL-851에 존재함을 나타낸다.
도 57 - eTPC-t로부터의 eTPC-x 역전의 입증
성분 2D' 를 GFP(성분 2Z)를 암호화하는 공여자 벡터로 교환함으로써, 각각 부위 2D' 및 2B'에서 TCR 알파 및 베타 쇄를 발현하는 모체 eTPC-t 세포주 ACL-851을 eTPC-x 주로 역전시켰다. 성분 2Z는 GFP ORF 측면에 배치된 리콤비나제 이종특이적 F14/F15 부위를 함유하였고, 따라서 성분 2D'와 상용성이었다. eTPC-t 주 ACL-851을 flp 리콤비나제를 암호화하는 작제물과 함께 성분 2Z로 형질주입하였다. 형질주입 7일 후, GFP 신호에 대해서 양성인 개별 세포를 단클론으로서 분류 및 성장시켰다. 생성된 단클론성 eTPC-x 주를 모체 eTPC-t와 함께 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 단일 실시예를 제공하였다. a) 및 b) 모체 eTPC-t ACL-851로부터 유래된 단클론 eTPC-x(ACL-987)를 모체 주와 함께 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯을 게이팅된 살아있는 단일 세포의 SSC 대 GFP 파라미터를 나타낸다. 모체 세포주는 GFP 발현을 갖지 않지만(a), 단클론 ACL-987은 예측된 바와 같이 이득된 GFP를 갖는데(b), 이는 GPF ORF에 대한 TCR 알파 ORF의 교환을 나타낸다. c) 및 d) 모체 eTPC-t ACL-851과 함께, 모체 ACL-851로부터 유래된 단클론 eTPC-x ACL-987을 CD3 및 TCRab에 대한 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯은 살아있는 단일 세포 상에 게이팅된 CD3 대 TCRab 파라미터를 나타낸다. 모체 세포는 CD3 및 TCRab 둘 모두에 대한 양성 염색을 나타내었지만(c), 유래된 단클론은 둘 모두에 대한 음성 염색을 나타내었는데(d)이는 유래된 eTPC-x 주에서 TCR 알파 ORF의 손실을 확인해 주었다.
도 58 - eTPC-t의 풀을 생성하기 위한 eTPC-x 내로의 샷건 통합의 입증
eTPC-t 풀을 성분 2B'에서 단일 TCR 베타 쇄를 발현하는 eTPC-x 모체 주로부터 생성하였다. eTPC-x 주는 사용 가능한 부위 2D에서 리포터로서 GFP를 발현하였다. 모체 쇄를 비롯한, 64개 변이체 TCR 알파 쇄의 풀을 작제하였다. 모체 TCR 쇄 쌍은 HLA-A*02:01에서 제시된 HCMV 항원에 대해서 공지된 특이성을 갖는 JG9-TCR을 나타낸다. 성분 2E 풀을 flp 리콤비나제를 암호화하는 작제물과 함께 모체 eTPC-x ACL-987 내에 형질주입하였다. 형질주입 10일 후 GFP 양성 세포에 대해서 분류함으로써 다클론성 주를 선택하였다. 그 다음 생성된 ACL-988 다클론성 eTPC-t를 GFP에 대한 음성 염색 및 HLA 다량체 시약(DEX HLA-A*02:01-NLVP)에 대한 양성 및 음성 염색을 기초로 분류하였다. 회수된 단일 세포를 서열결정하여 암호화된 TCR-알파 쇄를 식별하고, 모체 TCR 쇄 쌍에 대해서 특이적인 HLA 다량체 시약으로의 염색과 관련하여 네이티브 TCR-베타 쇄와 짝지워진 TCR-알파 쇄 변이체 각각의 평행 분석에 비교하였다. a) 및 b) 모체 eTPC-x ACL-987 주 및 생성된 다클론 eTPC-t ACL-988 주를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯을 살아있는 단일 세포의 SSC 대 GFP 파라미터를 나타낸다. 모체 세포주는 GFP에 대한 양성 신호를 나타내는데, 이는 무손상 성분 2D를 나타낸다(a). 유래된 다클론성 주는 GFP에 대해서 절반 양성 및 절반 음성을 나타내는데(b), 이는 다클론성 집단 내의 세포의 절반이 TCR 알파 ORF에 대해서 D에서 GFP ORF를 잠재적으로 교환하여 성분 2D'를 형성함을 나타낸다. c) 및 d) 모체 eTPC-x ACL-987 주 및 생성된 다클론 eTPC-t ACL-988 주를 CD3 항체 및 모체 JG9-TCR에 대해서 특이성을 갖는 HLA 다량체(DEX HLA-A*02:01-NLVP)로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯은 살아있는 단일 세포의 CD3 대 HLA 다량체 파라미터를 나타낸다. 모체 세포주는 CD3 및 HLA 다량체 염색에 대해서 음성이다(c). d)의 좌측 패널은 게이팅된 GFP-음성 사건을 나타내고, 우측은 GFP-양성 사건을 나타낸다. 성분 2D가 D'로 전환된 GFP-음성만 단독으로 CD3 양성 염색을 나타내며, 이의 하위세트는 HLA 다량체에 대한 양성 염색을 나타낸다. 게이팅된 HLA 다량체 음성 및 양성 게이트로부터의 단일 세포를 분류하고, 성분 2D'에서 통합된 ORF를 서열결정하여 TCR 알파 ORF의 아이덴티티를 결정하였다. e) 모든 64개의 JG9-TCR-알파 변이체를, 각각 모체 eTPC-x(ACL-987)에 독립적으로 형질주입되는 것이 허용된 발현 작제물 내에서 클로닝하였다. HLA-A*02:01-NLVP 사량체 시약에 대한 상대적인 염색 단위(relative staining uni: RSU)를 각각에 대해서 결정하였다. CD3 음성 집단에 대한, CD3 양성 집단에 대한 HLA-A*02:01-NLVP 사량체 신호의 평균 형광 강도(MFI)의 비로서 RSU를 계산하고, 이것은 HLA 다량체 시약에 대한 각각의 TCR 쇄 쌍 변이체의 결합 강도를 나타낸다. 도 e)에 플롯팅된 각각의 지점은 각각의 64개의 변이체에 대해서 관찰된 RSU를 나타낸다. 빈 원은 GFP-음성/HLA 다량체-양성 게이트로부터 회수된 서열결정된 세포와 연관된다. 빈 삼각형은 FP-음성/HLA 다량체-음성 게이트로부터 회수된 서열결정된 세포와 연관된다.
도 59 - eAPC-p 및 외인성 aAM을 사용한 eAPC:eTPC 시스템에서의 성분 2F의 기능성 입증
성분 2F를 보유하는 eTPC-t 세포주(ACL-1277)(여기서 성분 2B' 및 2D'에서 TCR 쇄는 HLA-A*02:01에 제시된 HMCV 항원성 펩타이드 NLVPMVATV에 대해서 특이적인 TCR 쌍을 암호화함). 성분 2F 리포터는 RFP였다. 이러한 eTPC-t를 모델 펩타이드 항원의 존재 및 부재 하에서 상이한 -p 특징의 다양한 eAPC 주와 24시간 동안 접촉시켰고, 접촉 배양물을 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 유세포 분석법 히스토그램 플롯은 eAPC에 의해서 제시되지 않은 특이적 표면 마커에 대한 항체 염색에 의해서 식별된 생존 가능한 단일 T-세포의 RFP 신호에 대한 사건 계수치를 나타낸다. a) 및 b) HLA-A*02:01만을 발현하는 eAPC-p 세포(ACL-209)를 NLVPMVATV(a) 또는 VYALPLKML(b) 펩타이드로 펄싱하고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. c) 및 d) HLA-A*24:02 만을 발현하는 eAPC-p 세포(ACL-963)를 NLVPMVATV(c) 또는 VYALPLKML(d) 펩타이드로 펄싱하고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. e) HLA-A*02:01 만을 발현하는 eAPC-p 세포(ACL-209)를 펩타이드 펄싱하지 않고 정치시켰고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. f) 세포 표면 상에 HLA를 발현하지 않는 eAPC 모체 세포(ACL-128)를 NLVPMVATV로 펄싱하였고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. RFP 신호는 NLVPMVATV로 펄싱된, HLA-A*02:01 발현 eAPC-p의 존재 하에서만 eTPC-t ACL-1277에서 상당히 증가되었는데, 이는 발현된 TCR의 공지된 표적을 나타낸다. 히스토그램 게이트 및 값은 RFP 양성 및 RFP 음성 게이트에서 사건의 백분율을 반영한다. 이는, eTPC-t 발현된 TCRsp와 동족 HLA/항원과의 결속(aAPX:aAM)에 대한 성분 2F의 특이적 반응을 나타낸다.
도 60 - 통합된 aAM을 갖는 eAPC-pa를 사용한 eAPC:eTPC 시스템에서의 성분 2F의 기능성 입증
성분 2F를 보유하는 eTPC-t 세포주(ACL-1150)(여기서 성분 2B' 및 2D'에서 TCR 쇄는 HLA-A*02:01에 제시된 HMCV 항원성 펩타이드 NLVPMVATV에 대해서 특이적인 TCR 쌍을 암호화함). 성분 2F 리포터는 RFP였다. 이러한 eTPC-t를 24시간 동안 외인성 항원의 부재 하에서 상이한 -pa 특징의 다양한 eAPC 주와 접촉시켰다. a) HLA-A*02:01 및 HCMV 단백질 pp52의 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1044). pp52는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원성 서열을 함유하지 않는다. b) HLA-A*02:01 및 HCMV 단백질 pp65에 대한 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1046). HLA-A*02:01으로 제시되는 경우, pp65는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원 서열을 함유한다. c) HLA-B*07:02 및 HCMV 단백질 pp52에 대한 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1045). pp52는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원 서열을 함유하지 않는다. d) HLA-B*07:02 및 HCMV 단백질 pp65에 대한 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1048). HLA-A*02:01으로 제시되는 경우, pp65는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원 서열을 함유한다. 48시간 동안의 각각의 eAPC-pa 주와 eTPC-t의 독립적인 공배양 후, eTPC-t에서의 RFP 발현을 유세포 분석법에 의해서 결정하였다. eAPC-pa ACL-1046와 접촉된 경우에만, eTPC-t ACL-1150에서 RFP 신호가 상당히 증가되었다. 이것은 통합된 aAM ORF에 의해서 암호화된 인식된 항원성 펩타이드 서열 및 적절한 HLA 제한 둘 모두를 갖는 유일한 eAPC-pa였다. 히스토그램 게이트 및 값은 RFP 양성 및 RFP 음성 게이트에서 사건의 백분율을 반영한다. 이는, eTPC-t 발현된 TCRsp와 동족 HLA/항원과의 결속(aAPX:aAM)에 대한 성분 2F의 특이적 반응을 나타낸다.
도 1 -eAPC 및 eTPC 시스템으로 구성된 2-부분 디바이스의 작동
2-부분 조작된 세포 디바이스는 2 다성분 세포 시스템인, eAPCS 및 eTPCS로 구성되며, 이것은 조합된 eAPC:eTPC 시스템으로서 접촉된다. 전체 디바이스의 작동은 2 단계, 즉 제조 단계 및 분석 단계를 포함한다. 단계 1의 일 양상에서, eAPCS 시스템은 세포 표면에서 분석물 항원-제시 복합체(aAPX), 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 발현하는 세포를 제조하는 데 사용된다(단계 i). aAPX 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-p라고 지칭된다. aAM 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-a라고 지칭된다. aAPX에서 카고로서 제시된 aAM을 제시하는 eAPC는 eAPC-pa라고 지칭된다. 이러한 분석물은 총괄하여 분석물 항원이라고 지칭된다. 단계 1의 별개의 양상에서, eTPCS 시스템은 세포 표면에서 분석물 TCR 쇄 쌍(TCRsp)을 발현하는 세포를 제조하는 데 사용된다(단계 ii). 세포 표면에서 TCRsp를 제시하는 eTPC는 eTPC-t라고 지칭된다. 전체 시스템의 단계 2는 단계 1에서 제조된 분석물-보유 세포를 접촉시켜, 조합된 eAPC:eTPC 시스템을 형성한다(단계 iii). 접촉된 분석물 eAPC는 분석물 eTPC에 분석물 항원을 제시한다. 조합된 eAPC:eTPC 시스템 내에서, 제공된 분석물 항원에 대한 분석물 TCR 쇄 쌍의 응답성은 이러한 보고 분석물 세포의 변경된 신호 상태를 나타내기 위해서 * 및 어두운 박스로 나타낸 바와 같이, 접촉-의존성 분석물 eAPC 및/또는 eTPC 반응의 판독에 의해서 결정된다 (단계 iv). eAPC:eTPC 시스템의 결과로서 특이적 eAPC 및/또는 eTPC-t가 다른 접촉하는 분석물 세포에서 반응을 유도하는 이의 반응 및/또는 능력을 기초로 선택될 수 있다. 따라서 그것은 디바이스 작동의 일차 산출물인 유형, eAPC-p, eAPC-a, eAPC-pa 및/또는 eTPC-t의, 선택된 단일 세포 또는 세포의 집단이다 (단계 v). 단계 v로부터 분석물 세포를 수득함으로써, 제시된 분석물 aAPX, aAM, aAPX:aAM, CM, aAPX:CM 및/또는 TCRsp가 이러한 세포로부터 디바이스 작동의 최종 산출물로서 식별될 수 있다(단계 vi).
도 2 - 단일 통합 커플 eAPCS의 성분의 설명.
3종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 1A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC 1A는 1종의 추가 성분 1B를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 1종의 추가적인 성분 1C는 부위 1B 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내며, 여기서 화살표는 커플링되는 특이성을 나타낸다. 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 3 - 이중 통합 커플 eAPCS의 성분의 설명
5종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 1A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eAPC 주 자체이다. eAPC 1A는 2종의 추가 성분 1B 및 1D를 함유하는데, 이것은 aAPX 및/또는 aAM의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. 2종의 추가적인 성분 1C 및 1E는 각각 부위 1B 및 1D 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내고, 여기서 화살표는 짝지워진 특이성을 나타낸다. 각각의 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 aAPX 및/또는 aAM 발현을 도입할 수 있다.
도 4 - 상이한 분석물 항원 제시 eAPC의 컴파일
eAPCS 시스템는 eAPC에서 시작하고, 공여자 벡터(들)를 사용하여 세포 표면에서 분석물 항원-제시 복합체(aAPX), 및/또는 분석물 항원성 분자(aAM)를 발현하는 세포를 생성시킨다. aAPX 단독을 제시하는 eAPC는 eAPC-p라 지칭되고, ORF(들)를 암호화하는 aAPX를 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 i). aAM 단독을 발현하는 eAPC는 eAPC-a라 지칭되고, 여기서 aAM은 세포 표면에서 발현될 수 있고, TCR 결속을 위해서 사용 가능하거나, 또는 카고로서 aAPX 내에 aAPX:aAM 복합체로서 가공 및 적재될 필요가 있다. eAPC 1A는 ORF(들)를 암호화하는 aAM을 eAPC에 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 ii). aAPX에서 aAM을 카고로서 제시하는 eAPC는 eAPC-pa라 지칭된다. eAPC-pa는 aAM 및 aAPX 암호화 ORF를 eAPC에 동시에 도입하는 것(단계 iii); aAM 암호화 ORF(들)를 eAPC-p에 도입하는 것(단계 iv); aAPX 암호화 ORF(들)를 eAPC-a에 도입하는 것(단계 v) 중 어느 하나에 의해서 생산될 수 있다.
도 5 - 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위 통합 커플의 작동
유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위는 통합 커플을 형성하는데, 여기서 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된 1종 이상의 ORF가 이의 커플링된 게놈 수용자 부위에 특이적으로 통합될 수 있다. 통합 커플의 작동에서의 단계 1은 1종 이상의 표적 ORF를 공여자 벡터에 도입하는 것이다. 초기 공여자 벡터는 X라 지정되고, 표적 ORF(들)의 도입에 의해서, 프라이밍된 공여자 벡터 X'로 변형된다. 단계 2는 프라이밍된 공여자 벡터 X'와, 게놈 수용자 부위 Y를 보유한 세포의 조합을 수반한다. 프라이밍된 공여자 벡터에 의해서 암호화된 ORF의 수용자 부위로의 도입은 통합된 부위 Y'를 보유한 세포의 생성을 초래한다.
도 6 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-p의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다.
도 7 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-p의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAPX를 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 발현을 도입한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않는다.
도 8 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-a의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다.
도 9 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-a의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 프라이밍된 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링되어 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1C'의 ORF를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAM 발현을 도입한다. 이는 eAPC-a의 두 형태, 즉, 세포 표면에서 aAM을 발현하는 것 또는 세포내에서 발현하는 것 중 하나를 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다.
도 10 - 하나의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 게놈 수용자 부위 1B를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다.
1A eAPC는 공여자 벡터 1C'와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다.
도 11 - 하나의 통합 커플 및 하나의 미사용 통합 부위를 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1C'는 1B에 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX뿐만 아니라 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 공여자 벡터 1C'와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX 및 aAM에 대한 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다.
도 12 - 2개의 통합 커플을 사용한 1 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 1E'는 aAM을 암호화한다. 1A eAPC는 공여자 1C' 및 1E'와 동시에 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 ORF 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 동시에, 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 1E'의 ORF는 가져서 부위 1D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서 aAPX의 발현, 세포내에서 aAM의 발현, 및 따라서 세포 표면에서 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재를 초래한다. 이는 eAPC-pa 세포주를 생성한다.
도 13 - eAPC-p를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAPX를 암호화하고, 공여자 벡터 1E'는 aAM을 암호화한다. 단계 1에서 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-p의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않는다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-p는 1E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E'를 가져서 부위 1D'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 발현된 aAPX의 카고로서 세포 표면 상에서 aAM의 발현, 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 14 - eAPC-a를 통해서 2개의 통합 커플을 사용한 2 단계의 eAPC-pa의 컴파일의 예
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 1C'는 aAM을 암호화하고, 공여자 벡터 1E'는 aAPX를 암호화한다. 단계 1에서 1A eAPC는 1C' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1C'를 가져서 부위 1B'를 생성하고, aAM에 대한 ORF를 전달한다. 이는 세포 표면 상에서의 aAM의 발현 및 eAPC-a의 생성을 초래한다. 게놈 수용자 부위 1D는 사용되지 않고 남아있다. 단계 2에서 단계 1에서 생성된 eAPC-a는 1E' 공여자 벡터와 조합된다. 생성된 세포는 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E'를 가져서 부위 1D'를 생성하고, aAPX에 대한 ORF를 전달한다. 이는 카고로서 aAM을 갖는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현 및 eAPC-pa의 생성을 초래한다.
도 15 - eAPC-p로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 컴파일
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 1D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1E' i 내지 iii의 풀은 1D에 커플링된다. 공여자 벡터 1E' i 내지 iii는 각각 단일 aAM 유전자를 암호화한다. eAPC-p는 동시에 공여자 벡터 1E' i, 1E' ii, 1E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAM 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAM 유전자 중 하나를 aAPX:aAM으로서 제시하는 1B'의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 16 - eAPC-p로부터의 eAPC-pa 풀의 샷건 컴파일
eAPC-a는 aAM을 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 1D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 1E' i 내지 iii의 풀은 1D에 커플링된다. 공여자 벡터 1E' i 내지 iii는 각각 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC-a는 동시에 공여자 벡터 1E' i, 1E' ii, 1E' iii와 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E' i 내지 iii 중 어느 하나를 가져서 각각 aAPX 유전자에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1D' i 내지 iii을 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 1B'에 암호화된 aAM과, 초기 벡터 라이브러리에 함유된 aAPX 유전자 중 어느 하나의 개별 조합물을 발현하는 3종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 17 - aAM 및 aAPX 유전자의 조합 짝지움을 함유하는 eAPC로부터의 풀링된 eAPC-pa 라이브러리의 샷건 컴파일
eAPC 1A는 별개의 게놈 수용자 부위 1B 및 1D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 1C' 및 1E'는 각각 1B 및 1D에 커플링된다. 공여자 벡터 1C' i 및 1C' ii는 각각 단일 aAM 유전자를 암호화하고, 공여자 벡터 1E' i 및 1E' ii는 각각 단일 aAPX 유전자를 암호화한다. eAPC 1A는 공여자 벡터 1C' i, 1C' ii, 1E' i 및 1E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1C' i 또는 1C' ii를 가져서 각각 aAM에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1B' i 및 1B' ii를 생성한다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 1D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 1E i 또는 1E ii를 가져서 각각 APX에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 1E' i 및 1E' ii를 생성한다. 생성된 eAPC-pa 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각의 유전자 중 하나로 구성된 표면에서 개별 무작위화된 aAPX:aAM 쌍을 발현하는 4종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 18 - 단일 통합 커플 eTPCS의 성분의 설명.
4종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 2A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eTPC 주 자체이다. eTPC 2A는 제2 성분, 2B를 함유하는데, 이것은 한 쌍의 상보성 분석물 TCR 쇄 ORF의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. eTPC, 2A에 포함된 제3 성분은 TCR 결찰 시에 유도된 합성 리포터 작제물, 2F이다. 1종의 추가적인 독립적인 성분 2C는 부위 2B 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내며, 여기서 화살표는 커플링되는 특이성을 나타낸다.
도 19 - 이중 통합 커플 eTPCS의 성분의 설명.
6종의 성분을 포함하는 eAPCS의 예. 제1 성분 2A는 세포의 모든 요구된 조작된 특징부를 갖는 eTPC 주 자체이다. eTPC 2A는 3종의 추가 성분을 함유하는데, 이들 중 둘은 2B 및 2D이고, 이들은 분석물 TCR 쇄 쌍의 통합을 위한 게놈 통합 부위이다. eTPC, 2A에 포함된 제3 성분은 TCR 결찰 시에 유도된 합성 리포터 작제물, 2F이다. 2종의 추가적인 독립적인 성분 2C 및 2E는 각각 부위 2B 및 2D 내로의 ORF의 부위-지향된 통합을 위한 유전자 공여자 벡터를 나타내고, 여기서 화살표는 커플링된 특이성을 나타낸다. 각각의 짝지워진 통합 부위 / 공여자 벡터 커플은 포맷팅되어 단일 ORF 또는 한 쌍의 ORF를 통합하여 상이한 수단에 의해서 분석물 TCR 쇄 쌍 발현을 도입할 수 있다.
도 20 - 상이한 분석물 TCRsp 제시 eTPC의 컴파일
eTPCS는 eTPC로 시작되고, 공여자 벡터(들)를 사용하여 분석물 TCRsp, 또는 단일 분석물 TCR 쇄를 발현하는 세포를 생성한다. TCRsp를 제시하는 eTPC는 eTPC-t라고 지칭되고, eTPC에 2개의 상보성 TCR 쇄 암호화 ORF의 도입에 의해서 생성될 수 있다(단계 i). 단일 분석물 TCR 쇄 단독을 발현하는 eTPC는 eTPC-x(여기서, a)라고 지칭되고, eTPC에 단일 TCR 쇄 암호화 ORF(들)를 도입함으로써 생성될 수 있다(단계 ii). eTPC-t는 대안적으로 eTPCx로서 생성될 수 있고, 여기서 제2 상보성 TCR 쇄 암호화 ORF가 존재하는 eTPC-x에 도입된다(단계 iii).
도 21 - 1-단계 및 1-벡터 포맷을 사용한 eTPC 시스템의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C는 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2C는 TCR 쇄 쌍을 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 부위 2C'를 생성하고, TCR 쇄 쌍에 대한 2종의 ORF를 전달한다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 22 - 하나의 벡터 및 미사용된 수용자 부위를 사용한 1 단계로의 eTPC-t의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 TCR 쇄 쌍을 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C'를 가져서 부위 2B'를 생성하고, TCR 쇄 쌍에 대한 2종의 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 23 - 2개의 벡터 및 2개의 통합 커플을 사용한 1 단계로의 eTPC-t의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2C' 및 2E'는 각각 2B 및 2D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 단일 TCR 쇄를 암호화하고, 공여자 벡터 2E'는 제2 상호 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' 및 2E'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 부위 2B'를 생성하고, 제1 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 또한, 생성된 세포주는 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E'를 가져서 부위 2D'를 생성하고, 제2 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 24 - 하나의 벡터 및 미사용된 수용자 부위를 사용한 1 단계로의 eTPC-x의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 단일 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C'를 가져서 부위 2B'를 생성하고, 단일 TCR 쇄 ORF를 전달한다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다. 이 세포는 단일 TCR 쇄 만을 발현하고, 따라서 eTPC-x라 지정된다.
도 25 - 2개의 벡터를 사용한 2 단계로의 eTPC-t의 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2C' 및 2E'는 각각 2B 및 2D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 2C'는 단일 TCR 쇄를 암호화하고, 공여자 벡터 2E'는 제2 상호 TCR 쇄를 암호화한다. 단계 1에서 eTPC 2A는 공여자 벡터 2C'와 조합된다. 생성된 세포는 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C'를 가져서 부위 2B'를 생성하고, 제1 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 이 세포는 단일 TCR 쇄 만을 발현하고, 따라서 eTPC-x라 지정된다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다. 단계 2에서, eTPC-x는 공여자 벡터 2E'와 조합된다. 생성된 세포는 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E'를 가져서 부위 2D'를 생성하고, 제2 상보성 TCR 쇄에 대한 ORF를 전달한다. 이러한 세포는 표면에서 TCRsp를 제시할 수 있고, 따라서 eTPC-t라 지정된다.
도 26 - 선택된 TCR 쇄 쌍 라이브러리로부터 개별 TCR 쇄 쌍을 발현하기 위한 단일 복제 벡터 내에 짝지워진 분석물 TCR 쇄를 갖는 eTPC로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC 2A는 게놈 수용자 부위 2B를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2B에 커플링된다. 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii은 별개의 TCR 쇄 쌍을 암호화하고, 개별 TCR 쇄 쌍의 혼합된 벡터 라이브러리를 구성한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii과 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각 개별 TCR 쇄 쌍에 대해서 2종의 ORF를 전달하는 부위 2B' i, 2B' ii 및 2B' iii을 생성한다. 이러한 eTPC-t 세포 풀은 각각 TCRsp i, ii 및 iii이라고 지칭되는 별개의 TCR 쇄 쌍을 발현하는 3개의 별개의 세포 클론의 혼합된 집단을 포함하여, eTPC-t 풀링된 라이브러리를 형성한다.
도 27 - 선택된 TCR 쇄 쌍 라이브러리 및 미사용된 리시버 부위로부터 개별 TCR 쇄 쌍을 발현하기 위한 단일 복제 벡터 내에 짝지워진 분석물 TCR 쇄를 갖는 eTPC로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 유전자 공여자 벡터 2C'는 2B에 커플링된다. 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii은 별개의 TCR 쇄 쌍을 암호화하고, 개별 TCR 쇄 쌍의 혼합된 벡터 라이브러리를 구성한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii 및 2C' iii과 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C를 가져서 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각 개별 TCR 쇄 쌍에 대해서 2종의 ORF를 전달하는 부위 2B' i, 2B' ii 및 2B' iii을 생성한다. 이러한 eTPC-t 세포 풀은 각각 TCRsp i, ii 및 iii이라고 지칭되는 별개의 TCR 쇄 쌍을 발현하는 3개의 별개의 세포 클론의 혼합된 집단을 포함하여, eTPC-t 풀링된 라이브러리를 형성한다. 게놈 수용자 부위 2D는 사용되지 않고 남아있다.
도 28 - 분비된 단일 TCR 쇄 라이브러리로부터 짝지워진 TCR 쇄 쌍의 무작위 조합물을 발현하기 위한 2개의 벡터를 사용한 eTPC로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC 2A는 별개의 게놈 수용자 부위 2B 및 2D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2C' 및 2E'는 각각 2B 및 2D에 독립적으로 커플링된다. 공여자 벡터 2C' i 및 2C' ii 각각은 단일 TCR 쇄를 암호화하고, 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii 각각은 상호 단일 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC 2A는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC 2A는 공여자 벡터 2C' i, 2C' ii, 2E' i 및 2E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2B 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2C' i 또는 2C' ii를 가져서 각각 TCR 쇄에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 2B' i 및 2B' ii를 생성한다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E i 또는 2E ii를 가져서 각각 부위 2C'i 및 2C'ii에서의 것에 대해 상호적인 TCR 쇄에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 2E' i 및 2E' ii를 생성한다. 생성된 eTPC-t 세포 풀은 각각 초기 벡터 라이브러리에 함유된 각각의 상호 TCR 쇄 중 하나로 구성된 표면에서 개별 무작위화된 TCRsp를 발현하는 4종의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 29 - 분비된 단일 TCR 쇄 라이브러리로부터 짝지워진 TCR 쇄 쌍의 무작위 조합물을 발현하기 위한 짝지워지지 않은 분석물 TCR 쇄를 사용한 eTPC-x로부터의 eTPC-t 풀의 샷건 컴파일
eTPC-x는 단일 TCR 쇄를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 2B' 및 별개의 게놈 수용자 부위 2D를 함유한다. 별개의 유전자 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii는 각각 2D에 커플링된다. 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii는 각각 단일 TCR 쇄를 암호화한다. eTPC-x는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC-x는 공여자 벡터 2E' i 및 2E' ii와 동시에 조합된다. 생성된 세포 풀은 다수의 독립적인 예에서 2D 게놈 수용자 부위에 대해서 교환된 삽입부 2E' i 또는 2E' ii를 가져서 각각 TCR 쇄에 대한 단일 ORF를 전달하는 부위 2E' i 및 2E' ii를 생성한다. 생성된 eTPC-t 세포 풀은 초기 벡터 라이브러리에 함유된 TCR 쇄 중 하나와 짝지워진 2B'로부터 발현된 TCR 쇄로 구성된 표면에서 개별 TCRsp를 발현하는 2개의 별개의 세포 코호트의 혼합된 집단을 포함한다.
도 30 - 가능한 eTPC-t-산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:eTPC 시스템의 작동
분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 분석물 eTPC는 각각 표면에서 상호 TCRsp를 암호화하는 하나의 ORF와 통합된 부위 2C' 및 2E'를 함유한다. eTPC-t는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. eTPC-t 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 eTPC-t 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 eTPC-t의 휴지 상태이고, 2F 요소에서 어떠한 신호 강도도 없으며, 이는 eTPC-t 제시된 쇄 쌍을 자극하기 위한 eAPC aAPX:aAM 복합체의 실패를 나타낸다. 3종의 양성 상태는 2F로부터의 증가하는 신호 강도를 나타낸다. 상태 2F'+, 2F'++ 및 2F'+++는 각각 낮은, 중간 및 높은 신호 강도를 나타낸다. 6각형으로 나타낸 2F의 유전자 산물은 세포의 더 어두운 음영에 의해서 나타낸 바와 같이, 각각의 세포 상태의 신호 강도를 보고하도록 축적된다. 이것은, eAPC-pa에 의해서 제시된 분석물 aAPX:aAM에 대해서 eTPC-t 집단에 의해서 표현된 분석물 TCRsp의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 31 - 가능한 eAPC-pa 산출물 상태를 나타내는 조합된 eAPC:eTPC 시스템의 작동
분석물 eAPC-pa는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 각각 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 분석물 eTPC는 각각 표면에서 상호 TCRsp를 암호화하는 하나의 ORF와 통합된 부위 2C' 및 2E'를 함유한다. eTPC-t는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 분석물 eTPC 및 eAPC-pa 집단이 접촉된 경우, 4종의 eAPC 반응 상태가 달성될 수 있는데, 하나는 음성이고, 3개는 양성이다. 음성 상태는 분석물 eAPC에 의해 제시된 aAPX:aAM 복합체를 자극하기 위한 TCRsp 쇄 쌍의 실패를 나타내는 분석물 eAPC의 휴지 상태이다. 3종의 양성 상태는 접촉된 aAPX:aAM으로부터의 증가하는 신호 강도를 나타낸다. 각각의 세포 상태의 보고된 신호 강도를 *, ** 및 **에 의해서 나타내고, 세포의 더 어두운 음영에 의해서 나타낸다. 이것은 TCRsp 쇄 쌍에 대한 분석물 aAPX:aAM의 등급화된 반응을 나타낸다.
도 32 - 개별 분석물 TCRsp 쇄 쌍을 발현하는 eTPC-t의 라이브러리로부터 분석물 aAPX:aAM과 반응성인 TCR 쇄 쌍을 식별하기 위한 2-부분 분석물 APC:eTPC 시스템의 조합된 작동
eTPC-t 풀은 부위 2C' i, ii 또는 ii를 보유하는 세포를 함유하며, 여기서 각각은 상호 TCR 쇄 쌍을 암호화하는 2종의 ORF와 통합되고, 따라서 집단 내의 각각의 세포 코호트는 표면에서 개별 TCRsp를 발현한다. eTPC-t는 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF의 별개의 세트와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 본 예에서, 2C' i로부터 발현된 TRC 쇄 쌍만 분석물 APC에 의해서 제시된 aAPX:aAM에 대해서 특이적이어서, eTPC-t 풀 및 분석물 APC 집단이 접촉되는 경우, 단지 2C' i을 보유하는 eTPC-t의 세포 코호트만 상태 2F'를 통해서 TCRsp 결속을 보고한다.
도 33 - 개별 분석물 aAPX:aAM 복합체를 발현하는 분석물 eAPC의 라이브러리로부터 분석물 eTPC와 반응성인 aAM을 식별하기 위한 2-부분 eAPC:eTPC 시스템의 조합된 작동
분석물 eAPC는, 세포 표면에서 aAPX에서 카고로서 적재된 aAM과 함께, 하나의 aAPX 및 하나의 aAM을 암호화하기 위한 ORF 각각의 별개의 세트와 통합된 부위 1C' 및 1E'를 함유한다. 분석물 eTPC는 표면에서 TCRsp를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 2C'를 함유한다. 그것은 TCR 신호 반응 요소 2F를 추가로 함유한다. 본 예에서, 복합체 aAPX:aAM i만 단지 분석물 eTPC에 의해서 제시된 TCR에 대해서 특이적이어서, 분석물 eAPC 풀 및 분석물 eTPC 집단이 접촉되는 경우, 단지 aAM i을 발현하는 세포 코호트만 별개의 신호 *를 발현한다.
도 34 - eAPC-p로부터의 eAPC-p + aAM의 생성 및 가용성의 제시 가능한 항원 aAM의 첨가
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'를 함유한다. 가용성의 직접 제시 가능한 항원 aAM은 eAPC-p와 조합된다. 이는 세포 표면 상에 aAPX:aAM 복합체의 형성을 초래하고 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 35 - eAPC-p 및 가용성 aAM으로부터의 eAPC-p + aAM의 생성
eAPC-p는 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'를 함유한다. 가용성 항원 aAM은 eAPC-p와 조합되고, 이는 세포 표면 상에서의 aAPX의 발현, 세포내의 aAM의 존재, 및 따라서 세포 표면 상에서의 aAPX:aAM 복합체의 형성 시에 aAPX에서 카고로서의 aAM의 적재 및 eAPC-p + aAM의 생성을 초래한다.
도 36 - aAM의 강제 방출을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAM은 인큐베이션 및 식별을 위해서 사용 가능한 방출된 aAM을 통해서 aAPX:aAM 표면 복합체로부터 방출된다.
도 37 - aAPX:aAM 복합체의 포획을 통한 eAPC-p + aAM에 의해서 제시된 aAM의 식별
eAPC-p + aAM은 aAPX를 발현하는 교환된 게놈 수용자 부위 1B'뿐만 아니라 aAPX:aAM 복합체로서 표면 상에 제시되는 내재화된 aAM을 함유한다. aAPX:aAM 표면 복합체는 적재된 aAM의 식별을 위해서 포획된다.
도 38 - HEK239 세포주에서 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌의 표적화된 돌연변이발생을 갖는 세포의 선택
a) HEK293 대조군 세포(점선 히스토그램)와 비교한 Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드 및 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 2개의 독립적인 세포 집단의 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). GFP 하위세트 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포가 다클론성 집단으로서 분류되었다. b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 세포 표면 HLA-ABC 신호(회색 히스토그램). 낮은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 39 - HLA-ABC 널 단클론의 표현형 분석: 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). 표지되지 않은 HEK293 세포(점선 히스토그램) 및 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 HEK293 세포(흑색선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. 모든 3종의 단클론 주는, 각각의 주 결핍된 HLA-ABC 표면 발현을 입증하는 표지되지 않은 대조군과 매칭되는 형광 신호를 나타내었다.
도 40 - 표적화된 HLA 대립유전자에서 게놈 결실을 입증하는 표면 HLA-ABC 발현이 결핍된 단클론의 선택의 유전학적 특징규명. 특이적 HLA 대립유전자의 gRNA 게놈 표적 부위를 연장시킨 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 이의 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 야생형 HLA-A 앰플리콘의 예측된 크기는 1067bp이고, HLA-B 앰플리콘은 717bp이고, HLA-C 앰플리콘은 1221bp이다.
도 41 - 합성 성분 D이 존재하거나 또는 존재하지 않는 합성 성분 B의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 표적으로 하는 플라스미드 및 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 유전 요소를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. b) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 둘 모두 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 B 및 D를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호(회색 히스토그램). HEK293 세포는 GFP 음성 대조군(점선 히스토그램)으로 제공된다. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다. c) BFP는 유지되었지만, D1 분류된 다클론성 집단에서 어떠한 검출 가능한 RFP 신호도 관찰되지 않았다. 사분면 Q3에서 높은 BFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 단클론을 함유하는 eAPC를 확립하였다. d) BFP는 유지되었고, D2 분류된 다클론성 집단에서 RFP 신호가 관찰되었다. 사분면 Q2에서 높은 BFP 및 RFP 신호를 나타낸 단일 세포를 분류하여 합성 성분 B 및 합성 성분 D를 함유하는 eAPC 단클론을 확립하였다.
도 42 - eAPC 단클론의 표현형 분석
유지된 BFP 발현을 나타내는 a 및 b) 단클론 집단은, 합성 성분 B의 통합을 시사한다. c) 유지된 BFP 및 RFP 발현을 나타내는 단클론 집단은 합성 성분 B 및 합성 성분 D 둘 모두의 통합을 시사한다.
도 43 - AAVS1 유전자좌에서 성분 B 또는 성분 B 및 D의 통합을 위한 단클론의 선택의 유전학적 특징규명
a) 성분 B 및/또는 D 내에 프라이밍된 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시키고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 380bp인데, 이는 성분 B 및/또는 D의 안정적인 통합을 나타낸다. b) 상동 아암에 의해서 암호화된 영역 및 성분 B 및/또는 D에 의해서 암호화된 SV40 pA 종결인자에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍되는 프라이머를 사용하여 PCR 앰플리콘을 생성시켰고, 크기를 전기영동법에 의해서 결정하였다. 양성 앰플리콘의 예측된 크기는 660bp인데, 이는 AAVS1 부위에서 일어난 성분 B 및/또는 D의 통합을 나타낸다.
도 44 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-A*24:02(좌측 패널) 또는 성분 C'HLA-B*-07:02(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단 ACL-303 또는 ACL-305로 분류되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 높은 PE-Cy5 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주로부터 검출된 신호(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다.
도 45 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합체 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02 ORF를 발현하고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 46 - 게놈이 성분 C'에 통합되고, 그 통합이 AAVS1 게놈 수용자 부위에서 일어나서, 성분 B'를 생성시킨 것을 예증하는 단클론의 선택의 유전학적 특징규명
a) PCR 앰플리콘은 HLA 삽입부의 존재를 확인하고, 810bp의 밴드는 적절한 CMV 프로모터 앰플리콘을 나타내었고, 380bp는 SV40pA 종결인자로부터 생성된 앰플리콘이다. b) PCR 앰플리콘은 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대한 원위에 AAVS1 게놈 서열 상에 프라이밍된 프라이머 및 분석물 HLA ORF에 연결된 SV40 pA 종결인자에 고유한 프라이머의 두 세트를 사용하여 생성되었다. 양성 앰플리콘 1kb 및 1.1kb의 예측된 크기는 성분 B'의 생성을 나타낸다.
도 47 - 성분 B 내로의 성분 C'의 표적화된 게놈 통합을 갖는 세포의 선택
a) Cas9-P2A-GFP를 암호화하는 플라스미드, AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 암호화하는 플라스미드 및 성분 C'HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01(좌측 패널) 또는 성분 C' HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01(우측 패널)를 암호화하는 플라스미드가 형질주입된 지 48시간 후 GFP 형광 신호. GFP+ 게이트 내에 GFP 신호를 갖는 세포는 다클론성 집단으로 분류되었다.
b) 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 표지되는 경우 2개의 분류된 다클론성 집단 상에서 관찰된 분석물 HLA 세포 표면 발현(회색 히스토그램). 알렉사 647 항-HLA-ABC 신호를 나타내고, 우측 분류 게이트 내에 디스플레이된 단일 세포를 분류하여 단클론을 확립하였다. 알렉사 647 항-HLA-ABC 표지된 ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)로부터 검출된 신호가 대조군으로서 제공되었다.
도 48 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 II 단백질을 발현하는 eAPC-p 단클론의 표현형 분석
단클론 집단을 알렉사 647 항-HLA-DR,DP,DQ 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128(HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주)(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-341 및 ACL-350 단클론 세포주는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01을 발현하였고, 따라서 eAPC-p 세포주임을 예증한다.
도 49 - 분석물 HLA 클래스 I 단백질의 RMCE 통합에 의해서 생성된 eAPC-p 단클론
a) eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 BFP 형광을 손실하였다(회색 히스토그램). 이의 모 eAPC 세포주 ACL-385(흑색 선 히스토그램) 및 BFP 음성 ARH 야생형 세포주(점선 히스토그램)는 대조군으로서 제공되었다.
b) PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색되는 경우 eAPC-p 단클론 집단 ACL-421 및 ACL-422는 HLA-A*02:01 발현을 얻었다(회색 히스토그램). 이의 모 ACL-385 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램) 및 ARH 야생형 세포주(흑색 선 히스토그램)는 각각 음성 및 양성 PE-Cy5 항-HLA-ABC 표지 대조군으로서 제공되었다.
이러한 결과는, ACL-421 및 ACL-422 세포주 둘 모두에서 BFP ORF와 HLA-A*02:01 ORF 사이에 일어난 성공적인 RMCE를 나타내었다.
도 50 - 단클론의 선택의 유전학적 특징규명은 RMCE에 의한 HLA-A*02:01 통합을 확인하였음
630bp의 앰플리콘은 단클론 ACL-421 및 422에서 HLA-A2의 존재를 나타내었지만, 대조군 주, ACL-128에서는 존재하지 않았다.
도 51 - 세포 표면 상에서 분석물 HLA 클래스 I 단백질을 발현하는 eAPC-pa 단클론 및 aAM의 표현형 분석
a) eAPC-p 단클론 집단을 PE-Cy5 항-HLA-ABC 접합된 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-321 및 ACL-331 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 각각 이의 분석물 aAPX, HLA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 나타내었고, 따라서 eAPC-p 세포주였음을 예증하였다.
b) eAPC-pa 단클론 집단을 유세포 분석법에 의해서 GFP 형광에 대해서 평가하였다(회색 히스토그램). ACL-128, HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 eAPC 세포주(점선 히스토그램)가 대조군으로서 제공되었다. ACL-391 및 ACL-395 단클론 세포주는 대조군에 비해서 더 강한 형광 신호를 나타내었는데, 이는 각각의 주가 분석물 aAM 선택 마커를 발현하고, 따라서 각각 또한 HLA-LA-A*02:01 또는 HLA-B*35:01 ORF를 발현하는 세포주에서 aAM 발현을 암시한다는 것을 예증하였다. 따라서 ACL-391 및 ACL-395는 eAPC-pa 주였다.
도 52 - 성분 1D 및/또는 1B를 함유하는 단클론의 유전학적 특징규명
각각 성분 1B, 또는 성분 1B 및 1D를 함유하도록 생성된 eAPC의 유전학적 특징규명을 요약한 2개의 표가 제공된다.
도 53 - 성분 1C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 1 단계로 작제된 eACP-p
HLA-A*02:01(V4.H.5) 또는 HLA-A*24:02(V4.H.6) 중 어느 하나로부터 선택된, aAPX를 암호화하는 하나의 성분 1C' 플라스미드와 함께, Tyr-리콤비나제, Flp(V4.1.8)의 발현을 암호화하는 플라스미드를 사용하여 세포주 ACL-402의 전기천공법에 의해서 RMCE를 통해서 eAPC-p를 생성시켰다. 전기천공법 10일 후, 성분 1B 선택 마커에 의해서 암호화된, HLAI 표면 발현에 대해서 양성이고, 형광 단백질 신호, RFP가 감소된 개별 세포를 분류하였다. 생성된 단클론성 eAPC-p 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 두 예를 제공한다: a) 개별 과성장된 단클론 주(ACL-900 및 ACL-963)를 RFP의 손실, BFP의 존재 및 HLA-ABC(aAPX)의 이득에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 좌측 플롯은 BFP 대 RFP를 나타내고, 모 세포는 BFP 및 RFP(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 모두를 갖는 반면, ACL-900(Q3, 중간 플롯, 99.7%) 및 ACL-963(Q3, 하단 플롯, 99.9%) 둘 모두는 RFP 신호가 결핍되었는데, 이는 성분 1B/1C' 간의 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. 우측 플롯은 BFP 대 HLA-ABC(aAPX)를 나타내는데, 여기서 ACL-900(Q2, 상단 플롯, 99.2%) 및 ACL-963(Q2, 하단 플롯, 99.2%) 둘 모두는 HLA-ABC(aAPX)에 대한 강한 신호를 나타내며, 이는 1B/1C' 통합을 더 뒷받침한다. 중요하게는, ACL-900 및 ACL-963 둘 모두는 강한 BFP 신호를 갖는데, 이는 성분 1D가 개방적이고, 성분 1B/1C' 통합 커플로부터 격리되어 있음을 나타낸다. b) ACL-900 및 ACL-963, 및 a)에 제공되지 않은 제3 eAPC-p, ACL-907을 더 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 추출하고, 성분 1B'의 인접 및 내부를 표적으로 하는 프라이머(표 5, 8.B.3, 15.H.2)를 사용하여 PCR을 수행하여, 성공적인 통합 커플 사례 만을 선택적으로 증폭시켰다. 변형되지 않은 모체 주, ACL-3에 대한 비교를 수행하였는데, 여기서 성분 1B는 결핍되어 있다. 성분 1B'에 대해서 특이적인 앰플리콘 산물을 모든 3종의 eAPC-p 단클론에 대해서 생산하였지만, 어떠한 산물도 ACL-3 반응에서 검출되지 않았는데, 이는 성분 1B와 성분 1C' 사이에 특이적 통합 커플 사례가 발생하였음을 확인해 준다.
도 54 - 성분 1D'가 단일 분석물 항원 분자(aAM) ORF를 암호화하는, 1 단계로 eAPC-p로부터 작제된 eAPC-pa.
다수의 eAPC-pa를 동시에 모체 eAPC-p(ACL-905)로부터 작제하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 1D는, aAM을 암호화하는 단일 ORF로 구성된, 프라이밍된 유전자 공여자 벡터, 성분 1E'에 의한 통합에 대해서 표적화된다. eAPC-p(ACL-900, 실시예 8)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V9.E.6, V9.E.7 또는 V9.E.8의 각각의 성분 1E'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 전기천공법 10일 후에, 개별 eAPC-pa를 선택하고, 성분 1D에 의해서 암호화된, 통합의 선택 마커 BFP의 감소된 신호를 기초로 단일 세포 분류하였다(단클론). 생성된 단클론성 eAPC-pa 주를 모체 eAPC 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 3개의 예를 제공한다. 또한, 생성된 단클론을 또한 유전적으로 특징규명하여 통합 커플 사례를 확인하였다. a) eAPC-pa에 대한 단클론, ACL-1219, ACL-1227 및 ACL-1233을 분석하였고, BFP 신호의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. BFP 대 SSC의 플롯을 BFP- 게이트로 나타낸다. 모체 eAPC-p에 비해서 BFP- 사례의 수의 증가가 관찰되며, 이는 성분 1D/1E' 간에 통합 커플이 일어났음을 나타낸다. BFP- 게이트로부터의 단일 세포는 선택, 분류 및 과성장되었다. b) ACL-1219, ACL-1227, ACL-1233의 선택된 단클론을 유세포 분석법에 의해서 분석하여 BFP의 손실 및 HLA-ABC 신호의 유지를 확인하였다. BFP 대 HLA-ABC의 플롯을 제공하며, 여기서 모든 3종의 단클론은 모체 eAPC-p(가장 우측 플롯)에 비해서 BFP 신호가 손실된 것이 관찰될 수 있는데, 이는 성공적인 통합 커플 사례를 나타낸다. c) 단클론이 aAM ORF에 대한 적절한 단편 크기를 함유하였다는 것을 예증하기 위해서, AM ORF를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행하였고, 대표적인 아가로스 젤을 나타낸다. 각각의 aAM ORF를 나타내는 2종의 클론으로부터의 결과를 나타낸다. 레인 1: 2_log DNA 마커, 레인 2-3: pp28 ORF(예측된 크기 0.8kb), 레인 4: 2_log DNA 마커, 레인 5-6: pp52 ORF(예측된 크기 1.5kb), 레인 7: 2_log DNA 마커, 레인 8-9: pp65 ORF(예측된 크기 1.9kb), 레인 10: 2_log DNA 마커. 분석된 모든 단클론은 대표적인 aAM에 대해서 예측된 앰플리콘 크기를 가졌는데, 이는 통합 커플이 일어났음을 추가로 나타낸다.
도 55 - 단일 단계로 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키기 위한 eAPC-p 내로의 다수의 항원의 샷건 통합
모체 eAPC-p 내로의 단일 단계 통합에 의해서 총괄적으로 다수의 aAM ORF(HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65)를 암호화하는 프라이밍된 성분 1E 벡터(성분 1E')의 풀로부터 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리를 생성시켰는데, 여기서 각각의 개별 세포는 성분 1D'에서, 벡터의 본래 풀로부터 유래된 단일 무작위 분석물 항원 ORF를 통합하여, 각각의 생성된 eAPC-pa는 단일 무작위 aAM을 발현하지만, 총괄적으로 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리는 벡터의 본래 풀링된 라이브러리에 암호화된 aAM ORF의 전부를 나타낸다. eAPC-p(ACL-905, aAPX: HLA-A*02:01)를 HCMVpp28, HCMVpp52 또는 HCMVpp65 중 하나에 대한 ORF를 암호화하는 개별 벡터(V9.E.6, V9.E.7 및 V9.E.8)로 구성되고, 1:1:1로 혼합된 풀링된 벡터 라이브러리와 조합함으로써 전기천공법에 의해서 eAPC-pa의 라이브러리를 생성시켰다. 생성된 eAPC-pa 집단을 모체 eAPC-p 주와 동시에 유세포 분석법에 의해서 분석 및 선택하였다. a) 전기천공법 10일 후에 추정 eAPC-pa 세포(형질주입체)를 유세포 분석법에 의해서, 모체 주(ACL-905)와 비교하여 분석 및 선택하였다. 플롯은 BFP- 집단에 대해서 게이팅된, 디스플레이 BFP 대 SSC를 나타내고, 여기서 BFP- 세포의 증가는 모체 주와 비교하여 BFP- 게이트에서 관찰된다. 벌크 세포를 BFP- 게이트를 기초로 형질주입체로부터 분류하였고, ACL-1050이라 지칭하였다. b) 과성장 후, ACL-1050 세포를 BFP의 손실에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 나타낸 플롯은 BFP 대 SSC이고, 여기서 ACL-1050은 약 4% BFP-인 모체 주에 비해서 96.4% BFP-가 풍부하였다. 그 다음, 단일 세포를 ACL-1050의 BFP- 오염물로부터 분류하였다. c) 다클론 ACL-1050이 HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65 암호화 세포의 혼합물로 구성되었다는 것을 입증하기 위해서, 12종의 단클론을 무작위로 선택하고, 과성장시키고, 이를 유전적 특징규명을 위해서 사용하였다. 세포를 aAM ORF(성분 1D')에 표적화된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해서 특징규명하여, 통합된 aAM을 증폭 및 검출하였다. PCR에 의해서 스크리닝된 모든 12종의 단클론은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 또는 pp65(1.9kb) 중 하나에 대해서 예측된 크기를 갖는 검출 가능한 앰플리콘을 갖는다. 또한, 모든 3종의 aAM을 12종의 단클론에 대해서 나타내었다. 비교 시에, aAM에서 공지된 3종의 개별 단클론으로부터의 앰플리콘을 대조군과 동시에 증폭시켰고; 모든 3종의 대조군은 pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb)의 적절한 크기의 앰플리콘을 생성시켰다. 따라서, 풀이 eAPC-pa로 구성되고, 여기서 각각의 세포는 3종의 벡터의 본래 풀의 단일 무작위로 선택된 aAM 형태를 갖는다는 것이 확인된다.
도 56 - 모체 eTPC로부터의 eTPC-t 생성의 입증
HLA-A*02:01로 제시된 HCMV 항원에 대해서 공지된 특이성을 갖는 모델 TCR 알파/베타 쌍(JG9-TCR)을 eTPC 모체 주에 대한 통합을 위해서 선택하였다. JG9-TCR-알파 ORF를 성분 2E' 맥락 내에 클로닝하였고, JG9-TCR-베타를 2C' 맥락 내에 클로닝하였다. eTPC-t를 성분 2C' 및 2E' 플라스미드 및 flp 리콤비나제를 암호화하는 작제물의 eTPC 주 ACL-488(이것은 각각 리포터 BFP 및 RFP를 암호화하는, 2개의 게놈 통합 부위, 2B 및 2D를 보유함) 내로의 형질주입에 의해서 RMCE를 통해서 생성시켰다. 형질 주입 10일 후, 성분 2B 및 2D 선택 마커에 의해서 암호화된, BFP 및 RFP 신호에 대해서 감소된 개별 세포를 단일 세포로서 분류하였다. 생성된 단 클론성 eTPC-t ACL-851를 모체 eTPC와 동시에 분석하였고, 단일 실시예를 제시하였다. a) 및 b) 모체 eTPC 세포주 ACL-488 및 실시예 단클론을 BFP 및 RFP 신호에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯은 BFP 대 RFP로서 살아있는 단일 세포를 나타내고, 이것은 eTPC 세포주가 성분 2B 및 2D에 존재하는 선택 마커에 대해서 양성이고(a), 생성된 단클론이 2B/2C와 2D/2E 간의 통합 커플 사건에 대해서 예측된 바와 같이 이들 마커를 손실하였음을 나타낸다(b). 백분율 값은 a)에서 이중 양성 세포의 백분율 및 b)에서 이중 음성 세포를 나타낸다. c) 내지 f) eTPC ACL-488 및 단클론 eTPC-t ACL-851을 CD3 및 TCR 알파/베타(TCRab)에 대한 항체 및 JG9-TCR에 대해서 특이적인 HLA 다량체 시약(Dex HLA-A*02:01-NLVP)으로 염색하였고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 살아있는 단일 세포에 대해서 게이팅하였다. 모체 eTPC 주는, 세포 표면 상의 CD3 또는 TCR에 대해서 양성 염색을 나타내지 않았고(c), 또한 HLA 다량체 시약으로의 염색에 대해서 음성이었다(d). 이에 반해서, 생성된 단클론은 세포 표면 상의 CD3 및 TCR 둘 모두에 대해서 양성 염색을 나타내었고(e), 발현된 JG9-TCR에 대해서 특이적인 다량체 시약을 사용하여 양성 염색을 나타내었다. 백분율 값은 c) 및 e)에서 CD3/TCRab 이중 양성 세포의 백분율을 나타내고 d) 및 f)에서 CD3/HLA-다량체 이중 양성 세포의 백분율을 나타낸다. g) 게놈 DNA를 단클론성 eTPC-t ACL-851로부터 제조하고, 성분 2D'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-알파 쇄에 대해서 특이적인 프라이머 및 성분 2B'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-베타 쇄에 대해서 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR에 적용하였다. PCR 산물을 아가로스 젤에 의해서 분할하고, 예측된 밴드 크기로서 관찰하였다. h) 게놈 DNA를 단클론성 eTPC-t ACL-851로부터 제조하고, 성분 2D'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-알파 쇄에 대해서 특이적인 프라이머 및 성분 2B'에 의해서 암호화된 JG9-TCR-베타 쇄에 대해서 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 디지털 드롭 PCR에 적용하였다. TCR 알파 계수의 인트론에 대한 참조군 앰플리콘 프라이머/프로브 쌍(TRAC)을 포함시켰다. 표는 TCR 알파에 대한 참조군의 비 및 TCR 베타에 대한 참조군의 비를 나타낸다. 0.33에 가까운 비는, 각각의 TCR 알파 및 베타 쇄의 단일 카피가 3배체 주인 eTPC-t 주 ACL-851에 존재함을 나타낸다.
도 57 - eTPC-t로부터의 eTPC-x 역전의 입증
성분 2D' 를 GFP(성분 2Z)를 암호화하는 공여자 벡터로 교환함으로써, 각각 부위 2D' 및 2B'에서 TCR 알파 및 베타 쇄를 발현하는 모체 eTPC-t 세포주 ACL-851을 eTPC-x 주로 역전시켰다. 성분 2Z는 GFP ORF 측면에 배치된 리콤비나제 이종특이적 F14/F15 부위를 함유하였고, 따라서 성분 2D'와 상용성이었다. eTPC-t 주 ACL-851을 flp 리콤비나제를 암호화하는 작제물과 함께 성분 2Z로 형질주입하였다. 형질주입 7일 후, GFP 신호에 대해서 양성인 개별 세포를 단클론으로서 분류 및 성장시켰다. 생성된 단클론성 eTPC-x 주를 모체 eTPC-t와 함께 유세포 분석법에 의해서 분석하였고, 단일 실시예를 제공하였다. a) 및 b) 모체 eTPC-t ACL-851로부터 유래된 단클론 eTPC-x(ACL-987)를 모체 주와 함께 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯을 게이팅된 살아있는 단일 세포의 SSC 대 GFP 파라미터를 나타낸다. 모체 세포주는 GFP 발현을 갖지 않지만(a), 단클론 ACL-987은 예측된 바와 같이 이득된 GFP를 갖는데(b), 이는 GPF ORF에 대한 TCR 알파 ORF의 교환을 나타낸다. c) 및 d) 모체 eTPC-t ACL-851과 함께, 모체 ACL-851로부터 유래된 단클론 eTPC-x ACL-987을 CD3 및 TCRab에 대한 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯은 살아있는 단일 세포 상에 게이팅된 CD3 대 TCRab 파라미터를 나타낸다. 모체 세포는 CD3 및 TCRab 둘 모두에 대한 양성 염색을 나타내었지만(c), 유래된 단클론은 둘 모두에 대한 음성 염색을 나타내었는데(d)이는 유래된 eTPC-x 주에서 TCR 알파 ORF의 손실을 확인해 주었다.
도 58 - eTPC-t의 풀을 생성하기 위한 eTPC-x 내로의 샷건 통합의 입증
eTPC-t 풀을 성분 2B'에서 단일 TCR 베타 쇄를 발현하는 eTPC-x 모체 주로부터 생성하였다. eTPC-x 주는 사용 가능한 부위 2D에서 리포터로서 GFP를 발현하였다. 모체 쇄를 비롯한, 64개 변이체 TCR 알파 쇄의 풀을 작제하였다. 모체 TCR 쇄 쌍은 HLA-A*02:01에서 제시된 HCMV 항원에 대해서 공지된 특이성을 갖는 JG9-TCR을 나타낸다. 성분 2E 풀을 flp 리콤비나제를 암호화하는 작제물과 함께 모체 eTPC-x ACL-987 내에 형질주입하였다. 형질주입 10일 후 GFP 양성 세포에 대해서 분류함으로써 다클론성 주를 선택하였다. 그 다음 생성된 ACL-988 다클론성 eTPC-t를 GFP에 대한 음성 염색 및 HLA 다량체 시약(DEX HLA-A*02:01-NLVP)에 대한 양성 및 음성 염색을 기초로 분류하였다. 회수된 단일 세포를 서열결정하여 암호화된 TCR-알파 쇄를 식별하고, 모체 TCR 쇄 쌍에 대해서 특이적인 HLA 다량체 시약으로의 염색과 관련하여 네이티브 TCR-베타 쇄와 짝지워진 TCR-알파 쇄 변이체 각각의 평행 분석에 비교하였다. a) 및 b) 모체 eTPC-x ACL-987 주 및 생성된 다클론 eTPC-t ACL-988 주를 GFP 발현에 대해서 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯을 살아있는 단일 세포의 SSC 대 GFP 파라미터를 나타낸다. 모체 세포주는 GFP에 대한 양성 신호를 나타내는데, 이는 무손상 성분 2D를 나타낸다(a). 유래된 다클론성 주는 GFP에 대해서 절반 양성 및 절반 음성을 나타내는데(b), 이는 다클론성 집단 내의 세포의 절반이 TCR 알파 ORF에 대해서 D에서 GFP ORF를 잠재적으로 교환하여 성분 2D'를 형성함을 나타낸다. c) 및 d) 모체 eTPC-x ACL-987 주 및 생성된 다클론 eTPC-t ACL-988 주를 CD3 항체 및 모체 JG9-TCR에 대해서 특이성을 갖는 HLA 다량체(DEX HLA-A*02:01-NLVP)로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 플롯은 살아있는 단일 세포의 CD3 대 HLA 다량체 파라미터를 나타낸다. 모체 세포주는 CD3 및 HLA 다량체 염색에 대해서 음성이다(c). d)의 좌측 패널은 게이팅된 GFP-음성 사건을 나타내고, 우측은 GFP-양성 사건을 나타낸다. 성분 2D가 D'로 전환된 GFP-음성만 단독으로 CD3 양성 염색을 나타내며, 이의 하위세트는 HLA 다량체에 대한 양성 염색을 나타낸다. 게이팅된 HLA 다량체 음성 및 양성 게이트로부터의 단일 세포를 분류하고, 성분 2D'에서 통합된 ORF를 서열결정하여 TCR 알파 ORF의 아이덴티티를 결정하였다. e) 모든 64개의 JG9-TCR-알파 변이체를, 각각 모체 eTPC-x(ACL-987)에 독립적으로 형질주입되는 것이 허용된 발현 작제물 내에서 클로닝하였다. HLA-A*02:01-NLVP 사량체 시약에 대한 상대적인 염색 단위(relative staining uni: RSU)를 각각에 대해서 결정하였다. CD3 음성 집단에 대한, CD3 양성 집단에 대한 HLA-A*02:01-NLVP 사량체 신호의 평균 형광 강도(MFI)의 비로서 RSU를 계산하고, 이것은 HLA 다량체 시약에 대한 각각의 TCR 쇄 쌍 변이체의 결합 강도를 나타낸다. 도 e)에 플롯팅된 각각의 지점은 각각의 64개의 변이체에 대해서 관찰된 RSU를 나타낸다. 빈 원은 GFP-음성/HLA 다량체-양성 게이트로부터 회수된 서열결정된 세포와 연관된다. 빈 삼각형은 FP-음성/HLA 다량체-음성 게이트로부터 회수된 서열결정된 세포와 연관된다.
도 59 - eAPC-p 및 외인성 aAM을 사용한 eAPC:eTPC 시스템에서의 성분 2F의 기능성 입증
성분 2F를 보유하는 eTPC-t 세포주(ACL-1277)(여기서 성분 2B' 및 2D'에서 TCR 쇄는 HLA-A*02:01에 제시된 HMCV 항원성 펩타이드 NLVPMVATV에 대해서 특이적인 TCR 쌍을 암호화함). 성분 2F 리포터는 RFP였다. 이러한 eTPC-t를 모델 펩타이드 항원의 존재 및 부재 하에서 상이한 -p 특징의 다양한 eAPC 주와 24시간 동안 접촉시켰고, 접촉 배양물을 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 유세포 분석법 히스토그램 플롯은 eAPC에 의해서 제시되지 않은 특이적 표면 마커에 대한 항체 염색에 의해서 식별된 생존 가능한 단일 T-세포의 RFP 신호에 대한 사건 계수치를 나타낸다. a) 및 b) HLA-A*02:01만을 발현하는 eAPC-p 세포(ACL-209)를 NLVPMVATV(a) 또는 VYALPLKML(b) 펩타이드로 펄싱하고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. c) 및 d) HLA-A*24:02 만을 발현하는 eAPC-p 세포(ACL-963)를 NLVPMVATV(c) 또는 VYALPLKML(d) 펩타이드로 펄싱하고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. e) HLA-A*02:01 만을 발현하는 eAPC-p 세포(ACL-209)를 펩타이드 펄싱하지 않고 정치시켰고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. f) 세포 표면 상에 HLA를 발현하지 않는 eAPC 모체 세포(ACL-128)를 NLVPMVATV로 펄싱하였고, 그 다음 eTPC-t와 24시간 동안 공배양하였다. RFP 신호는 NLVPMVATV로 펄싱된, HLA-A*02:01 발현 eAPC-p의 존재 하에서만 eTPC-t ACL-1277에서 상당히 증가되었는데, 이는 발현된 TCR의 공지된 표적을 나타낸다. 히스토그램 게이트 및 값은 RFP 양성 및 RFP 음성 게이트에서 사건의 백분율을 반영한다. 이는, eTPC-t 발현된 TCRsp와 동족 HLA/항원과의 결속(aAPX:aAM)에 대한 성분 2F의 특이적 반응을 나타낸다.
도 60 - 통합된 aAM을 갖는 eAPC-pa를 사용한 eAPC:eTPC 시스템에서의 성분 2F의 기능성 입증
성분 2F를 보유하는 eTPC-t 세포주(ACL-1150)(여기서 성분 2B' 및 2D'에서 TCR 쇄는 HLA-A*02:01에 제시된 HMCV 항원성 펩타이드 NLVPMVATV에 대해서 특이적인 TCR 쌍을 암호화함). 성분 2F 리포터는 RFP였다. 이러한 eTPC-t를 24시간 동안 외인성 항원의 부재 하에서 상이한 -pa 특징의 다양한 eAPC 주와 접촉시켰다. a) HLA-A*02:01 및 HCMV 단백질 pp52의 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1044). pp52는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원성 서열을 함유하지 않는다. b) HLA-A*02:01 및 HCMV 단백질 pp65에 대한 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1046). HLA-A*02:01으로 제시되는 경우, pp65는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원 서열을 함유한다. c) HLA-B*07:02 및 HCMV 단백질 pp52에 대한 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1045). pp52는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원 서열을 함유하지 않는다. d) HLA-B*07:02 및 HCMV 단백질 pp65에 대한 전장 ORF를 발현하는 eAPC-pa 주(ACL-1048). HLA-A*02:01으로 제시되는 경우, pp65는 JG9-TCR에 의해서 인식되는 항원 서열을 함유한다. 48시간 동안의 각각의 eAPC-pa 주와 eTPC-t의 독립적인 공배양 후, eTPC-t에서의 RFP 발현을 유세포 분석법에 의해서 결정하였다. eAPC-pa ACL-1046와 접촉된 경우에만, eTPC-t ACL-1150에서 RFP 신호가 상당히 증가되었다. 이것은 통합된 aAM ORF에 의해서 암호화된 인식된 항원성 펩타이드 서열 및 적절한 HLA 제한 둘 모두를 갖는 유일한 eAPC-pa였다. 히스토그램 게이트 및 값은 RFP 양성 및 RFP 음성 게이트에서 사건의 백분율을 반영한다. 이는, eTPC-t 발현된 TCRsp와 동족 HLA/항원과의 결속(aAPX:aAM)에 대한 성분 2F의 특이적 반응을 나타낸다.
물질 및 방법
본 출원에서 사용된 모든 세포주는 ARH 또는 HEK293 배경 상에 있다. 이것은 ACL 다음에 숫자에 의해서 표현된다. 본 출원에서 사용된 세포주의 요약을 표 1에 나타낸다.
세포의 형질주입
형질주입/전기천공 1일 전에, 세포를 1.2 내지 1.4 x106개 세포/60㎜ 접시의 밀도로 90% DMEM + 2mML-글루타민 + 10% HI-FBS(라이프 테크놀로지스) 중에 시딩하였다. 다음 날, 65% 컨플루언시를 갖는 세포를 6의 N/P 비에서 5ug DNA 및 jetPEI ®(폴리플러스(Polyplus) 형질주입 시약, 라이프 테크놀로지스)의 총량으로 형질주입시켰다. DNA 및 jetPEI ®의 스톡 용액을 각각 멸균 1M NaCl 및 150mM NaCl 중에 희석시켰다. 각각의 용액의 최종 부피는 총 믹스 부피의 50%에 동일하였다. 이어서, PEI 용액을 희석된 DNA에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로 DNA/PEI 혼합물을 세포막이 파괴되지 않도록 주의하면서 60-㎜ 접시에 첨가하였다. DNA 전달 마커 발현 분석 이전에 세포를 48시간 동안 (37℃, 5% CO2, 95% 상대 습도)에서 인큐베이션시켰다. 배지를 형질주입 이전에 대체하였다.
형광 활성화 세포 분류(FACS)
단일 세포 분류 또는 다클론 분류를 BD인플럭스 장비를 사용한 표준 세포 분류 방법을 통해서 달성하였다. 간략하면, ACL 세포를 TrypLETM Express Trypsin(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))을 사용하여 수거하고, 세포 분류 전에, DPBS 1X(라이프 테크놀로지스)의 적합한 부피로 20% HI-FBS 및 Anti-Anti 100X(라이프 테크놀로지스)를 함유하는 DMEM 1X 배지 중에 재현탁시켰다. 표 2는 FACS를 위해서 본 출원에서 사용된 항체 및 다량체를 요약한다.
eAPC 세포주에서 HLA-A*02:01 서열의 Flp-매개된 통합
eAPC 세포를 Flp를 암호화하는 벡터, 전달을 추적하기 위한 마커를 암호화하는 DNA(GFP를 암호화하는 벡터) 및 HLA-A*02:01을 함유하는 벡터로 전기천공하였다. HLA-A*02:01 서열은 또한 3'단부에서 링커 및 3xMyc- 태그를 암호화하였다. 사용된 전기천공법 조건은 258V, 12.5㎳, 2회 펄스, 1회 펄스 간격이었다. 각각의 통합 벡터와 Flp-벡터 간의 비는 1:3이었다. 2일 후 GFP 분류를 위한 게이트를 설정하기 위해서 GFP-벡터 만으로 전기천공된 세포 및 전기천공되지 않은 세포를 각각 대조군으로 사용하였다. 다음 날(전기천공법 2일 후), 세포를 분석하고, GFP 발현을 기초로 분류하였다. 세포를 BD 인플럭스 세포 분류기를 사용하여 분류하였다.
전기천공법 3일 후, 전기천공된 세포를 풍부하게 하기 위해서 GFP-발현을 기초로 한 분류를 수행하였다. 전기천공법 7 내지 8일 후, 세포를 수거하고, HLA-ABC 발현에 대해서 표면 염색하였다. BFP+ve RFP-ve HLA+ve 세포는 단클론성에 대해서 분류된 단일 세포였다.
세포를 유전형결정하기 위해서, 100ng의 DNA를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하여 통합이 예측된 통합 부위에서 일어났는지의 여부를 확인하였다. 통합 카세트를 표적화하는 순방향 프라이머(Pan_HLA_GT_F1) 및 통합 부위 외부 만을 표적화하는 역방향 프라이머(SV40pA_GT_R1)를 사용하였고, PCR 산물을 1% 아가로스 젤 상에서 이동시켰다.
eAPC-p 세포주에서 HCMV ORF 서열의 Flp-매개된 통합
eAPC-p 세포를 Flp를 암호화하는 벡터, 전달을 추적하기 위한 마커를 암호화하는 DNA(GFP를 암호화하는 벡터) 및 HCMV pp28, pp52 또는 pp65 aAM-ORF을 함유하는 벡터로 전기천공하였다. HCMV-ORF 서열은 또한 3'단부에서 링커 및 3xMyc- 태그를 암호화하였다. 사용된 전기천공법 조건은 258V, 12.5㎳, 2회 펄스, 1회 펄스 간격이었다.
각각의 통합 벡터와 Flp-벡터 간의 비는 1:3이었다. 2일 후 GFP 분류를 위한 게이트를 설정하기 위해서 GFP-벡터 만으로 전기천공된 세포 및 전기천공되지 않은 세포를 각각 대조군으로 사용하였다. 다음 날(전기천공법 2일 후), 세포를 분석하고, GFP 발현을 기초로 분류하였다. 세포를 BD 인플럭스 세포 분류기를 사용하여 분류하였다.
eAPC-p 세포주에서 3개의 HCMV ORF 서열의 Flp-매개된 샷건 통합
eAPC-p 세포를 Flp를 암호화하는 벡터, 전달을 추적하기 위한 마커를 암호화하는 DNA(GFP를 암호화하는 벡터) 및 HCMV pp28, pp52 또는 pp65 aAM-ORF을 함유하는 벡터로 전기천공하였다. HCMV-ORF 서열은 또한 3'단부에서 링커 및 3xMyc- 태그를 암호화하였다. 사용된 전기천공법 조건은 258V, 12.5㎳, 2회 펄스, 1회 펄스 간격이었다. 샷건 통합을 위해서, HCMV-ORF를 함유하는 벡터를 1:1:1의 비로 풀링시키고, 혼합물을 eAPC-p 세포 내에 전기천공하였다. 생성된 eAPC-pa 세포는 다클론성이었다. 개별 단클론 세포를 분류하고, 유전적으로 특징규명하여, 다클론이 3종의 모든 HCMV-ORF를 함유하는 세포로 구성되었음을 예증하였다.
단클론의 유전학적 특징규명
성분 D 내의 HCMV ORF의 RMCE-통합을 평가하기 위한 PCR 반응
프라이머를 사용하여 링커(순방향 프라이머 10.D.1) 및 EF1aplha 프로모터(역방향 프라이머 15.H.4))에 어닐링된 HCMV ORF의 통합을 평가하였다. 예측된 크기는 pp28의 경우 0.8kb, pp52의 경우 1.5kb, pp65의 경우 1.9kb였다. PCR 산물을 1XTAE 완충액 중의 1% 아가로스 젤 상에서, 파워팩 베이직(PowerPac Basic)(바이오래드(Bio-Rad))을 사용하여 이동시키고, 시버세이프(sybersafe)의 10,000배 희석물로 염색하고, Fusion SL(빌버 루멧(Vilber Lourmat))로 분석하였다.
짝지워진 통합 커플 사이의 RMCE
RMCE 통합을 위해서, 세포를 0.6㎍의 FLP를 암호화하는 DNA 벡터, (V4.I.8), 2㎍의 성분 C/Y, 2㎍의 성분 E/Z, 0.4㎍의 DNA 전달을 추적하기 위한 마커를 암호화하는 DNA로 형질주입하였다. 형질주입 2일 후, DNA 전달 마커에 대해서 양성, GFP 또는 RFP 양성 세포를 FACS에 의해서 분류하였다. 형질주입 4 내지 10일 후, 성분 D 및 B 선택 마커에 의해서 암호화된, 감소된 형광 단백질 신호를 나타내는 개별 세포를 FACS에 의해서 분류하였다. ACL-987을 생성하는 것에 대한 예외, 여기서 GFP 양성을 나타내는 개별 세포를 FACS에 의해서 분류하였다.
RSU를 특징규명하기 위한 TCR 쇄 쌍의 일시적인 발현
일시적인 발현을 위해서, 세포를 FLP를 암호화하는 DNA 벡터, (V4.I.8), JG9-TCR-알파 변이체(VP.7751.RC1.A1 내지 VP.7751.RC1.H8), JG9-TCR-베타 WT 쇄(V3.C.5) 및 DNA 벡터 비히클(V1.C.2)로 형질주입하였다. 형질주입 2일 후, 모든 세포를 HLA-A*02:01-NLVP 사량체 및 항-CD3 항체로 염색하였다. CD3 음성 집단에 대한, CD3 양성 집단에 대한 HLA-A*02:01-NLVP 사량체 신호의 평균 형광 강도(MFI)의 비로서 RSU를 계산하였고, 이것은 각각의 TCR 쇄 쌍 변이체의 결합 강도를 나타내었다.
HLA 다량체 염색
세포를 얼음 상에서 HLA-다량체 시약으로 10분 동안 염색하고, 이어서, CD3 및/또는 TCRab 항체로 염색하였다. BD인플럭스 장비에 의한 특이적 세포 형광 특성의 검출을 표 6에 정의한다.
단클론성 생성에 대한 단일 세포의 분류, 관심대상 표현형을 나타내는 세포를 200ul의 성장 배지를 함유하는, 96-웰 플레이트에 침착시켰다. 1 내지 2개의 플레이트를 샘플당 분류하였다. 다클론성 세포 분류물을 세포 분류기 인플럭스TM(비디 바이오사이언시스)에서의 이측 분류 설정을 사용하여, 배지를 함유하는 FACS 튜브로 안내하였다.
JG9-TCR-알파 변이체의 분자 특징규명을 위한 단일 세포 분류물을 5μL의 뉴클레아제 무함유 물이 미리 적재된 PCR 플레이트에 대해서 분류하였다. 후속 가공시까지, 시편을 스냅-동결시켰다.
유전학적 특징규명을 위한 게놈 DNA 추출
DNA를 QIAamp DNA 미니키트(퀴아젠)를 사용하여 5x106개 세포로부터 추출하였다. DNA를 1xTE(10mM 트리스(Tris) pH 8.0 및 0.1mM EDTA) 중에 저장하였다.
성분 2B 또는 2D 내로의 TRA-ORF 및 TRB-ORF의 RMCE-통합을 평가하기 위한 PCR 반응.
프라이머를 사용하여 게놈 수용 부위의 미리 존재하는 부분인 TRAC 분절(순방향 프라이머 1.F.7) 및 sv40pA 종결인자(역방향 프라이머 15.H.2)에 어닐링된 TRA-알파의 통합을 평가하였다. 예측된 크기 566bp. 프라이머를 사용하여 게놈 수용 부위의 미리 존재하는 부분인 TRBC 분절(순방향 프라이머 1.F.9) 및 sv40pA 종결인자(역방향 프라이머 15.H.2)에 어닐링된 TCR-베타의 통합을 평가하였다. 예측된 크기 610bp. PCR 산물을 1XTAE 완충액 중의 1% 아가로스 젤 상에서, 파워팩 베이직(바이오래드)을 사용하여 이동시키고, 시버세이프의 10,000배 희석물로 염색하고, Fusion SL(빌버 루멧)로 분석하였다.
DNA 전달 후 게놈에서 TRA-ORF 및 TRB-ORF의 카피 수를 평가하기 위한 ddPCR 반응
선택된 ACL-851 단클론의 DNA를 관심대상 TCR ORF C 분절(TRAC)을 표적으로 하는 특이적 프라이머 및 프로브를 사용함으로써 분석하였다. 프라이머 및 프로브를 사용하여 TRAC 분절에 어닐링된 TRA-ORF 카피 수를 평가하였다(순방향 프라이머 1.F.7, 역방향 프라이머 1.F.8 및 프로브 1.G.1). 프라이머 및 프로브를 사용하여 TRB-C 분절에 어닐링된 TRB-ORF 카피 수를 평가하였다(순방향 프라이머 1.F.9, 역방향 프라이머 1.F.10 및 프로브 1.G.2).
모든 경우에, HEX와 접합된 형광 프로브 10.B.6과 함께 프라이머 10.A.9 및 10.A.10을 사용하여, 참조군 유전자(TRAC)를 염색체에 대해서 동시에 스크리닝하여 카피 수를 결정하였다. 통합 카피 수는, HEK293 세포가 참조군 유전자(TRAC)에 대해 3배체인 것으로 간주되었다. 드롭렛 디지털(Droplet Digital) PCR 이전에, DNA를 MfeI(NEB)로 소화시켜 탠덤 통합을 분리하였다. 반응 설정 및 사이클링 조건은, QX200TM 드롭렛 판독기(Droplet Reader) 및 드롭렛 제너레이터(Droplet Generator) 및 C1000 TouchTM 딥-웰 써멀 사이클러(deep-well Thermal cycler)(바이오래드)를 사용하여, ddPCRTM 프로브용 슈퍼믹스(Supermix for Probes)(dUTP 없음)(바이오래드)에 대한 프로토콜을 따랐다. 데이터를 QuantaSoftTM 소프트웨어를 사용하여 획득하여, Ch1을 사용하여 HEX에 대한 FAM 및 Ch2를 검출하였다.
단일 T-세포로부터의 TCR 알파 및 베타 쇄의 서열결정
개별 FACS-분류된 eTPC-t-세포를, 각각의 TRA 및 TRB에 대한 V-영역 특이적 프라이머 수집물을 동반하는 2-단계 증폭 공정에 적용하고, 그 다음 서열 분석을 위한 TRA 및 TRB 앰플리콘을 생성하는 짝지워진 네스팅된 PCR 반응에 적용하였다. 이러한 절차는 이미 기술되어 있다(Han et. al. Nat Biotechnol. 2014 32(7):684-692). 하기 물질을 기술된 절차에서 사용하였다:
성분 F의 기능성 입증
37℃, 90% 상대 습도 및 5% CO2에서 eTPC-t 및 eAPC 세포를 0.2 x 10^6 내지 1.5 x 10^6개 세포/㎖로 RPMI+10% 열-불활성화된 우태아 혈청(완전 배지) 중에서 일상적으로 배양하였다. 펩타이드 NLVPMVATV는 젠스크립트(Genescript)에 의해서 합성되었고, 제공된 대로 동결건조되었다. 펩타이드 일차 스톡을 10% DMSO 중에 현탁시키고, -80℃에서 저장하였다. 작업 스톡을 완전 배지 중에서 50μM로, 투여 시기에 제조하였다(50x 농축됨). HLA-A*02:01(ACL-900) 또는 HLA-B*07:02(ACL-906)를 제시하는 하기 eAPC-p 또는 aAPX 및 aAM을 갖는 eAPC-pa, HLA-A*02:01+HCMVpp52(ACL-1044) 또는 HLA-A*02:01+HCMVpp65(ACL-1046) 또는 HLA-B*07:02+HCMVpp52(ACL-1045) 또는 HLA-B*07:02+HCMVpp65(ACL-1048), 또는 모체 eAPC(ACL-128)를 사용하였다. 2종의 상이한 eTPC-t 세포주를 사용하였다; 제1 eTPC-t, ACL-1277, (성분 A)는 2개의 고유한 게놈 수용자 부위를 갖도록 조작되었고, 네이티브 CD3 발현을 이용하고, 게놈 2-성분, 합성 반응 요소(성분 F, RFP 리포터)를 보유한다(실시예 14 참고). 제2 eTPC-t, ACL-1150, (성분 A)은 2개의 고유한 게놈 수용자 부위를 갖도록 조작되었고, 네이티브 CD3 발현을 이용하고, 게놈 1-성분, 합성 반응 요소(성분 F, RFP 리포터)를 보유한다(실시예 15 참고). eTPC-t 둘 모두에, HLA-펩타이드 복합체(HLA), HLA-A*02:01-NLVPMVATV에 대해서 특이적인 TCR 쌍을 암호화하는 성분 2B' 및 2E'에서 TCR 쇄 ORF로 적재하였다.
항원 펄싱 절차
eAPC 세포의 활발하게 성장하는 배지(0.4 내지 1.0 x 10^6개 세포/㎖)를 현탁시키고, 샘플을 취하고, 계수하여 세포 농도를 결정하였다. 그 다음, 1백만개의 세포를 수거하고, 둘베코 인삼염 완충 식염수(DPBS, 깁코(Gibco))로 1회 세척하고, 1μM의 펩타이드를 함유하거나 펩타이드를 함유하지 않는 완전 배지 중에서 1 내지 2 x 10^6개 세포/㎖의 농도로 현탁시켰다. 세포를 2시간 동안 표준 배양 조건에서, 24-웰 배양 플레이트 내에서 인큐베이션시켰다. 2시간 후, 세포를 수거하고, 원심분리(400rcf, 3분)에 의해서 펠릿화하고, DPBS로 3 x 10㎖로 세척하였다. 그 다음 세포를 완전 배지 중에서 0.2 x 10^6개 세포/㎖로 현탁시켰다.
eTPC-t 수거
eTPC-t 세포의 활발하게 성장하는 배지(0.4 내지 1.0 x 10^6개 세포/㎖)를 현탁시키고, 샘플을 취하고, 계수하여 세포 농도를 결정하였다. 세포를 수거하고, DPBS로 1회 세척하고, 이어서 완전 배지 중에서 0.4x10^6개(내인성 검정의 경우) 또는 0.6 x 10^6개 세포㎖(또는 외인성 검정)의 농도로 현탁시켰다.
eTPC:eAPC 시스템에서의 eTPC-t 및 eAPC와 외인성 항원성 분자의 접촉
96-웰 둥근-바닥 플레이트의 각각의 웰에, 50㎕의 완전 배지, 50㎕의 eAPC, 그 다음 50㎕의 eTPC-t를 첨가하였다. 이것은 대략 0.27 x 10^6개 세포/㎖의 총 세포 농도에서, 1:3의 비에 대한 대략 10,000개의 eAPC 및 30,000개의 eTPC-t에 동일하였다. 이어서 세포 혼합물을 표준 배양 조건에서 대략 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
eTPC:eAPC 시스템에서의 eTPC-t 및 eAPC와 내인성 항원성 분자의 접촉
96-웰 둥근-바닥 플레이트의 각각의 웰에, 50㎕의 완전 배지, 50㎕의 eAPC, 그 다음 50㎕의 eTPC-t를 첨가하였다. 이것은 대략 0.2 x 10^6개 세포/㎖의 총 세포 농도에서, 1:2의 비에 대한 대략 10,000개의 eAPC 및 20,000개의 eTPC-t에 동일하였다. 이어서 세포 혼합물을 표준 배양 조건에서 대략 48시간 동안 인큐베이션시켰다.
염색 및 분석
24시간 또는 48시간 인큐베이션 후, 하포를 수거하고, 0.75㎖ V-바닥 마이크론 튜브 내에 이식하고, 500㎕ DPBS로 1회 세척하고, 하기와 같이 죽은 세포 마커(DCM-APC-H7)로 염색하였다; 각각의 웰에 25㎕의 염색 용액을 첨가하였고, 혼합에 의해서 세포를 현탁시켰고, 이어서 15 내지 20분 동안 인큐베이션시켰다. 염색 용액은 100㎕ 염색 용액당 0.5㎕의 DCM-APC-H7로 구성되었다. 인큐베이션 후, 세포를 500㎕ DPBS+2%FCS(세척 완충액)로 2회 세척하였다. 이어서 세포를 eTPC-t에 고유한 표면 마커에 대해서 염색하고; 각각의 웰에 30㎕의 염색 용액을 첨가하였고, 혼합에 의해서 세포를 현탁시켰고, 이어서 30 내지 45분 동안 인큐베이션시켰다. 염색 용액은 100㎕ 염색 용액(클론 9E10, 산타 크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech)) 당 2.5㎕의 항-myc-AF647로 구성되었다. 인큐베이션 후, 세포를 500㎕ 세척 완충액으로 2회 세척하고, 이어서 200㎕의 세척 완충액 중에 현탁시키고, LSRFortessa(비디 바이오사이언시스) 상에서 FACS에 의해서 분석하였다.
실시예
실시예 1: 표적화된 돌연변이발생에 의한 APX 유전자 패밀리의 결실
여기서는 항원-제시 복합체(APX) 암호화 유전자의 패밀리의 표적화된 돌연변이발생이 어떻게 달성되어 조작된 항원-제시 세포(eAPC)의 제1 특질을 생성시켰는지를 기술하였다. 상기 특질은 APX 패밀리의 적어도 하나의 구성원의 표면 발현의 결핍이다.
본 실시예에서, 표적화된 APX는 HEK293 세포주에서 주요 HLA 클래스 I 패밀리의 3개의 구성원, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함하였다. HEK293 세포는 HLA-ABC의 내인성 표면 발현을 나타내는 인간 배아 신장 세포로부터 유래되었다. 세포유전학적 분석은, 세포주가 근사 3배체 핵형을 갖고, 따라서 HEK293 세포는 각각의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 3종의 대립유전자를 암호화하였음을 예증하였다.
조작된 CRISPR/Cas9 시스템(여기서 Cas9 뉴클레아제 활성도는 합성 가이드 RNA(gRNA)에 의해서 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌에 표적화되었음)을 사용하여 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 표적화된 돌연변이발생을 수행하였다. 4 내지 5개의 고유한 gRNA를 각각의 HLA 유전자 유전자좌에 대해서 보존된 뉴클레오타이드 서열을 표적화하도록 설계하고, 표적화된 부위를 유전자 암호 서열의 시작부를 향해서 편향시켰는데, 이는 널 대립유전자를 생성시킬 가능성이 크기 때문이었다. 표적화된 유전자좌에서 돌연변이를 유도하는 gRNA 효율을 결정하고, 가장 효율적인 gRNA를 선택하여 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 널(HLA-ABC널) HEK293 세포주를 생성시켰다.
Cas9-P2A-GFP를 암호화한 플라스미드와 함께, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌를 표적으로 하는 최적의 gRNA를 암호화한 플라스미드를 본 방법에 기술된 바와 같이 HEK293 세포 내에 형질주입하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 형질주입 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 38a). GFP 분류된 세포를 5일 초과 동안 추가로 확장시켜 유전자 편집 사례가 발생하기에 충분한 시간을 허용하였고, 장해 돌연변이의 경우, 잔류하는 내인성 HLAI 단백질의 발현의 손실에 충분한 시간을 허용하였다. 이러한 성장 기간 후, 세포를 pan-HLA-ABC 항체로 염색하여, 이의 표면 상에서 감소된 발현된 HLA-ABC를 갖는 세포를 식별하였다(도 38b). pan-HLA-ABC 항체 염색의 부재는, 각각의 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 대립유전자가 돌연변이되었음을 의미하였다. 개별 HLA-ABC 음성 세포를 분류 및 확장시켜 단클론의 수집물을 나타내었다.
HLA-ABC널 단클론을 HLA-ABC의 표면 발현의 결핍에 의해서 확인하였다. 이는, 단클론의 하위세트가 HLA-ABC의 표면 발현이 결핍되었음을 예증하였고, 이의 3종의 예시적인 단클론, ACL-414, ACL-415 및 ACL-416을 도 39에 도시한다. 세포주가 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 모든 대립유전자에서 근본적인 유전자 돌연변이를 보유하였는지를 결정함으로써 HLAI 표면 발현이 결핍된 단클론의 추가의 유전학적 특징규명을 수행하였다(도 40). 앰플리콘 크기 변화를 검출하기 위해서, gRNA 게놈 표적 부위에 연장된 프라이머를 사용한 PCR에 의해서 유전학적 특징규명을 수행하였고/거나 이를 서열결정을 위한 주형으로서 사용하였다. 도 40은 제조된 세포주(예를 들어, ACL-414)의 앰플리콘 크기에 비해서 더 짧은 PCR 앰플리콘에 의해서 검출된 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 대립유전자에서 유전자 결실을 함유한 HLA-ABC널 단클론의 선택을 나타낸다.
결론적으로, ACL-414, ACL-415 및 ACL-416을 비롯한, 유전적으로 변형된 HEK293 세포주는, HLA-ABC의 표면 발현이 결핍되었고, 따라서 조작된 항원-제시 세포(eAPC)의 제1 특질을 보유하였음이 입증되었다.
실시예 2: 성분 1B를 함유한 eAPC의 생성
여기서는 성분 1B가 HLA-ABC널 단클론 주 ACL-414에 어떻게 안정적으로 통합되어 eAPC의 제2 특질을 생성시켰는지를 기술하였다. 상기 제2 특질은 적어도 1종의 ORF의 통합을 위해서 적어도 하나의 게놈 수용자 부위를 함유하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위는 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해서 설계된 합성 작제물이었다.
본 실시예에서, 게놈 통합 부위, 성분 1B는 선택된 유전 요소로 구성되었다. 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3가 존재하며, 이것은 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화한 ORF에 플랭킹되었다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터였고, F3 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자였다. 이종특이적 리콤비나제 부위 상에 비-암호 시스-조절 요소를 배치하는 것의 이점은, 그것이 매칭된 유전자 공여자 벡터, 성분 1C에서 요구되지 않기 때문이다. 따라서, 유전자 공여자 벡터의 세포 전달 이후에, 암호화된 ORF의 어떠한 일시적인 발현도 관찰되지 않을 것이다. 이것은 성공적인 RMCE의 선택을 보다 신뢰 가능하게 만드는데, 그 이유는 유전자 공여자 벡터로부터의 ORF의 세포 발현이 성분 1B 내로의 적절한 통합 이후에만 대부분 일어나기 때문에, 그것이 이제 적절한 시스-조절인자 요소를 함유하기 때문이다(실시예 6 참고).
성분 1B의 게놈 안전 보유 유전자좌, AAVS1 내로의 안정적인 게놈 통합을 촉진시키기 위해서, 플라스미드를 작제하였고, 여기서, 성분 1B의 DNA 요소는 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암 측면에 배치되었다. 각각의 아암은 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성되었다.
상동 유도 재조합(상동 유도 재조합: HDR)의 과정을 통해서 게놈 안전 보유 유전자좌, AAVS1에서 성분 1B의 안정적인 통합을 달성하였다. ACL-414 세포주를 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 최적의 gRNA를 암호화한 플라스미드, Cas9-P2A-GFP를 암호화한 플라스미드 및 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암에 의해서 측면에 배치된 성분 1B 유전 요소를 암호화한 플라스미드로 형질주입하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 형질주입 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 41a). GFP 분류된 세포를 7일 초과 동안 추가로 확장시켜, HDR이 발생하고, 선택 마커, BFP의 일시적인 발현이 손실되기에 충분한 시간을 허용하였다. 이러한 성장 기간 후, 세포를 FACS 기계 상에서 분석하고, 개별 BFP 양성 세포를 분류 및 확장시켜 단클론의 수집체를 나타내었다(도 41c).
개별 단클론 주를 이의 유지된 BFP 발현을 기초로 그리고 성분 1B의 목적하는 AAVS1 게놈 위치 내로의 단일 통합을 위해서 eAPC로서 선택하였다. 세포주 ACL-469 및 ACL-470은 유지된 BFP 발현을 갖는 단클론을 나타내었다(도 42a 및 b). 유전학적 특징규명을 단클론 ACL-469 및 ACL-470으로부터 추출된 DNA 상에서 수행하였고, 이러한 유전학적 특징규명은 이의 게놈이 성분 1B를 통합하였고, 성분 1B는 AAVS1 부위 내에 통합되었음을 입증하였다(도 43). 성분 1B에 대해서 특이적인 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 게놈 통합의 확인을 결정하였다(도 43a). 성분 1B가 AAVS1 부위 내에 통합되었는지의 확인은, 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열에 대해서 설계된 프라이머 및 성분 1B에 의해서 암호화된 SV40 pA 종결인자에 대해서 고유한 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 결정하였다(도 43b). 디지털 드롭 PCR에 의해서 성분 1B의 카피-수를 결정하였고, 여기서 성분 1B 및 참조군 유전자 DNA 분자의 수를 측정하고, 비를 계산하였다(표 1). 단클론 ACL-469 및 ACL-470은 1 성분 1B 분자 대 3 참조군 유전자 분자의 비를 함유하였다. 제조된 HEK293 세포주가 근사 3배체 핵형이라는 것을 고려할 때, 이는, ACL-469 및 ACL-470 세포주에서 성분 1B의 단일 통합을 입증하였다.
결론적으로, 유전적으로 변형된 ACL-469 및 ACL-470 세포주는 HLA-ABC널 이었고, RMCE를 위해서 설계된 합성 게놈 수용자 부위의 단일 카피를 함유하였고, 따라서 단일 합성 통합 수용자 부위를 갖는 eAPC의 생성을 입증하였다.
실시예 3: 성분 1B 및 성분 1D를 함유한 eAPC의 생성
여기서는 성분 1B 및 성분 1D가 HLA-ABC널 단클론 주 ACL-414에 어떻게 안정적으로 통합되어 eAPC의 제2 특질을 생성시켰는지를 기술하였다. 상기 제2 특질은 적어도 1종의 ORF의 통합을 위해서 2개의 게놈 수용자 부위를 함유하는데, 여기서 게놈 수용자 부위는 리콤비나제 매개된 카세트 교환(RMCE)을 위해서 설계된 합성 작제물이었다.
본 실시예는, 제2 게놈 수용자 부위, 성분 1D의 첨가를 제외하고는, 실시예 2에 기술된 것과 동일한 방법 및 성분을 사용한다. 성분 1D 유전 요소는 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15로 구성되었는데, 이것은 성분 1B와 상이하였다. 이러한 부위는 선택 마커, 적색 형광 단백질(RFP)을 암호화한 ORF 측면에 배치되었다. F14 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터였고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자였다. 실시예 2에서와 같이, 성분 1D 유전 요소를 각각 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암 측면에 배치하였다.
성분 1B 및 성분 1D를, 성분 1D 요소를 암호화한 플라스미드를 형질주입 믹스에 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기술된 바와 같이 AAVS1 내에 통합하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 형질주입 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 41b). GFP 분류된 세포를 7일을 초과 동안 추가로 확장시키고, 그 후, 세포를 FACS 기계 상에서 분석하고, 개별 BFP 및 RFP 양성 세포를 분류 및 확장시켜 단클론의 수집체를 나타내었다(도 41d).
개별 단클론 주를 이의 유지된 BFP 및 RFP 발현을 기초로 그리고 성분 1B 및 성분 1D의 상이한 AAVS1 대립유전자 내로의 단일 통합을 위해서 eAPC로서 선택하였다. 세포주 ACL-472가 유지된 BFP 및 RFP 발현을 갖는 대표적인 단클론이었다(도 42c). 실시예 2에 기술된 바와 같이, 유전학적 특징규명을 단클론 ACL-472로부터 추출된 DNA 상에서 수행하였고, 이러한 유전학적 특징규명은 이의 게놈이 성분 1B 및 성분 1D를 통합하였고, 두 성분 모두가 AAVS1 부위 내에 통합되었음을 입증하였다(도 43). 디지털 드롭 PCR에 의해서 두 성분 1B 및 1D의 카피-수를 결정하였고, 여기서 성분 B, D 및 참조군 유전자 DNA 분자의 수를 측정하고, 비를 계산하였다. 단클론 ACL-472는 2 성분 1B와 D 분자 대 3 참조군 유전자 분자의 비를 함유하였다(표 2). 제조된 HEK293 세포주가 근사 3배체 핵형이라는 것을 고려할 때, 이는, 성분 1B 및 성분 1D의 ACL-472 세포주 내로의 단일 통합을 입증하였다.
결론적으로, 유전적으로 변형된 ACL-472 세포주는 HLA-ABC널이었고, RMCE에 대해서 설계된 합성 게놈 수용자 부위 성분 1B 및 성분 1D의 단일 카피를 함유하였고, 따라서 2개의 고유한 합성 통합 수용자 부위를 갖는 eAPC의 생성을 입증하였다.
실시예 4: 성분 1C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 작제된 eAPC-p
여기서는 eAPC-p가 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술하였으며, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 1B는 네이티브 게놈 부위이고, 유전자 공여자 벡터, 성분 1C'는 하나의 분석물 항원-제시 복합체(aAPX)를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예에서, eAPC는 APX의 2개의 패밀리, 주요 HLA 클래스 I 패밀리 및 HLA 클래스 II가 돌연변이된, ACL-128이라고 지정된, 유전적으로 변형된 ARH-77 세포주였다. 제조된 세포주, ARH-77은 강한 HLA-A,B,C 및 HLA-DR,DP,DQ 세포 표면 발현을 나타낸 형질세포 백혈병으로부터 유래된 B 림프아구이다. 세포유전학 분석은, 제조된 ARH-77 세포주가 근사 2배체 핵형을 갖지만, 또한 HLA 유전자좌를 암호화하는 영역인 염색체 6p21 결실을 나타내었다는 것을 입증하였다. ARH-77 유전자좌의 DNA 서열결정은, ARH-77이 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 및 HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA 및 HLA-DPB 유전자 패밀리의 단일 대립유전자 만을 암호화하였다는 것을 확인해주었다.
HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널 세포주 ACL-128을 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 및 HLA-DRA, HLA-DRB, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA 및 HLA-DPB 유전자 패밀리를 표적으로 하는 gRNA를 사용하여 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 CRISPR/cas9 표적화된 돌연변이발생에 의해서 생성시켰다. pan-항-HLA-ABC 또는 pan-항-HLA-DR,DP,DQ로의 표면 표지는, ACL-128이 APX 패밀리 둘 모두의 표면 발현을 결핍하였음을 확인해주었다(각각 도 44b 및 45 및 도 47b).
본 실시예에서, 게놈 수용자 부위, 성분 1B는 네이티브 AAVS1 게놈 부위였고, 표적화된 통합은 HDR을 통해서 달성되었다. 유전자 공여자 벡터, 성분 1C를, 각각 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암을 암호화하는 성분 1C에 의해서, 성분 1B에 매칭시켰다. AAVS1 좌측 상동 아암과 우측 상동 아암 사이에서, 플라스미드가 CMV 프로모터 및 SV40 종결인자를 암호화하였다. 관심대상 aAPX를 프로모터와 종결인자 사이에 클로닝하여, 성분 1C'를 생성시켰다. 본 실시예에서, 성분 1C'는 하나의 aAPX인 HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02를 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이들은 각각 성분 1C'HLA-A*24:02 및 성분 1C'HLA-B*-07:02라 지칭되었다.
eAPC-p를 작제하기 위한 과정은 성분 1C'의 성분 1B 내로의 HDR 유도된 통합을 통해서 성분 1B'를 생성시키는 것이었다. 세포주 ACL-128을 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 최적의 gRNA를 암호화한 플라스미드, Cas9-P2A-GFP를 암호화한 플라스미드 및 성분 1C'를 암호화한 플라스미드로 전기천공하였다. Cas9-P2A-GFP 플라스미드 흡수에 대해 양성인 세포를 전기천공 2일 후 GFP 형광을 기초로 FAC 분류하였다(도 44a). GFP 분류된 세포를 7일 초과 동안 추가로 확장시켜 HDR이 발생하고, aAPX의 일시적인 발현이 손실되기에 충분한 시간을 허용하였다. 이러한 성장 기간 후, 세포를 pan-HLA-ABC 항체로 염색하여, 이의 표면 상에서 분석물 HLA의 발현을 얻은 세포를 식별하였다(도 44b). pan-HLA-ABC 항체 염색의 존재는, 성분 1C'에 암호화된 분석물 HLA ORF가 게놈 내에 통합되었음을 암시하였다. 개별 HLA-ABC 양성 염색된 세포를 분류 및 확장시켜 eAPC-p 단클론의 수집물을 나타내었다.
개별 단클론 주를 이의 유지된 분석물 HLA 표면 발현을 기초로 그리고 성분 1B'를 생성시키는, 게놈 수용자 부위 내로의 분석물 ORF의 통합을 기초로 eAPC-p로서 선택하였다. 세포주 ACL-321 및 ACL-331는 각각 HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02의 분석물 HLA 표면 발현을 갖는 대표적인 단클론이었다(도 45). 유전학적 특징규명을 선택된 단클론 ACL-321, ACL-327, ACL-331 및 ACL-332로부터 추출된 DNA 상에서 수행하였고, 이러한 유전학적 특징규명은 이의 게놈이 성분 1C'를 통합하였고, 그 통합은 AAVS1 게놈 수용자 부위에서 발생하여, 성분 1B'를 생성하였음을 입증하였다(도 46). 성분 1C'에 대해서 특이적인 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 게놈 통합의 확인을 결정하였다(도46a). 성분 1B'의 존재를, 분석물 HLA ORF에 연결된 SV40 pA 종결인자에 고유한 프라이머 및 상동 아암에 의해서 암호화된 영역에 대해서 원위인 AAVS1 게놈 서열에 대해서 설계된 프라이머를 사용한 예측된 크기의 PCR 앰플리콘의 검출에 의해서 확인하였다(도 46b).
결론적으로, 게놈 수용자 부위, 성분 1B' 내에, 각각 aAPX HLA-A*24:02 또는 HLA-B*-07:02 ORF의 카피를 함유한, 유전적으로 변형된 ACL-321 및 ACL-331 세포주의 생성은 세포 표면 상에서 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 I 구성원일 상기 분석물 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-p 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 5: 성분 1C'가 짝지워진 HLAI ORF를 암호화한 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 작제된 eAPC-p
여기서는 eAPC-p가 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술하였으며, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 1B는 네이티브 게놈 부위였고, 유전자 공여자 벡터, 성분 1C'는 2개의 aAPX 쇄를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예는 eAPC, ACL-128, 및 성분 1B를 사용하였고, 이들 둘 모두는 실시예 4에 정의되어 있다. 그러나 성분 1C'는 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소에 의해서 HLA-DRB1*01:01 대립유전자에 연결된 HLA-DRA*01:01 대립유전자, 또는 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소에 의해서 HLA-DPB1*04:01 대립유전자에 연결된 HLA-DPA1*01:03 대립유전자를 암호화한 단일 ORF를 포함하였고, 이는 각각 성분 1C'HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 및 성분 1C' HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01라 지칭되었다. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소는, 전사되는 경우 합성된 펩타이드의 자가-절단을 초래하고, 각각의 HLA 쇄를 한정하는 2개의 폴리펩타이드를 생산하는 펩타이드 서열을 암호화하였다.
표면 상에서 분석물 HLA의 발현을 얻은 세포의 식별을 pan-항-HLA-DR,DP,DQ 항체로의 세포 표면 표지에 의해서 평가한 것을 제외하고는, APC-p를 작제하는 과정은 실시예 4에 기술되어 있다(도 47). pan-항-HLA-DR,DP,DQ 항체 염색의 존재는, 성분 1C'에 암호화된 분석물 HLA ORF가 게놈 내에 통합되었음을 암시하였다. 개별 HLA-DR,DP,DQ 양성 염색된 세포를 분류 및 확장시켜 eAPC-p 단클론의 수집물을 나타내었다.
개별 단클론 주를 실시예 4에 기술된 바와 같이, 이의 유지된 분석물 HLA 표면 발현을 기초로 그리고 성분 1B'를 생성시키는, 게놈 수용자 부위 내로의 분석물 ORF의 통합을 기초로 eAPC-p로서 선택하였다. 세포주 ACL-341 및 ACL-350는 HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01의 유지된 분석물 HLA 표면 발현을 갖는 대표적인 단클론이었다(도 48).
결론적으로, 게놈 수용자 부위, 성분 1B' 내에, 각각 aAPX HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01 또는 HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01 ORF의 카피를 함유한, 유전적으로 변형된 ACL-341 및 ACL-350 세포주의 생성은 세포 표면 상에서 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 II 구성원일 상기 분석물 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-p 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 6: 성분 1B가 합성 작제물인 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 작제된 eAPC-p
여기서는 eAPC-p가 하나의 통합 커플을 사용하여 1 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술하였으며, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 1B는 RMCE에 대해서 설계된 합성 작제물이었고, 유전자 공여자 벡터, 성분 1C'는 하나의 aAPX 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예에서, 게놈 통합 부위, 성분 1B는 선택된 유전 요소로 구성되었다. 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3가 존재하며, 이것은 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화한 ORF에 플랭킹되었다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터였고, F3 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자였다. 성분 1B의 유전 요소를 실시예 2에 기술된 바와 같이 동일한 플라스미드로 전기천공법에 의해서 세포주 ACL-128에 통합하였다. 개별 단클론 주를 이의 유지된 BFP 발현을 기초로 선택하였고, 이것은 실시예 2에 기술된 바와 같이 목적하는 AAVS1 게놈 위치 내로의 성분 1B의 단일 통합을 함유하는 것으로 유전적으로 특징규명되었다(도 49a). 생성된 eAPC 세포주, ACL-385는 HLA-ABC널 및 HLA-DR,DP,DQ널이었고, RMCE에 대해서 설계된, 합성 게놈 수용자 부위, 성분 1B의 단일 카피를 함유하였다.
유전자 공여자 벡터, 성분 1C는 성분 1B에 매칭되었는데, 그 이유는 성분 1C가 동일한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3을 암호화하였기 때문이다. 관심대상 aAPX ORF는 시작 코돈 직전에 코작 서열을 추가로 암호화하고, 2개의 이종특이적 리콤비나제 부위 사이에 클로닝되어, 성분 1C'를 생성하였다. 본 실시예에서, 성분 C1'는 하나의 aAPX인 HLA-A*02:01을 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이는 성분 1C'FRT:HLA-A*02:01:F3이라고 지정되었다.
RMCE를 통해서, 성분 1C'FRT:HLA-A*02:01:F3과 함께, Tyr-리콤비나제, Flp를 암호화한 플라스미드를 사용한 세포주 ACL-385의 전기천공법에 의해서 eAPC-p를 생성시켰다. 전기천공법 4 내지 10일 후, HLAI 표면 발현에 대해서 양성이고, 성분 1B 선택 마커에 의해서 암호화된, 형광 단백질 마커, BFP에 대해서 음성/감소된 개별 세포를 분류하였다. 개별 과성장된 단클론 주를 이의 유지된 HLAI 대립유전자 발현 및 BFP 형광의 손실(예측된 RMCE가 발생하였음을 나타냄)을 기초로 선택하였다. 이러한 단클론을 식별하기 위해서, 표현형결정 시험 및 유전자 시험 둘 모두를 수행하였다. 먼저, 모든 단클론 세포주를 세포 표면 HLA-ABC 발현 및 BFP 형광의 결핍에 대해서 스크리닝하였다(도 49). 게놈 DNA를 그러한 세포주, 예를 들어, ACL-421 및 ACL-422로부터 추출하고, 성분 1B'를 생성한 성분 1C'의 성분 1B 내로의 통합을 성분 1B'에 특이적인 PCR 산물의 검출에 의해서 확인하였다(도 50).
결론적으로, 합성 게놈 수용자 부위, 성분 1B' 내에, 각각 aAPX HLA-A*02:01 ORF의 카피를 함유한, 유전적으로 변형된 ACL-421 및 ACL-422 세포주의 생성은 세포 표면 상에서 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 I 구성원일 상기 분석물 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-p 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 7: 2개의 통합 커플을 사용하여 2 단계로 작제된 eAPC-pa
여기서는 eAPC-pa가 2 단계로 어떻게 작제되었는지를 기술하였다. 단계 1, 게놈 수용자 부위, 성분 1B는 네이티브 게놈 부위였고, 유전자 공여자 벡터, 성분 1C'는 하나의 aAPX를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다. 단계 2, 게놈 수용자 부위, 성분 1D는 제2 네이티브 게놈 부위였고, 유전자 공여자 벡터, 성분 1E'는 하나의 분석물 항원 분자(aAM)를 암호화한 단일 ORF를 포함하였다.
본 실시예에서, 단계 1을 수행하였는데, 여기서 eAPC는 ACL-128이었고, 게놈 수용자 부위인 성분 1B는 HLA-A널이라고 지정된, 돌연변이된 HLA-A 대립유전자 게놈 부위였고, 표적화된 통합은 HDR을 통해서 달성되었다. 유전자 공여자 벡터, 성분 1C를, 각각 HLA-A널 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 HLA-A널 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암을 암호화하는 성분 1C에 의해서, 성분 1B에 매칭시켰다. HLA-A널 좌측 상동 아암과 우측 상동 아암 사이에서, 플라스미드가 CMV 프로모터 및 SV40 종결인자를 암호화하였다. 관심대상 aAPX를 프로모터와 종결인자 사이에 클로닝하여, 성분 1C'를 생성시켰다. 본 실시예에서, 성분 C1'는 하나의 aAPX인 HLA-A*02:01 또는 HLA-B*-35:01을 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이는 각각 성분 1C'HLA-A*02:01 성분 1C'HLA-B*-35:01이라고 지정되었다.
성분 1B 내로의 성분 1C'의 통합, 및 단클론 eAPC-p 세포주의 선택은, HLA-A널 게놈 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA를 사용하여 성분 1C'의 성분 1B 내로의 HDR 통합을 촉진시킨 것을 제외하고는, 실시예 4에 기술된 바와 같았다. 단클론 eAPC-p ACL-191 및 ACL-286은 각각 세포 표면 상에서 HLA-A*02:01 또는 HLA-B*-35:01을 발현하였다(도 51a).
본 실시예에서, 단계 2를 수행하였는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 1D는 네이티브 AAVS1 게놈 부위였고, 표적화된 통합은 HDR을 통해서 달성되었다. 유전자 공여자 벡터, 성분 1E를, 각각 AAVS1 게놈 유전자좌에 상동성인 500bp 초과의 서열로 구성된 AAVS1 좌측 상동 아암 및 우측 상동 아암을 암호화한 성분 1E에 의해서, 성분 1D에 매칭시켰다. AAVS1 좌측 상동 아암과 우측 상동 아암 사이에서, 플라스미드가 CMV 프로모터 및 SV40 종결인자를 암호화하였다. 관심대상 aAM을 프로모터와 종결인자 사이에 클로닝하여, 성분 1E'를 생성시켰다. 본 실시예에서, 성분 1E'는 hCMV-pp65를 암호화한, aAM ORF에 연결된, 선택 마커, GFP를 암호화한 단일 ORF를 포함하였는데, 이를 성분 1E'GFP:2A:pp63이라 지칭한다. 바이러스 자가-절단 펩타이드 요소는, 전사되는 경우 합성된 펩타이드의 자가-절단을 초래하고, 2개의 폴리펩타이드, GFP 및 세포내 hCMV-pp65 단백질을 생산하는 펩타이드 서열을 암호화하였다.
성분 1E'의 성분 1D 내로의 통합은 실시예 4에 기술되어 있다. 개별 단클론 주, ACL-391 및 ACL-395를 이의 유지된 선택 마커 GFP 발현을 기초로 eAPC-pa로서 선택하였다(도 51b).
결론적으로, 게놈 수용자 부위, 성분 1B' 내에 각각 aAPX HLA-A*02:01 또는 HLA-B*-35:01 ORF의 카피를 함유하고, 게놈 수용자 부위 성분 1D' 내에 aAM ORF pp65를 함유한 유전적으로 변형된 ACL-391 및 ACL-395 세포주를 생성시켰다. 이러한 유전적 변형은 상기 aAM을 또한 발현한 세포의 세포 표면 상에 발현된 유일한 주요 HLA 클래스 I 구성원인 상기 aAPX를 초래하였다. 따라서, 이것은 다성분 시스템을 사용한 2종의 정의된 eAPC-pa 세포주의 생성을 입증하였다.
실시예 8: 성분 1C'가 단일 HLAI ORF를 암호화한 1 단계로 작제된 eACP-p
여기서 단일 통합 커플을 통해서, 1 단계로 eAPC를 eAPC-p로 전환시켜 분석물 항원-제시 복합체(aAPX)를 암호화하는 단일 HLAI ORF를 통합하는 것을 기술하며, 여기서 eAPC는 RMCE 기반 게놈 통합을 위해서 설계된 2개의 합성 게놈 수용자 부위 성분 1B 및 성분 1D를 함유한다. 생성된 eAPC-p는 HLAI ORF(성분 1B')에 의해서 점유된 하나의 게놈 수용자 부위를 갖는 반면, 나머지 성분 1D는 추가적인 통합 커플 사례를 위해서 사용 가능하다.
본 실시예는 성분 1B 및 1D를 함유하는 실시예 3에서 생성된 eAPC(ACL-402)를 사용하였으며, 여기서 성분 1B는 선택 마커, 적색 형광 단백질(RFP)을 암호화하는 ORF를 플랭킹한 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15를 포함한다. F14 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터이고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다. 성분 1D는 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화하는 ORF를 플랭킹한, 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3으로 구성된다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터이고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다.
본 실시예는 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15로 구성된 성분 1C 유전자 공여자 벡터를 사용하고, 따라서 성분 1B에 매칭된다. 2개의 독립적인 성분 1C'를 성분 1C로부터 생성시켰는데, 여기서 하나의 벡터(V4.H.5)는 코작 서열, 시작 코돈 및 F14/F15 부위 사이의 HLA-A*02:01을 암호화하는 aAPX ORF로 구성되고, 여기서 제2 벡터(V4.H.6)는 코작 서열, 시작 코돈 및 F14/F15 부위 사이의 HLA-A*24:02를 암호화하는 aAPX ORF를 포함한다.
eAPC(ACL-402)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V4.H.5 또는 V4.H.6의 각각의 성분 1C'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 세포를 4 내지 10일 동안 배양하였고, 그 때 세포를 세포의 표면 상에서의 통합의 선택 마커, RFP의 손실, 및 HLAI의 이득을 기초로 선택 및 분류하였다. 그 다음, 개별 과성장된 단클론 주를 HLAI 표면 발현의 이득 및 RFP 형광의 손실(이것은 성분 1B에서 1B'로의 예측된 전환이 발생하였음을 나타냄)을 기초로 특징규명, 확인 및 선택하였다. 선택된 eAPC-p 단클론 ACL-900(V4.H.5, HLA-A*02:01) 및 ACL-963(V4.H.6, HLA-A*24:02)은 모체 ACL-402 세포주에 비해서 RFP에 대해서 음성이며, HLAI 표면 발현을 유지한다(도 53a). 추가로, 단클론은 BFP 통합의 선택 마커의 발현을 유지하는데, 이는 성분 1D가 비커플링되어 성분 1B 통합 커플 사례로부터 분리되어 유지됨을 나타낸다. eAPC-p 단클론을 추가로 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 세포로부터 추출하고, 성분 1B'를 생성시키는, 성분 1B'에 대해서 특이적인 PCR 산물의 검출에 의해서 성분 1C'와 성분 1B 간의 통합 커플의 확인을 수행하였다(도 53b). 게놈 수용자 부위에 인접한 영역(프라이머 ID 8.B.3), 통합 커플 사례 내의 영역(프라이머 ID 15.H.2)을 표적으로하도록 프라이머를 설계하였다. 특이적 통합의 경우에서만 증폭을 수행하였지만, 어떠한 산물도 대조군(ACL-3) 또는 오프-타깃 재조합으로부터 생성되지 않았다.
요약하면, 본 실시예는 다성분 시스템을 사용한, eAPC에서 eAPC-p로의 전환의 구체적인 두 실시예를 설명하는데, 여기서 2종의 상이한 aAPX가 개별적으로 전달되고(성분 1C'), RMCE 게놈 통합 방법에 의해서 단일 게놈 수용자 부위 내에 통합되며(성분 1B), 그 다음 2개의 개별 eAPC-p를 포함하는 제한된 라이브러리를 생성시킨다. 추가로, 제2 게놈 수용자 부위(성분 1D)는 격리되고, 성분 1B/성분 1C' 통합 커플에 의해서 영향을 받지 않았음을 입증하였다.
실시예 9: 성분 1D'가 단일 분석물 항원 분자(aAM) ORF를 암호화하는, 1 단계로 eAPC-p로부터 작제된 eAPC-pa.
본 실시예는 다수의 eAPC-pa를 동시에 모체 eAPC-p(실시예 8에 기술됨)로부터 어떻게 작제하는지를 설명하는데, 여기서 게놈 수용자 부위, 성분 1D는, aAM을 암호화하는 단일 ORF로 구성된, 프라이밍된 유전자 공여자 벡터, 성분 1E'에 의한 통합에 대해서 표적화된다.
본 실시예에서, 사용된 모체 eAPC-p 주는 ACL-900이었는데, 이것은 성분 1B' (실시예 8에 기술됨)에서 통합된 단일 aAPX(HLA-A*02:01)를 발현한다. eAPC-p 성분 1D는 개방되어 유지되고, 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3으로 구성되는데, 이것은 선택 마커, 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화하는 ORF를 플랭킹한다. FRT 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터이고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다. 유전자 공여자 벡터, 성분 1E를 본 실시예에서 사용하였는데, 이것은 2개의 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15로 구성되고, 따라서 성분 1D에 매칭된다. 본 실시예에서, 성분 1E를 또한 각각 C-말단 글리신-세린 풍부 링커 및 c-myc 태그를 암호화하는, HCMVpp28(V9.E.6), HCMVpp52(V9.E.7), 또는 HCMVpp65(V9.E.8)로부터 선택된 관심대상의 하나의 aAM ORF로 추가로 프라이밍하였다. 추가로, 각각의 성분 1E'는 aAM ORF의 5'에 바로 옆의 시작 코돈 및 코작 서열로 구성된다. 따라서, 3개의 벡터로 구성된, 성분 1E'의 작은 개별 라이브러리를 생성하였다.
eAPC-p(ACL-900)를 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8) 및 V9.E.6, V9.E.7 또는 V9.E.8의 각각의 성분 1E'와 전기천공법에 의해서 독립적으로 조합하였다. 세포를 4 내지 10일 동안 인큐베이션시켜 통합 커플이 발생하는 것을 허용하였고, 그 때 개별 eAPC-pa를 성분 1D에 의해 암호화된, 통합의 선택 마커 BFP의 감소된 신호를 기초로 선택 및 단일 세포 분류(단클론)하였다(도 54a). 그 다음, 개별 과성장된 단클론 eAPC-pa, ACL-1219(pp28), ACL-1227(pp52) 및 ACL-1233(pp65)을, BFP 발현의 손실 및 HLAI(성분 1B'에서의 aAPX)의 유지된 표면 발현(이것은 1D에서 1D'로의 예측된 전환이 발생하였음을 나타냄)을 기초로 특징규명, 확인 및 선택하였다(도 54b). 추가로, aAPX의 유지된 표면 발현은, 성분 1B'가 성분 1D와 성분 1E' 간의 통합 커플 사례로부터 영향을 받지 않고 격리되어 있음을 나타내었다. 선택된 eAPC-pa 단클론을 추가로 특징규명하기 위해서, 게놈 DNA를 추출하고, 성분 1D'에 대해 특이적인 중합효소 연쇄 반응(PCR) 앰플리콘 산물의 검출에 의해서 성분 1D'를 생성시키는, 성분 1E'와 성분 1D 간의 통합 커플의 확인을 수행하였다(10.D.1, 15.H.4). 도 54c에서, 각각 3개의 eAPC-pa를 나타내는 2개의 단클론을 나타내는데, 여기서 aAM ORF pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb)에 대해서 예측된 크기의 앰플리콘 산물이 관찰되며, 이는 예측된 통합 사례가 발생하였음을 추가로 보여준다.
요약하면, 본 실시예는 다성분 시스템을 사용한 eAPC-p에서 eAPC-pa로의 전환의 구체적인 3개의 실시예를 설명하는데, 여기서 3종의 상이한 aAM이 개별적으로 전달되고(성분 1E'), RMCE 게놈 통합 방법에 의해서 단일 게놈 수용자 부위(성분 1D) 내에 통합되며, 그 다음 3종의 상이한 aAM ORF를 보유한 3개의 개별 eAPC-pa의 작은 라이브러리를 생성시킨다. 추가로, 이는, 이전의 적재된 제2 게놈 수용자 부위(성분 1B')가 격리되어 있고, 성분 1D/성분 1E' 통합 커플에 의해서 영향을 받지 않았음을 입증하였다.
실시예 10: 단일 단계로 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키기 위한 eAPC-p 내로의 다수의 분석물 항원 분자 ORF의 샷건 통합
여기서는 다수의 aAM ORF(HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65)를 총괄적으로 암호화하는 프라이밍된 성분 1E 벡터(성분 1E')의 풀이 어떻게 단일 단계로 모체 eAPC-p(실시예 8에 기술됨) 내에 통합되어 풀링된 eAPC-pa 라이브러리를 생성시키는지를 설명하는데, 여기서 각각의 개별 세포는 성분 1D'에서, 벡터의 본래 풀로부터 유래된 단일 무작위 분석물 항원 ORF를 통합하여, 각각의 eAPC-pa는 단일 무작위 aAM을 발현하지만, 총괄적으로 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리는 벡터의 본래 풀링된 라이브러리에 암호화된 aAM ORF의 전부를 나타낸다. 벡터의 풀로부터 단일 무작위 ORF를 각각 발현하는 eAPC-pa의 풀을 생성시키는 이러한 방법을 샷건 통합이라 지칭한다.
본 실시예에서, 사용된 모체 eAPC-p 주는 세포 표면 상에서 aAPX(HLA-A*02:01)를 발현하는 ACL-905였고(세포주의 작제는 실시예 8에 기술됨), 성분 1D 및 성분 1E'는 실시예 9에 기술된 바와 같았다. 본 실시예에서, 각각 HCMVpp28, HCMVpp52 및 HCMVpp65를 암호화하는 aAM ORF로 구성된, 실시예 9의 개별 성분 1E' 벡터, V9.E.6, V9.E.7, 및 V9.E.8을 함께 1:1:1 몰비로 혼합하여 벡터 풀을 생성시켰다. eAPC-p(ACL-905)를 벡터 풀 및 RMCE 리콤비나제 효소의 발현을 암호화하는 벡터(Flp, V4.1.8)와 전기천공법에 의해서 조합하였다. 세포를 4 내지 10일 동안 인큐베이션시키고, 그 때 세포를 풀링된 세포 집단 ACL-1050(도 55b)을 생성시키는 성분 1D(도 55a)에 의해서 암호화된 통합의 선택 마커, BFP에 대한 감소된 신호를 갖는 것을 기초로 벌크 분류하였다.
eAPC-pa 풀 ACL-1050이 성분 1D'에서, 각각 HCMVpp28, HCMVpp52 또는 HCMVpp65 중 하나를 암호화하는 eAPC-pa의 혼합물로 구성되었는지를 확인하기 위해서, 개별 세포를 다클론성 집단으로부터 단일 세포 분류하였고, 12개를 유전 특징규명을 위해서 무작위로 선택하였다. 각각의 aAM을 연장시키는 프라이머를 사용하여 성분 1D'의 증폭을 수행하였다(10.D.1 and 15.H.4). 도 55c에서, 12개의 세포에 대해서 생성된 앰플리콘을 대조군과 함께 나타내고, 여기서 모든 12개의 세포에 대해서, aAM ORF, pp28(0.8kb), pp52(1.5kb) 및 pp65(1.9kb) 중 하나에 대한 예측된 크기와 일관된 단일 앰플리콘 산물이 관찰된다. 추가로, 각각의 aAM ORF는 적어도 1회 식별되는데, 이는 eAPC-pa 풀이 eAPC-pa의 혼합물로 구성됨을 나타내고, 여기서 풀 내의 각각의 eAPC-pa는 3개의 벡터의 본래 풀로부터의 단일 무작위 aAM ORF를 통합하였다.
결론적으로, 본 실시예는 eAPC-p를 3종의 상이한 분석물 항원 분자(성분 1E')를 암호화하는 3종의 벡터의 풀링된 라이브러리와 조합하고, RMCE 기반 샷건 통합 접근법을 사용함으로써, 단일 단계로 eAPC-p를 eAPC-pa의 풀링된 라이브러리로 전환시키기 위한 다성분 시스템의 용도를 입증한다. 추가로, 본 실시예는, eAPC-pa의 생성된 풀 내의 각각의 eAPC-pa가, 성분 1D와 성분 1E' 간의 통합 커플 사례에 의해서 본래 벡터 풀로부터의 단일 무작위 aAM ORF를 통합하였고, 모든 3종의 aAM ORF는 생성된 풀링된 eAPC-pa 라이브러리 내에서 나타남을 입증한다.
실시예 11: 1 단계의 eTPC-t 생성의 입증
본 실시예는 표준화된 방식의 eTPC-t의 생성을 기술하며, 여기서 모체 eTPC는 별개의 합성 게놈 수용자 부위 성분 2B 및 2D를 함유한다. 본 실시예 및 모든 추가 실시예에 기술된 모든 eTPC 모체 주를 상기 실시예에 제시된 eAPC 주와 동일한 기술을 사용하여 생성시켰다. 유전자 공여자 벡터 성분 2C' 및 2E'는 HLA-A*02 대립유전자에 제시되는 경우 인간 사이토메갈로바이러스 폴리펩타이드 65(HCMV pp65)로부터 유래된 항원성 펩타이드 NLVPMVATV(NLVP)와 결속된다고 공지된 TCR 쌍(JG9-TCR)의 단일 쇄를 포함하였다. 성분 C' 및 E'는 RMCE를 위해서 설계되고, 모체 성분 2C 및 2E로부터 유래된다.
본 실시예는 모체 eTPC 세포주 ACL-488을 사용하며, 이것은 TCR 널, HLA 널, CD4 널 및 CD8 널이고, 성분 2B 및 2D를 추가로 함유한다. 성분 2B는 코작 서열 및 선택 마커인 청색 형광 단백질(BFP)을 암호화하는 ORF 측면에 배치된 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT 및 F3을 포함한다. FRT 부위의 5'는 EF1a 프로모터이고, F3 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다. 성분 2D는 2개의 고유한 이종특이적 리콤비나제 부위, F14 및 F15를 포함하는데, 이것은 성분 2B와 상이하였다. 이 부위는 선택 마커인 적색 형광 단백질(RFP)을 암호화하는 ORF 및 코작 서열 측면에 배치된다. F14 부위의 암호화된 5'는 EF1a 프로모터이고, F15 부위의 3'는 SV40 폴리아데닐화 신호 종결인자이다.
본 실시예는, 각각 2개의 이종특이적 리콤비나제 부위, FRT/F3(2C') 및 F14/F15(2E')로 구성되어, 각각 성분 2B 및 2D에 매칭되는 유전자 공여자 벡터, 성분 2C' 및 성분 2E'를 사용한다. 성분 2C'는 코작 서열의 FRT/F3 부위 사이에, 시작 코돈 및 JG9-TCR-베타 쇄를 암호화하는 TCR ORF를 추가로 포함한다. 성분 2E'는 코작 서열의 F14/F15 부위 사이에, 시작 코돈 및 JG9-TCR-알파 쇄를 암호화하는 TCR ORF를 추가로 포함한다.
ACL-488(eTPC)의 전기천공에 의해서 RMCE를 통해서 eTPC-t를 생성시켰다. 전기천공 4 내지 10일 후, 성분 2D 및 2B 선택 마커에 의해서 암호화된, 감소된 형광 단백질 신호, BFP 및 RFP를 나타내는 개별 세포를 FACS에 의해서 분류하였다. 개별 단클론을 과성장시키고, 이어서 표현형을 평가하였다. 생성된 단클론, ACL-851은 BFP 및 RFP 음성이었다(도 56a 및 b). ACL-851은 또한 TCR 및 CD3 표면 발현을 나타내었지만, 모체 세포주는 그렇지 않았다(도 56c 및 e). 추가로, 도입된 JG9-TCR은 HLA-A*02:01- NLVP 사량체로의 특이적 염색을 나타내었는데, 이는 그것이 eTPC-t의 표면 상의 기능성 TCRsp임을 나타낸다(도 56d 내지 f). ACL-851은, 게놈 내에 통합된 성분 2B' 및 성분 2D'에 의해서 암호화된 TCRsp를 함유하는 것이 PCR에 의해서 확인되었다(도 56g 및 h).
요약하면, eTPC는 성분 2C' 및 2E' 내에 전달된 TCR ORF를 통합하기 위해서 RMCE 기반 통합 방법을 사용함으로써, eTPC-t로 전환되어, 성분 2B 및 2D는 성분 2B' 및 2D'로 전환되었고, 여기서 이러한 eTPC-t에 의해서 세포의 표면 상에 기능성 TCRsp가 발현되었다. 추가로, 본 실시예는 단순한 eTPC:A 시스템의 작동을 입증하는데, 여기서 eTPC-t 및 분석물 항원의 2상 조성물을 조합하고, eTPC-t를 가용성 분석물 항원(HLA 다량체: HLA-A*02:01-NLVPMVATV) 간의 복합체 형성을 기초로 선택하였다.
실시예 12: eTPC-t의 eTPC-x로의 전환의 입증
본 실시예는 eTPC-t의 eTPC-x로의 전환을 기술하는데, 여기서 eTPC-x는 TCR 쇄 ORF를 암호화하는 성분 2B'를 갖고, 성분 2D는 상보성 TCR 쇄 ORF의 통합을 위해서 사용 가능하다. eTPC-t의 성분 2D'의, eTPC-x의 성분 2D로의 전환은 성분 2D'에 매칭된 유전자 공여자 벡터(성분 2Z)의 사용에 의해서 달성된다.
본 실시예에서, 실시예 11에서 생성된 모체 eTPC-t 세포주 ACL-851을 사용하였다. 성분 2Z는 성분 2D', 코작 서열, 시작 코돈 및 통합의 선택 마커로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 ORF에 통합된 2개의 이종특이적 리콤비나제 부위, F14/F15로 구성된 플라스미드 벡터이다. eTPC-t를 성분 2Z 및 RMCE 리콤비나제 효소를 암호화하는 벡터와 전기천공에 의해서 조합하고, 그 다음 세포를 CD3 제시의 손실 및 통합의 선택 마커인 GFP의 이득에 대해서 선택하였다. 단클론 ACL-987을 FACS에 의해서 표현형을 특징규명하였고, ACL-987이 GFP를 얻었고, CD3 및 TCRab를 손실하였음이 관찰되었는데(도 57b, d), 이는 JG9-TCR-알파의 GFP ORF로의 성공적인 교환 및 성분 2D'의 성분 2D로의 성공적인 전환, 및 따라서 eTPC-x의 생성을 나타내었다. 모체 eTPC-t에 비해서, ACL-851은 GFP 발현이 결핍되어 있고, CD3 및 TCRab 표면 발현을 갖는다(도 57a, c).
요약하면, 본 실시예는 eTPC-t의 eTPC-x로의 전환, 통합의 선택 마커인 GFP에 대한 교환에서 성분 2D'에서 JG9-TCR-알파 TCR ORF의 제거, 따라서 대안적인 상보성 TCR 쇄 ORF의 추가 통합 커플링 사건을 위한, 성분 2D의 생성을 입증한다. 이러한 전환은 게놈 통합을 위한 RMCE 방법을 사용하여 수행되었다.
실시예 13: eTPC-t의 풀을 생성하기 위한 eTPC-x 내로의 샷건 통합의 입증
본 실시예는 64개의 단일 JG9-TCR-알파 변이체(성분 2E'로서)를 암호화하는 벡터의 풀을 어떻게 단일 단계로서 모체 eTPC-x 세포주(실시예 12에 기술됨) 내에 통합되어 풀링된 eTPC-t 라이브러리를 생성시키는지를 설명하는데, 여기서 각각의 개별 세포는 벡터의 본래 풀로부터 알파 쇄를 암호화하는 단일 무작위 TCR ORF를 통합하여, 각각의 eTPC-t는 TCRsp로서 TCR ORF의 단일 무작위 쌍을 발현한다. 함께 조합하면, 개별 eTPC-t는 eTPC-t의 풀링된 라이브러리를 포함하는데, 여기서 세포의 풀은 불변 본래 TCR 베타 쇄와 짝지워진 64개의 TCR-알파의 모든 가능한 조합을 잠재적으로 나타낸다. 이러한 방법은 현재 '샷건' 통합이라고 지칭된다. 64개의 JG9-TCR-알파 변이체는, V 및 J 단편의 접합부에 포함된 CDR3 서열을 변형시킴으로써 생성되었다.
본 실시예에서, 표면 발현되지 않은 JG9-TCR-베타 (성분 2B') 및 CD3 복합체를 갖는 모체 eTPC-x 세포주 ACL-987(실시예 12 참고)을 사용하였다. 성분 2D는 실시예 12에 기술된 바와 같은 선택 마커인 GFP를 암호화한다. 본 실시예에서, 64개의 JG9-TCR-알파 변이체 단편을 성분 2E 공여자 벡터 내에 클로닝하여, 성분 2D에 매칭한, F14/ F15 부위에 의해서 측면에 배치된 성분 2E'를 생성하였다. 그 다음 64개의 벡터를 벡터의 단일 풀에 조합하였다.
eTPC-t 풀을 RMCE 기반 게놈 통합에 의해서 생성시켰고, 여기서 eTPC-x(ACL-987) 및 64개의 성분 2E' 및 RMCE 리콤비나제 벡터를 전기천공에 의해서 조합하였다. 다클론을 GFP 발현을 기초로 선택하였다. 생성된 다클론인 ACL-988은, GFP 양성 세포 만으로 구성된 모체 주와 달리, GFP 양성 GFP 음성 세포 집단 둘 모두로 구성되었다(도 58a 및 b). 그러나, 단지 GFP 음성 집단만 일관되게 강한 CD3 발현을 나타내었는데, 이는 성분 2D의 성분 2D'로의 전환을 나타내고, 따라서 eTPC-x가 eTPC-t의 풀로 전환되었음을 나타낸다(도 58c 및 d). 추가로, ACL-988 GFP 음성 집단은, JG9-TCR 특이적 다량체 시약(DEX HLA-A*02:01-NLVP)으로 염색되는 경우 2개의 별개의 강도를 나타내었는데, 이는 이러한 집단이 다양한 결합 효율을 갖는 TCR 변이체를 발현하는 세포로 구성되었음을 시사한다.
동시에, 모든 64개의 JG9-TCR-알파 변이체를, 모체 eTPC-x (ACL-987)에 대한 일시적인 형질주입을 허용하는 발현 작제물 내에 클로닝하고, 변이체 JG9-TCR을 발현하는 상기에 기술된 풀링된 eTPC-t에 제시된 각각의 TCR 쌍에 대한 참조군에 대한, HLA-A*02:01-NLVP 다량체 시약에 대한 상대적인 염색 단위(RSU)를 결정하였다. CD3 음성 집단에 대한, CD3 양성 집단에 대한 HLA 다량체 신호의 평균 형광 강도(MFI)의 비로서 RSU를 계산하였고, 이것은 각각의 TCR 쇄 쌍 변이체의 결합 강도를 나타내었다. 모체 ACL-987 주의 각각의 JG9-TCR-알파 변이체로의 독립적인 형질주입 이후에, 세포를 CD3에 대한 항체 및 HLA-다량체 시약으로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. 도 58e에 플롯팅된 각각의 점은 각각의 64개 변이체에 대한 관찰된 RSU를 나타낸다.
ACL-988의 풀로부터의 개별 세포는, HLA-다량체 양성 집단 및 HLA-다량체 음성 집단으로부터의, 분류된 단일 세포였다. 각각의 단일 세포를 위해서 변이체 JG9-TCR-알파 ORF를 암호화하는 성분 2D'를 증폭시키고, 서열결정하고, 상기에 기술된 일시적인 발현 RSU 단위의 결과와 비교하였다(도 58e). 실제로, HLA-다량체 양성인 개별 ACL-988 세포는 개별적으로 시험된 변이체에서 높은 RSU 결과를 우세하게 나타낸 JG9-TCR-알파 변이체를 암호화하였다(도 58e, 빈 원). 더욱이, pHLA-다량체 음성인 개별 ACL-988 세포는 낮은 RSU 결과를 우세하게 나타낸 JG9-TCR-알파 변이체를 암호화하였다(도 58e, 빈원).
결론적으로, 본 실시예는, eTPC-x 및 벡터(성분 2E')의 풀링된 라이브러리의, 다수의 상이한 TCRsp를 함유하는 eTPC-t의 풀링된 라이브러리로의 전환을 위한, 다성분 시스템의 용도를 입증한다. 이것은 샷건 통합을 사용하여 단일 단계로 달성되었다. 더욱이, 본 실시예는 eTPC-t의 풀이 eTPC:A 시스템으로 분석물 항원(가용성 친화성 시약으로서)과 조합되었음을 입증하였고, 여기서 풀의 단일 세포는 분석물 항원(HLA-다량체)과의 복합체 형성을 기초로 선택될 수 있고, 여기서 성분 2D'에 암호화된 후속 TCR 쇄 ORF가 추출되고, DNA 서열이 수득되었다.
실시예 14: 외인성 aAM을 사용한 조합된 eAPC:eTPC 시스템에서의 성분 2F의 기능성 입증
여기서는 2개의 고유한 게놈 수용자 부위(성분 2B, 2D)를 갖도록 조작되고, HLA 널이도록 조작되고, 네이티브 CD3 발현을 이용하고, 조작된 게놈 2-성분, 합성 반응 요소(성분 2F)를 보유하는 eTPC-t 세포주(ACL-1063, 성분 2A)를 기술한다. 본 실시예에서, eTPC 세포주를 실시예 11에 상기에 기술된 바와 같이 eTPC-t 세포주(ACL-1277)로 전환하였고, 여기서 성분 2B' 및 2E'에서 TCR 쇄 ORF는 HLA-펩타이드 복합체(HLA), HLA-A*02:01-NLVPMVATV에 대해서 특이적인 TCR 쌍을 암호화한다. 이러한 eTPC-t를 용해성 펩타이드 형태의 외인성 aAM의 존재 하에서 상기에 기술된 eAPC-p와 조합하여 eAPC:eTPC 시스템을 조립하였다. 이러한 조합된 시스템의 판독은 성분 2F로부터의 리포터인 eTPC-t 내에서의 RFP 신호였다.
성분 2F로서 정의된 반응 요소는 드라이버-활성인자 성분 및 증폭인자-보고 성분으로 구성되었고, 여기서 두 단위 모두는 합성 프로모터를 사용하였다. 드라이버는 NFAT-AP1-NFkB(3xNF-AP-NB)에 대한 탠덤 전사 인자 결합 부위의 3개의 세트를 암호화하는, 네이티브 TCR 신호전달 경로에 반응성인 합성 프로모터이다. 전사 활성화 시, 드라이버는 활성인자 단백질, 허피스 VP16 활성화 도메인의 융합에 의해서 유래된 합성 설계된 전사 인자, GAL4 DNA 결합 도메인 및 N- 및 C-말단에서의 2개의 핵 국지화 신호의 발현을 유도하고(NV16G4N), 동족 DNA 인식 서열은 증폭인자 프로모터에서 탠덤으로 6회 존재한다. 드라이버 및 증폭인자 프로모터 둘 모두는 각각의 전사 인자 결합 부위의 바로 3'의 HCMV IE1 프로모터로부터의 코어 프로모터 서열(B 인식 요소(BRE), TATA 박스, 개시인자(INR) 및 전사 시작 부위)을 사용하였다. 전사 활성화 시 증폭인자는 리포터, 적색 형광 단백질(RFP)의 발현을 유도한다.
이어서 eTPC-t 세포주를 HLA-A*02:01(ACL-209) 또는 HLA-A*24:02(ACL-963)를 제시하는 eAPC-p에 대해서 시험감염시켰거나 또는 이것은 HLA-널 모체 eAPC(ACL-128)였다. 여기서 eAPC-pa를 펩타이드 NLVPMVATV 또는 VYALPLKML 중 어느 하나의 분석물 항원 또는 펩타이드가 없는 분석물 항원으로 펄싱함으로써 분석물 eAPC-p를 제조하였다. 그 다음, eTPC-t 및 분석물 eAPC-pa를 10,000개의 eAPC-pa와 공배양된 30,000개의 eTPC-t로 이루어진 eAPC:eTPC 시스템으로 24시간 동안 컴파일하였다 24시간 후 집단을 구별하기 위해서 세포를 수거하고, 세척하고, eTPC-t 및 분석물 eAPC-pa에 대해서 특이적인 마커로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. eTPC-t, 성분 2F의 강한 활성화는 공지된 동족 항원 pHLA 복합체를 제시한 분석물 eAPC-pa, 즉, HLA-A*02:01 및 NLVPMVATV를 갖는 eAPC-pa로 시험감염된 eTPC-t에서만 관찰되었다(도 59a). 이에 반해서, 비특이적 분석물 eAPC-pa(도 59b, c, d) 또는HLA가 결핍된 대조군 모체 eAPC(도 59f) 또는 외인성 aAM 펩타이드가 결핍된 eAPC-p(도 59e)로 구성된 eAPC:eTPC 컴파일에서는 단지 휴지 상태 RFP 발현만 관찰되었다.
결론적으로, 기능성 성분 2F를 함유하는 eTPC-t 세포주를 조작하였고, 그 다음 이를 사용하여 eTPC-t를 생성시켰다. eTPC-t와, 외인성 가용성 aAM으로서 제공된, 이의 동족 표적 T-세포 항원을 제시하는 분석물 eAPC-pa의 상호작용 시, 반응은 RFP 발현에서의 증가로서 측정 가능하였다. 이에 반해서, 비-동족 T-세포 항원 및 HLA를 제시하거나 또는 HLA를 제시하지 않는 분석물 eAPC 또는 eAPC-p 또는 eAPC-pa와 접촉되는 경우, 배경을 초과하는 RFP 발현의 측정 가능한 증가는 eTPC-t에 의해서 나타나지 않았다. 추가로, 본 실시예는 eAPC:eTPC 시스템을 입증하며, 여기서 분석물 eAPC-pa 및 분석물 eTPC-t가 개별 2상 조성물로 컴파일되고, eTPC-t 반응을 사용하여 분석물 eAPC-pa 및 eTPC-t 둘 모두를 식별하고, 여기서 TCRsp와 분석물 항원 간의 협동 복합체가 생성된다.
실시예 15: eAPC-pa에 통합된 aAM ORF를 사용한 조합된 eAPC:eTPC 시스템에서의 성분 2F의 기능성 입증
본 실시예는, HLA-펩타이드 복합체(HLA), HLA-A*02:01-NLVPMVATV에 대해서 특이적인 TCR 쇄를 암호화하는 성분 2B' 및 2E'에서 TCR 쇄 ORF가 적재된, 2개의 고유한 게놈 수용자 부위를 갖도록 조작되고, 네이티브 CD3 발현을 이용하고, 1D'에서 통합된 aAM 암호화 ORF와의 통합에 의해서 생성된 eAPC-pa와 함께 eAPC:eTPC 시스템으로 컴파일된, 게놈 1-성분, 합성 반응 요소(성분 2F)를 보유하는 eTPC-t(ACL-1150), (성분 2A)의 사용을 기술한다. 본 실시예에서, 4종의 상이한 eAPC-pa 변이체를 2종의 상이한 HLA 대립유전자 및 HCMV 게놈으로부터 유래된 2종의 상이한 aAM ORF와 조립하여; 4종의 별개의 eAPC-pa 주를 생성시켰다.
성분 2F로서 정의된 반응 요소는 드라이버-리포터 성분으로 구성되었다. 드라이버는 NFAT-AP1에 대한 탠덤 전사 인자 결합 부위의 6개 세트(6xNF-AP)를 암호화하는, 네이티브 TCR 신호전달 경로에 반응성이고, 각각의 전사 인자 결합 부위의 바로 3'의 HCMV IE1 프로모터로부터의 코어 프로모터 서열(B 인식 요소(BRE), TATA 박스, 개시인자(INR) 및 전사 시작 부위)을 사용하는 합성 프로모터이다. 전사 활성화 시 드라이버는 리포터, 적색 형광 단백질(RFP)의 발현을 유도한다.
제1 eAPC-pa 주(ACL-1046)는 HLA-A*02:01 및 HCMV 단백질 pp65에 대한 전장 ORF를 발현하는데, 여기서 HLA-A*02:01로 제시되는 경우, pp65는 eTPC-t TCRsp에 의해서 인식되는 항원성 펩타이드를 함유한다. 제2 eAPC-pa 주(ACL-1044)는 HLA-A*02:01 및 HCMV 단백질 pp52에 대한 전장 ORF를 발현한다. 제3 eAPC-pa 주 ACL-1045는 HLA-B*07:02 및 HCMV 단백질 pp52에 대한 전장 ORF를 발현한다. 제4 eAPC-pa 주(ACL-1048)는 HLA-B*07:02 및 HCMV 단백질 pp65에 대한 전장 ORF를 발현한다. 제2, 제3 및 제4 eAPC-pa는 eTPC-t TCRsp에 의해서 인식되지 않는 aAPX:aAM 복합체를 발현한다.
eTPC-t 세포주 ACL-1150을 상기에 기술된 바와 같은 4개의 eAPC-pa 각각과 독립적인 eAPC:eTPC 시스템으로 컴파일하였다. 48시간 후 집단을 구별하기 위해서 세포를 수거하고, 세척하고, eTPC-t 및 분석물 eAPC-pa에 대해서 특이적인 마커로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. eTPC-t, 성분 2F의 강한 활성화는 공지된 동족 항원 pHLA 복합체를 제시한 분석물 eAPC-pa, 즉, HLA-A*02:01 및 pp65를 갖는 eAPC-pa로 시험감염된 eTPC-t에서만 관찰되었다(도 60b). 이에 반해서, 비특이적 분석물 eAPC-pa(도 60a, c, d)로 구성된 eAPC:eTPC 컴파일에서는 단지 휴지 상태 RFP 발현만 관찰되었다.
결론적으로, 기능성 성분 2F를 함유하는 eTPC-t 세포주를 조작하였고, 그 다음 이를 사용하여 eTPC-t를 생성시켰다. eTPC-t와, 통합에 의해서 내인성 aAM ORF로서 제공된, 이의 동족 표적 T-세포 항원을 제시하는 분석물 eAPC-pa의 상호작용 시, 반응은 RFP 발현에서의 증가로서 측정 가능하였다. 이에 반해서, 동족 T-세포 항원 및 HLA를 제시하지 않는 분석물 eAPC-pa와 접촉되는 경우, 배경을 초과하는 RFP 발현의 측정 가능한 증가는 eTPC-t에 의해서 나타나지 않았다. 추가로, 본 실시예는 eAPC:eTPC 시스템을 입증하며, 여기서 분석물 eAPC-pa 및 분석물 eTPC-t가 개별 2상 조성물로 컴파일되고, eTPC-t 반응을 사용하여 분석물 eAPC-pa 및 eTPC-t 둘 모두를 식별하고, 여기서 TCRsp와 분석물 항원 간의 협동 복합체가 생성된다.
정의
한 쌍의 상보성 TCR 쇄: 번역된 단백질이 TCR 제시 세포의 표면 상에서 TCRsp를 형성할 수 있는 2개의 TCR 쇄.
친화성: 2종 이상의 분자 또는 단백질 간의 상호작용의 동적 또는 평형 파라미터.
친화성 시약: 분석물에 대해서 특이적 친화성을 갖도록 설계된 임의의 시약 HLA-항원 복합체에 대한 친화성과 관련하여 종종 사용됨.
대립유전자: 주어진 유전자의 변이체 형태.
AM: 분석물 항원성 분자. 일반적으로, 그러나 단백질은 또한 게놈 DNA 및/또는 특이적 도입된 유전자 서열로부터 세포에 의해서 발현된 대사산물일 수 있다. AM은 세포에서 발현되고, 이어서 단편은 APX에 의해서 카고로서 세포 표면 상에 또는 그 자신 상에 제시될 수 있다. 카고로서 또는 그렇지 않든, 이어서 AM은 T-세포 수용체 보유 세포 또는 관련된 친화성 시약의 표적일 수 있다.
앰플리콘: PCR을 비롯한 다양한 방법을 사용한 인공 증폭의 공급원 및/또는 산물인 DNA 또는 RNA의 조각.
분석물: 조합된 시스템에서 식별 및/또는 측정 및/또는 문의될 관심대상 엔티티.
항체: 면역계 호출된 B-세포의 전문화된 세포에 의해서 발현되고, 2개의 쇄를 함유하는 친화성 분자. B-세포는 자가 단백질에 일반적으로 결합하지 않지만 숙주를 위협할 병원체 또는 독소에 결합하여, 이를 중화시킬 수 있는 항체의 매우 크고 매우 다양한 레퍼토리를 발현한다. 자연 또는 인공 조작된 항체가 종종 친화성 시약으로서 사용된다.
항원: 항원-제시 복합체에 의해서 종종 제시되는, T-세포 내에 형질도입될 신호를 유발하고, TCR에 의해서 결속될 수 있는 임의의 분자.
분석물 항원: 총괄적으로 분석 결정을 위한 항원을 제시하는 임의의 엔티티를 나타내는 eAPC:eTPC 시스템.
APC: 항원-제시 세포. 세포의 표면 상에 AM, APX, APX를 보유하는 세포.
APX: 항원-제시 복합체. 게놈 DNA 및/또는 특이적으로 도입된 유전자 서열을 암호화하는 유전자/ORF로부터 유핵 세포에 의해서 세포 표면 상에 발현 및 제시되는 단백질. APX는 펩타이드 또는 다른 대사산물 분자인 카고를 제시한다.
C-영역: 불변 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. c-영역은, TCR의 다양성을 유도한다기 보다는, 면역계에서 그의 일반적인 기능을 정의하는 별개의 분절이다.
카고-적재 머시너리: 단백질 또는 세포에서 발견되는 다른 제시된 분자로부터 APX 상에 카고 분자를 생성시키고, 적재하는 단백질의 세포 세트.
CDR: 상보성-결정 영역. 표적 결합 기능의 대부분을 수행하는 TCR 및 항체의 항원-대면 단부 상의 짧은 서열. 각각의 항체 및 TCR은 6개의 CDR을 함유하고, 이것은 일반적으로 분자의 가장 가변적인 부분이어서, 상당한 수의 다양한 표적 분자의 검출을 가능하게 한다.
CM: 카고 분자. 항원-제시 복합체, 예를 들어, HLA I 또는 HLA II에 의해서 제시되는 펩타이드 또는 대사산물. CM은 게놈 DNA로부터 본질적으로 세포에 의해서 발현되거나, 배양 배지 내로 도입되거나, 특이적으로 도입된 유전자 서열로부터 발현될 수 있다.
카피-수: 세포의 게놈 내에 암호화된 정의된 서열의 전체 수 발생.
세포유전학: 염색체의 구조 및 기능과 관련된 유전의 연구, 즉, 세포의 핵형을 결정함.
세포독성의/세포독성: T-세포가 표적 세포를 직접 및 특이적으로 손상시키는 인자를 방출하는 경로.
D-영역: 다양성 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. 각각의 개체는 이러한 영역의 상당한 수의 상이한 변형을 가져서 각각의 개체가 매우 다양한 상이한 TCR을 갖는 T-세포가 되게 한다.
DNA: 데옥시리보핵산. 유전자 및 단백질을 암호화하는 유전 물질을 형성하는 분자의 화학 명칭.
eAPC 시스템: eAPCS, eAPC-pa, eAPC-p 및 eAPC-a 세포, 또는 이들의 라이브러리가 eAPC:eTPC 시스템으로의 조합을 위해서 제조된 시스템.
eTPC 시스템: eTPCS, eTPC-t 세포 또는 이의 라이브러리가 eAPC:eTPC 시스템으로의 조합을 위해서 제조된 시스템.
eAPC:eTPC 시스템: 시스템 by which eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원 및 eTPC에 의해서 제시된 분석물 TCR이 조합된 시스템.
내인성: 세포 내로부터 유래된 물질.
조작된 세포: 게놈이 유전자 변형을 통해서 조작된 변형된 세포.
진핵생물 조건 조절 요소: 정의된 조건 하에서 유도 또는 억제될 수 있는, 프로모터의 활성도에 영향을 줄 수 있는 DNA 서열.
진핵생물 프로모터: RNA 중합효소 결합 부위 및 반응 요소를 암호화하는 DNA 서열. 프로모터 영역의 서열은 RNA 중합효소 및 전사 인자의 결합을 제어하고, 따라서 프로모터는 관심대상 유전자가 발현될 장소 및 시기의 결정에 중요한 역할을 한다.
진핵생물 종결인자/신호 종결인자: RNA 중합효소 II와 회합되어 전사의 종결 과정을 촉발하는 단백질 인자에 의해서 인식되는 DNA 서열. 그것은 또한 폴리-A 신호를 암호화한다.
FACS/유세포 분석법: 형광-활성화 세포 분류. 개별 세포가 특이적 세포 표면 및 세포내 마커의 발현에 대해서 분석될 수 있는 분석 기술. 이 기술의 변형인 세포 분류는 마커의 정의된 세트를 보유한 세포가 추가 분석을 위해서 검색되는 것을 가능하게 한다.
APX의 패밀리: 항원 제시 복합체를 구성하는 기능적으로 관련된 단백질을 암호화하는 몇몇 유사한 유전자의 세트.
형광 (단백질) 마커: 특이적 소멸 및 방출 특징을 갖고, 현미경관찰법, FACS 및 관련 기술에 의해서 검출될 수 있는 분자.
유전자 공여자 벡터: 게놈 수용자 부위로의 유전 물질의 전달을 위한 유전자 기반 벡터.
게놈 수용자 부위: 유전자 공여자 벡터 내에 암호화된 공여자 유전 물질의 표적화된 통합을 위한 게놈 내의 부위.
이종특이적 리콤비나제 부위: 2개의 DNA 분자의 크로스오버를 촉진시키기 위해서 리콤비나제 효소에 의해서 인식되는 DNA 서열.
HLA I: 인간 백혈구 항원 클래스 I. 모든 유핵세포에서 인간에서 발현되고, 세포 표면(여기서 그것은 T-세포 수용체에 대한 내부 단백질의, 카고 짧은 단편, 펩타이드로서 존재함)으로 외수송되는 유전자. 따라서 그것은 내재하는 단백질과 함께 잠재하는 진행 중인 감염의 단편을 제시한다. HLA I은 배양 배지에 첨가되거나, 도입된 유전 요소로부터 발현된 단백질로부터 생성되거나, 세포에 의해서 취해진 단백질로부터 생성된 카고 펩타이드로서 추가로 존재할 수 있다. HLA 클래스 I 유전자는, 상이한 개체가 제시 시에 변이로 이어지는 동일한 유전자에서의 변이를 가질 가능성이 있다는 것을 의미하는 다형성이다. HLA 클래스 II에 관련됨.
HLA II: 인간 백혈구 항원 클래스 II. 인간에서 획득 면역 반응을 조직화하고, 돕는 특이적 세포, 예를 들어 수지상 세포에서 발현되는 유전자. HLA 클래스 I에 관련됨. HLA 클래스 II 단백질은 세포 표면(여기서 이것은 T-세포 수용체에 대한 외부 단백질의, 카고 짧은 단편, 펩타이드로서 존재함)으로 외수송된다. 따라서 그것은 내재하는 단백질과 함께 잠재하는 진행 중인 감염의 단편을 제시한다. HLA II는 배양 배지에 첨가되거나, 도입된 유전 요소로부터 발현된 단백질로부터 생성되거나, 세포에 의해서 취해진 단백질로부터 생성된 카고 펩타이드로서 추가로 존재할 수 있다. HLA 클래스 II 유전자는, 상이한 개체가 제시 시에 변이로 이어지는 동일한 유전자에서의 변이를 가질 가능성이 있다는 것을 의미하는 다형성이다.
상동 아암: 보체 상동 아암에 대해서 유사한 동일한 서열을 가져서, 세포 과정, 상동 직접 수선에 의해서 2개의 DNA 분자의 교환을 촉진시키는 DNA의 스트레치.
면역 감시: 면역계가 감염, 악성종양 또는 잠재적으로 병원성인 변경을 검출하고, 이에 의해서 활성화되는 과정.
인설레이터: 유전자가 근처 유전자의 활성화 또는 억압에 의해서 영향을 받는 것을 예방하는 DNA 서열. 인설레이터는 또한 침묵화된 유전자로부터 능동적으로 전사된 유전자로의 이질염색질의 확산을 예방한다.
통합: 세포의 염색체 내에서의 DNA 서열의 물리적 결찰.
통합 커플: 짝지워진 유전자 공여자 벡터 및 게놈 수용자 부위.
내부 리보솜 유입 부위(IRES): 전사 시에, 캡-의존적 방식으로 번역의 개시를 허용하는 RAN 요소를 암호화하는 DNA 서열.
J-영역: 결합 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. 각각의 개체는 이러한 영역의 상당한 수의 상이한 변형을 가져서 각각의 개체가 매우 다양한 상이한 TCR을 갖는 T-세포가 되게 한다.
핵형: 세포의 염색체 조성.
코작 서열: 번역의 효율적인 개시를 위해서 요구되는 짧은 서열.
주요 HLA 클래스 I: 유전자 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C를 포함하는 APX의 패밀리.
매칭된: 두 성분이 상보성 성분 사이의 상호작용을 유도 및 제한하는 유전 요소를 암호화하는 경우.
메가뉴클레아제 인식 부위: 일반적으로 메가뉴클레아제라고 지칭되는, 엔도데옥시리보뉴클레아제에 의해서 인식되는 DNA 서열.
대사산물: 세포의 대사 경로를 통해서 생성 또는 변경되는 분자.
이동성 유전 요소: DNA와 트랜스포사제 효소의 활성도의 통합을 허용할 수 있는 DNA 서열.
단클론 세포주: 반복된 세포 복제에 의해서 단일 조상 세포로부터 생산된 세포의 정의된 군.
네이티브: 세포에 자연 발생하는 엔티티.
비-암호 유전자: 기능성 비-암호 RNA 분자로 전사되는 비 단백질 암호 DNA 서열.
ORF: 오픈 리딩 프레임. 리보솜에 의해서 단백질(폴리펩타이드)의 합성을 위해서 번역 프레임을 암호화하는 유전 물질의 스트레치.
파라크린: 이웃하는 세포에 직접 작용하는 가용성 인자를 통한 신호전달.
PCR: 특이적 표적 DNA 분자가 기하급수적으로 증폭되는 중합효소 연쇄 반응.
펩타이드: 6 내지 30개 아미노산 길이의 아미노산의 짧은 스트링.
표현형 분석: 세포의 관찰 가능한 특징의 분석.
다형성: 동일한 유전자의 상이한 대립유전자의 존재를 통해서 동일한 종의 개체에서 상이한 형태로 존재함.
폴리펩타이드: 3-차원 구조를 형성하는, 펩타이드의 스트레치로 이루어진 단백질.
일차 산출물: 최종 산출물이 유래 및/또는 결정될 수 있는 eAPC 세포 및 eTPC 세포.
프라이머: 예를 들어, PCR 동안 표적 DNA 서열의 특이적 인식을 허용하는 짧은 DNA 서열.
프로모터: 유전자 발현의 제어된 개시를 위한 조절 DNA 요소.
선택 가능한 마커: 인공적인 선택 방법에 적합한 특질을 부여하는 DNA 서열.
샷건 통합: 벡터의 라이브러리가 세포의 집단 내에 도입되어, 임의의 주어진 벡터 삽입부의 단지 단일 카피가 각각의 단일 세포의 게놈에 통합될 수 있는 방법. 통합 커플을 통한 주어진 세포 집단에 대한 풀링된 벡터 통합을 지칭하는 데 사용됨.
슬라이스 수용자 부위: 인트론 AM, APX CM 또는 표면 상에 TCRsp를 갖는 세포와의 상호작용을 위한 친화성 시약, 또는 TCRsp 기반 시약의 3' 단부의 DNA 서열.
슬라이스 공여자 부위: 인트론의 5' 단부에서의 DNA 서열.
합성적: 인공적으로 생성되어, 세포에 도입된 엔티티.
T-세포: T 림프구. 표면 상에서 T-세포 수용체를 발현하는 백혈구. 자신의 신체와 반응하지 않지만 감염 및 악성종양을 인식하고, 동일한 종의 대부분의 구성원으로부터의 이식편을 거부하도록 면역계에 의해서 선택됨.
TCR: T-세포 수용체. 림프구 호출된 T-림프구의 하위군에 의해서 발현된 친화성 분자. 인간에서 TCR은 바이러스 또는 박테리아 감염 또는 암성 세포로부터의 단편을 비롯한, APX CM 또는 APX AM에 의해서 제시된 카고를 인식한다. 따라서, TCR 인식은 획득 면역계의 통합된 부분이다. TCR은 세포 표면 상에서 짝지워진 2개의 쇄로 이루어진다. 각각의 세포의 표면 상에 발현된 TCR은 다양한 유전자의 큰 풀로부터 무작위로 조립되고(v,d,j 및 c 영역), 따라서 각각의 개체는 상이한 TCR의 매우 크고 다양한 레퍼토리를 발현하는 T-세포의 풀을 갖는다.
TCRsp: CD3과 복합체를 이룬 표면 단백질로서 발현하는 한 쌍의 상보성 TCR 쇄 또는 가용성 시약, 고정된 시약의 형태로 또는 NCBP에 의해서 제시된 단백질로서 발현되는 한 쌍의 상보성 TCR 쇄.
최종 산출물: AM, APX, APX:CM, APX:AM 또는 TCRsp의 형태의 분석물 항원 및 TCR 서열.
TRA: TCR 알파 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 알파 쇄 단백질은 전형적으로 번역된 TCR 베타 쇄 단백질과 짝을 이뤄 알파/베타 TCRsp를 형성한다.
TRB: TCR 베타 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 베타 쇄 단백질은 전형적으로 TCR 알파 쇄 단백질과 짝을 이뤄 알파/베타 TCRsp를 형성한다.
TRD: TCR 델타 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 델타 쇄 단백질은 전형적으로 번역된 TCR 감마 쇄 단백질과 짝을 이뤄 감마/델타 TCRsp를 형성한다.
TRG: TCR 감마 암호화 유전자좌. VDJ 재조합된 TCR 쇄를 형성할 수 있는 4종의 상이한 유전자좌 암호화 유전자 중 하나. 번역된 TCR 감마 쇄 단백질은 전형적으로 번역된 TCR 델타 쇄 단백질과 짝을 이뤄 감마/델타 TCRsp를 형성한다.
V-영역: 가변 영역. T-세포 수용체를 조립하는 데 사용되는 유전자 분절 중 하나. 각각의 개체는 이러한 영역의 상당한 수의 상이한 변형을 가져서 각각의 개체가 매우 다양한 상이한 TCR을 갖는 T-세포가 되게 한다.
항목
1. 2-부분 디바이스로서, 제1 부분은 조작된 항원-제시 세포 시스템(eAPCS)이고, 제2 부분은 조작된 TCR-제시 세포 시스템(eTPCS)인, 2-부분 디바이스.
2. 항목 1에 있어서, eAPCS는 하기로부터 선택된 분석물 eAPC 중 1종 이상을 제공하는, 2-부분 디바이스:
a. eAPC-p 및/또는
b. eAPC-a, 및/또는
c. eAPC-pa, 및/또는
d. a 및/또는 b 및/또는 c의 1종 이상의 라이브러리.
3. 항목 2에 있어서, eAPC-p, eAPC-a 또는 eAPC-pa는 하기로부터 선택된 분석물 항원을 발현하는, 2-부분 디바이스:
a. aAPX 또는
b. aAM 또는
c. aAPX:aAM 또는
d. aAPX:CM 또는
e. 이들의 조합물.
4. 항목 1 또는 2에 있어서, eTPCS는 하기로부터 선택된 1종 이상의 분석물 eTPC를 제공하는, 2-부분 디바이스:
a. eTPC-t및/또는
b. 이의 1종 이상의 라이브러리.
5. 항목 4에 있어서, TCR 쇄의 분석물 쌍은 분석물 eTPC에 의해서 CD3과 복합체를 이룬 TCR 표면 단백질(TCRsp)로서 발현되는, 2-부분 디바이스.
6. 상기 항목 중 어느 하나에 있어서, 1종 이상의 분석물 eAPC는 1종 이상의 분석물 eTPC와 조합된, 2-부분 디바이스.
7. 항목 6에 있어서, 조합은 분석물 TCRsp와, 항목 3에 정의된 바와 같은 분석물 항원 간의 접촉을 초래하는, 2-부분 디바이스.
8. 항목 7에 있어서, 상기 접촉은 상기 분석물 TCRsp와 분석물 항원 간의 복합체의 형성을 초래할 수 있는, 2-부분 디바이스.
9. 항목 8에 있어서, 존재하는 경우, 복합체의 형성은 분석물 eTPC 및/또는 상기 분석물 eAPC에서 신호 반응을 유도할 수 있는, 2-부분 디바이스.
10. 항목 9에 있어서, 반응은 신호 반응을 갖거나 또는 갖지 않는 분석물 eTPC 또는 분석물 eTPC의 풀 및/또는 신호 반응을 갖거나 또는 갖지 않는 분석물 eAPC 또는 분석물 eAPC의 풀을 선택하는 데 사용되는, 2-부분 디바이스.
11. 상기 항목 중 어느 하나에 따른 2-부분 디바이스로부터 수득된 분석물 eTPC이되, 분석물 항원에 대한, 분석물 TCRsp를 발현하는 상기 분석물 eTPC의 신호 반응의 특징규명에서 사용하기 위한, 분석물 eTPC.
12. 1종 이상의 분석물 eTPC를 수득하기 위하여, 입력 분석물 eTPC 또는 분석물 eTPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 eTPC를 선택하는 방법으로서, 발현된 TCRsp는 항목 3에 정의된 바와 같은 1종 이상의 분석물 항원에 결합하되,
a. 1종 이상의 분석물 eTPC를 1종 이상의 분석물 eAPC와 조합하여 분석물 TCRsp와 분석물 항원을 접촉시켜서, 하기 b 내지 d 중 적어도 하나의 측정하는 단계를 초래하는 단계:
b. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
c. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 분석물 eTPC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
d. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 분석물 eAPC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계; 및
e. 단계 b, c 및/또는 d를 기초로 1종 이상의 분석물 eTPC를 선택하는 단계로서, 상기 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행되는, 상기 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
13. 항목 12에 있어서, 선택하는 단계 e는 풀로의 단일 세포 분류 및/또는 세포 분류에 의해서 수행되는, 방법.
14. 항목 13에 있어서, 분류 이후에 분류된 단일 세포를 확장시키는, 방법.
15. 항목 13에 있어서, 분류 이후에 세포의 분류된 풀을 확장시키는, 방법.
16. 항목 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 분류된 및/또는 확장된 세포(들)의 성분 2B' 및/또는 성분 2D'를 서열결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
17. 항목 16에 있어서, 서열결정 단계 이전에 하기 단계가 선행되는, 방법:
a. 게놈 DNA를 추출하는 단계 및/또는
b. 성분 2B' 및/또는 성분 2D' RNA 전사물을 추출하는 단계 및/또는
c. 성분 2B' 및/또는 성분 2D'의 DNA 및/또는 RNA 전사물을 PCR 및/또는 RT-PCR에 의해서 증폭시키는 단계.
18. 항목 16 또는 17에 있어서, 서열결정 단계는 세포에 대해서 파괴성이고, 수득된 서열결정 정보는 항목 12의 단계 e에서 선택된 분석물 eTPC를 제조하기 위해서 사용되는, 방법.
19. 항목 12, 13, 14, 15, 18 중 어느 하나에 있어서, 선택된 분석물 eTPC-t는 신호 반응의 특징규명에 적용되고, 방법은 하기 단계를 더 포함하는, 방법:
a. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
b. 상기 eTPC가 성분 2F를 함유하는 경우, 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계.
20. 항목 19에 있어서, 유도된 신호 반응은 비-유도된 신호 반응 상태에 대해서 비교된 하기 중 하나 이상의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되는, 방법:
a. 분비된 생물분자,
b. 분비된 화학물질,
c. 세포내 생물분자,
d. 세포내 화학물질,
e. 표면 발현된 생물분자,
f. 분석물 eAPC에 대한 분석물 eTPC의 세포독성 작용,
g. 신호 반응이 분석물 eAPC에 의해서 유도되고, a 내지 e 중 임의의 것의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되도록 하는 분석물 eAPC에 대한 분석물 eTPC의 파라크린 작용,
h. 분석물 eTPC의 증식,
i. 분석물 eTPC와 분석물 eAPC 간의 면역학적 시냅스.
21. 발현된 분석물 항원에 대한 분석물 TCRsp를 발현하는 1종 이상의 분석물 eTPC의 신호 반응을 유도하는 분석물 항원을 식별하기 위해서 항목 1 내지 10에 정의된 바와 같은 2-부분 디바이스로부터 수득된, 분석물 eAPC.
22. 항목 3에 정의된 바와 같은 발현된 분석물 항원에 대한 분석물 TCRsp를 발현하는 1종 이상의 분석물 eTPC의 신호 반응을 유도하는 1종 이상의 분석물 eAPC를 수득하기 위하여, 입력 분석물 eAPC 또는 분석물 eAPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 분석물 eAPC를 선택하는 방법으로서,
a. 1종 이상의 분석물 eAPC를 1종 이상의 분석물 eTPC와 조합하여, 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 eTPC의 분석물 TCRsp 간의 접촉을 초래하는 단계;
b. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCRsp 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계; 및/또는
c. 존재하는 경우, 분석물 TCRsp와 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 eTPC에서 신호 반응을 측정하는 단계; 및/또는
d. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된 분석물 eAPC에 의한, 신호 반응을 측정하는 단계; 및
e. 단계 b, c 및/또는 d로부터 1종 이상의 eAPC를 선택하는 단계로서, 상기 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행되는, 상기 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
23. 항목 22에 있어서, 선택하는 단계 e는 풀로의 단일 세포 분류 및/또는 세포 분류에 의해서 수행되는, 방법.
24. 항목 23에 있어서, 분류 이후에 분류된 단일 세포를 확장시키는, 방법.
25. 항목 24에 있어서, 분류 이후에 세포의 분류된 풀을 확장시키는, 방법.
26. 항목 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 분류된 및/또는 확장된 세포(들)의 성분 1B' 및/또는 성분 1D'를 서열결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
27. 항목 26에 있어서, 서열결정 단계 이전에 하기 단계가 선행되는, 방법:
a. 게놈 DNA를 추출하는 단계 및/또는
b. 성분 1B' 및/또는 성분 1D' RNA 전사물을 추출하는 단계 및/또는
c. 성분 1B' 및/또는 성분 1D'의 DNA 및/또는 RNA 전사물을 PCR 및/또는 RT-PCR에 의해서 증폭시키는 단계.
28. 항목 26 또는 27에 있어서, 서열결정 단계는 세포에 대해서 파괴성이고, 수득된 서열결정 정보는 항목 22의 단계 e에서 선택된 분석물 eAPC를 제조하기 위해서 사용되는, 방법.
29. 항목 22, 23, 24, 25, 28 중 어느 하나에 있어서, 선택된 분석물 eAPC는 분석물 eTPC의 신호 반응을 기초로 선택되고, 방법은 하기 단계를 더 포함하는, 방법:
a. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
b. 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계.
30. 항목 29에 있어서, 유도된 신호 반응은 비-유도된 신호 반응 상태에 대해서 비교된 하기 중 하나 이상의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되는, 방법:
a. 분비된 생물분자,
b. 분비된 화학물질,
c. 세포내 생물분자,
d. 세포내 화학물질,
e. 표면 발현된 생물분자,
f. 분석물 eAPC에 대한 분석물 eTPC의 세포독성 작용,
g. 신호 반응이 분석물 eAPC에 의해서 유도되고, a 내지 e 중 임의의 것의 증가 또는 감소를 검출함으로써 결정되도록 하는 분석물 eAPC에 대한 분석물 eTPC의 파라크린 작용,
h. 분석물 eTPC의 증식,
i. 분석물 eTPC와 분석물 eAPC 간의 면역학적 시냅스.
31. aAM 카고 또는 CM 카고를 선택 및 식별하는 방법으로서, 카고는 항목 22 내지 30에 정의된 방법에 의해서 선택 및 수득된 분석물 eAPC의 aAPX에 적재된, 대사산물 및/또는 펩타이드이고, 방법은
a. aAPX:aAM 또는 aAPX:CM 또는 카고 aM 또는 카고 CM을 단리하는 단계, 및
b. 적재된 카고를 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
32. 항목 31에 있어서, 단계 b는 단리된 aAPX:aAM 또는 aAPX:CM을 하기 중 하나 이상에 적용하는 단계를 포함하는, 방법:
a. 질량 분광학 분석,
b. 펩타이드 서열결정 분석.
33. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 12 내지 20에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 한 쌍의 TCR 쇄 서열 또는 TCR 쇄 서열의 쌍의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
34. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 22 내지 32에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 항원성 분자 및/또는 상기 항원성 분자를 암호화하는 ORF를 또는 이의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
35. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 22 내지 32에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 카고로서 항원성 분자에 적재된 항원-제시 복합체 및/또는 상기 복합체를 암호화하는 ORF(들) 또는 이의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
36. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 22 내지 30에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 eAPC, 또는 eAPC의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
37. 하기 중 적어도 하나에서 사용하기 위한, 항목 12 내지 20에 정의된 바와 같은 방법에 의해서 선택된 eTPC, 또는 eTPC의 라이브러리:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
38. 하기 중 적어도 하나에 사용하기 위한, 항목 1 내지 10 중 어느 것에 따른 디바이스:
a. 진단학,
b. 의학,
c. 화장품,
d. 연구 및 개발.
SEQUENCE LISTING
<110> Genovie AB
<120> An engineered two-part cellular device for discovery and characterisation of T-cell receptor interaction with cognate antigen
<130> WO/2018/083339
<140> PCT/EP2017/078474
<141> 2017-11-07
<150> PA 2016 70874
<151> 2016-11-07
<160> 104
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Cytomegalovirus
<220>
<223> Analyte Antigenic Peptide
<400> 1
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analyte Antigenic Peptide
<400> 2
Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu
1 5
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HCMV Antigen
<400> 3
Asn Leu Val Pro
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HCMV Antigen
<400> 4
Asn Leu Val Pro
1
<210> 5
<211> 6071
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pcDNA3.1_GFP vector V1.A.4
<400> 5
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgccaccat ggaatccgat gagtctggcc tgcccgccat 960
ggaaatcgag tgcagaatca ccggcaccct gaacggcgtg gaatttgagc tcgtgggcgg 1020
aggcgagggc acacctgaac agggcagaat gaccaacaag atgaagtcca ccaagggggc 1080
cctgaccttc agcccctacc tgctgtctca cgtgatgggc tacggcttct accacttcgg 1140
cacctacccc agcggctacg agaacccttt cctgcacgcc atcaacaacg gcggctacac 1200
caacacccgg atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg cacgtgtcct tcagctacag 1260
atacgaggcc ggcagagtga tcggcgactt caaagtgatg ggcaccggat tccccgagga 1320
cagcgtgatc ttcaccgaca agatcatccg gtccaacgcc accgtggaac atctgcaccc 1380
catgggcgac aacgacctgg acggcagctt caccagaacc ttctccctgc gggatggcgg 1440
ctactacagc agcgtggtgg acagccacat gcacttcaag agcgccatcc accccagcat 1500
cctccagaac ggcggaccca tgttcgcctt cagacgggtg gaagaggacc acagcaacac 1560
cgagctgggc atcgtggaat accagcacgc cttcaagacc cccgatgccg atgccggcga 1620
ggaatgagtc gagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 1680
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1740
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 1800
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 1860
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 1920
gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 1980
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 2040
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 2100
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 2160
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 2220
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 2280
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 2340
gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 2400
ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 2460
gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 2520
ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 2580
cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 2640
gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 2700
ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga tcaagagaca 2760
ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 2820
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 2880
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 2940
ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 3000
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 3060
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 3120
atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 3180
caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 3240
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 3300
aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 3360
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 3420
gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 3480
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 3540
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 3600
accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa 3660
ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc 3720
tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 3780
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 3840
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga 3900
gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 3960
cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 4020
aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 4080
agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 4140
ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 4200
ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 4260
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 4320
tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 4380
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 4440
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 4500
tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 4560
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 4620
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 4680
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 4740
actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 4800
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt 4860
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4920
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4980
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 5040
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 5100
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 5160
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 5220
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 5280
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 5340
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 5400
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 5460
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 5520
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 5580
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 5640
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 5700
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 5760
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 5820
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5880
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5940
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 6000
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 6060
cacctgacgt c 6071
<210> 6
<211> 6068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pcDNA3.1_RFP vector V1.A.6
<400> 6
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgccaccat gagcgagctg atcaaagaaa acatgcacat 960
gaagctgtac atggaaggca ccgtgaacaa ccaccacttc aagtgcacca gcgagggcga 1020
gggcaagcct tacgagggca cccagaccat gaagatcaag gtggtggaag gcggccctct 1080
gcccttcgcc tttgatatcc tggccaccag ctttatgtac ggcagcaagg ccttcatcaa 1140
ccacacccag ggcatccccg atttcttcaa gcagagcttc cccgagggct tcacctggga 1200
gcggatcacc acatacgagg acggcggagt gctgaccgcc acccaggata ccagcttcca 1260
gaacggctgc atcatctaca acgtgaagat taacggcgtg aacttcccca gcaacggccc 1320
cgtgatgcag aagaaaacca gaggctggga ggccaacacc gagatgctgt accctgccga 1380
tggcggcctg agaggccatt ctcagatggc cctgaaactc gtgggcggag gctacctgca 1440
ctgctccttc aagaccacct acagaagcaa gaagcccgcc aagaacctga agatgcccgg 1500
cttccacttc gtggaccacc ggctggaacg gatcaaagag gccgacaaag aaacctacgt 1560
ggaacagcac gagatggccg tggccaagta ctgcgacctg cctagcaagc tgggccacag 1620
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ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 1740
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 1800
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 1860
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 1920
ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 1980
tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 2040
cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 2100
tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 2160
tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 2220
cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 2280
ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 2340
gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 2400
aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 2460
accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 2520
aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 2580
agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 2640
gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 2700
ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga 2760
tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 2820
gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 2880
gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 2940
gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 3000
ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 3060
gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 3120
atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 3180
caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 3240
gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 3300
gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat 3360
atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 3420
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catggtcata gctgtttcct tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg 2700
ctgcgctcgg tcgttcgggt aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg 2760
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 2820
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 2880
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 2940
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 3000
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 3060
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 3120
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 3180
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 3240
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 3300
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 3360
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 3420
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 3480
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 3540
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 3600
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 3660
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccagatt 3720
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 3780
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 3840
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 3900
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 3960
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 4020
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 4080
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 4140
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 4200
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 4260
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 4320
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 4380
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 4440
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 4500
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 4542
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Ala Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala
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Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Thr
35 40
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2460
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attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 2580
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 2640
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 2700
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agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3060
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3120
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3180
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ac 3602
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<213> Artificial Sequence
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<223> pMA_F14_HLA-B*35:01-6xHis_F15 vector V4.H.8
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acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
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attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
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atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
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aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 960
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ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1080
caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1140
caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1200
gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1260
caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1320
ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1380
gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1440
ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1500
gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1560
cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1620
caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1680
gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 1740
gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 1800
caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 1860
cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 1920
cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 1980
caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2040
gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2100
cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2160
ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2220
gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2280
ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2340
cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2400
gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2460
catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2520
cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2580
cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2640
gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 2700
gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 2760
cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 2820
cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 2880
cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 2940
cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3000
gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3060
caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3120
cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3180
ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3240
cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3300
ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3360
gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3420
cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3480
cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3540
gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3600
cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3660
cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 3720
tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 3780
taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 3840
acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 3900
agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 3960
ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4020
cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4080
ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4140
taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4200
ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4260
cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4320
gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4380
caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4440
cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4500
caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4560
cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4620
ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4680
aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 4740
tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 4800
tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 4860
gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 4920
cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 4980
gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5040
ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5100
caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5160
ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaaggaa ttcggcagtg gagagggcag 5220
aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggcccagtga gcaagggcga 5280
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 5340
caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 5400
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 5460
ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 5520
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 5580
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 5640
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 5700
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 5760
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 5820
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 5880
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 5940
cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag gaattctaac gctagagggc 6000
ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 6060
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 6120
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 6180
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 6240
tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg 6300
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 6360
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 6420
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 6480
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 6540
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 6600
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 6660
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 6720
cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc 6780
aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc 6840
aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt 6900
cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 6960
ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct 7020
attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg 7080
agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 7140
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 7200
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 7260
ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga 7320
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 7380
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 7440
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 7500
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 7560
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 7620
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga 7680
ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 7740
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 7800
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 7860
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 7920
gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca 7980
tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc 8040
cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac 8100
cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 8160
acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 8220
tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag 8280
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 8340
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 8400
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 8460
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 8520
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gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 8760
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 8820
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tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 8940
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gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 9180
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tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 9420
tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 9480
cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 9540
ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 9600
tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 9660
gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 9720
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atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 9840
tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 9900
gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 9960
agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 10020
cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 10080
ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 10140
ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 10200
actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 10260
ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 10320
atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 10380
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 10428
<210> 85
<211> 2762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-A-sg-sp-opti1 vector V2.A.1
<400> 85
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
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acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg gatccaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 420
ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca 480
aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 540
ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 600
ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg agggttcggg gcgccatgag 660
tttaagagct atgctggaaa cagcatagca agtttaaata aggctagtcc gttatcaact 720
tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttcagacatc catagatcta gctcgagttt 780
tttttctaga ctgggcctca tgggccttcc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 840
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taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 1080
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 1140
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 1200
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 1260
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 1320
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 1380
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ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 1680
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 1740
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 1800
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 1860
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaacc 1920
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 1980
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 2040
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 2100
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 2160
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 2220
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 2280
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 2340
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 2400
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 2460
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 2520
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 2580
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 2640
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 2700
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 2760
ac 2762
<210> 86
<211> 2762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-B-sg-sp-3 vector V2.A.7
<400> 86
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg gatccaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 420
ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca 480
aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 540
ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 600
ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg tagaaatacc tcatggagtg 660
tttaagagct atgctggaaa cagcatagca agtttaaata aggctagtcc gttatcaact 720
tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttcagacatc catagatcta gctcgagttt 780
tttttctaga ctgggcctca tgggccttcc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 840
tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct tgcgtattgg gcgctctccg 900
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt aaagcctggg gtgcctaatg 960
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 1020
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 1080
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 1140
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 1200
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 1260
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 1320
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 1380
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 1440
cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 1500
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 1560
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 1620
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 1680
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 1740
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tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 1860
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaacc 1920
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aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 2040
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agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 2220
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 2280
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ac 2762
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<211> 2762
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 1800
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<220>
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aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 2040
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 2100
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<210> 89
<211> 2763
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_2 vector V2.J.1
<400> 89
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
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aggccgcatg gatccaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 420
ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca 480
aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 540
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ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 2760
cac 2763
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<211> 2762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAVSI_sg-sp-opti_3 vector V2.J.6
<400> 90
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
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gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg gatccaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 420
ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca 480
aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 540
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agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 2220
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 2280
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 2340
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 2400
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 2460
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 2520
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 2580
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 2640
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 2700
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ac 2762
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-GT-F1 ddPCR primer/probe
<400> 91
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<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.8
<400> 92
ttcggaaccc aatcactgac 20
<210> 93
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-probe-FAM ddPCR primer/probe
<400> 93
tttctcgacc agcttgacat cacagg 26
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC2-GT-F1 ddPCR primer/probe 1.F.9
<400> 94
gctgtcaagt ccagttctac g 21
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC2-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.10
<400> 95
cttgctggta agactcggag 20
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRBC2-probe-FAM ddPCR primer/probe 1.G.2
<400> 96
caaacccgtc acccagatcg tca 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.9
<400> 97
ctgatcctct tgtcccacag ata 23
<210> 98
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.10
<400> 98
gacttgtcac tggatttaga gtctct 26
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TRAC-probe(HEX) ddPCR primer/probe 10.B.6
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cttttgttct ccagatccag atccacc 27
Claims (22)
- 2-부분 디바이스로서, 제1 부분은 조작된 항원-제시 세포 시스템(engineered antigen-presenting cell system: eAPCS)이고, 제2 부분은 조작된 TCR-제시 세포 시스템(engineered TCR(T-cell receptor)-presenting cell system: eTPCS)인, 2-부분 디바이스.
- 제1항에 있어서, eAPCS는 하기 a 내지 d로부터 선택된 분석물 eAPC 중 1종 이상을 제공하는, 2-부분 디바이스:
a. eAPC-p 및/또는
b. eAPC-a, 및/또는
c. eAPC-pa, 및/또는
d. a 및/또는 b 및/또는 c의 1종 이상의 라이브러리. - 제2항에 있어서, eAPC-p, eAPC-a 또는 eAPC-pa는 하기 a 내지 e로부터 선택된 분석물 항원을 발현하는, 2-부분 디바이스:
a. aAPX 또는
b. aAM 또는
c. aAPX:aAM 또는
d. aAPX:CM 또는
e. 이들의 조합물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, eTPCS는 하기 a 및 b로부터 선택된 1종 이상의 분석물 eTPC를 제공하는, 2-부분 디바이스:
a. eTPC-t 및/또는
b. 이의 1종 이상의 라이브러리. - 제4항에 있어서, TCR 쇄의 분석물 쌍은 분석물 eTPC에 의해서 CD3과 복합체를 이룬 TCR 표면 단백질(분석물 TCRsp)로서 발현되는, 2-부분 디바이스.
- 제5항에 있어서, 상기 eTPC는 상기 eTPC의 상기 게놈에 대해서 조작된 합성 TCR 신호 반응 요소를 나타내는 성분 2F를 함유하고, 이것은 분석물 TCRsp와, eAPC -p, -a 또는 -pa에 의해서 제시된 분석물 항원 간의 복합체의 형성을 보고하는 데 사용되고, 이것은 상기 eTPC에서의 신호 반응을 유발하는, 2-부분 디바이스.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 분석물 eAPC는 1종 이상의 분석물 eTPC와 조합되는, 2-부분 디바이스.
- 제7항에 있어서, 상기 조합은 분석물 TCRsp와, 제3항에 정의된 바와 같은 분석물 항원 간의 접촉을 초래하고, 상기 접촉은 신호 반응을 초래할 수 있거나 또는 초래할 수 없는, 2-부분 디바이스.
- 제8항에 있어서, 상기 접촉은 상기 분석물 TCRsp와 상기 분석물 항원 간의 복합체의 형성을 초래할 수 있는, 2-부분 디바이스.
- 제9항에 있어서, 존재하는 경우, 복합체의 형성은 상기 분석물 eTPC 및/또는 상기 분석물 eAPC에서 신호 반응을 유도할 수 있는, 2-부분 디바이스.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호 반응은 신호 반응을 갖거나 또는 갖지 않는 분석물 eTPC 또는 분석물 eTPC의 풀(pool) 및/또는 신호 반응을 갖거나 또는 갖지 않는 분석물 eAPC 또는 분석물 eAPC의 풀을 선택하는 데 사용되는, 2-부분 디바이스.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 2-부분 디바이스로부터 수득된 분석물 eTPC이되, 분석물 항원에 대한, 분석물 TCRsp를 발현하는 상기 분석물 eTPC의 신호 반응의 특징규명에서 사용하기 위한, 분석물 eTPC.
- 1종 이상의 분석물 eTPC를 수득하기 위하여, 입력 분석물 eTPC 또는 분석물 eTPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 eTPC를 선택하는 방법으로서, 발현된 TCRsp는 제3항에 정의된 바와 같은 1종 이상의 분석물 항원에 결합하되,
a. 1종 이상의 분석물 eTPC를 1종 이상의 분석물 eAPC와 조합하여 분석물 TCRsp와 분석물 항원을 접촉시켜서, 하기 b 내지 d 중 적어도 하나의 측정하는 단계를 초래하는 단계:
b. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계 및/또는
c. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 상기 분석물 eTPC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계 및/또는
d. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 복합체의 형성에 의해서 유도된, 상기 분석물 eAPC에 의한 신호 반응을 측정하는 단계; 및
e. 단계 b, c 및/또는 d를 기초로 1종 이상의 eTPC를 선택하는 단계로서, 상기 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행되는, 상기 선택하는 단계를 포함하는, 1종 이상의 eTPC를 선택하는 방법. - 제13항에 있어서, 상기 선택하는 단계 e는 풀로의 단일 세포 분류 및/또는 세포 분류에 의해서 수행되는, 1종 이상의 eTPC를 선택하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 분류 이후에 분류된 단일 세포를 확장시키는, 1종 이상의 eTPC를 선택하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 분류 이후에 분류된 세포의 풀을 확장시키는, 1종 이상의 eTPC를 선택하는 방법.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 eTPC는 상기 신호 반응의 특징규명에 적용되되,
a. 네이티브 신호전달 반응을 결정하는 단계 및/또는
b. 상기 eTPC가 성분 2F를 함유하는 경우, 합성 신호전달 반응을 결정하는 단계를 더 포함하는, 1종 이상의 eTPC를 선택하는 방법. - 발현된 분석물 항원에 대한 분석물 TCRsp를 발현하는 1종 이상의 분석물 eTPC의 신호 반응을 유도하는 상기 분석물 항원을 식별하기 위해서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 2-부분 디바이스로부터 수득된 eAPC.
- 제3항에 정의된 바와 같은 발현된 분석물 항원에 대한 분석물 TCRsp를 발현하는 1종 이상의 분석물 eTPC의 신호 반응을 유도하는 1종 이상의 분석물 eAPC를 수득하기 위하여, 입력 분석물 eAPC 또는 분석물 eAPC의 라이브러리로부터 1종 이상의 eAPC를 선택하는 방법으로서,
a. 1종 이상의 분석물 eAPC를 1종 이상의 분석물 eTPC와 조합하여, 상기 분석물 eAPC에 의해서 제시된 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 eTPC의 분석물 TCRsp 간의 접촉을 초래하는 단계;
b. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 항원과 1종 이상의 분석물 TCRsp 간의 복합체의 형성을 측정하는 단계; 및/또는
c. 존재하는 경우, 상기 분석물 TCRsp와 상기 분석물 항원 간의 상기 복합체의 형성에 의해서 유도된, 1종 이상의 분석물 eTPC에서 신호 반응을 측정하는 단계; 및/또는
d. 존재하는 경우, 1종 이상의 분석물 TCRsp와 1종 이상의 분석물 항원 간의 상기 복합체의 형성에 의해서 유도된 분석물 eAPC에 의한, 신호 반응을 측정하는 단계; 및
e. 단계 b, c 및/또는 d로부터 1종 이상의 eAPC를 선택하는 단계로서, 상기 선택은 양성 및/또는 음성 측정에 의해서 수행되는, 상기 선택하는 단계를 포함하는, 1종 이상의 eAPC를 선택하는 방법. - 제19항에 있어서, 상기 선택하는 단계 e는 풀로의 단일 세포 분류 및/또는 세포 분류에 의해서 수행되는, 1종 이상의 eAPC를 선택하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 분류 이후에 분류된 단일 세포를 확장시키는, 1종 이상의 eAPC를 선택하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 분류 이후에 분류된 세포의 풀을 확장시키는, 1종 이상의 eAPC를 선택하는 방법.
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