JP2023027162A - T細胞レセプターの同族抗原との相互作用の発見及び特徴決定のための遺伝子操作された二部構成細胞デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、2つの部分を含んでなり各部分が、システムの動作中に互いに相互作用する別異の遺伝子操作された細胞システムを含む、遺伝子操作された細胞デバイスの構築及び使用に関する。二部構成細胞デバイスの第1の部分は、当該APCがヒト白血球抗原(HLA)分子、HLA様分子並びに別異の形態の抗原提示分子及び抗原性分子の細胞表面提示に関してヌルとなるようにゲノム編集により遺伝子操作されている抗原提示細胞(APC)システムである。加えて、遺伝子操作されたAPCシステム(eAPCS)は、抗原提示分子をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)の挿入のため、及び必要に応じて、遺伝子コードされた被分析物抗原の挿入のためのゲノム組込み部位を含有する。APCのゲノム組込み部位を標的し、被分析物抗原分子-及び/又は抗原提示複合体をコードするORFを迅速に送達するように設計された遺伝子ドナーベクターは、eAPCSを完成させる。二部構成細胞デバイスの第2の部分は、当該細胞がTCR鎖の表面発現に関してヌルとなるようにゲノム編集により遺伝子操作されているT細胞レセプター(TCR)-提示細胞システムである。この遺伝子操作されたTCR提示細胞システム(eTPCS)は、TCRをコードするORFの導入に際して、TCRヘテロ二量体複合体を細胞表面でCD3複合体状況で発現させることに関して依然としてコンピテントであり、TCRライゲーションに対して検出可能な様式で応答することに関してもコンピテントである。TCR-提示細胞のゲノム組込み部位を標的し、被分析物TCR ORFを迅速に送達するように設計された遺伝子ドナーベクターは、eTPCSを完成させる。この遺伝子操作された二部構成細胞デバイスは、細胞-細胞コミュニケーションの天然型機能的状況でのTCR/抗原相互作用の標準化された分析のために設計されている。
Tリンパ球(T細胞)による免疫監視機構は、全ての有顎脊椎動物の適応免疫における中心的な機能である。T細胞による免疫監視機構は、T細胞サブタイプにわたる豊富な機能的多様性を介して達成され、該T細胞サブタイプは、病原体感染及び腫瘍性細胞の排除に貢献し、侵入病原体、共生微生物、食物の分子成分のような共生非自己因子に対する適応免疫応答を組織化し、更には自己の免疫寛容を維持する。様々な外来及び自己因子に応答するために、T細胞は、これらの外来及び自己因子の分子構成成分を特異的に検出できなければならない。よって、T細胞は、個体が遭遇する自己及び非自己分子の大多数を、病原性生物及び病的な自己に対する有効な応答を開始するために十分な特異性を持って、健常な自己に対するそのような応答の開始を回避しながら検出できなければならない。この任務の非常に複雑な性質は、外来及び自己の分子の両方の実際的に無限の多様性を考慮した場合に明らかになり、病原性生物は、T細胞による検出を逃れるための進化圧力の下にある。
T細胞は、主として、T細胞レセプター(TCR)の発現により規定される。TCRは、T細胞適応免疫の標的と相互作用しそれを感知する役割を担うT細胞の成分である。一般的に言えば、TCRは、細胞表面で提示されるヘテロ二量体タンパク質複合体で構成される。2つのTCR鎖の各々は、共に免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインに属し、逆並行βシートを形成する可変(V)領域及び定常(C)領域である2つの細胞外ドメインで構成される。これらは、短い細胞質尾部に隣接するI型膜貫通ドメインにより細胞膜に係留されている。多様な分子構成成分に適応してそれを検出するT細胞の素質は、T細胞発生中に生じるTCR鎖におけるバリエーションから生じる。このバリエーションは、B細胞における抗体発生に類似の様式で体細胞組換えにより生じる。
T細胞プールは、幾つかの機能及び表現型が不均質な下位集団からなる。しかし、T細胞は、その表面で発現される体性再編成TCRアイソフォームに従ってαβ又はγδに大きく分類できる。2つのTCR鎖対アイソフォーム、すなわちTCRα(TRA)とTCRβ(TRB)との対、及びTCRガンマ(TRG)とTCRデルタ(TRD)との対が存在する。TRA:TRB対を発現するT細胞はαβT細胞と呼ばれ、TRG:TRD対を発現するT細胞は、しばしばγδT細胞と呼ばれる。
αβ及びγδ形のTCRは、共に多様なリガンド、すなわち「抗原」の認識を担い、各T細胞は、T細胞成熟中にαβ又はγδレセプター鎖を新たに生じる。これらの新たなTCR鎖対は、体細胞V(D)J組換えと呼ばれるプロセスにおいてレセプター配列多様性を生じることにより認識の多様性を達成し、体細胞V(D)J組換えの後に各T細胞は、別個に再編成された単一TCRのコピーを発現する。TRA及びTRG遺伝子座では、幾つかの分離した可変(V)及び機能的(J)遺伝子セグメントが組換えのために利用可能であり、定常(C)遺伝子セグメントに並置されるので、VJ組換えと呼ばれる。TRB及びTRD遺伝子座での組換えは、更に、多様性(D)遺伝子セグメントを含むので、VDJ組換えと呼ばれる。
組換えられた各TCRは、αβT細胞の場合にα及びβ鎖、又はγδT細胞の場合にγ及びδ鎖により形成されるリガンド結合部位の構造により決定される、ユニークなリガンド特異性の能力を有する。TCRの構造多様性は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、各鎖の3つの短いヘアピンループに主に限定される。3つのCDRは、レセプター鎖対の各鎖からもたらされ、これらの6つのCDRループはまとめて、TCR細胞外ドメインの膜から遠い末端に存在して、抗原結合部位を形成する。
各TCR鎖における配列多様性は、2つの形態で達成される。第一に、組換えのための遺伝子セグメントの無作為選択は、基本的な配列多様性をもたらす。例えば、TRB組換えは、47のユニークV、2のユニークD及び13のユニークJ生殖系列遺伝子セグメントの間で起こる。一般的に、V遺伝子セグメントは、CDR1及びCDR2ループの両方に貢献し、よって生殖系列にコードされている。配列多様性を生じるための第2の形態は、組み換えられるV、(D)及びJ遺伝子セグメントの間の接合部にて鋳型ヌクレオチドの無作為欠失及び非鋳型ヌクレオチドの付加により生じる超可変CDR3ループ内で起こる。
成熟αβ及びγδTCR鎖対は、ε、γ、δ及びζと呼ばれる幾つかのアクセサリーCD3サブユニットと一緒に複合体として細胞表面にて提示される。これらのサブユニットは、αβ又はγδTCRと一緒に3つの二量体(εγ、εδ、ζζ)として会合する。このTCR:CD3複合体は、αβ又はγδTCRと同族抗原との結合の際に細胞シグナル伝達応答を開始するためのユニットを形成する。TCR:CD3複合体として結合したCD3アクセサリーは、免疫レセプター活性化チロシンモチーフ(ITAM)と呼ばれるシグナル伝達モチーフに貢献する。
CD3ε、CD3γ及びCD3δは各々、単一のITAMに貢献するが、CD3ζホモ二量体は3つのITAMを含む。TCRと共に組み立てられる3つのCD3二量体(εγ、εδ、ζζ)は、よって、10のITAMに貢献する。同族抗原とのTCRライゲーションの際に、直列型チロシン残基のリン酸化は、重要な70kDaのζ鎖関連タンパク質(ζ-chain-associated protein of 70 kDa;ZAP-70)のようなSrcホモロジー2(Scr homology 2;SH2)ドメインを含むタンパク質のための対形成したドッキング部位を創出する。このようなタンパク質の動員は、T細胞活性化及び分化を最終的に担うTCR:CD3シグナル伝達複合体の形成を開始する。
αβT細胞は、一般的に、ヒトにおいて、対応するγδT細胞よりも豊富に存在する。αβT細胞の多くは、細胞表面でHLA複合体により提示されるペプチド抗原と相互作用する。ペプチド-HLA(pHLA)認識T細胞は、最初に記述され、最もよく特徴決定されている。αβT細胞のより稀な形も記述されている。粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞は、比較的限定されたα及びβ鎖多様性を有するとみられ、タンパク質断片よりもむしろ細菌代謝産物を認識する。インバリアントナチュラルキラーT細胞(invariant natural killer T-cell;iNK T細胞)及び生殖系列によりコードされるミコリル反応性T細胞(germline-encoded mycolyl-reactive T-cell;GEM T細胞)は、非HLA分子により交差提示される糖脂質の認識に限定される。iNK T細胞は、大部分が、CD1dにより提示される糖脂質と相互作用すると考えられるが、GEM T細胞細胞は、CD1bにより提示される糖脂質と相互作用する。更に別の形のT細胞は、CD1a及びCD1cに関連付けられた糖脂質と相互作用すると考えられるが、このような細胞は、まだ詳細に特徴決定されていない。
ほとんどのαβT細胞の重要な特徴は、HLA分子に関連したペプチド抗原の認識である。これらは、しばしば、「通常型」αβT細胞と呼ばれる。個体内で自己HLA分子は、自己及び外来タンパク質からのペプチドをT細胞に提示し、悪性病変及び外来病原体に対する適応免疫、共生生物、食物及び自己に向けての適応寛容のための必須の基礎を提供する。HLAタンパク質をコードするHLA遺伝子座は、ヒトゲノムのうちで最も遺伝子密度が高く、多型性の領域であり、ヒトにおいて12,000を超えるアレレが記載されている。HLA遺伝子座における多型の程度が高いことにより、個体間のペプチド抗原提示の多様性が確実になり、このことは、集団レベルでの免疫のために重要である。
2つの形の古典的HLA複合体、すなわちHLAクラスI(HLAI)及びHLAクラスII(HLAII)が存在する。3つの古典的HLAI遺伝子、すなわちHLA-A、HLA-B及びHLA-Cが存在する。これらの遺伝子は、インバリアントβ2ミクログロブリン(β2M)鎖と会合する膜貫通型α鎖をコードする。HLAIα鎖は、免疫グロブリンフォールド型の3つのドメイン、すなわちα1、α2及びα3で構成される。α3ドメインは、膜の近くにあり、大部分がインバリアントであるが、α1及びα2ドメインは一緒になって、多型の膜から遠くにある抗原結合窩を形成する。6つの古典的HLAII遺伝子、すなわちHLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA及びHLA-DRB1が存在する。これらの遺伝子は、α鎖及びβ鎖を含む、対形成したDP、DQ及びDRヘテロ二量体HLA複合体をコードする。各鎖は、免疫グロブリンフォールド型の2つの主要な構造ドメインを有し、ここで、α2及びβ2ドメインは、HLAIα3ドメインのものに類似の、膜に近い大部分がインバリアントのモジュールを含む。HLAIIα2及びβ2ドメインは一緒になって、膜から遠くにある抗原結合窩を形成し、多型性が高い領域である。
HLAI及びHLAIIの抗原結合窩は、8つの逆平行βシートのプラットフォーム上に2つの逆平行αヘリックスを含む。この窩において、ペプチド抗原が結合し、伸ばされた立体構造で提示される。HLAI及びHLAIIにおけるペプチド接触残基は、ほとんどの配列多型の場所であり、これは、異なるHLAアレレにより提示される多様なペプチドレパートリーの分子的基礎を構成する。ペプチドは、抗原結合窩と広範囲で接触し、その結果、各HLAアレレは、提示されたペプチドに対する別個の配列制約及び優先性を課す。所定のペプチドは、よって、限定された数のHLAとだけ結合し、相互的に、各アレレは、所定のタンパク質からのペプチドコレクションの特定の画分だけを受け入れる。各個体に存在するHLAI及びHLAIIアレレのセットは、HLAハプロタイプと呼ばれる。HLAI及びHLAII遺伝子の多型並びに遺伝性のアレレの相互優性発現は、ヒト集団全体にわたるHLAハプロタイプの非常に大きい多様性を駆動し、これは、αβTCRの莫大な配列多様性と組み合わせた場合に、これらのHLA-抗原-TCR相互作用の分析の標準化のために大きな障害となる。
αβTCRは、HLA及びペプチド抗原(変化した自己)の両方の残基により形成される混合pHLA結合界面の一部としてペプチドを認識する。HLAI複合体は、ほぼ全ての有核細胞の表面に提示され、内因性タンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。T細胞は、よって、相互作用細胞のpHLAI複合体をサンプリングすることにより、HLAI提示細胞の内因性細胞性プロテオームを調べることができる。HLAIの結合は、相互作用T細胞によるTCR共レセプターCD8の発現を必要とするので、HLAIサンプリングは、CD8+αβT細胞に制限される。これとは対照的に、HLAII複合体の表面発現は、プロフェッショナルAPCに主に制限され、提示細胞にとって外因性のタンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。相互作用T細胞は、よって、提示細胞が存在する細胞外微小環境のプロテオームを調べることができる。HLAIIの結合は、相互作用T細胞によるTCR共レセプターCD4の発現を必要とするので、HLAIIサンプリングは、CD4+αβT細胞に制限される。
上記のαβTCRの役割は、pHLA複合体の検出であり、TCR提示T細胞は、確立された免疫におけるそのT細胞の役割と密接な関係がある応答を高めることができる。個体において生じたαβTCRレパートリーは、特定のハプロタイプと関連して、多様性が実際に起こる前に遭遇する可能性が高い全ての外来抗原の巨大で予測できない多様性の理由であるはずである。この結果は、自己pHLAとの強い相互作用を回避するように特異的に教授されただけで特定されていないpHLA複合体を認識する能力を有して非常に多様で多数のαβTCRがある程度無作為化された様式で生じる背景に対して達成される。これは、胸腺選択と呼ばれるプロセスにおいてT細胞成熟中に注意深く調整される。
胸腺におけるT細胞成熟の第1の工程中に、十分な親和性をもって自己pHLA複合体と相互作用できないαβTCRを有するT細胞は、生存シグナルを奪われ、排除される。ポジティブ選択と呼ばれるこの工程により、正しいHLAに関連付けられて提示される外来又は変化したペプチドを少なくとも認識できる可能性があるTCRレパートリーを生存T細胞が確実に有することになる。その後、自己pHLAと強く相互作用し、よって自己免疫を駆動する能力を有するαβTCRは、ネガティブ選択のプロセスにより能動的に除去される。ポジティブ及びネガティブ選択のこの組合せは、末梢にある自己pHLAに対する低い親和性を有するαβTCRを有するT細胞だけをもたらす。これは、自己に制限されるが自己反応性ではないαβT細胞レパートリーを確立する。HLAハプロタイプに対するT細胞発生のこの高度に個別化された性質は、αβTCR-抗原-HLA相互作用の標準化された分析における困難を強調する。更に、これは、移植片拒絶及び移植片対宿主病の両方の基礎、並びに一個体において同定されるαβTCRが第2の個体において完全に異なる影響を有し得るという一般的な原理の基礎を形成し、このことは、実際の臨床において現れるTCRベース及びT細胞ベースの治療及び診断方策について明確な意味を有する。
αβT細胞の非HLA拘束又は「非通常型」の形は、非常に異なる分子抗原標的を有する。これらの非通常型αβT細胞は、古典的HLA複合体を結合させないが、CD1ファミリー又はMR1のような保存されたHLA様タンパク質を結合させる。CD1ファミリーは、抗原交差提示に関与する4つの形(CD1a、b、c及びd)を含む。これらの細胞表面複合体は、HLAIによく似たα鎖を有し、これがβ2Mとヘテロ二量体を形成する。α鎖の膜から遠い表面で提示される小さい疎水性ポケットは、病原体由来の脂質ベースの抗原のための結合部位を形成する。自然様NK T細胞(innate like NK T-cell;iNK T細胞)は、脂質/CD1ファミリー認識の最もよく理解された例であり、GEM T細胞は、別の顕著な例を表す。「I型」iNK T細胞は、CD1dに関連付けられた脂質α-GalCerと強く相互作用することが知られている。これらのiNK T細胞は、固定されたTCRα鎖(Vα10/Jα18)及び限定された数のβ鎖(制限されたvβ使用を有する)を有する非常に限定されたTCR多様性を示し、これらは、Toll様及びNod様レセプターのような自然の病原体関連分子パターン(PAMPS)認識レセプターになぞらえられている。これとは対照的に、「II型」NK T細胞は、より多様なTCRレパートリーを示し、より多様な形態のCD1d-脂質複合体結合を有するとみられる。GEM T細胞は、CD1bにより提示されるマイコバクテリア由来糖脂質を認識するが、CD1a、b及びcによる抗原提示並びにそれらのT細胞認識の分子的な詳細は、理解され始めたばかりである。
MAIT細胞は、インバリアントTCRα鎖(TRAJ33、TRAJ20又はTRAJ12とライゲーションされたTRAV1-2)を主に発現し、該鎖は、一連のTCRβ鎖と対形成できる。ペプチド又は脂質の代わりに、MAIT TCRは、HLAI様分子であるMR1により提示される病原体由来葉酸及びリボフラビンベースの代謝産物と結合できる。MAIT TCRについて観察されるTCRにおける限定されているが著しい多様性は、保存されたMR1に関連付けられた多様であるが相関する代謝産物の認識を可能にするとみられる。
非古典的HLA拘束αβT細胞TCRがどのようにして成熟中に胸腺において選択されるのか、よく理解されていない。しかし、上で概説したネガティブ及びポジティブ選択の基本的なプロセスが当てはまるようであり、胸腺内で特殊化した適所においてこのことが生じることを示唆するいくらかの証拠がある。
αβTCR発生及びpHLA結合の詳細な機械論的理解とは対照的に、抗原標的及びそれらのγδT細胞対応物の関係性については比較的ほとんど知られていない。このことは、循環T細胞区画中のそれらの量が比較的低いことが理由の一つである。しかし、γδT細胞は、厳密にHLA拘束されないと広く考えられており、抗体と同様に、より自由に表面抗原を認識するとみられる。加えて、より最近では、γδT細胞は、外来抗原との免疫系の主な相互作用部位である上皮組織の常在型T細胞区画を支配できることが認識されるようになってきている。更に、γδT細胞腫瘍免疫監視及び調節不全になった自己のその他の形の監視機構についての様々な機序が文献において明らかにされ始めている。自然様及び適応γδT細胞の両方の特異的抗原標的は、まだほとんど定義されていないが、PAMPの組織分布及び迅速な認識は、外来抗原に対する応答の初期及び適応免疫系がまだ成熟中の生命の初期の両方におけるγδT細胞の基本的な役割を示唆する。
γδT細胞の多様な機能は、異なるVγVδ遺伝子セグメント使用に基づくとみられ、γδT細胞が主にインバリアントTCRと一緒に、感染中の非常に初期にPAMPの自然様認識を媒介する2つの主なカテゴリーにおいて広く理解できる。PAMP以外に、これらのタイプのγδT細胞は、更に、細胞ストレス、感染及びおそらく腫瘍発生の非常に初期のサインを与え得るリン酸抗原を含む自己分子を認識すると考えられている。PAMP及びこのようないわゆる損傷関連分子パターン(danger associated molecular pattern;DAMPS)並びに多数の組織拘束自然様γδT細胞の認識は、これらの細胞が、予め活性化、ホーミング及びクローン増殖を必要とせず抗原負荷に対して迅速に応答するのに適していることを強く示唆する。
T細胞及びTCRとの関係において、抗原は、TCRと結合でき、T細胞内のシグナル伝達をもたらす任意の分子と定義できる。最もよく特徴決定されているT細胞抗原は、HLAI及びHLAII複合体において提示され、通常型αβT細胞と結合するペプチドである。しかし、近年、非通常型αβT細胞及びγδT細胞が抗原として広範囲の生体分子、例えば脂質、リポペプチド、糖ペプチド、糖脂質並びに一連の代謝産物及び異化産物を結合できることが明らかになってきた。更に、γδT細胞が、抗体様の様式で完全にフォールドされたタンパク質と直接結合できることが明らかになってきた。よって、T細胞抗原がHLAにより提示されるペプチドに主に拘束されるという視点は、過去20年間で、ほぼ全ての生体分子を含むように拡大されている。この概念を念頭に置いて、何を抗原提示細胞(APC)と考えることができるかを定義することが適切である。
抗原及び抗原提示細胞
初代T細胞の養子移入は、免疫不全患者にウイルス免疫を与えるために、ウイルス抗原に向かう、エクスビボで増殖させたT細胞をまず用いて、1990年代初期に臨床背景において初めて試験された。特定のがん抗原に対してエクスビボで増殖させた初代T細胞を用いる同様のアプローチが、そのすぐ後に悪性腫瘍の処置において試験された。現在でも課題であり続けるこれらの初期のアプローチにおけるある限界は、治療製品において組成を精細に最適化する必要性と対立する、T細胞の性質及び多様性についての理解の欠如である。現在、エクスビボで増殖させた初代T細胞の使用は、ウイルス抗原に対する特異性を有する初代T細胞を用いる一握りのイニシアティブ以外は、製薬業界においてほぼあきらめられている。
関連する観点において、臨床診断目的のために特定のTCR配列の量の検出を用いることに対する興味が増加している。特にディープシーケンシング法の台頭につれて、ある個体内の全体の、そして特定の関係におけるマッチするαβ対についての完全なTCR多様性を把握することが可能である。このことは、患者における疾患関連抗原に対する免疫応答の確立のための代理の読み出しとして、増殖したT細胞クローンの量を単に検出することにより特定の状態及び疾患状態を診断するための手段になる可能性がある。しかし、このような包括的なアプローチは、確立された臨床タイムポイントを有する非常に強い免疫応答に現在のところ限定されており、配列決定により同定された任意の特定のTCRの特異的抗原標的を同定することの根底にある困難に苦しんでいる。
適応免疫応答を活用する基本的な強さは、TCR-抗原相互作用の精巧な特異性が、各病原体、がん細胞又は自己免疫疾患に特異的に関連する抗原についての詳細な知識を必要とするという中心的な技術的困難と言い換えられる。更に、各抗原は、特異的抗原提示複合体又はそのアレレにより提示され得るので、抗原の発見は、関連する各HLA遺伝子及びアレレについて行わなければならない。強い適応免疫応答と関連し、保存されたエピトープ応答階層を一般的に示すHIV、インフルエンザ及びCMVのような幾つかの感染性疾患について、最も重要なエピトープが、幾つかの一般的なHLAと関連付けられてマッピングされている。同様に、がん、アレルギー及び自己免疫の分野において、関連T細胞抗原をマッピングする系統的な試みが増えてきている。しかし、これらは、困難な手順であり、異なる臨床状況と関連するT細胞抗原を系統的に表す努力は、効率的で確固とした迅速で適応性のあるプロトコールが存在しないことにより妨げられている。
特に、がん細胞は、困難で重要な態様である。なぜなら、悪性細胞の表面で提示されるペプチドのほとんどは自己抗原であるか又は自己抗原に非常に類似しているからである。よって、胸腺選択は、これらのペプチドを強く認識しうるTCRを削除するであろう。それと同時に、腫瘍は免疫認識を逃れるように発展する。このことは、確立された腫瘍に対する有力な免疫応答が比較的稀であり、標的を予測又は発見することが難しいことを意味する。しかし、これらの応答は存在し、そして重要なことには、通常、よりよい結果と関連している。このような応答の標的、腫瘍関連抗原(TAA)は、ほとんどの場合、自己からの区別可能な特徴を有し、がん発展中に過剰発現されるか、発展のこの段階では細胞型に存在しないか、又は遺伝子変異若しくは翻訳後改変、例えばリン酸化により特異的に変更されたタンパク質に由来する。
細胞療法の可能性及び確認された標的の欠如に鑑みて、見込のあるTCR抗原の同定は、いまだに、特に癌を処置するための努力におけるTCRに基づく免疫療法の最も急を要する障害の一つである。
全体として、TCRに基づく療法の発展はまだその初期段階であり、限定された成功しかしていない。とてつもない可能性があるが、診断的アプローチは、患者の疾患状態又は療法に対する応答を評価することを目的とする比較臨床研究においてほとんど実施されていない。天然型TCR鎖対の安定した捕捉と、高スループットにて細胞同士のコミュニケーションの機能的関係におけるTCR-抗原相互作用の系統的な分析とについて十分に発展していない技術は、TCRに基づく療法及び診断の発展のための主な障害である。
最近まで、細胞との関係での単離TCR配列の詳細な機能解析は、初代T細胞又は不死T細胞株への分析物TCR鎖対のトランスフェクションと、細胞活性化の伝統的なフローサイトメトリ分析による細胞応答の検出又は抗原負荷の際のトランスフェクションされた細胞から分泌される因子の検出という面倒なプロトコールにより制限されてきた。Guoらによる最近の発表において、単細胞からの対形成したTCR鎖の迅速なクローニング、発現及び機能的特徴決定が報告された(Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3:15054)。この研究では、分析物ヒトαβTCR対を、αβTCR発現が欠如したレポーター細胞株で発現させているが、これは、TCR刺激の際に活性化されるNur77プロモーターと連結した緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター系を含んでいた。この系は、レポーター細胞株ゲノムへの標準化されたTCR組込みの欠如のために、まだ非効率であり、APCエレメントによる細胞に結合した抗原負荷のための系統的な方法を提供しない。
本発明は上記の必要性に取り組むものである。詳細には、本発明は、TCR及びT細胞抗原の発見及び特徴決定のための遺伝子操作された二部構成細胞デバイスの構築及び使用に関する。細胞デバイス全体の2つの部分は、デバイス動作時に互いに接触する別異の遺伝子操作された細胞タイプで構成される。デバイスは、被分析物抗原に対する被分析物TCRの応答性の標準化された機能的分析に使用される。この応答性の読み出しは、TCR、T細胞抗原の同定及び選択、並びにTCR/抗原相互作用の詳細な機能的特徴決定に使用される。デバイスは、第1の細胞集団、eAPCシステム(eAPCS)を用いて作製される遺伝子操作された抗原提示細胞(eAPC)により被分析物抗原を提示する。デバイスは、第2の細胞集団、eTPCシステム(eTPCS)を用いて作製される遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)により被分析物TCRを提示する。
i.第1相、被分析物抗原及び被分析物TCRを有する細胞集団の作製、及び2つの被分析物細胞集団を接触させる組合せシステムへのそれらの組立て
ii.第2相、デバイスの出力を得るための、組合せシステムの接触された細胞集団のいずれかに固有の応答の読み出し
を含む2つの相で作動する。ここで、eAPCS及びeTPCSはそれぞれ、eAPC:eTPC組合せシステムに組み立てられる被分析物eAPC及びeTPC集団を作製する手段を提供する(図1、工程i及びii)。
eAPCSは、eAPC:eTPC組合せシステムに提供される種々の形態の被分析物eAPC集団を作製するシステムとして定義される。ここで、被分析物eAPC集団は、以下
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
iv.それらのライブラリー
の1つとして定義され、eAPC:eTPC組合せシステムへの入力被分析物eAPC集団の選択は、デバイスの動作の対象である抗原の性質により決定される。すなわち、eAPC:eTPCシステムへの組合せに必要とされるeAPC集団は、必要とされるデバイスの一次出力及び/又は必要とされるデバイスの終端出力により定義される(図1、工程i)。
i.eTPC-t
ii.eTPC-tのライブラリー
の1つとして定義され、eAPC:eTPC組合せシステムへの入力被分析物eTPC集団の選択は、デバイスの動作の対象であるTCRの性質により決定される。すなわち、eAPC-eTPCシステムへの組合せに必要とされるeTPC集団は、必要とされるデバイスの一次出力及び/又は必要とされるデバイスの終端出力により定義される(図1、工程ii)。
デバイスの一次出力は、選択された細胞集団であり、これは、eAPC:eTPCシステムに提供された相互関係性細胞により提示される被分析物に対して応答したものであってもしなかったものであってもよい。すなわち、この一次出力は、eAPC:eTPC組合せシステム内で報告される応答の存否に基いて選択された単一細胞又は細胞プールとして表し得る(図1工程v)。被分析物eAPC内の応答は、接触するeTPCにより提示される同族TCRの結合によってのみ誘発される。被分析物eTPC内の応答は、接触するeTPCにより提示される同族抗原の結合によってのみ誘発される(図1 工程iv)。
デバイスの一次eAPC出力は、選択された細胞であり、選択は、報告されるシグナル応答の存否に基いてなされ、これら細胞は以下
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
の1又は2以上を含み、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞プール又は異なるアイデンティティの細胞プールを含んでよい(図1 工程v)。
デバイスの一次eTPC出力は選択された細胞であり、選択は、報告されるシグナル応答の存否に基いてなされ、これら細胞はeTPC-tを含み、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞プール又は異なるアイデンティティの細胞プールを含んでよい(図1 工程v)。
二部構成細胞デバイスが作動していとき、作製されeAPC:eTPCシステムに組み合わされる被分析物細胞集団の選択は、eAPC及びeTPC集団の各々が存在する被分析物の性質により決定される。
eAPC-aは、被分析物抗原分子(aAM)を発現するものとして定義される。このaAMは細胞表面に提示されていてもよいし、及び/又は細胞内で発現若しくはプロセシングされてもよく、aAPXに積載されていてもよい積荷aAMを表す。
eAPC-paは、aAPX及びaAMを発現するものとして定義される。aAMは細胞内で発現又はプロセシングされてもよく、aAPXに積載されていてもよい積荷aAMを表す。よって、APC-paは、aAPXを細胞表面で発現するが、発現したaAMを積荷としてaAPXに積載していてもよい。これはaAPX:aAM複合体として定義される。eAPC-paは、aAMを積荷としてaAPXに積載してaAPX:aAM複合体を形成しないこともある。更に、生物学的システムの性質に起因して、aAPX:CM複合体もaAPC-paに存在することは不可避である。
eTPC-tは、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として発現される被分析物TCR鎖対をプロセッシングするものとして定義される。ここで、CD3は、TCRヘテロ二量体対が提示される表面複合体を表し、3つの二量体(εγ、εδ、ζζ)として相補性TCR鎖対と結合するε、γ、δ及びζサブユニットを有するものとして定義される。CD3及び相補性TCR鎖対の発現は、細胞表面での提示に必要であり、よって、TCR又はCD3のいずれかの発現がなければ、それらの細胞表面での提示が妨げられる。eTPC-tの作製において、αβ若しくはγδ TCR対及び/又はCD3の発現はポジティブ選択として利用される。したがって、eTPC-tの作製に用いるTCR α、β、γ又はδ鎖の組合せの性質にかかわらず、相補性TCR鎖対がCD3と複合体化して細胞表面に提示される細胞のみを、eTPC-tと呼ぶ。
eAPC-pは、aAPXを細胞表面で提示するものとして定義され、aAPX:CM複合体を細胞表面で提示してもよい。よって、eAPC:eTPC組合せシステムから報告される応答に基いて選択されるeAPC-pは、aAPX、CM及び/又はaAPC:CM終端デバイス出力を決定するために用いられてもよい。ここで、これら出力アイデンティティーは、決定した被分析物抗原が、eAPC:eTPC組合せシステムにおいて選択されたeAPC-pと接触させられる被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspと複合体を形成し、及び/又は該被分析物TCRspにより刺激されるシグナル応答を報告する能力に基いて選択されたものである。
eAPC-aは、aAMを細胞表面又は細胞内で提示するものとして定義される。よって、eAPC:eTPC組合せシステムから報告される応答に基いて選択されるeAPC-aは、aAM終端デバイス出力を決定するために使用し得る。ここで、この出力アイデンティティーは、決定した被分析物の、eAPC:eTPC組合せシステムにおいて、選択されたeAPC-aと接触した、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspと複合体を形成し、及び/又は該被分析物TCRspにより刺激されるシグナル応答を報告する能力に基いて選択される。
上記のように、被分析物eAPCの選択は、接触するeTPCにおいて報告される応答に基いてなされ得る。したがって、eTPCSへのTCRsp入力が被分析物eTPC-tの作製前に既知である場合、eAPC-p、eAPC-a及びeAPC-paのいずれも、TCRsp出力を間接的に取得するために使用され得る。
本発明に関して、eTPC-tは、TCRspを提示するものとして定義される。よって、eAPC:eTPC組合せシステムから報告される応答に基いて選択されるeTPC-tは、TCRsp終端デバイス出力を決定するために使用され得る。ここで、この出力アイデンティティーは、決定した被分析物TCRspの、eAPC:eTPC組合せシステムにおいて、選択されたeTPCと接触した、被分析物eAPCにより提示される被分析物抗原と複合体を形成し、及び/又は該被分析物抗原により刺激されるシグナル応答を報告する能力に基いて選択される。
上記のように、被分析物eTPCの選択は、接触するeAPCにおいて報告される応答に基いてなされ得る。したがって、eAPCSへの被分析物抗原入力が被分析物eAPCの作製前に既知である場合、eTPCは、被分析物抗原出力aAM、aAPX、aAPX:aM及び/又はaAPX:CMのいずれもを間接的に取得するために使用され得る。
上記のように、本発明は、各部分が遺伝子操作された細胞システムである二部構成細胞デバイスの提供に関する。第1の遺伝子操作された細胞システムは、デバイス内での二部構成eACP:eTPCシステムへの組合せのための被分析物eAPCを作製するために用いられる、遺伝子操作された多成分eAPCSである。
最小形態のeAPCSは、第1の成分が、ゲノム受容部位としての第2の成分(成分1B)及び遺伝子ドナーベクターとしての第3の成分(成分1Cと呼ぶ)を含むeAPC(成分1Aと呼ぶ)である多成分システムである(図2)。
eAPCは、本システムの他の全ての成分が関係する、eAPCSの基本成分である。したがって、eAPCは、天然型であるか又は操作された或る特徴を含み、この特徴により、eAPCは、eAPCS及び二部構成組合せデバイスの両方における使用に適切とされる。
i.aAPX及び/又はaAMの少なくとも1つのファミリーの内因性表面発現を欠き、
ii.少なくとも1つのゲノム受容部位(成分1Bと呼ぶ)を含有し、
ここで、i)は、aAPX及び/又はaAMの発現を欠く天然に存在する細胞集団の選択により得てもよいし、又は当該発現を欠くように遺伝子操作されていてもよく、ii)は、合成のものであってもよいし、特異的若しくは非特異的なゲノム組込みにより導入されていてもよい。
aAPX及び/又はaAM発現を欠くように細胞を遺伝子操作することは、非標的化又は標的化手段により達成してもよい。細胞の非標的化変異誘発は、細胞に化学的、放射線学的又はその他の変異原を提供し、次いで、標的aAPX及び/又はaAM発現を欠く細胞を選択することにより達成できる。ゲノム遺伝子座の標的化変異は、限定されないが:
i.ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii.CRISPR/Cas9媒介ターゲティング、
iii.合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む異なる手段により達成でき、
ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座で部位特異的DNA修復エラー変異誘発(また、非相同端部連結としても知られる)を誘発して、その後、変異細胞を、標的aAPX及び/又はaAM発現を欠く細胞の選択により得る。
成分1A(eAPC)は、必要に応じて、細胞表面接着分子成分の導入又は内因性細胞表面接着分子の除去を更に含んで、それぞれ、被分析物eTPCとのeAPCの結合及び免疫シナプスの形成を促進し、又はeAPC:eTPC組合せシステム内での堅固な結合及び有害な細胞クラスタリングの形成を回避してもよい。成分1Aに追加のORFとして導入され得るか又は成分1Aから遺伝子除去され得る接着分子は、接着タンパク質のインテグリンファミリーから選択できる。
eAPCは、、必要に応じて、抗原をプロセスし、天然型のプロセシング及び積載(loading)機構により積荷(cargo)としてaAPXに積載する能力を有していてもよい。抗原をプロセスし、天然型のプロセシング及び積載機構により積荷としてaAPXに積載する能力を有するeAPCはまた、eAPC又は(eAPCを含む)培養系に対して内因性である積荷分子(cargo molecule;CM)をプロセスし、積載する能力も有する(CMが積載されているaAPXをaAPX:CM複合体と呼ぶ)。
成分1Cは、eAPC(成分1A)のゲノム内に含まれる成分1Bのゲノム受容部位とカップリングされている遺伝子ドナーベクターである。成分1Cは、遺伝子ドナーベクターにコードされる、aAPX及び/又はaAMをコードする1又は2以上のORFのゲノム受容部位(成分1B)への組み込みのために設計されている。ここで、この組込みは、標的eAPCによるaAPX及び/又はaAMの発現をもたらす。
本発明に関して、対をなす遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は組込みカップルとも記載される。
拡大形態の多成分eAPCSにおいて、成分1A(eAPC)は、第2の遺伝子ドナーベクター(成分1Eと呼ぶ;これもまた本システムに追加される)とカップリングされた第2のゲノム受容部位(成分1Dと呼ぶ)を更に含んでいてもよい(図3)。
多成分eAPCSは、1又は2以上の追加の組込みカップルを更に含んでなってもよい。
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
の製造に用いられ、ここで、各遺伝子ドナーベクターは、1又は2以上のaAPX及び/又はaAMをコードする1又は2以上のORFを含み、該ORFをカップリングされたゲノム受容部位に組み込むためのものであってもよく、i)は少なくとも1つのaAPXを発現し、ii)は少なくとも1つのaAMを発現し、iii)は少なくとも1つのaAPX及び少なくとも1つのaAMを発現する(図4)。
遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は、eAPCSの組込みカップルサブシステムとして働く。遺伝子ドナーベクターは、先ず、標的ORFと組み合わされなければならず、ここで、基本ドナーベクターが当該標的ORFをコードするようになる。次いで、組立てられて準備が整ったドナーベクターは、標的ORFをゲノム受容部位と交換するために標的eAPCに導入され、よって、標的ORFが、標的細胞のカップリングされた受容部位に組み込まれる(図5)。
遺伝子ドナーベクター1C及び/又は1Eへの1又は2以上のORFの組合せは、独特なORFのライブラリーを用いて、
i.複数のORFをコードする1C'及び/又は1E'ベクターの別個のライブラリーを得るための別個の反応
ii.複数のORFをコードする1C'及び/又は1E'ベクターのプールされたライブラリーを得るための単一反応
として複数回行なってもよい。ここで、別個のライブラリーは、独特なaAPX及び/又はaAMをコードする独特なORFを有するeAPCの別個のライブラリーが得られるように、成分1Aと複数回組み合わされてもよく、プールされたライブラリーは、独特なaAPX及び/又はaAMをコードする独特なORFを各々が有するeAPCのプールされたライブラリーが得られるように、成分1Aと単一事象として組み合わされてもよい。
ゲノム受容部位への予測可能なコピー数の1又は2以上のORFの効率的組込みは、被分析物eAPC集団が迅速に調製及び特徴決定され得る標準化eAPCの動作のために非常に有利である。よって、ゲノム受容部位及びカップリングされたドナーベクターはeAPCの機能に重要である。更に、eAPCを、成分1B及び1Dが互いに隔離されてドナーベクター成分1Cが成分1Bで組み込まれず、その逆も同様であるようにすることが非常に望ましい。加えて、成分1B及び/又は成分1Dが、被分析物抗原の導入が迅速で反復可能であり、aAPX及び/又はaAMの所望のコピー数での正しい組込み及び送達の可能性が高いeAPCの作製方法に適することも望ましい。
i.リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
ii.部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
iii.部位特異的相同組換え用の天然型ゲノム部位
から選択され得、ここで、i)が好ましい。RMCE法は、各成分1B及び1Dが隔離された特異性を有するように、個別のリコンビナーゼ酵素に特異的である選択された異種特異的部位を採用してよい。
本発明に関して、ゲノム受容部位である成分1B及び/又は成分1Dは、以下の遺伝子エレメント:
i.異種特異的リコンビナーゼ部位
ii.相同性アーム
iii.真核生物プロモーター
iv.真核生物条件付き調節エレメント
v.真核生物ターミネーター
vi.選択マーカー
vii.スプライスアクセプター部位
viii.スプライスドナー部位
ix.非タンパク質コーディング遺伝子
x.インスレーター
xi.可動遺伝子エレメント
xii.メガヌクレアーゼ認識部位
xiii.内部リボソーム進入部位(IRES)
xiv.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xv.コザックコンセンサス配列
の少なくとも1つを含んでなる。
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
B)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
C)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
D)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性コード化タンパク質マーカーであり、
E)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
F)は、エレメントv)真核生物ターミネーターである。
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F] [G] [H] [I]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
B)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
C)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
D)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー1であり、
E)は、エレメントv)真核生物二方向転写ターミネーターであり、
F)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性コード化タンパク質マーカー2であり、
G)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
H)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
I)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
更に、この第2の配置において、エレメントF、G及びIは、アンチセンス方向にコードされる。
i.異種特異的リコンビナーゼ部位
ii.相同性アーム
iii.真核生物プロモーター
iv.真核生物条件付き調節エレメント
v.真核生物ターミネーター
vi.選択マーカー
vii.スプライスアクセプター部位
viii.スプライスドナー部位
ix.非タンパク質コーディング遺伝子
x.インスレーター
xi.可動遺伝子エレメント
xii.メガヌクレアーゼ認識部位
xiii.内部リボソーム進入部位(IRES)
xiv.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xv.コザックコンセンサス配列
xvi.組込みの選択マーカー
xvii.抗生物質耐性カセット
xviii.細菌性複製起点
xix.酵母複製起点
xx.クローニング部位
の少なくとも1つで構成される。
第1の配置は、RMCE組込みによる、1又は2以上のaAPX及び/又は1又は2以上のaAM及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFの送達のためのものであり、ここで、該配置は
5'-[A] [B] [C] [D] [E]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
B)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
C)は、エレメントxx)1又は2以上のaAPX及び/又は1又は2以上のaAM及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードする単一ORFのクローニング部位であり、
D)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
E)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌性複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のaAPX及び/又は1又は2以上のaAM及び/又はエレメントxviを一緒に連結するために用いてよい。
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
B)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
C)は、1又は2以上のaAPX及び/又は1又は2以上のaAM及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードし、真核生物のターミネーターを有する2又は3以上のORFの導入のためのクローニング部位であり、
D)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列(アンチセンス方向)であり、
E)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
F)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のaAPX及び/又はaAM及び/又はエレメントxviを各ORF内で一緒に連結するために用いてよい。
上記eAPCSシステムは、二部構成デバイスの動作中に、eAPC:eTPC組合せシステム内で、eTPCに被分析物aAPX、aAM、aAPX:aAM及びaAPX:CMを提示するように働く、別異の形態の被分析物eAPC又はそのライブラリーを作製するために複数の様式で用いてもよい。
単一組込みカップルを含んでなるeAPCSは、aAPXのORFと組み合わされた成分1C'を提供することにより、eAPC-pを成分1Aから一工程で作製するために用いてもよい。このaAPXは部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAPXを発現し、aAPXは細胞表面に提示される(図6)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、aAPXのORFと組み合わされた成分1C'を提供することにより、eAPC-pを成分1Aから一工程で作製するために用いてもよい。このaAPXは部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAPXを発現し、aAPXは細胞表面に提示される。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図7)。
単一組込みカップルを含んでなるeAPCSは、aAMのORFと組み合わされた成分1C'を提供することにより、eAPC-aを成分1Aから一工程で作製するために用いてもよい。このaAMは部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAMを発現し、aAMは細胞表面に提示されるか、又は細胞内に保持される(図8)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、aAMのORFと組み合わされた成分1C'を提供することにより、eAPC-aを成分1Aから一工程で作製するために用いてもよい。このaAMは部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAMを発現し、aAMは細胞表面に提示されるか、又は細胞内に保持される。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図9)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、一方はaAPXをコードし、他方はaAMをコードする2つのORFと組み合わされた成分1C'を提供することにより、eAPC-paを成分1Aから一工程で作製するために用いてもよい。aAPX及びaAMは共に部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAPX及びaAMを発現し、aAPX:aAMを細胞表面に提示してもよい。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図11)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、各々がaAPX又はaAMのいずれかをコードする1つのORFと組み合わされた成分1C'及び1E'を提供することにより、eAPC-paを成分1Aから一工程で作製するために用いられてもよい。aAPX及びaAMは共に部位1B又は1Dに組み込まれ、成分1B'及び1D'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAPX及びaAMを発現し、aAPX:aAMを細胞表面に提示してもよい(図12)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、aAPXをコードするORFと組み合わされた成分1C'を先ず提供することにより、eAPC-paを成分1Aから二工程で作製するために使用されてもよい。このaAPXは部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAPXを発現し、aAPXは細胞表面に提示される)。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままである。第2の工程において、ドナーベクターがaAMをコードするORFと組み合わされた1E'が提供される。このaAMは部位1Eに組み込まれ、成分1E'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAMを発現し、これはaAPXにおいてプロセスされて積荷として積載され、細胞表面でaAPX:aAM複合体を形成してもよい(図13)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、aAMをコードするORFと組み合わされた成分1C'を先ず提供することにより、eAPC-paを成分1Aから二工程で作製するために用いてもよい。このaAMは部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAMを発現する(eAPC-a中間体)。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままである。第2の工程において、ドナーベクターがaAPXをコードするORFと組み合わされた1E'が提供される。このaAPXは1Eに組み込まれ、成分1E'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAPXを発現し、これは細胞表面に提示される。第1の工程で組み込まれたaAMは、aAPXにおいてプロセスされて積荷として積載され、細胞表面でaAPX:aAM複合体を形成してもよい(図14)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、aAPXをコードするORFと組み合わせた成分1C'を先ず提供することにより、eAPC-paを成分1Aから二工程で作製するために用いてもよい。このaAPXは部位1Bに組み込まれ、成分1B'が作製される。得られる細胞株は提供されたaAPXを細胞表面で発現する(eAPC-p中間体)。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままである。第2の工程において、複数の1E'のライブラリーが提供され、ここで、ドナーベクターのライブラリーは、各々がaAMをコードする単一ORFと組み合わされたベクタープールを含んでなり、各aAMは単一細胞で部位1Eに組み込まれ、成分1E'が作製される。得られる細胞プールは細胞の集団を含み、ここで、各細胞は元のベクタープールからの単一ランダムaAM ORFが組み込まれている。第2の工程で組み込まれたaAMは、第1の工程で組み込まれたaAPXにおいてプロセスされて積荷として積載され、細胞表面でaAPX:aAM複合体を形成してもよい(図15)。
2つの組込みカップルを含んでなるeAPCSは、各々がaAPXのライブラリー又はaAMのライブラリーのいずれかをコードするORFのライブラリーと組み合わされた成分1C'及び1E'を提供することにより、eAPC-paを成分1Aから一工程で作製するために用いられてもよい。aAPX及びaAMは共に部位1B又は1Dに組み込まれ、1B'及び1D'が作製される。得られる細胞プールは細胞の集団を含み、ここで、各細胞は、元のベクタープールからの単一ランダムaAPX ORF及び単一ランダムaAM ORFが組み込まれている。プールされたライブラリー中の各細胞内で、組み込まれたaAMは、プロセスされ、同一細胞中に組み込まれたaAPXに積荷として積載されて、細胞表面でaAPX:aAM複合体を形成してもよい。このプールされたライブラリーは、提供されたaAPX及びaAMセットからaAPX:aAMの可能性のある全ての組合せを含み得る(図17)。
eAPC-paのプールされたライブラリーを提供するための上記ショットガン組込み法において、システムの堅牢性は単一コピーのゲノム受容部位に依拠する。このことは、単一被分析物のみが組込みカップルを介して各細胞に導入されることを確実にする。この単一コピーゲノム受容部位は、eAPCSの1つの任意選択の側面である。なぜならば、同一ゲノム受容部位の複数コピーは、提供されたベクターのライブラリーからの複数の「アレレ」が製造されたeAPCにおいて取得され得る組込み工程の提供において有益であり得るからである。
i.HLAクラスIの1又は2以上のメンバー
ii.HLAクラスIIの1又は2以上のメンバー
iii.1又は2以上の非HLA抗原提示複合体
の1つから選択され得る。
aAPXは、以下:
i.被分析物抗原として提供されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ii.被分析物抗原として提供されるポリペプチドに由来するペプチド
iii.被分析物抗原として提供されるペプチド
iv.被分析物抗原として提供される代謝物
v.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
vi.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
vii.成分Aプロテオームの変更に由来するペプチド
viii.成分Aプロテオームに由来するポリペプチド
ix.成分Aメタボロームの変更に由来する代謝物
の1つから選択され得る。
上記のように、本発明は、各パートが遺伝子操作された細胞システムである二部構成細胞デバイスの提供に関する。第1の遺伝子操作された細胞システムは、上記のeAPCSである。第2の遺伝子操作された細胞システムは、デバイス内で二部構成eACP:eTPCシステムに組み合わされるための被分析物eTPCの製造に用いられる遺伝子操作された多成分eTPCSである。
最小形態のeTPCSは、第1の成分がeTPC(成分2Aと呼ぶ)であり、第2の成分が遺伝子ドナーベクター(成分2Cと呼ぶ)である多成分システムである(図18)。
eTPCは、本システムの他の全ての成分が関係する、eTPCSの基本成分である。したがって、eTPCは、天然型であるか又は操作された或る特徴を含み、この特徴により、eTPCは、eTPCS及び二部構成組合せデバイスの両方における使用に適切とされる。
i.TCRα、β、δ及びγ鎖の内因性発現を欠き、
ii.細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
iii.更なる成分(成分2Bと呼ぶ)である、少なくとも1つの被分析物TCRα、β、δ又はγ鎖をコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFの組込みのためのゲノム受容部位を含み、
ここで、i)は、前記発現を欠く天然に存在する細胞集団の選択により取得されてもよいし、該発現を欠くように遺伝子操作されてもよく、ii)は、前記発現を含む天然に存在する細胞集団の選択により取得されてもよいし、該発現を含むように遺伝子操作されていてもよく、iii)は、遺伝子工学の手段によりゲノムに導入されていてもよい。
TCRα、β、δ及びγ鎖発現を欠くようにeTPCを遺伝子操作することは、標的付けられていない又は標的付けられた手段により達成され得る。細胞の標的付けられていない変異誘発は、細胞に化学的、放射線又はその他の変異原を提供し、次いで、標的aAPX及び/又はaAM発現を欠く細胞を選択することにより達成できる。ゲノム遺伝子座の標的付けられた変異は、
i.ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii.CRISPR/Cas9媒介ターゲティング(正確及び頭文字)、
iii.合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む(が、これらに限定されない)異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座で部位特異的DNA修復エラー変異誘発を誘導し、その後、変異細胞を、TCRα、β、δ及びγ鎖の発現を欠く細胞の選択により取得する。
i.ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii.CRISPR/Cas9媒介ターゲティング、
iii.合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む(が、これらに限定されない)異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座でHDRによる部位特異的DNA修復を誘導する。この事象の後、一部の細胞は、組み込まれたHDRベクターを有し、以下:
iv.非破壊的表現型発現解析
v.破壊的表現型発現解析
vi.遺伝子解析
の任意の組合せにより選択及び/又は決定できる
ここで、iv及びviは、奏功するゲノム組込み事象の選択及び決定のための好ましい方法である。
或いは、ウイルスベクターを用いて、部位特異的又は非特異的様式で必要な成分を送達することができる。
eTPC成分2Aは、必要に応じて、aAPX及び/又はaAMの少なくとも1つのファミリーの内因性表面発現を欠き、表面発現の欠如は、標的被分析物抗原のマッチさせた分析(matched analysis)における干渉を最小化するように選択される。
aAPXのファミリーは、以下のいずれであってもよい:
i.HLAクラスI
ii.HLAクラスII
iii.非HLA抗原提示複合体。
i.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ii.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
iii.成分Aプロテオームの変更に由来するペプチド
iv.成分Aプロテオームの変更に由来するポリペプチド
v.成分Aメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される。
成分2A eTPCは、必要に応じて、T細胞コレセプターを更に含んでよく、この特徴により、被分析物eTPCと被分析物eAPCとの強固な又は変化する形態のコミュニケーションが可能となり、整調可能なコミュニケーションは、特異的被分析物TCRsp及び/又は被分析物抗原の同定又は特徴決定に適切である。
本発明に関して、eTPC成分2Aは、必要に応じて、CD28及び/又はCD45を発現してよく、ここで、CD28及びCD45は、シグナル伝達に対するポジティブフィードフォワード効果によりシグナル感受性に寄与する一方、シグナル伝達に対するネガティブフィードバック効果によりシグナル特異性にも寄与し得る。なぜならば、これらは、発現された被分析物TCRspによりシグナル伝達に関係するからである。
成分2A eTPCは、必要に応じて、細胞表面接着分子成分の導入又は内因性細胞表面接着分子の除去を更に含んで、それぞれ、被分析物eAPCとのeTPCの結合及び免疫シナプスの形成を促進し、又はeAPC:eTPC組合せシステム内での堅固な結合及び有害な細胞クラスタリングの形成を回避してもよい。
成分2Aに追加のORFとして導入され得るか又は成分2Aから遺伝子除去され得る接着分子は、インテグリンファミリーの接着タンパク質から選択できる。
成分2Cは、eTPC(成分2A)のゲノム内に含まれる成分2Bのゲノム受容部位とカップリングされている遺伝子ドナーベクターである。成分2Cは、遺伝子ドナーベクターにコードされる、1又は2以上の被分析物TCR鎖をコードするORFのゲノム受容部位(成分2B)への組み込みのために設計されている。ここで、この組込みは、標的eTPCによる被分析物TCR鎖の発現をもたらす。
対をなす遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は組込みカップルとも記載される。
本発明に関して、eTPC成分2Aは:
i.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
ii.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメント 成分2Fと呼ぶ成分を更に含み、ここで、i及び/又はiiの活性化は、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも1つのシグナル伝達経路に依存する。
i.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
ii.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメント 成分2Fと呼ぶ成分を更に含んでいてもよく、ここで、i及び/又はiiの活性化は、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも1つのシグナル変換経路に依存する。
天然型プロモーターと対立するものとしての合成プロモーターを有する合成TCR刺激応答エレメント(成分2F)は、天然のTCR刺激応答を模擬する可能性が少なく、よって、天然のT細胞刺激とは距離がある近似を表す。しかし、合成プロモーターは、被分析物抗原に生産的に結合するTCRspを提示するeTPC-tの堅固な同定のためのレポーター応答の整調及び調節の関して非常な柔軟性を提供する。
合成プロモーターは、当初の天然のTCRシグナル伝達経路の下流に存在させ得るか又は該経路と置き換えることができる人工的合成シグナル伝達成分に連結することができる。この場合、CD3複合体は、人工的合成シグナル伝達経路及び応答ネットワークと部分的又は全体的にカップリングされることができる。このような人工的経路は、応答の微調整又は増強に関して、モジュール式で順応性が高いという利点を提供する。
TCRsp刺激と成分2Fとをカップリングさせる正確な様式にかかわらず、所望の終端結果は検出可能なレポーターである。好適な実施形態において、蛍光検出(すなわち、FACS)及び/又は物理的選択方法(例えば、磁気活性化細胞選別(MACS))に従うレポーターが望ましい。或いは、レポーターは、分光光度、蛍光又は発光アッセイ(好ましくは非破壊的性質のもの)による検出のための、分泌されるものであるか又は細胞内分子であり得る。ここで、当該集団は、その後、レポーター分子の存否に基いて選択することができる。加えて、応答は、単一レポータータイプに制限されず、1又は2以上の異なるレポーターの組合せであり得る。
駆動因子-アクチベーター/リプレッサー:
a)合成プロモーター
b)コザック配列
c)転写因子
d)第1のターミネーター
増幅因子-レポーター
e)第2の合成プロモーター
f)コザック配列
g)レポーター
h)第2のターミネーター
を含んでなり、ここで、
a)は、被分析物抗原へのTCRspのライゲーションにより生じる当初の天然のシグナル伝達経路とカップリングされて設計されている合成プロモーター(駆動因子)を表す。最小駆動因子は、1又は2以上の転写因子結合部位及びコアプロモーターを含んでなり、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、開始エレメント(Inr)及び転写開始部位を含んでなり;b)は、転写因子の効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し;c)は、第2の合成プロモーターのDNA配列に結合することができる合成又は天然の転写因子(アクチベーター又はリプレッサー)をコードするORFを表し;d)は、転写因子のmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の1又は2以上の非翻訳3'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい;e)は、c)転写因子及びコアプロモーターの結合のための1又は2以上の認識部位をコードする第2の合成プロモーター(増幅因子)を表し、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、Inr及び転写開始部位を含んでなる;f)は、レポーターの効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し;g)は、レポータータンパク質をコードするORFを表し;h)は、レポーターのmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の1又は2以上の非翻訳3'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい。
a)合成プロモーター
b)コザック配列
c)レポーター
d)ターミネーター
を含んでなり、ここで
a)は、被分析物抗原へのTCRspのライゲーションにより生じる当初の天然のシグナル伝達経路とカップリングされて設計されている合成プロモーター(駆動因子)を表す。最小駆動因子は、1又は2以上の転写因子結合部位及びコアプロモーターを含んでなり、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、Inr及び転写開始部位を含んでなり;b)は、レポーターの効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し;c)は、レポータータンパク質をコードするORFを表し;d)は、レポーターのmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の1又は2以上の非翻訳3'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい。
eTPCS 成分2Aは、1又は2以上の追加の組込みカップルを更に含んでなってもよい。
eTPC及び1つ又は2つの組込みカップルを含んでなるeTPCSは、eAPC:eTPC組合せシステムの組み立てに使用するeTPC-tの製造に用いる。
eTPC-tは、2つの相補性TCR鎖を組み込んでTCRspを形成することにより製造されてもよいし、又は代替的に、各相補性鎖を逐次提供することにより二工程で製造してもよい(図20)。
遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は、eTPCSの組込みカップルサブシステムとして働く。遺伝子ドナーベクターは、先ず、標的ORFと組み合わされなければならず、ここで、基本ドナーベクターが当該標的ORFをコードするようになる。次いで、組立てられて準備が整ったドナーベクターは、標的ORFをゲノム受容部位と交換するために標的eTPCに導入され、よって、標的ORFが、標的細胞のカップリングされた受容部位に組み込まれる(図21)。
遺伝子ドナーベクター2C及び/又は2Eへの1又は2以上のORFの組合せは、独特なORFのライブラリーを用いて、
i.複数のORFをコードする2C'及び/又は2E'ベクターの別個のライブラリーを得るための単一の別個の反応
ii.複数のORFをコードする2C'及び/又は2E'ベクターのプールされたライブラリーを得るための単一反応
として複数回行なってもよい。ここで、別個のライブラリーは、独特なTCR鎖をコードする独特なORFを有するeTPCの別個のライブラリーが得られるように、成分2Aと複数回組み合わされてもよく、プールされたライブラリーは、各eTPC-tは元のベクタープールからの被分析物TCR鎖をコードするランダム化されたORFが組み込まれており、結果として、各eTPC-tが単一ランダムの独特なTCRspを発現するプールされたeTPC-tのライブラリーが得られるように、分2Aと1回又は2回以上組み合わされてもよい。
ゲノム受容部位への予測可能なコピー数の1又は2以上のORFの効率的組込みは、被分析物eTPC集団が迅速に調製及び特徴決定され得る標準化eTPCの動作のために非常に有利である。よって、ゲノム受容部位及びカップリングされたドナーベクターはeTPCの機能に重要である。更に、eTPCを、成分2B及び2Dが互いに隔離されてドナーベクター成分2Cが成分2Bで組み込まれず、その逆も同様であるようにすることが非常に望ましい。加えて、成分2B及び/又は成分2Dが、単一の相補性TCR鎖対の導入が迅速で反復可能であり、単一対のみの正しい組込み及び送達の可能性が高いeTPC-tの作製方法に適することも望ましい。
i.リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
ii.部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
から選択され得、ここで、i)がRCME用に好適な形態のゲノム受容部位である。RMCE法は、各成分2B及び2Dが隔離された特異性を有するように、個別のリコンビナーゼ酵素に特異的である選択された異種特異的部位を採用してよい。
ゲノム受容部位である成分2B及び/又は成分2Dは、以下の遺伝子エレメント:
i.異種特異的リコンビナーゼ部位
ii.相同性アーム
iii.真核生物プロモーター
iv.真核生物条件付き調節エレメント
v.真核生物ターミネーター
vi.選択マーカー
vii.スプライスアクセプター部位
viii.スプライスドナー部位
ix.非タンパク質コーディング遺伝子
x.インスレーター
xi.可動遺伝子エレメント
xii.メガヌクレアーゼ認識部位
xiii.内部リボソーム進入部位(IRES)
xiii.内部リボソーム進入部位(IRES)ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xiv.コザックコンセンサス配列
の少なくとも1つを含んでなる。
第1の配置は、RMCE組込みにより、1又は2以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFを受容するためのものであり、ここで、該配置は
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
B)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
C)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
D)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性コード化タンパク質マーカーであり、
E)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
F)は、エレメントv)真核生物ターミネーターである。
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F] [G] [H] [I]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
B)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
C)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
D)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー1であり、
E)は、エレメントv)真核生物二方向転写ターミネーターであり、
F)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー2であり、
G)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
H)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
I)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
更に、この第2の配置において、エレメントF、G及びIは、アンチセンス方向にコードされる。
i.異種特異的リコンビナーゼ部位
ii.相同性アーム
iii.真核生物プロモーター
iv.真核生物条件付き調節エレメント
v.真核生物ターミネーター
vi.選択マーカー
vii.スプライスアクセプター部位
viii.スプライスドナー部位
ix.非タンパク質コーディング遺伝子
x.インスレーター
xi.可動遺伝子エレメント
xii.メガヌクレアーゼ認識部位
xiii.内部リボソーム進入部位(IRES)
xiv.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xv.コザックコンセンサス配列
xvi.組込みの選択マーカー
xvii.抗生物質耐性カセット
xviii.細菌性複製起点
xix.酵母複製起点
xx.クローニング部位
の少なくとも1つで構成される。
第1の配置は、RMCE組込みによる、1又は2以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFの受容のためのものであり、ここで、該配置は
5'-[A] [B] [C] [D] [E]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
B)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
C)は、エレメントxx)1又は2以上のTCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードする単一ORFのクローニング部位であり、
D)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
E)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌性複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のTCR鎖及び/又はエレメントxviを一緒に連結するために用いてよい。
ここで、
A)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
B)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
C)は、1又は2以上のTCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードし、真核生物のターミネーターを有する2又は3以上のORFの導入のためのクローニング部位であり、
D)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列(アンチセンス方向)であり、
E)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
F)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のTCR鎖及び/又はエレメントxviを各ORF内で一緒に連結するために用いてよい。
上記eTPCSシステムは、二部構成デバイスの動作において、eAPC:eTPC組合せシステム内でeAPCに対して被分析物TCRspを提示するように働く別異の形態の被分析物eTPC集団又はそのライブラリーを作製する複数の方法で使用してもよい。
作製されるeTPC-t集団は、特定の供給源から被分析物TCR鎖(これに対して候補抗原を分析する)を導く必要がある。
被分析物TCR鎖をコードする配列の供給源は、
i.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
ii.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
iii.合成TCR鎖ORF配列
から誘導することができ、ここで、i)は、胸腺選択に起因して、一般に、自己のaAPX及び/又はaAPX積荷に対して交差反応性である可能性が高くない天然型TCRspの発見に好適であり;ii)は、候補TCR親和性反応剤を同定するために使用されてもよく;iii)は、TCR親和性反応剤の親和性成熟において用いられてもよい。
2つの組込みカップルを含んでなるeTPCSは、TCR鎖の相補対のORFと組み合わされた成分2C'を提供することにより、eTPC-tを成分2Aから一工程で作製するために用いてもよい。この被分析物TCR対は部位2Bに組み込まれ、成分2B'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR対を発現し、TCR対は細胞表面にTCRspとして提示される。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図22)。
2つの組込みカップルを含んでなるeTPCSは、各々が相補性TCR鎖対の1つの鎖をコードする1つのORFと組み合わされた成分2C'及び2E'を提供することにより、eTPC-tを成分2Aから一工程で作製するために用いられてもよい。両被分析物TCRは部位2B又は2Dに組み込まれ、成分2B'及び2D'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR対を発現し、TCR対は細胞表面にTCRspとして提示される(図23)。
2つの組込みカップルを含んでなるeTPCSは、単一被分析物TCR鎖のORFと組み合わされた成分2C'を提供することにより、eTPC-xを成分2Aから一工程で作製するために用いてもよい。この被分析物TCR鎖は部位2Bに組み込まれ、成分2B'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR鎖を発現するが相補性鎖を欠いており、よって表面TCRを発現しない。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図24)。
被分析物eTPC-x及び/又はeTPC-t集団をeTPCから作製する上記の例において、eTPCSシステムは、既知の被分析物TCR鎖を規定された様式で提供して、規定されたTCRspを発現する被分析物eTPCの別個の集団を作製するために用いられる。この方法は、デバイス動作時に、eAPC:eTPC組合せシステムに提供するeTCP-x及び/又はeTCP-tのライブラリーを構築するために複数回繰り返されてもよい。代替アプローチは、被分析物eTPC-tのプールされたライブラリー(各eTPC-tは元のベクタープールからのTCR ORFの単一ランダム対が組み込まれ、よって、各eTPC-tは単一ランダムTCRspを発現するが、まとまったプールとしては元のベクタープールに表される複数の種のTCRspをコードする)を採用することである。同じショットガン原理をeTPC-xのプールの作製に適用することができる。これは、候補TCRspの大きなライブラリーを被分析物抗原に対して分析するときに特に有用である。
2つの組込みカップルを含んでなるeTPCSは、被分析物TCR対のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わせた成分2C'を提供することにより、eTPC-tプールを成分2Aから一工程で作製するために用いてもよい。この対は各細胞内で部位Bに組み込まれ、成分B'が作製され、ここで、各eTPCは元のベクタープールからのTCR ORFの単一ランダム対が組み込まれ、よって、各eTPC-tは単一ランダムTCRspを発現するが、まとまったプールとしては元のベクタープールに表される複数の種のTCRspをコードする。得られる細胞プールは集団として複数の被分析物TCRspを発現する細胞集団を含む。第2の組込みカップル1D/1Eは非改変のままである(図27)。
本発明に関して、2つの組込みカップルを含んでなるeTPCSは、eTPC-tプールを事前に得られたe-TPC-xから一工程で作製するために用いてもよい。ここで、部位2Bは2B'に変換され、単一被分析物TCR鎖を含む。eTPC-tは、既に組み込まれた鎖に相補性である単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わされた成分2E'を提供することにより作製される。各eTPC-tは、提供された2E'ライブラリーの単一ランダム化されたTCR鎖ORFが部位2Dに組み込まれ、成分2D'が作製されている。eTPC-tプール中の得られる各細胞は、eTPC-xから出発し、各単一相補性被分析物TCR鎖を選択することにより提供される被分析物TCR鎖を有し、その結果、プール中の各細胞はORFのランダム対をTCRspとして発現する。このアプローチは、相補性TCR鎖対中の固定された鎖に対する種々の単一鎖の効果を分析するときに用いられる(図29)。
eTPC-tのeTPC-xへの変換に好適な遺伝子組込みベクター 成分2Y及び成分2Zは、上記成分2C及び2Eと同じ組込みベクター要件を含むが、TCR鎖ORFをコードせず、好ましくは組込みのマーカーをコードする。
本発明は、遺伝子操作された二部構成細胞デバイスの提供に関する。デバイスの2つの部分eAPCS及びeTPCSは、それぞれ被分析物eAPC及び被分析物eTPCの組み立てに用いられる。次いで、これら被分析物細胞集団はeAPC:eTPC組合せシステムに組み立てられる。該システムからデバイス出力を得てもよい。eAPC:eTPCシステムは、上記(図4~29)のように作製される、1又は2以上の被分析物eAPC集団及び1又は2以上のeTPC集団の選択で構成される(図1)。eAPC:eTPCシステムは、被分析物eAPCと被分析物eTPC集団との物理的接触を可能にする形式で提供される。この接触は、1又は2以上の被分析物抗原と、1又は2以上の被分析物eTPC-tのTCRspとの間の複合体形成を可能とする。ここで、被分析物抗原は、被分析物eTPCにより提示される被分析物TCRspと共に、被分析物eAPCにより提示される、以下:
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM及び/又は
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM
のいずれかである。複合体形成は当該複合体の安定化を導き得、被分析物eAPC及び/又は被分析物eTPC内でのシグナル伝達の誘導が報告され測定され得る。
eAPC:eTPC組合せシステムから得られる被分析物eTPCは、被分析物eAPCにより提示される被分析物抗原に対する、被分析物TCRspを発現する被分析物eTPCのシグナル応答の特徴決定のために用いられ、ここで、このシグナル応答は、二値(binary)又は徐々に変化するもののいずれであってもよく、eTPCに固有なもの(図30)又はeAPCに固有なもの(図31)として測定され得る。
i.1又は2以上の被分析物eTPCを1又は2以上の被分析物eAPCと組み合わせて、被分析物TCRspと被分析物抗原との接触をもたらすことと、以下の少なくとも1つ:
ii.形成される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
iii.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eTPCによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
iv.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eAPCによるシグナル応答を測定すること、及び
v.工程b、c及び/又はdに基いて1又は2以上の被分析物eTPCを選択することであって、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によりなされること
を含み、ここで、i、iii及びvは好ましい構成を含む。
eAPC:eTPC組合せシステムから、入力の被分析物eAPC又は被分析物eAPCのライブラリーからの1又は2以上の被分析物eAPCを選択して、1又は2以上の被分析物eAPCを得る方法であって、発現した被分析物抗原が被分析物eTPCにより提示される1又は2以上の被分析物TCRspと結合する方法は:
i.1又は2以上の被分析物eAPCと1又は2以上の被分析物eTPCとを組み合わせて、被分析物eAPCにより提示される被分析物抗原と1又は2以上の被分析物eTPCの被分析物TCRspとの接触をもたらすこと、及び
ii.形成する場合、1又は2以上の被分析物抗原と1又は2以上の被分析物TCRspとの間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
iii.誘導される場合、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される1又は2以上の被分析物eTPCにおけるシグナル応答を測定すること、及び/又は
iv.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eAPCによるシグナル応答を測定すること、及び
v.工程b、c及び/又はdから1又は2以上の被分析物eAPCを選択することであって、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされること
を含み、ここで、i、iii及びvは好ましい構成を含む。
eAPC:eTPCシステムは、製造された単一被分析物eAPC及び製造されたeTPCのプールライブラリーの入力を含んでいてもよい(図32)。
eAPC:eTPCシステムは、製造された単一被分析物eTPC及び製造されたeAPCのプールライブラリーの入力を含んでいてもよい(図33)。
eATP:eTPC組合せシステム内で、あれば、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導され得る、1若しくは2以上の被分析物eTPC又は1若しくは2以上のeAPCにおけるシグナル応答を測定することは、一次デバイス出力の選択に重要である。ここで、一次デバイス出力は、以下:
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
iv.eTPC-t
の1又は2以上の単一細胞又は細胞プールである。ここで、細胞の選択は、接触した被分析物eAPC又は被分析物eTPC細胞の一方又は両方において報告されるシグナル応答の存否に基いてなされてもよい。
i.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
ii.eTPCが成分2Fを含有する場合及び/又はeAPCが等価な合成レポーターエレメントを含む場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
も含んでよい。
eAPC及び/又はeTPCに固有である誘導された天然型又は合成のシグナル応答は、以下:
i.分泌された生体分子
ii.分泌された化学物質
iii.細胞内生体分子
iv.細胞内化学物質
v.表面発現された生体分子
vi.被分析物eTPCの被分析物eAPCに対する細胞毒性作用
vii.シグナル応答が被分析物eAPCにおいて誘導され、a~eのいずれかの増減を検出することにより決定されるような、被分析物eTPCの被分析物eAPCに対するパラクリン作用
viii.被分析物eTPCの増幅
ix.被分析物eTPCと被分析物eAPCとの間の免疫学的シナプス
の1又は2以上の増減を検出することにより測定され、ここで、前記検出されるシグナル応答は、eAPC:eTPC組合せシステム及び/又は並行して組み立てられた組合せシステムの組立ての前の、被分析物eAPC及び/又は被分析物eTPCに固有の非誘導シグナル応答状態と比較され、ここで、被分析物eAPC及び/又は被分析物eTPCは、用いるeAPC:eTPC組合せシステム内でシグナル応答を誘導しないことが知られている対照の被分析物抗原及び/又は被分析物TCR種を提示し得る。
本発明は、遺伝子操作された二部構成細胞デバイスの提供に関する。デバイスの2つの部分eAPCS及びeTPCSは、それぞれ被分析物eAPC及び被分析物eTPCの組み立てに用いられる。次いで、これら被分析物細胞集団はeAPC:eTPC組合せシステムに組み立てられる。該システムからデバイス出力を得てもよい。eAPC:eTPCシステムは、上記(図4~29)のように作製される、1又は2以上の被分析物eAPC集団及び1又は2以上のeTPC集団の選択で構成される(図1)。eAPC:eTPCシステムは、被分析物eAPCと被分析物eTPC集団との物理的接触を可能にする形式で提供される。この接触は、1又は2以上の被分析物抗原と、1又は2以上の被分析物eTPC-tのTCRspとの間の複合体形成を可能とする。ここで、被分析物抗原は、被分析物eTPCにより提示される被分析物TCRspと共に、被分析物eAPCにより提示される、以下:
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM及び/又は
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM
のいずれかである。複合体形成は当該複合体の安定化を導き得、被分析物eAPC及び/又は被分析物eTPC内でのシグナル伝達の誘導が報告され測定され得る。
デバイスの一次出力は、選択された細胞集団であり、これは、eAPC:eTPCシステムに提供された相互関係性細胞により提示される被分析物に対して応答したものであってもしなかったものであってもよい。すなわち、この一次出力は、eAPC:eTPC組合せシステム内で報告される応答の存否に基いて選択された単一細胞又は細胞プールとして表し得る(図1工程v)。被分析物eAPC内の応答は、接触するeTPCにより提示される同族TCRの結合によってのみ誘発される。被分析物eTPC内の応答は、接触するeTPCにより提示される同族抗原の結合によってのみ誘発される(図1 工程iv)。
本発明に関して、デバイスの一次eAPC出力は、選択された細胞であり、選択は、報告されるシグナル応答の存否に基いてなされ、これら細胞は以下
i.eAPC-p
ii.eAPC-a
iii.eAPC-pa
の1又は2以上を含み、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞プール又は異なるアイデンティティの細胞プールを含んでよい(図1 工程v)。
デバイスの一次eTPC出力は選択された細胞であり、選択は、報告されるシグナル応答の存否に基いてなされ、これら細胞はeTPC-tを含み、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞プール又は異なるアイデンティティの細胞プールを含んでよい(図1 工程v)。
eAPC及び/又はeTPC型の一次出力は、eAPC:eTPC組合せシステムが二元培養性質のものである場合(例えば図30及び図31)、所望の被分析物eAPC及び/又は被分析物eTPC集団を二部構成システムから選択することにより達成され得る。
eAPC及び/又はeTPC型の一次出力は、eAPC:eTPC組合せシステムが固定されたeAPC及びプールされたライブラリー被分析物eTPCの性質のものである場合(例えば図32)又はeAPC:eTPC組合せシステムが固定されたeTPC及びプールされたライブラリー被分析物eAPCの性質のものである場合(例えば図33)、所望の被分析物eAPC及び/又は被分析物eTPC集団を組合せ培養系から選択することにより達成され得る。
一次出力たるeAPC及び/又はeTPC細胞は、単一細胞選別により単一細胞を得てもよく、及び/又は細胞プール選別により細胞プールを得てもよい。
一次出力たるeAPC及び/又はeTPC細胞は、単一細胞選別により単一細胞を得てもよく、その後、単一細胞を増殖させて、選択されたeAPC又はeTPC細胞のモノクローナルプールを得てもよい。
一次出力たるeAPC及び/又はeTPC細胞は、細胞プール選別により細胞プールを得てもよく、その後、細胞プールを増殖させて、選択されたeAPC及び/又はeTPC細胞のプールを得てもよい。
測定されるシグナル応答に基づいて選択された被分析物eAPC及び/又はeTPC細胞である一次出力を取得する上記の方法に続いて、2部構成細胞デバイスの終端出力を、選択されたeAPCa及び/又はeTPC一次出力の更なる加工処理により得てもよい。
二部構成細胞デバイスからの終端出力は、被分析物eAPC(i~v)又は被分析物eTPC(vi)により提示され、eAPC:eTPC組合せシステムからの選択により二部構成デバイスからの一次出力として得られる
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM及び/又は
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM及び/又は
vi.TCRsp
のアイデンティティである。
eAPCは、選別された及び/又は拡大されたeAPC-p、eAPC-a又はeAPC-pa細胞の成分1B'及び/又は成分1D'について遺伝子配列を得て:
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM
のアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、得られるアイデンティティは、二部構成細胞デバイスの終端出力を表す。
eAPCは、選別された及び/又は拡大されたeAPC-p、eAPC-a又はeAPC-pa細胞のゲノムについて遺伝子配列を得て:
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM
のアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、得られるアイデンティティは、二部構成細胞デバイスの終端出力を表す。
eTPCは、選別された及び/又は拡大されたeTPC-t細胞のゲノムについて遺伝子配列を得て、TCRspのアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、TCRspの得られるアイデンティティは二部構成細胞デバイスの終端出力を表す。
本発明に関して、配列決定工程の前に
i.ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
ii.成分1B'及び/又は1D'及び/又は2B'及び/又は2D'のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
iii.成分1B'及び/又は1D'及び/又は2B'及び/又は2D'のDNA及び/又はRNA転写産物をPCR及び/又はRT-PCRによりにより増幅すること
を行ってよい。
配列決定工程は、二部構成デバイスの一次出力として得られるeAPC又はeTPC、又はそれらのプールに対して破壊的であってよい。
遺伝子によりコードされる被分析物分子の上記場面において、二部構成デバイスの終端出力は、成分1B'及び/又は1D'及び/又は2B'及び/又は2D'並びに/又は細胞ゲノムから配列情報を得ることにより得てよい。しかし、幾つかの実施形態では、抗原情報は、遺伝子によりコードされない。翻訳後修飾される抗原、非遺伝子的手段によりeAPC:eTPC組合せシステムに提供される抗原、被分析物eAPCプロテオソーム又は代謝物の誘導又は改変された状態から現れる抗原、eAPC:eTPCシステムに固有のCMは、遺伝子手段により合理的に同定されない場合がある。
本発明に関して、aAM積荷又はCM積荷を選択し同定する方法であって、積荷が、二部構成デバイスの一次出力として選択されて得られるeAPCのaAPXに積載される代謝物及び/又はペプチドである方法は、
i.aAPX:aAM又はaAPX:CM又は積荷aM又は積荷CMを単離することと、
ii.積載された積荷を同定することと
を含み、ここで、同定される積載された積荷は、二部構成デバイスの終端出力である。
単離aAM及び/若しくはCMを直接に又は単離aAPX:aAM若しくはaAPX:CM複合体から同定する方法は:
i.質量分析
ii.ペプチド配列決定分析
を含むことができ、ここで、含まれるaAM及び/又はCMのアイデンティティは、二部構成デバイスの終端出力である。
図面の説明
本発明を以下の非限定的図面において説明する。
本願で用いた全ての細胞株は、ARH又はHEK293のいずれかのバックグランドである。これらは、番号を後に付した「ACL」で表される。本願で用いた細胞株の要約を表1に示す。
トランスフェクション/エレクトロポレーションの1日前、細胞を1.2~1.4×106細胞/60mmディッシュの密度で90% DMEM+2mML-グルタミン+10% HI-FBS(Life Technologies)中に播種した。翌日、65%コンフルーエントの細胞を、総量5μgのDNA及びjetPEI(登録商標)(Polyplusトランスフェクション試薬、Life Technologies)(N/P比6)でトランスフェクトした。培地を交換した後、トランスフェクションを行った。DNA及びjetPEI(登録商標)のストック溶液を、それぞれ滅菌1M NaCl及び150mM NaClに希釈した。各溶液の最終容量を総混合容量の50%とした。次いで、PEI溶液を希釈したDNAに加え、混合物を室温にて15分間インキュベートした。最後に、DNA/PEI混合物を60mmディッシュに、細胞フィルムを破壊しないように注意深く加えた。細胞を(37℃,5% CO2,95%相対湿度で)48時間インキュベートした後、DNA送達マーカー発現分析を行った。培地を交換した後、トランスフェクションを行った。
単一細胞選別又はポリクローン選別を、BDInflux装置を用いる標準的な細胞選別法により達成した。簡潔には、ACL細胞を、TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS 1×(Life Technologies)中に再懸濁した後、20% HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含有するDMEM 1×培地中で細胞選別を行った。表2に、本願でFACSに用いた抗体及びマルチマーを要約する。
eAPC細胞を、Flpをコードするベクター、送達を追跡するためのマーカーをコードするDNA(GFPをコードするベクター)及びHLA-A*02:01を含有するベクターでエレクトロポレートした。HLA-A*02:01配列は、3'末端にリンカー及び3×Myc-タグもコードしていた。用いたエレクトロポレーション条件は、258V、12.5ms、2パルス、1パルス間隔であった。各組込みベクターとFlp-ベクターとの比は1:3であった。2日後のGFP選別についてのゲートを設定するために、GFP-ベクターのみをエレクトロポレートした細胞及びエレクトロポレートしていない細胞をそれぞれコントロールとして用いた。翌日(エレクトロポレーションの2日後)に、細胞を分析し、GFP発現に基いて選別した。BD Influx 細胞ソーターを用いて細胞を選別した。
エレクトロポレーションの3日後、GFP発現に基づく選別を行い、エレクトロポレートされた細胞を富化した。エレクトロポレーションの7~8日後、細胞を採集し、HLA-ABC発現に関して表面を染色した。BFP+ve RFP-ve HLA+ve細胞を単一細胞選別してモノクローナルとした。
細胞を遺伝子型決定するため、100ngのDNAをテンプレートとして用いて、PCR反応を行い、組込みが予想された組込み部位で生じているかどうかを検証した。組込みカセットを標的するフォワードプライマー(Pan_HLA_GT_F1)及び組込み部位の直ぐ外側を標的するリバースプライマー(SV40pA_GT_R1)を用い、PCR産物を1%アガロースゲルで泳動した。
eAPC-p細胞を、Flpをコードするベクター、送達を追跡するマーカーをコードするDNA(GFPをコードするベクター)及びHCMV pp28、pp52又はpp65 aAM-ORFを含有するベクターでエレクトロポレートした。HCMV-ORF配列は、3'末端にリンカー及び3×Myc-タグもまたコードしていた。用いたエレクトロポレーション条件は、258V、12.5ms、2パルス、1パルス間隔であった。
各組込みベクターとFlp-ベクターとの比は1:3であった。2日後のGFP選別についてのゲートを設定するために、GFP-ベクターのみをエレクトロポレートした細胞及びエレクトロポレートしていない細胞をそれぞれコントロールとして用いた。翌日(エレクトロポレーションの2日後)に、細胞を分析し、GFP発現に基いて選別した。BD Influx細胞ソーターを用いて細胞を選別した。
eAPC-p細胞を、Flpをコードするベクター、送達を追跡するマーカーをコードするDNA(GFPをコードするベクター)及びHCMV pp28、pp52又はpp65 aAM-ORFを含有するベクターでエレクトロポレートした。HCMV-ORF配列は、3'末端でリンカー及び3×Myc-タグもまたコードしていた。用いたエレクトロポレーション条件は、258V、12.5ms、2パルス、1パルス間隔であった。ショットガン組込みのため、HCMV-ORFを含有するベクターを比1:1:1でプールし、混合物をeAPC-p細胞にエレクトロポレートした。得られるeAPC-pa細胞はポリクローナルであった。個々のモノクローン細胞を選別し、遺伝的に特徴付けて、ポリクローンが3つ全てのHCMV-ORFを含有する細胞で構成されることを証明した。
成分DへのHCMV ORFのRMCE-組込みを評価するPCR反応
HCMV ORFの組込みを評価するために用いるプライマーを、リンカー(フォワードプライマー10.D.1)及びEF1aplhaプロモーター(リバースプライマー15.H.4)にアニールさせた。予想サイズは、pp28については0.8kb、pp52については1.5kb、pp65については1.9kbであった。PCR産物は、1×TAE緩衝液中、1%アガロースゲルで、PowerPac Basic(Bio-Rad)を用いて泳動させ、10,000希釈のsybersafeで染色し、Fusion SL(Vilber Lourmat)を用いて分析した。
RMCE組込みのために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)0.6μg、2μgの成分C/Y、2μgの成分E/Z、DNA送達を追跡するためのマーカーをコードするDNA0.4μgでトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、GFP又はRFPポジティブのいずれかのDNA送達マーカーについてポジティブな細胞を、FACSにより選別した。トランスフェクションの4~10日後に、成分D及びB選択マーカーによりコードされる蛍光タンパク質シグナルの減少を示す個々の細胞を、FACSにより選別した。ACL-987の作製については例外で、GFPポジティブを示す個々の細胞をFACSにより選別した。
一過性発現のために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)、JG9-TCR-αバリアント(VP.7751.RC1.A1~VP.7751.RC1.H8)、JG9-TCR-βWT鎖(V3.C.5)及びDNAベクタービヒクル(V1.C.2)でトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、全ての細胞をHLA-A*02:01-NLVPテトラマー及び抗CD3抗体で染色した。RSUは、CD3ネガティブ集団に対する、CD3ポジティブ集団についてのHLA-A*02:01-NLVPテトラマーシグナルの平均蛍光強度(MFI)の比として算出し、各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標であった。
細胞を、HLA-マルチマー反応剤で氷上にて10分間染色した後、CD3及び/又はTCRab抗体で染色した。BDInflux装置による特異的細胞蛍光特性の検出を表6に示す。
モノクローナル作製のための単一細胞の選別のため、興味対象の表現型を表示する細胞を、200μlの増殖培地を含有する96ウェルプレートに配置した。サンプルあたり1~2のプレートを選別した。ポリクローナル細胞選別を、培地を含有するFACSチューブ中、細胞ソーターInfluxTM(BD Biosciences)において二方式選別設定を用いて行った。
分子特徴決定のために、JG9-TCR-αバリアントの単一細胞を選別し、5μlのヌクレアーゼフリーの水を予め充填したPCRプレートに配置した。その後の加工処理まで、標本を急速凍結した(snap-frozen)。
DNAは、QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いて5×106細胞から抽出した。DNAは、1×TE(10mM Tris pH8.0及び0.1mM EDTA)中に貯蔵した。
TCR-αの組込みを評価するために用いるプライマーを、TRACセグメント(フォワードプライマー1.F.7)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネーター(リバースプライマー15.H.2)にアニールさせた。予測サイズ566bp。TCR-βの組込みを評価するために用いるプライマーを、TRBCセグメント(フォワードプライマー1.F.9)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネーター(リバースプライマー15.H.2)にアニールさせた。予測サイズ610bp。PCR産物は、1×TAE緩衝液中、1%アガロースゲルで、PowerPac Basic(Bio-Rad)を用いて泳動させ、10,000希釈のsybersafeで染色し、Fusion SL(Vilber Lourmat)を用いて分析した。
選択したACL-851モノクローンのDNAを、興味対象のTCR_ORF Cセグメント(TRAC)を標的する特異的プライマー及びプローブを用いることにより分析した。TRA-ORFコピー数を評価するために用いるプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.7、リバースプライマー1.F.8及びプローブ1.G.1)をTRACセグメントにアニールさせた。TRB-ORFコピー数を評価するために用いるプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.9、リバースプライマー1.F.10及びプローブ1.G.2)をTRB-Cセグメントにアニールさせた。
全ての場合で、参照遺伝子(TRAC)を同時にスクリーニングして、プライマー10.A.9及び10.A.10並びにHEXと接合した蛍光プローブ10.B.6を用いて染色体のコピー数を決定した。組込みコピー数から、参照遺伝子(TRAC)について、HEK293細胞は参照遺伝子(TRAC)について三倍体であると考えられた。デジタルドロップPCRの前に、DNAをMfeI(NEB)で消化し、直列組込みを分離した。反応セットアップ及びサイクル条件は、QX200TM Droplet Reader及びDroplet Generator及びC1000 TouchTM deep-well Thermal cycler(Bio-Rad)を用いるddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-Rad)のプロトコルに従った。QuantaSoftTMソフトウェアを用いてデータを取得し、FAMの検出にはCh1を用い、HEXについてはCh2を用いた。
FACS選別した個々のeTPC-t細胞を、TRA及びTRBの各々についてV領域特異的プライマーコレクションを伴う二工程増幅プロセス、続いて、配列分析のためのTRA及びTRBアプリコンアプリコンを生じるペア型ネステッドPCR反応に供した。この手順は、以前に記載されている(Hanら、Nat Biotechnol. 2014 32(7): 684-692)。以下の材料を、記載する手順で用いた:
eTPC-t及びAPC細胞を、RPMI+10%熱不活化胎仔ウシ血清(完全培地)中で、0.2×106~1.5×106細胞/mlの間、37℃、90%相対湿度及び5%CO2にてルーチーンに培養した。ペプチドNLVPMVATVは、Genescriptにより合成され、凍結乾燥された状態で受領した。ペプチドの一次ストックを10%DMSOに懸濁し、-80℃にて貯蔵した。作業ストックは、50μMにて完全培地(50×濃縮)に用時調製した。以下の、HLA-A*02:01(ACL-900)若しくはHLA-B*07:02(ACL-906)を提示する以下のeAPC-p、又は、aAPX及び外因性aAM、HLA-A*02:01+HCMVpp52(ACL-1044)若しくはHLA-A*02:01+HCMVpp65(ACL-1046)若しくはHLA-B*07:02+HCMVpp52(ACL-1045)若しくはHLA-B*07:02+HCMVpp65(ACL-1048)を有するeAPC-pa、又は親eAPC(ACL-128)を用いた。2つの異なるeTPC-t細胞株を用いた:第1のeTPC-t、ACL-1277(成分A)は、2つの独特なゲノム受容部位を有するように遺伝子操作されており、天然型CD3発現を利用し、ゲノム二成分合成応答エレメント(成分F、RFPレポーター)を有した(実施例14を参照)。第2のeTPC-t、ACL-1150(成分A)は、2つの独特なゲノム受容部位を有するように遺伝子操作されており、天然型CD3発現を利用し、ゲノム一成分合成応答エレメント(成分F、RFPレポーター)を有した(実施例15を参照)。両eTPC-tは、成分2B'及び2E'に、HLA-ペプチド複合体(HLA)、HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCR対をコードするTCR鎖ORFが積載されていた。
eAPC細胞の活発に増殖している培養物(0.4~1.0×106細胞/ml)を懸濁し、サンプルを採取し、計数して細胞濃度を決定した。その後、1百万細胞を採集し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS、Gibco)で1回洗浄した後、細胞濃度1~2×106細胞/mlにて1μMのペプチドと又はペプチドなしで完全培地に懸濁した。細胞を2時間、標準培養条件で、24ウェル培養プレートにてインキュベートした。2時間後、細胞を採集し、遠心分離(400rcf、3分間)によりペレット化した後、DPBSで3×10mlで洗浄した。細胞を、その後、完全培地中に0.2×106細胞/mlにて懸濁した。
eTPC-t細胞の活発に増殖している培養物(0.4~1.0×106細胞/ml)を懸濁し、サンプルを採取し、計数して細胞濃度を決定した。細胞を採集し、DPBSで1回洗浄し、次いで、完全培地中に0.4×106細胞/ml(内因性アッセイについて)又は0.6×106細胞/ml(外因性アッセイについて)の濃度にて懸濁した。
96ウェル丸底プレートの各ウェルに、50μlの完全培地、50μlのeAPC、続いて50μlのeTPC-tを加えた。これは、1:3の比の約10,000のeAPC及び30,000のeTPC-tであり、約0.27×106細胞/mlの全細胞濃度であった。次いで、細胞混合物を標準培養条件にて約24時間インキュベートした。
96ウェル丸底プレートの各ウェルに、50μlの完全培地、50μlのeAPC、続いて50μlのeTPC-tを加えた。これは、1:2の比の約10,000のeAPC及び20,000のeTPC-tであり、約0.2×106細胞/mlの全細胞濃度であった。次いで、細胞混合物を標準培養条件にて約48時間インキュベートした。
24時間又は48時間のインキュベーション後、細胞を採集し、0.75mlのV底Micronicチューブに移植し、500μlのDPBSで1回洗浄し、その後、以下のように死細胞マーカー(DCM-APC-H7)で染色した。各ウェルに、25μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、15~20分間インキュベートした。染色溶液は、100μl染色溶液あたり0.5μlのDCM-APC-H7で構成されていた。インキュベーション後、細胞を、500μlのDPBS+2%FCS(洗浄緩衝液)で2回洗浄した。次いで、細胞をeTPC-tに独特な表面マーカーについて染色した。各ウェルに、30μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、30~45分間インキュベートした。染色溶液は、100μl染色溶液あたり2.5μlの抗myc-AF647で構成された(クローン9E10、Santa Cruz Biotech)。インキュベーション後、細胞を、500μlの洗浄緩衝液で2回洗浄し、次いで、200μlの洗浄緩衝液に懸濁し、次いで、FACSによりLSR-Fortessa(BD Biosciences)で分析した。
実施例1:標的化変異誘発によるAPX遺伝子ファミリーの欠失
本実施例では、遺伝子操作された抗原提示細胞(eAPC)の第1の形質を作製するために、抗原提示複合体(APX)のファミリーをコードする遺伝子の標的化変異誘発をどのように達成したかを記載する。前記形質はAPXファミリーの少なくとも1つのメンバーの表面発現の欠失である。
本実施例では、標的付けられたAPXは、HEK293細胞株における主要HLAクラスIファミリーの3つのメンバーHLA-A、HLA-B及びHLA-Cを含んでなっていた。HEK293細胞は、HLA-ABCの内因性表面発現を示すヒト胚性腎臓細胞に由来するものであった。細胞遺伝学的分析は、この細胞株が三倍体に近い核型を有し、したがってHEK293細胞が各HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子の3つのアレレをコードしていることを証明した。
HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子の標的化変異誘発は遺伝子操作されたCRISPR/Cas9システムを用いて行われ、該システムでは、Cas9ヌクレアーゼ活性は、合成ガイドRNA(gRNA)によりHLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子座に標的付けられた。4~5の独特なgRNAが、各HLA遺伝子遺伝子座について、保存されたヌクレオチド配列を標的するように設計され、標的付けられた部位は遺伝子コーディング配列の開始点に向けられた。なぜならば、このことがヌルアレレを生じさせる可能性がより高いからであった。標的付けられた遺伝子座で変異を誘導するgRNAの効率が決定され、最も効率的なgRNAが、HLA-A、HLA-B及びHLA-Cヌル(HLA-ABCnull)HEK293細胞株を生じさせるために選択された。
結論として、遺伝子改変されたHEK293細胞株(ACL-414、ACL-415及びACL-416を含む)は、HLA-ABCの表面発現を欠くことが証明され、したがって遺伝子操作された抗原提示細胞(eAPC)の第1の形質を有していた。
本実施例では、成分1BをHLA-ABCnullモノクローン株ACL-414に安定に組み込んでeAPCの第2の形質を生じさせる方法を記載する。前記第2の形質は、少なくとも1つのORFの組込みのための少なくとも1つのゲノム受容部位を含み、ここで、ゲノム受容部位はリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物であった。
本実施例では、ゲノム組込み部位(成分1B)は選択された遺伝子エレメントで構成される。2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3(これらは、選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟み込む)。FRT部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F3部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。異種特異的リコンビナーゼ部位の外側に非コーディングシス調節エレメントが位置することの利点は、それらがマッチした遺伝子ドナーベクター(成分1C)に必要でないことである。したがって、遺伝子ドナーベクターの細胞送達後、コードされるORFの一過性発現は観察されない。このことから、奏功するRMCEの選択が、遺伝子ドナーベクターからのORFの細胞発現がおそらく成分1Bへの正しい組込み後にのみ生じるような、より信頼できるものとなった。なぜならば、適切なシス調節エレメントが含まれているからである(実施例6を参照)。
成分1Bの安定な組込みは、ゲノムセーフハーバー遺伝子座AAVS1での相同性指向組換え(HDR)のプロセスにより達成された。ACL-414細胞株を、AAVS1遺伝子座を標的する最適なgRNAをコードするプラスミド、Cas9-P2A-GFPをコードするプラスミド及びAAVS1左右相同性アームが隣接する成分1B遺伝子エレメントをコードするプラスミドでトランスフェクトした。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、トランスフェクションの2日後にGFP蛍光に基いてFAC選別した(図41a)。GFP選別された細胞を7日間以上更に増殖させて、HDRが生じ、選択マーカーBFPの一過性発現を喪失するに十分な時間を許容させた。この増殖期間の後、細胞をFACS装置で分析し、個々のBFPポジティブ細胞を選別し、増殖させてモノクローン集団とした(図41c)。
結論として、遺伝子改変されたACL-469及びACL-470細胞株はHLA-ABCnullであり、単一コピーの、RMCE用に設計された合成ゲノム受容部位を含んでおり、したがって単一合成組込み受容部位を有するeAPCの作製が証明された。
本実施例では、成分1B及び成分1DをHLA-ABCnullモノクローン株ACL-414に安定に組み込んでeAPCの第2の形質を生じさせる方法を記載する。前記第2の形質は、少なくとも1つのORFの組込みのための2つのゲノム受容部位を含み、ここで、ゲノム受容部位はリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物であった。
本実施例は、第2のゲノム受容部位(成分1D)を追加したことを除き、実施例2に記載されたものと同じ方法及び成分を使用する。成分1D遺伝子エレメントは、成分1Bとは異なる2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15で構成された。これら部位は、選択マーカー赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟むものであった。F14部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。実施例2のように、成分1D遺伝子エレメントは、各々がAAVS1ゲノム遺伝子座に相同な>500bpの配列で構成されるAAVS1左右相同性アームに挟まれていた。
成分1B及び成分1Dを、成分1Dエレメントをコードするプラスミドのトランスフェクションミックスへの追加を除き、実施例2に記載したようにAAVS1に組み込んだ。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、トランスフェクションの2日後にGFP蛍光に基いてFAC選別した(図41b)。GFP選別された細胞を7日間以上更に増殖させ、その後、細胞をFACS装置で分析し、個々のBFP及びRFPポジティブ細胞を選別し、増殖させて、モノクローン集団とした(図41d)。
結論として、遺伝子改変されたACL-472細胞株はHLA-ABCnullであり、単一コピーの、RMCE用に設計された合成ゲノム受容部位 成分1B及び成分1Dを含んでおり、2つの独特な合成組込み受容部位を有するeAPCの作製が証明された。
本実施例では、ゲノム受容部位(成分1B)が天然型ゲノム部位であり、遺伝子ドナーベクター(成分1C')が1つの被分析物抗原提示複合体(aAPX)をコードする単一ORFを含んでなるeAPC-pを、1つの組込みカップルを用いる一工程で構築する方法を記載する。
本実施例では、eAPCは遺伝子改変されたARH-77細胞株(ACL-128と呼ぶ)であり、ここでは、2つのファミリーのAPX 主要HLAクラスIファミリー及びHLAクラスIIを変異させた。基本の細胞株ARH-77は、強いHLA-A、B、C及びHLA-DR、DP、DQ細胞表面発現を示す、形質細胞白血病に由来するBリンパ芽球である。細胞遺伝子分析により、基本のARH-77細胞株は、二倍体に近い核型を有するが、また、HLA遺伝子座をコードする領域である染色体6p21の欠失を示すことが証明された。ARH-77遺伝子座のDNA配列決定により、ARH-77はHLA-A、HLA-B及びHLA-C並びにHLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DPA及びHLA-DPB遺伝子ファミリーの単一アレレのみをコードすることが確証された。
HLA-ABCnull及びHLA-DR,DP,DQnull細胞株ACL-128を、実施例1に記載の方法を用い、HLA-A、HLA-B及びHLA-C並びにHLA-DRA、HLA-DRB、HLA-DQA、HLA-DQB、HLA-DPA及びHLA-DPB遺伝子ファミリーを標的するgRNAでのCRISPR/cas9標的化変異誘発により作製した。汎-抗HLA-ABC又は汎-抗HLA-DR,DP,DQでの表面標識により、ACL-128は両APXファミリーの表面発現を欠くことが確証された(それぞれ、図44b及び45並びに図47b)。
eAPC-pを構築する方法は、成分1B'を作製するための成分1Bへの成分1C'のHDR誘導組込みによるものであった。細胞株ACL-128を、AAVS1遺伝子座を標的する最適なgRNAをコードするプラスミド、Cas9-P2A-GFP及び成分1C'でエレクトロポレートした。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、GFP蛍光に基いて、エレクトロポレーションの2日後にFAC選別した(図44a)。GFP選別された細胞を、7日間以上更に増殖させ、HDRが生じ、aAPXの一過性発現を喪失するに十分な時間を許容させた。この増殖期間の後、細胞を汎-HLA-ABC抗体で染色し、被分析物HLAの表面での発現を獲得した細胞を同定した(図44b)。汎-HLA-ABC抗体染色の存在により、成分1C'にコードされる被分析物HLA ORFがゲノムに組み込まれたことが示された。個々のHLA-ABCポジティブ染色細胞を選別し、増殖させてeAPC-pモノクローン集団とした。
結論として、それぞれaAPX HLA-A*24:02又はHLA-B*-07:02 ORFのコピーをゲノム受容部位 成分1B'内に含む遺伝子改変されたACL-321及びACL-331細胞株の作製により、前記被分析物aAPXのみが、細胞表面に発現される主要HLAクラスIメンバーであるという結果がもたらされた。したがって、このことから、多成分システムを用いての、2つの規定されたeAPC-p細胞株の作製が証明された。
本実施例では、eAPC-pを1つの組込みカップルを用いる一工程で構築する方法を記載する。ここでは、ゲノム受容部位 成分1Bが天然型ゲノム部位であり、遺伝子ドナーベクター(成分1C')は2つのaAPX鎖をコードする単一ORFを含んでなるものであった。
本実施例は、eAPC、ACL-128及び成分1Bを利用した。いずれも実施例4に規定されるものであった。しかし、成分1C'は、HLA-DRB1*01:01アレレにウイルス性自己切断ペプチドエレメントにより連結されたHLA-DRA*01:01アレレ、又はHLA-DPB1*04:01アレレにウイルス性自己切断ペプチドエレメントにより連結されたHLA-DPA1*01:03アレレをコードする単一ORFを含んでいた(それぞれ、成分1C'HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01及び成分1C'HLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01と呼ぶ)。ウイルス性自己切断ペプチドエレメントは、転写されたとき、合成されたペプチドの自己切断をもたらし、各HLA鎖を規定する2つのポリペプチドを生じるペプチド配列をコードするものであった。
実施例4に記載のとおり、個々のモノクローン株を、維持された被分析物HLA表面発現及びゲノム受容部位への被分析物ORFの組込み(成分1B'の作製)に基いて、eAPC-pとして選択した。細胞株ACL-341及びACL-350は、HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01又はHLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01の被分析物HLA表面発現が維持されている代表的なモノクローンであった(図48)。
結論として、それぞれaAPX HLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*01:01又はHLA-DPA1*01:03/HLA-DPB1*04:01 ORFのコピーをゲノム受容部位 成分1B'内に含む遺伝子改変されたACL-341及びACL-350細胞株の作製により、前記被分析物aAPXのみが、細胞表面に発現される主要HLAクラスIIメンバーであるという結果がもたらされた。したがって、このことから、多成分システムを用いての、2つの規定されたeAPC-p細胞株の作製が証明された。
本実施例では、eAPC-pを1つの組込みカップルを用いる一工程で構築する方法を記載する。ここでは、ゲノム受容部位 成分1BがRMCEゲノム部位用に設計された合成構築物であり、遺伝子ドナーベクター(成分1C')は、1つのaAPXをコードする単一ORFを含むものであった。
本実施例では、ゲノム組込み部位(成分1B)は、選択された遺伝子エレメントで構成された。2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3(これらは、選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟み込む)。FRT部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F3部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。成分1Bの遺伝子エレメントを、実施例2に記載のものと同じプラスミドを用いてエレクトロポレーションにより、細胞株ACL-128に組み込んだ。実施例2に記載のように、個々のモノクローン株を、維持されたBFP発現に基いて選択し、所望のAAVS1ゲノム位置への成分1Bの単一組込みを含んでいることを遺伝子的に特徴付けた(図49a)。得られるeAPC細胞株ACL-385は、HLA-ABCnull及びHLA-DR,DP,DQnullであり、RMCE用に設計された合成ゲノム受容部位 成分1Bの単一コピーを含んでいた。
eAPC-pを、Tyr-リコンビナーゼFlpをコードするプラスミドと成分1C'FRT:HLA-A*02:01:F3とを用いる細胞株ACL-385のエレクトロポレーションによるRMCEにより作製した。。エレクトロポレーションの4~10日後、HLAI表面発現についてポジティブであり、成分1B選択マーカーによりコードされる蛍光タンパク質マーカーBFPについてネガティブ/低減である個々の細胞を選別した。より成長した個々のモノクローン株を、維持されたHLAIアレレ発現及び(予想されたRMCEが生じたことを示す)BFP蛍光の喪失に基いて選択した。このモノクローンを同定するため、表現型及び遺伝子検査の両方を行った。先ず、全てのモノクローン細胞株を、細胞表面HLA-ABC発現及びBFP蛍光の欠如についてスクリーニングした(図49)。ゲノムDNAを、当該細胞株、例えば、ACL-421及びACL-422から抽出し、成分1B'を生じる、成分1Bへの成分1C'の組込みを、成分1B'に特異的なPCR産物の検出により確証した(図50)。
結論として、それぞれaAPX HLA-A*02:01 ORFのコピーを合成ゲノム受容部位 成分1B'内に含む遺伝子改変されたACL-421及びACL-422細胞株の作製により、前記被分析物aAPXのみが、細胞表面に発現される主要HLAクラスIメンバーであるという結果がもたらされた。したがって、このことから、多成分システムを用いての、2つの規定されたeAPC-p細胞株の作製が証明された。
本実施例では、eAPC-paを二工程で構築する方法を記載する。工程1 ゲノム受容部位
成分1Bは天然型ゲノム部位であり、遺伝子ドナーベクター(成分1C')は1つのaAPXをコードする単一ORFを含んでなるものであった。工程2 ゲノム受容部位(成分1D)は第2の天然型ゲノム部位であり、遺伝子ドナーベクター 成分1E'は1つの被分析物抗原分子(aAM)をコードする単一ORFを含むものであった。
本実施例では、eAPCがACL-128であり、ゲノム受容部位 成分1Bが変異HLA-Aアレレゲノム部位(HLA-Anullと呼ぶ)であり、標的付けられた組込みがHDRにより達成される工程1を行った。成分1Cが、各々がHLA-Anullゲノム遺伝子座に相同な>500bpの配列で構成されるHLA-Anull左右相同性アームをコードすることにより、遺伝子ドナーベクター(成分1C)を成分1Bにマッチさせた。HLA-Anull左右相同性アーム間で、プラスミドはCMVプロモーター及びSV40ターミネーターをコードしていた。興味対象のaAPXをプロモーターとターミネーターとの間にクローニングして、成分1C'を作製した。本実施例では、成分1C'は、1つのaAPX HLA-A*02:01又はHLA-B*-35:01をコードする単一ORFを含んでなっていた(それぞれ、成分1C'HLA-A*02:01、成分1C'HLA-B*-35:01と呼ぶ)。
成分1Bへの成分1C'の組込み及びモノクローンeAPC-p細胞株の選択は、成分1Bへの成分1C'のHDR組込みを促進するためにHLA-Anullゲノム遺伝子座を標的するgRNAを用いたことを除き、実施例4のとおりであった。モノクローンeAPC-p ACL-191及びACL-286は、細胞表面に、それぞれHLA-A*02:01又はHLA-B*-35:01を発現した(図51a)。
成分1Dへの成分1E'の組込みは実施例4のとおりであった。個々のモノクローン株ACL-391及びACL-395を、維持された選択マーカーGFP発現に基いて、eAPC-paとして選択した(図51b)。
結論として、それぞれaAPX HLA-A*02:01又はHLA-B*-35:01 ORFのコピーをゲノム受容部位 成分1B'内に含み、aAM ORF pp65をゲノム受容部位 成分1D'内に含む遺伝子改変されたACL-391及びACL-395細胞株が作製された。これら遺伝子改変により、前記aAPXのみが、細胞表面に発現される主要HLAクラスIメンバーであり、該細胞表面には前記aAMもまた発現されるという結果がもたらされた。したがって、このことから、多成分システムを用いての、2つの規定されたeAPC-pa細胞株の作製が証明された。
本実施例では、被分析物抗原提示複合体(aAPX)をコードする単一HLAI ORFを組み込むための、単一組込みカップル事象による一工程でのeAPC-pへのeAPCの変換を記載する。ここでは、eAPCは、RMCEベースのゲノム組込み用に設計された2つの合成ゲノム受容部位 成分1B及び成分1Dを含む。作製されたeAPC-pは、HLAI ORFにより占められた1つのゲノム受容部位(成分1B')を有する一方、残る成分1Dは追加の組込みカップル事象に利用可能である。
本実施例は、成分1B及び1Dを含む、実施例3で作製されたeAPC(ACL-402)を利用した。ここで、成分1Bは、選択マーカー赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟む2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15を含む。F14部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。成分1Dは、選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟む2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3を含む。FRT部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。
本実施例は、異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15を含み、よって成分1Bにマッチする成分1C遺伝子ドナーベクターを使用する。2つの独立成分1C'を成分1Cから作製した。ここで、1つのベクター(V4.H.5)は、F14/F15部位間に、コザック配列、開始コドン及びHLA-A*02:01をコードするaAPX ORFを含み、第2のベクター(V4.H.6)は、F14/F15部位間に、コザック配列、開始コドン及びHLA-A*24:02をコードするaAPX ORFを含む。
まとめると、本実施例は、多成分システムを用いての、eAPCのeAPC-pへの変換の2つの具体例を証明する。ここでは、2つの異なるaAPXは個々に送達され(成分1C')、単一ゲノム受容部位(成分1B)にRMCEゲノム組込み法により組み込まれた後、2つの別個のeAPC-pを含む限定的なライブラリーが作製される。更に、第2のゲノム受容部位(成分1D)は隔離されており、成分1B/成分1C'組込みカップルにより影響されないことが示された。
本実施例は、親のeAPC-p(実施例8に記載)から複数のeAPC-paを並行して構築する方法を記載する。ここでは、ゲノム受容部位(成分1D)は、プライムされた遺伝子ドナーベクター(aAMをコードする単一ORFを含んでなる成分1E')による組込みについて標的される。
本実施例では、用いた親のeAPC-p株は、成分1B'に組み込まれている単一aAPX(HLA-A*02:01)を発現するACL-900であった(実施例8に記載)。eAPC-p 成分1Dは、開いたままであり、選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟む2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3を含む。FRT部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。本実施例では、遺伝子ドナーベクター 成分1Eを用い、これは2つの異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15を含み、よって成分1Dにマッチしていた。本実施例では、成分1Eを、HCMVpp28(V9.E.6)、HCMVpp52(V9.E.7)又はHCMVpp65(V9.E.8)(これらは各々C末端にグリシン-セリンリッチリンカー及びc-mycタグをコードする)から選択される1つの興味対象のaAM ORFで更にプライムした。更に、各成分1E'は、aAM ORFの直ぐ5'側にコザック配列及び開始コドンを更に含む。よって、3つのベクターを含む成分1E'の小さな別個のライブラリーが作製された。
まとめると、本実施例は、多成分システムを用いての、eAPC-pのeAPC-paへの変換の3つの具体例を証明する。ここでは、3つの異なるaAMは個々に送達され(成分1E')、単一ゲノム受容部位(成分1D)にRMCEゲノム組込み法により組み込まれた後、3つの異なるaAM ORFを有する3つの別個のeAPC-paの小さなライブラリーが作製される。更に、積載された第2のゲノム受容部位(成分1B')は隔離されており、成分1D/成分1E'組込みカップルにより影響されないことが示された。
本実施例では、複数のaAM ORF(HCMVpp28、HCMVpp52及びHCMVpp65)をまとめてコードするプライムされた成分1Eベクター(成分1E')のプールを単一工程で親のeAPC-p(実施例8に記載)に組み込んで、プールされたeAPC-pライブラリーを作製する方法を記載する。ここでは、各個の細胞には、元のベクタープールに由来する単一ランダム被分析物抗原ORFが成分1D'で組み込まれる結果、各々のeAPC-paは単一ランダムaAMを発現するが、eAPC-paのプールされたライブラリーは、集団として、元のプールされたベクターライブラリーにコードされていたaAM ORFの全てを表す。各々がベクタープールに由来する単一ランダムORFを発現するeAPC-paのプールを作製するこの方法は、ショットガン組込みと呼ばれる。
本実施例では、用いた親のeAPC-p株は、aAPX(HLA-A*02:01)を細胞表面に発現するACL-905であり(細胞株の構築は実施例8に記載)、成分1D及び成分1E'は実施例9に記載のとおりであった。本実施例では、それぞれHCMVpp28、HCMVpp52及びHCMVpp65をコードするaAM ORFを含む実施例9の個々の成分1E'ベクターV9.E.6、V9.E.7及びV9.E.8を一緒にモル比1:1:1で混合してベクタープールを作製した。eAPC-p(ACL-905)を、ベクタープール及びRMCEリコンビナーゼ酵素の発現をコードするベクター(Flp、V4.1.8)とエレクトロポレーションにより組み合わせた。細胞を4~10日間インキュベートした後、成分1Dによりコードされる組込みの選択マーカーBFPのシグナル低下に基いて細胞をバルク選別し(図55a)、プールされた細胞集団ACL-1050を作製した(図55b)。
結論として、本実施例は、eAPC-pを、3つの異なる被分析物抗原分子をコードする3つのベクター(成分1E')のプールされたライブラリーと組み合わせ、RMCEベースのショットガン組込みアプローチを利用することによる、eAPC-pのeAPC-paのプールされたライブラリーへの単一工程での変換のための多成分システムの使用を証明する。更に、本実施例により、作製されたeAPC-paプール中の各eAPC-paは、元のベクタープールからの単一ランダムaAM ORFが成分1Dと成分1E'との間の組込みカップル事象により組み込まれていること及び3つ全てのaAM ORFが作製されたプールされたeAPC-pライブラリー内に表されることが証明される。
本実施例は、標準化様式でのeTPC-tの作製を記載する。ここで、親のeTPCは、別異の合成ゲノム受容部位 成分2B及び2Dを含有する。本実施例及び更なる全ての実施例で記載する全てのeTPC親株は、上記の実施例で示したeAPC株と同じ技法により作製した。遺伝子ドナーベクター成分2C'及び2E'は、HLA-A*02アレレにおいて提示されるとき、ヒトサイトメガロウイルスポリペプチド65(HCMV pp65)に由来する抗原性ペプチドNLVPMVATV(NLVP)と結合することが知られている単一鎖のTCR対(JG9-TCR)を含むものであった。成分C'及びE'はRMCE用に設計され、親の成分2C及び2Eに由来する。
本実施例は、TCRヌル、HLAヌル、CD4ヌル及びCD8ヌルであり、更に成分2B及び2Dを含有する親eTPC細胞株ACL-488を使用する。成分2Bは、コザック配列及び選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟む2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3を含む。FRT部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F3部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。成分2Dは、成分2Bとは異なる2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15を含む。これら部位は、コザック配列及び選択マーカー赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟む。F14部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。
本実施例は、各々が2つの異種特異的リコンビナーゼ部位FRT/F3(2C')及びF14/F15(2E')を含み、よってそれぞれ成分2B及び2Dにマッチしている遺伝子ドナーベクター(成分2C'及び成分2E')を使用する。成分2C'は、FRT/F3部位間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-β鎖をコードするTCR ORFを更に含む。成分2E'は、F14/F15部位間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-α鎖をコードするTCR ORFを更に含む。
まとめると、eTPCは、RMCEベースの組込み法を用いて成分2C'及び2E'に送達されるTCR ORFを組み込む(その結果、成分2B及び2Dが成分2B'及び2D'に変換される)ことにより、eTPC-tに変換された。このeTPC-tは細胞表面に機能的TCRspを発現した。更に、本実施例は、eTPC-t及び被分析物抗原の二元組成物が組み合わされて、eTPC-tが可溶性被分析物抗原(HLAマルチマー:HLA-A*02:01-NLVPMVATV)との複合体形成に基いて選択されるという単純なeTPC:Aシステムの動作を証明している。
本実施例はeTPC-tのeTPC-xへの変換を記載する。ここで、eTPC-xはTCR鎖ORFをコードする成分2B'を有し、成分2Dは相補性TCR鎖ORFの組込みに利用可能である。eTPC-xの成分2DへのeTPC-tの成分2D'の変換は、成分2D'にマッチしている遺伝子ドナーベクター(成分2Z)の使用により達成される。
本実施例では、実施例11で作製した親eTPC-t細胞株ACL-851を用いた。成分2Zは、成分2D'にマッチしている2つの異種特異的リコンビナーゼ部位F14/F15、コザック配列、開始コドン及び組込みの選択マーカーとして緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするORFで構成されるプラスミドベクターである。eTPC-tを成分2Z及びRMCEリコンビナーゼ酵素をコードするベクターとエレクトロポレーションにより組み合わせた。その後、細胞を、CD3提示の喪失及びGFP組込みの選択マーカーの獲得について選択した。モノクローンACL-987をFACSにより表現型に関して特徴付けた。ACL-987はGFPを獲得し、CD3及びTCRabを喪失したことが観察され(図57b、d)、このことは、JG9-TCR-αのGFP ORFでの交換及び成分2D'の成分2Dへの変換が奏功し、よって、eTPC-xが作製されたことを示している。対照的に、親eTPC-tであるACL-851は、GFP発現を欠き、CD3及びTCRab表面発現を有する(図57 a、c)。
まとめると、本実施例は、成分2D'のJG9-TCR-α TCR ORFを除去し、GFP組込みの選択マーカーと交換することによって代替の相補性TCR鎖ORFの更なる組込みカップリング事象のための成分2Dを作製することによるeTPC-tのeTPC-xへの変換を証明する。この変換は、ゲノム組込みのためのRMCE法を用いて行われた。
本実施例は、64の単一JG9-TCR-αバリアントをコードするベクター(成分2E')のプールを、単一工程として、親のeTPC-x細胞株(実施例12に記載する)に組み込んで、プールされたeTPC-tライブラリー(各細胞に元のベクタープールからのα鎖をコードする単一ランダムTCR ORFが組み込まれている結果、各eTPC-tがTCR ORFの単一ランダム対をTCRspとして発現する)を作製する方法を記載する。個々のeTPC-tが一緒に組み合わさって、プールされたeTPC-tのライブラリーを構成し、ここで、細胞プールは、おそらく、64のTCR-αと元の定まったTCRβ鎖との可能な対の全ての組合せを表わしている。このような方法を、本明細書において、「ショットガン」組込みと呼ぶ。64のJG9-TCRαバリアントは、V及びJフラグメントの接合部にあるCDR3配列を改変することにより作製した。
本実施例では、JG9-TCR-β(成分2B')及びCD3複合体を表面発現しない親eTPC-x細胞株ACL-987(実施例12参照)を用いた。成分2Dは、実施例12に記載するように、選択マーカーGFPをコードする。本実施例では64のJG9-TCR-αバリアントフラグメントを成分2Eドナーベクターにクローニングして、F14/F15部位に挟まれ成分2Dにマッチする成分2E'を作製した。その後、64のベクターを単一ベクタープールに組み合わせた。
eTPC-tプールを、RMCEベースのゲノム組込みにより作製した。ここでは、eTPC-x(ACL-987)と64の成分2E'とRMCEリコンビナーゼベクターとをエレクトロポレーションにより組み合わせた。ポリクローンを、GFP発現に基づいて選択した。得られるポリクローンACL-988は、GFPポジティブ細胞のみで構成される親株とは異なり、GFPポジティブ及びGFPネガティブの両方の細胞集団で構成された(図58 a及びb)。しかし、GFPネガティブ集団のみが、強いCD3発現を定常的に示し、このことは、成分2Dの成分2D'への変換が奏功したこと、したがってeTPC-xがeTPC-tプールに変換されたことを示す(図58 c及びd)。更に、ACL-988 GFPネガティブ集団は、JG9-TCR特異的マルチマー反応剤(DEX HLA-A*02:01-NLVP)で染色したとき、2つの別異の強度を示した。このことは、この集団が、結合効率が異なるTCRバリアントを発現する細胞を含むことを示唆する。
ACL-988プールの個々の細胞を、HLA-マルチマーポジティブ集団及びHLA-マルチマーネガティブ集団から、単一細胞選別した。各単一細胞について、バリアントJG9-TCR-α ORFをコードする成分2D'を増幅して配列決定し、上記の一過性発現RSU単位の結果と比較した(図58e)。事実、HLA-マルチマーポジティブである個々のACL-988細胞は、個々に試験したバリアントにおいて高いRSU結果を優勢に示すJG9-TCR-αバリアントをコードしていた(図58e、白抜き円)。更に、pHLA-マルチマーネガティブである個々のACL-988細胞は、低いRSU結果を優勢に示すJG9-TCR-αバリアントをコードした(図58e、白抜き三角)。
結論として、本実施例は、eTPC-x及びプールされたベクター(成分2E')ライブラリーの、複数の異なるTCRspeを含有するTPC-tのプールされたライブラリーへの変換のための多成分システムの使用を証明する。これは、ショットガン組込みを用いて単一工程で達成された。更に、本実施例は、eTPC-tプールが被分析物抗原(可溶性親和性反応剤として)と、eTPC:Aシステムに組み合わされることを証明した。被分析物抗原(HLA-マルチマー)との複合体形成に基いて単一細胞プールを選択し、その後、成分2D'にコードされるTCR鎖ORFを抽出してDNA配列を取得し得ることが示された。
本実施例では、2つの独特なゲノム受容部位(成分2B、2D)を有しHLAヌルであるように遺伝子操作され、天然型CD3発現を利用し、遺伝子操作されたゲノム二成分 合成応答エレメント(成分2F)を有するeTPC細胞株(ACL-1063、成分2A)を記載する。本実施例では、eTPC細胞株を実施例11に記載したようにeTPC-t細胞株(ACL-1277)に変換した。eTPC-t細胞株では、成分2B'及び2E'のTCR鎖ORFは、HLA-ペプチド複合体(HLA)HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCR対をコードする。このeTPC-tを上記eAPC-pと、可溶性ペプチドの形態の外因性aAMの存在下に組み合わせて、eAPC:eTPCシステムを組み立てた。これら組合せシステムの読み出しは、eTPC-t内の、成分2FからのレポーターであるRFPシグナルであった。
応答エレメントは、駆動因子-アクチベーター成分及び増幅因子-レポート成分で構成される成分2Fとして定義され、これら両ユニットは、合成プロモーターを利用するものであった。駆動因子は、NFAT-AP1-NFkBのための3セットの直列の転写因子結合部位(3×NF-AP-NB)をコードする天然型TCRシグナル伝達経路に応答性の合成プロモーターである。転写活性化の際、駆動因子は、増幅因子プロモーター内に同族DNA認識配列が直列で6回存在する、ヘルペスVP16活性化ドメイン、GAL4 DNA結合ドメイン並びにN末端及びC末端の2つの核局在化シグナル(NV16G4N)の融合により導かれる合成の設計された転写因子であるアクチベータータンパク質の発現を誘導する。両駆動因子及び増幅因子プロモーターは、それぞれの転写因子結合部位の直ぐ3'側の、HCMV IE1プロモーターからのコアプロモータ配列(B認識エレメント(BRE)、TATAボックス、イニシエーター(INR)及び転写開始部位)をで利用した。増幅因子は、転写活性化の際、レポーター赤色蛍光タンパク質(RFP)の発現を駆動する。
結論として、機能的成分2Fを含むeTPC-t細胞株が遺伝子操作された後、eTPC-tを作製するために使用された。eTPC-tと、その同族標的T細胞抗原(外因性可溶性aAMとして提供される)を提示する被分析物eAPC-paとの相互作用に際して、応答はRFP発現の増加として測定可能であった。逆に、同族T細胞抗原及びHLAを提示しないか又はHLAを提示しない被分析物eAPC又はeAPC-p又はeAPC-paと接触させたときには、eTPC-tはバックグランドを超えるRFP発現の測定可能な増加を示さなかった。更に、本実施例は、被分析物eAPC-pa及び被分析物eTPC-tが別の二元組成物に編成され、eTPC-t応答(TCRspと被分析物抗原との間の協調的複合体が生じる)が被分析物eAPC-pa及びeTPC-tの両方を同定するために用いられるeAPC:eTPCシステムを証明する。
本実施例は、2つの独特なゲノム受容部位を有し成分2B'及び2E'でHLA-ペプチド複合体(HLA)HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCR対をコードするのTCR鎖ORFが積載されているように遺伝子操作され、天然型CD3発現を利用し、ゲノム一成分 合成応答エレメント(成分2F)を有し、aAMをコードするORFを部位1D'で組み込むことにより作製されたeAPC-paを有するeAPC:eTPCシステムに編成される、eTPC-t(ACL-1150)(成分2A)の使用を記載する。本実施例では、2つの異なるHLAアレレ及びHCMVゲノムに由来する2つの異なるaAM ORFを用いて4つの別異のeAPC-pa株が作製されるように、4つの異なるeAPC-paバリアントを組み立てた。
応答エレメントは、駆動因子-レポーター成分で構成される成分2Fとして定義した。駆動因子は、NFAT-AP1のための6セットの直列の転写因子結合部位(6×NF-AP)をコードする天然型TCRシグナル伝達経路に応答性の合成プロモーターであり、る。転写活性化の際、駆動因子は、増幅因子プロモーター内に同族DNA認識配列が直列で6回存在する、ヘルペスVP16活性化ドメイン、GAL4 DNA結合ドメイン並びにN末端及びC末端の2つの核局在化シグナル(NV16G4N)の融合により導かれる合成の設計された転写因子であるアクチベータータンパク質の発現を誘導する。両駆動因子及び増幅因子プロモーターは、それぞれの転写因子結合部位の直ぐ3'側の、HCMV IE1プロモーターのコアプロモータ配列(B認識エレメント(BRE)、TATAボックス、イニシエーター(INR)及び転写開始部位)を利用する。駆動因子は、転写活性化の際、レポーター赤色蛍光タンパク質(RFP)の発現を誘導する。
eTPC-t細胞株ACL-1150を、上記の4つのeAPC-paの各々を有する独立のeAPC:eTPCシステムに編成した。48時間後、細胞を採集し、洗浄し、eTPC-t及び被分析物eAPC-paに特異的なマーカーで染色して、集団を識別し、フローサイトメトリーにより分析した。eTPC-t(成分2F)の強い活性化は、既知の同族抗原pHLA複合体を提示する被分析物eAPC-pa、すなわち、HLA-A*02:01及びpp65を有するeAPC-paでチャレンジしたeTPC-tでのみ観察された(図60b)。対照的に、非特異的被分析物eAPC-pa(図60a、c、d)で構成されるeAPC:eTPC編成においては、静止状態のRFP発現のみが観察された。
結論として、機能的成分2Fを含むeTPC-t細胞株が遺伝子操作された後、eTPC-tを作製するために使用された。eTPC-tと、その同族標的T細胞抗原(組込みにより内因性aAM ORFとして提供される)を提示する被分析物eAPC-paとの相互作用に際して、応答はRFP発現の増加として測定可能であった。逆に、同族T細胞抗原及びHLAを提示しない被分析物eAPC-paと接触させたときには、eTPC-tはバックグランドを超えるRFP発現の測定可能な増加を示さなかった。更に、本実施例は、被分析物eAPC-pa及び被分析物eTPC-tが別の二元組成物に編成され、eTPC-t応答(TCRspと被分析物抗原との間の協調的複合体が生じる)が被分析物eAPC-pa及びeTPC-tの両方を同定するために用いられるeAPC:eTPCシステムを証明する。
<110> Genovie AB
<120> An engineered two-part cellular device for discovery and characterisation of T-cell receptor interaction with cognate antigen
<130> ANO15
<160> 104
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1 <223> Analyte Antigenic Peptide
<210> 2 <223> Analyte Antigenic Peptide
<210> 3 <223> HCMV Antigen
<210> 4 <223> HCMV Antigen
<210> 5 <223> pcDNA3.1_GFP vector V1.A.4
<210> 6 <223> pcDNA3.1_RFP vector V1.A.6
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<210> 9 <223> pMA-F14-GFP-F15 vector V4.H9
<210> 10 <223> pMA-F14-TCR-JG9-alpha-F15 vector V7.A.3
<210> 11 <223> pMA-FRT-TCR-JG9-beta-F3 vector V7.A.4
<210> 12 <223> F14-TCRaF15 CDR3degen.64mix vector V8.F.8
<210> 13 <223> CMVpro-Flp-sv40pA-V2 vector V4.I.8
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<210> 77 <223> pMA_F14_HLA-A*02:01-6xHis_F15 vector V4.H.5
<210> 78 <223> pMA_F14_HLA-A*24:02-6xHis_F15 vector V4.H.6
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<210> 80 <223> pMA_F14_HLA-B*35:01-6xHis_F15 vector V4.H.8
<210> 81 <223> FRT_HCMVpp28-3xMYC_F3 vector V9.E.6
<210> 82 <223> FRT_HCMVpp52-3xMYC_F3 vector V9.E.7
<210> 83 <223> FRT_HCMVpp52-3xMYC_F3 vector V9.E.8
<210> 84 <223> SpCas9-2A-GFP Vector V1.A.8
<210> 85 <223> HLA-A-sg-sp-opti1 vector V2.A.1
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<210> 87 <223> HLA-C-sg-sp-4 vector V2.B.3
<210> 88 <223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_1 vector V2.I.10
<210> 89 <223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_2 vector V2.J.1
<210> 90 <223> AAVSI_sg-sp-opti_3 vector V2.J.6
<210> 91 <223> TRAC-GT-F1 ddPCR primer/probe
<210> 92 <223> TRAC-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.8
<210> 93 <223> TRAC-probe-FAM ddPCR primer/probe
<210> 94 <223> TRBC2-GT-F1 ddPCR primer/probe 1.F.9
<210> 95 <223> TRBC2-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.10
<210> 96 <223> TRBC2-probe-FAM ddPCR primer/probe 1.G.2
<210> 97 <223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.9
<210> 98 <223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.10
<210> 99 <223> TRAC-probe(HEX) ddPCR primer/probe 10.B.6
<210> 100 <223> HCMVpp65_GT_F2ddPCR primer/probe 21.I.1
<210> 101 <223> HCMVpp28_GT_F1 ddPCR primer/probe 21.I.2
<210> 102 <223> HCMVpp52_GT_F1 ddPCR primer/probe 21.I.3
<210> 103 <223> Myc-Tag_GT_R1 ddPCR primer/probe 20.H.10
<210> 104 <223> Linker-Myc_Probe_Fam ddPCR primer/probe 20.H.9
aAPX 被分析物抗原提示複合体
aAM 被分析物抗原性分子
aCT 被分析物TCR
APC 抗原提示細胞
APX 抗原提示複合体
BFP 青色蛍光タンパク質
CAR-T CAR T細胞
CM 積荷分子
CRISPR クラスター化した規則配置性短パリンドローム配列反復
gRNA Cas9ガイドRNA
CDR 相補性決定領域
C領域 定常領域
CMV サイトメガロウイルス
DAMPS 危険関連分子パターン
DC 樹状細胞
DNA デオキシリボ核酸
D領域 多様性領域
eAPC 遺伝子操作された抗原提示細胞
eAPC-p 被分析物抗原提示複合体を提示する遺伝子操作抗原提示細胞
eAPC-pa 被分析物抗原提示複合体及び被分析物抗原性分子を提示する遺伝子操作抗原提示細胞
eAPC-a 被分析物抗原性分子を発現する遺伝子操作抗原提示細胞
eAPCS 遺伝子操作された抗原提示細胞システム
eTPC 遺伝子操作されたTCR提示細胞
eTPC-t 全長TCR対を提示する遺伝子操作されたTCR提示細胞
FACS 蛍光活性化細胞選別
GEM T細胞 生殖系列によりコードされるミコリル反応性T細胞
GFP 緑色蛍光タンパク質
HLAI HLAクラスI
HLAII HLAクラスII
HDR 相同性指向組換え
HLA ヒト白血球抗原
IgSF イムノグロブリンスーパーファミリー
iNK T細胞 インバリアントナチュラルキラーT細胞
J領域 連結領域
MACS 磁性活性化細胞選別
MAGE メラノーマ関連抗原
MAIT 粘膜関連インバリアントT
NCBP 非細胞ベース粒子
ORF オープンリーディングフレーム
PAMPS 病原体関連分子パターン
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
RFP 赤色蛍光タンパク質
DNA リボ核酸
SH2 Src相同性2
T細胞 Tリンパ球
TCR T細胞レセプター
TRA TCRα
TRB TCRβ
TRD TCRδ
TALEN 転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ
TRG TRCγ
TAA 腫瘍関連抗原
V領域 可変領域
β2M β2-ミクログロブリン
ZAP-70 70kDaのζ-鎖関連タンパク質
相補TCR鎖の対:翻訳されたタンパク質がTCR提示細胞の表面でTCRspを形成できる2つのTCR鎖。
親和性:2又は3以上の分子又はタンパク質の間の相互作用の動的又は平衡パラメータ
親和性反応剤:被分析物に関して特異的親和性を有するように設計された任意の反応剤。HLA-抗原複合体に関する親和性について使用されることがおおい。
アレレ:所与の遺伝子のバリアント形態。
AM:被分析物抗原性分子。一般に、ゲノムDNA及び/又は特定の導入遺伝子配列から細胞により発現されるタンパク質であるが、代謝産物でもあり得る。AMは、細胞で発現され、フラグメントが次いで積荷としてAPXにより又はそれ自体で細胞表面で提示され得る。積荷としてであってもなくても、AMは、次いで、T細胞レセプター保有細胞又は関連する親和性反応剤の標的になり得る。
アンプリコン:PCRを含む様々な方法を用いる人工的増幅の源及び/又は生成物であるDNA又はRNA片。
抗体:B細胞と呼ばれる免疫系の専門細胞により発現され、2つの鎖を含む親和性分子。B細胞は、一般には自己タンパク質に結合しないが、宿主を脅かす病原体又は毒素に結合して中和することができる、非常に多くの非常に多様なレパートリーの抗体を発現する。天然の又は人工的に遺伝子操作された抗体は親和性反応剤として用いられることがおおい。
抗原:TCRが結合し得、T細胞内で伝達されるシグナルをもたらる任意の分子(抗原提示複合体により提示されることが多い)
被分析物抗原:まとめて、分析測定のための抗原を提示する任意の物質を表すeAPC:eTPCシステム
APC:抗原提示細胞。細胞表面にAM、APX、APXを保有する細胞。
APX:抗原提示複合体。有核細胞により、ゲノムDNA及び/又は特定の導入遺伝子配列をコードする遺伝子/ORFから細胞表面で発現及び提示されるタンパク質。APXは、ペプチド又はその他の代謝物分子である積荷を提示する。
C領域:定常領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。c領域は、TCRの多様性を駆動するのではなく、免疫系における全般的機能を規定する別個のセグメントである。
CDR:相補性決定領域。標的結合機能のほとんどを行う、TCR及び抗体の、抗原に面する端部の短い配列。各抗体及びTCRは、6つのCDRを含み、これらは、一般に、多数の多様な標的分子の検出を可能にする、当該分子の最も可変な部分である。
CM:積荷子。抗原提示複合体、例えばHLA I又はHLA IIにより提示されるペプチド又は代謝物。CMは、ゲノムDNAから固有に細胞により発現されるか、培養培地に導入されるか又は特異的に導入された遺伝子配列から発現されることができる。
コピー数:細胞のゲノム内でコードされる規定された配列の存在総数。
細胞遺伝学的:染色体の構造及び機能に関する遺伝学、すなわち細胞の核型の決定。
細胞傷害性/細胞毒性:標的細胞を直接的で特異的に損傷する因子をT細胞が放出するプロセス。
D領域:多様性領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。各個が、これら領域の多くの異なるバリエーションを有し、そのことにより、各個体は非常に多種類の異なるTCRを有するT細胞で武装することが可能である。
DNA:デオキシリボ核酸。遺伝子及びタンパク質をコードする遺伝物質を形成する分子の化学名称。
eAPCシステム:eAPCS:eAPC-pa、eAPC-p及びeAPC-a細胞又はそれらのライブラリーがeAPC:eTPCシステムにおける組合せ用に製造されるシステム
eTPCシステム:eTPCS:eTPC-t細胞又はそのライブラリーがeAPC:eTPCシステムにおける組合せ用に製造されるシステム
eAPC:eTPCシステム:eAPCにより提示される被分析物抗原とeTPCにより提示される被分析物TCRとが組み合わされているシステム
内因性:細胞内に起源を発する物質。
真核生物条件付き調節エレメント:規定された条件下で誘導又は抑制され得る、プロモーターの活性に影響し得るDNA配列
真核生物プロモーター:RNAポリメラーゼ結合部位及び応答エレメントをコードするDNA配列。プロモーター領域の配列は、RNAポリメラーゼ及び転写因子の結合を制御し、したがって、プロモーターは、興味対象の遺伝子がどこでいつ発現されるかを決定する大きな役割を演じる。
真核生物ターミネーター/シグナルターミネーター:RNAポリメラーゼIIと結合して転写終結プロセスの誘引するタンパク質因子により認識されるDNA配列。これは、ポリAシグナルもコードする。
FACS/フローサイトメトリー:蛍光活性化細胞選別。個々の細胞を特異的細胞表面及び細胞内マーカーの発現について分析できる分析技術。この技術の変法である細胞選別は、規定されたマーカーセットを有する細胞を、更なる分析のために回収することを可能にする。
APXのファミリー:抗原提示複合体を構成する機能的に関連するタンパク質をコードする幾つかの類似する遺伝子のセット。
蛍光(タンパク質)マーカー:特異的な消光及び発光の特徴を有し、顕微鏡観察、FACS及び関連技術により検出できる分子。
遺伝子ドナーベクター:遺伝物質をゲノム受容部位に送達するための遺伝子ベースのベクター。
異種特異的リコンビナーゼ部位:2つのDNA分子のクロスオーバーを促進するための、リコンビナーゼ酵素により認識されるDNA配列。
HLA I:ヒト白血球抗原クラスI。ヒトにおいて全ての有核細胞で発現される遺伝子。発現したHLA Iは、細胞表面に輸送されて、そこで、内部タンパク質の短いフラグメント、ペプチドを積荷としてT細胞レセプターに提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質のフラグメントを提示する。HLA Iは、加えて、培養培地に加えられるか、導入遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から生成されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から生成されるペプチドを積荷として提示できる。HLAクラスI遺伝子は多型であり、これは、異なる個体が、提示におけるバリエーションを導く同一遺伝子におけるバリエーションを有する可能性があることを意味する。HLAクラスIIと関連する。
HLA II:ヒト白血球抗原クラスII。ヒトにおいて適応免疫応答を調和し援助する特定細胞(例えば樹状細胞)で発現される遺伝子。HLAクラスIと関連する。HLAクラスIIタンパク質は、細胞表面に輸送され、そこで、外部タンパク質の短いフラグメント、ペプチドを積荷としてT細胞レセプターに提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質のフラグメントを提示する。加えて、HLA IIは、培養培地に加えられるか、導入遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から生成されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から生成ペプチドを積荷として提示できる。HLAクラスII遺伝子は、多型であり、これは、異なる個体が、提示におけるバリエーションを導く同一遺伝子におけるバリエーションを有する可能性があることを意味する。
免疫監視:免疫系が感染、悪性病変又はその他の病原性である可能性のある変化を検出し、それにより活性化されるプロセス。
インスレーター:遺伝子が近傍の遺伝子の活性化又は抑制により影響されることを妨ぐDNA配列。インスレーターは、サイレント化された遺伝子から活発に転写される遺伝子へのヘテロクロマチンの広がりも妨ぐ。
組込み:細胞の染色体へのDNA配列の物理的ライゲーション。
組込みカップル:対をなす組込みベクター及びゲノム受容部位
内部リボソーム進入部位(IRES):転写されると、キャップ非依存様式で翻訳の開始を可能にするRNAエレメントをコードするDNA配列。
J領域:連結領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。各個体は、これらの領域の多数の異なるバリエーションを有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するT細胞で武装できるようにする。
核型:細胞の染色体組成。
コザック配列:翻訳の効率的な開始に必要な短い配列
マッチした(する):2つの成分が、相補成分間の相互作用を導き及び制限する遺伝子エレメントをコードするとき。
メガヌクレアーゼ認識部位:メガヌクレアーゼと一般に呼ばれるエンドデオキシリボヌクレアーゼにより認識されるDNA配列
代謝物:細胞の代謝経路により生成又は改変された分子
可動遺伝子エレメント:トランスポサーゼ酵素の活性を有するDNAの組込みを許容するDNA配列。
モノクローン細胞株:細胞複製の反復により単一始祖細胞から生成される規定された細胞群。
天然型:細胞に天然に生じる物質。
非コーディング遺伝子:機能的非コーディングRNA分子に転写されるタンパク質非コーディングDNA配列。
ORF:オープンリーディングフレーム。リボソームによるタンパク質(ポリペプチド)の合成のための翻訳フレームをコードする遺伝物質伸長部。
パラクリン:近傍細胞に直接作用する可溶性因子によるシグナル伝達。
ペプチド:6~30アミノ酸長のアミノ酸の短い一続き。
表現型分析:細胞の観察可能な特徴の分析。
多型:同一遺伝子の異なるアレレの存在により、同一種の個体における異なる形態の存在。
ポリペプチド:三次元構造を形成する、一続きのペプチドからなるタンパク質。
一次出力:終端出力が由来することができ、及び/又は終端出力を測定することができるeAPC細胞及びeTPC細胞
プライマー:例えばPCRの間に、標的DNA配列の特異的認識を可能にする短いDNA配列。
プロモーター:遺伝子発現の制御された開始のための調節DNAエレメント。
選択マーカー:人工的選択法に適切な形質を与えるDNA配列。
ショットガン組込み:ベクターのライブラリーが細胞集団に導入されるプロセスであって、このプロセスにより、任意の所与のベクターインサートの単一コピーのみが各単一細胞のゲノムに組み込まれ得る。組込みカップルを介する所与の細胞集団へのプールされたベクターの組込みを言うときに用いる。
スプライスドナー部位:イントロンの5'末端のDNA配列。
合成:人工的に生成又は細胞に導入された物質。
T細胞:Tリンパ球。その表面でT細胞レセプターを発現する白血球。自己と反応しないが、感染及び悪性疾患を認識し、同じ種のほとんどのメンバーからの移植片を拒絶する能力を有するように免疫系により選択される。
TCR:T細胞レセプター。Tリンパ球と呼ばれるリンパ球の亜集団により発現される親和性分子。ヒトでは、TCRは、ウイルス若しくは細菌感染又はガン性細胞からのフラグメントを含む、APX CM又はAPX AMにより提示される積荷を認識する。したがって、TCR認識は、適応免疫系の肝要な部分である。TCRは、細胞表面で対合した2つの鎖からなる。各細胞の表面で発現されるTCRは、様々な遺伝子(v、d、j及びc領域)の大きなプールからランダムに組み立てられ、よって各個が、異なるTCRの非常に大きく多様なレパートリーを発現するT細胞のプールを有する。
TCRsp:CD3と複合体化して表面タンパク質として発現される相補性TCR鎖対、又は可溶性反応剤、不動化反応剤の形態のタンパク質若しくはNCBPにより提示されるタンパク質として発現される相補性TCR鎖対。
終端出力:AM、APX、APX:CM、APX:AM又はTCRspの形態の被分析物抗原及びTCR配列。
TRB:TCRβをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする4つの異なる遺伝子座のうちの1つ。翻訳されたTCRβ鎖タンパク質は、代表的には、TCRα鎖タンパク質と対合して、α/βTCRspを形成する。
TRD:TCRδをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする4つの異なる遺伝子座のうちの1つ。翻訳されたTCRδ鎖タンパク質は、代表的には、翻訳されたTCRγ鎖タンパク質と対合して、γ/δTCRspを形成する。
TRG:TCRγをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする4つの異なる遺伝子座のうちの1つ。翻訳されたTCRγ鎖タンパク質は、代表的には、転写されたTCRδ鎖タンパク質と対合して、γ/δTCRspを形成する。
V領域:可変領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。各個が、これら領域の多くの異なるバリエーションを有し、そのことにより、各個体は非常に多種類の異なるTCRを有するT細胞で武装することが可能である。
1.第1の部分が遺伝子操作された抗原提示細胞システム(eAPCS)であり、第2の部分が遺伝子操作されたTCR提示細胞システム(eTPCS)である二部構成デバイス。
2.eAPCSが下記:
a.eAPC-p、及び/又は
b.eAPC-a、及び/又は
c.eAPC-pa、及び/又は
d.a及び/又はb及び/又はcの1又は2以上のライブラリー
から選択される1又は2以上の被分析物eAPCを提供する、項目1に記載の二部構成デバイス。
3.eAPC-p、eAPC-a又はeAPC-paが下記:
a.aAPX、又は
b.aAM、又は
c.aAPX:aAM、又は
d.aAPX:CM、又は
e.それらの組合せ
から選択される被分析物抗原を発現する、項目2に記載の二部構成デバイス。
4.eTPCSが
a.eTPC-t、及び/又は
b.1又は2以上のそのライブラリー
から選択される1又は2以上の被分析物eTPC、項目1又は2に記載の二部構成デバイス。5.被分析物TCR鎖対がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として被分析物eTPCにより発現される、項目4に記載の二部構成デバイス。
7.組合せが被分析物TCRspと項目3に規定する被分析物抗原との間での接触を生じる、項目6に記載の二部構成デバイス。
8.接触が被分析物TCRspと被分析物抗原と間での複合体形成を生じることができる、項目7に記載の二部構成デバイス。
9.複合体形成が、誘導する場合、被分析物eTPC及び/又は被分析物eAPCにおいてシグナル応答を誘導することができる、項目8に記載の二部構成デバイス。
10.応答が、シグナル応答を有するか若しくは有しない被分析物eTPC若しくは被分析物eTPCのプール及び/又はシグナル応答を有するか若しくは有しない被分析物eAPC若しくは被分析物eAPCのプールを選択するために用いられる、項目9に記載の二部構成デバイス。
12.入力の被分析物eTPC若しくは被分析物eTPCのライブラリーから1又は2以上の被分析物eTPCを選択して1又は2以上の被分析物eTPCを取得する方法であって、発現されたTCRspは1又は2以上の項目3に規定する被分析物抗原に結合し、
a.1又は2以上の被分析物eTPCを1又は2以上の被分析物eAPCと組み合わせて、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での接触を生じさせること、並びに下記:
b.形成される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
c.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eTPCによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
d.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eAPCによるシグナル応答を測定すること、及び
e.工程b、c及び/又はdに基いて1又は2以上の被分析物eTPCを選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされる
の少なくとも1つを含んでなる方法。
13.選択工程が単一細胞選別及び/又はプールへの細胞選別により行われる、項目12に記載の方法。
14.選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、項目13に記載の方法。
15.選別が選別された細胞プールの拡大に先行する、項目13に記載の方法。
17.配列決定工程が下記:
a.ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
b.成分2B'及び/又は成分2D'のRNA転写物の抽出すること、及び/又は
c.成分2B'及び/又は成分2D'のDNA及び/又はRNA転写物をPCR及び/又はRT-PCRにより増幅すること
に後続する、項目16に記載の方法。
18.配列決定工程が細胞に対して破壊的であり、得られる配列決定情報が項目12の工程eにおいて選択される被分析物eTPCを製造するために用いられる、項目16又は17に記載の方法。
19.選択された被分析物eTPCがシグナル応答の特徴決定に付され、
a.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
b.eTPCが成分2Fを含有する場合には、合成シグナル伝達応答を決定すること
を更に含んでなる項目12、13、14、15、18のいずれか1項に記載の方法。
20.誘導されたシグナル応答が、非誘導シグナル応答状態と比較した下記:
a.分泌された生体分子
b.分泌された化学物質
c.細胞内生体分子
d.細胞内化学物質
e.表面発現された生体分子
f.被分析物eTPCの被分析物eAPCに対する細胞毒性作用
g.シグナル応答が被分析物eAPCにおいて誘導され、a~eのいずれかの増減を検出することにより決定されるような、被分析物eTPCの被分析物eAPCに対するパラクリン作用
h.被分析物eTPCの増幅
i.被分析物eTPCと被分析物eAPCとの間の免疫学的シナプス
の1又は2以上の増減を検出することにより決定される、項目19に記載の方法。
22.入力の被分析物eAPC又は被分析物eAPCのライブラリーから1又は2以上の被分析物eAPCを選択して、被分析物TCRspを発現する1又は2以上の被分析物eTPCの発現した項目3に規定する被分析物抗原に対するシグナル応答を誘導する1又は2以上の被分析物eAPCを取得する方法であって、
a.1又は2以上の被分析物eAPCと1又は2以上の被分析物eTPCとを組み合わせて、被分析物eAPCにより提示される被分析物抗原と1又は2以上の被分析物eTPCの被分析物TCRspとの間の接触を生じさせること、及び
b.形成する場合、1又は2以上の被分析物抗原と1又は2以上の被分析物TCRspとの間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
c.誘導される場合、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される1又は2以上の被分析物eTPCにおけるシグナル応答を測定すること、及び/又は
d.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eAPCによるシグナル応答を測定すること、及び
e.工程b、c及び/又はdから1又は2以上の被分析物eAPCを選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされる
を含んでなる方法。
23.選択工程が単一細胞選別及び/又はプールへの細胞選別により行われる、項目22に記載の方法。
24.選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、項目23に記載の方法。
25.選別が選別された細胞プールの拡大に先行する、項目24に記載の方法。
27.配列決定工程が下記:
a.ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
b.成分1B'及び/又は成分1D'のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
c.成分1B'及び/又は成分1D'のDNA及び/又はRNA転写物をPCR及び/又はRT-PCRにより増幅すること
に後続する項目26に記載の方法。
28.配列決定工程が細胞に対して破壊的であり、得られる配列決定情報が項目22の工程eにおいて選択される被分析物eAPCを製造するために用いられる、項目26又は27に記載の方法。
29.選択された被分析物eAPCが被分析物eTPCのシグナル応答に基いて選択され、
a.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
b.合成シグナル伝達応答を決定すること
を更に含んでなる項目22、23、24、25、28のいずれか1項に記載の方法。
30.誘導されたシグナル応答が、非誘導シグナル応答状態と比較した下記:
a.分泌された生体分子
b.分泌された化学物質
c.細胞内生体分子
d.細胞内化学物質
e.表面発現された生体分子
f.被分析物eTPCの被分析物eAPCに対する細胞毒性作用
g.シグナル応答が被分析物eAPCにおいて誘導され、a~eのいずれかの増減を検出することにより決定されるような、被分析物eTPCの被分析物eAPCに対するパラクリン作用
h.被分析物eTPCの増幅
i.被分析物eTPCと被分析物eAPCとの間の免疫学的シナプス
の1又は2以上の増減を検出することにより決定される、項目29に記載の方法。
a.aAPX:aAM若しくはaAPX:CM又は積荷aM若しくは積荷CMを単離すること、及び
b.積載された積荷を同定すること
aAM積荷又はCM積荷を選択し同定する方法。
32.工程bが、単離されたaAPX:aAM又はaAPX:CMを
a.質量分析
b.ペプチド配列決定分析
の1以上に付することを含んでなる、項目31に記載の方法。
33.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目12~20に規定する方法により選択されたTCR鎖対配列又はTCR鎖対配列のライブラリー。
34.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目22~32に規定する方法により選択された抗原性分子及び/又は前記抗原性分子をコードするORF、又はそのライブラリー。
35.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目22~32に規定する方法により選択された抗原性分子を積荷として積載した抗原提示複合体及び/又は前記複合体をコードするORF、又はそのライブラリー
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目22~32に規定する方法により選択されたeAPC、又はeAPCのライブラリー。
37.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目12~20に規定する方法により選択されたeTPC、又はeTPCのライブラリー。
38.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目1~10のいずれか1項に記載のデバイス。
<110> Genovie AB
<120> An engineered two-part cellular device for discovery and characterisation of T-cell receptor interaction with cognate antigen
<130> ANO15
<160> 104
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Cytomegalovirus
<220>
<223> Analyte Antigenic Peptide
<400> 1
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Analyte Antigenic Peptide
<400> 2
Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu
1 5
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HCMV Antigen
<400> 3
Asn Leu Val Pro
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> HCMV Antigen
<400> 4
Asn Leu Val Pro
1
<210> 5
<211> 6071
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pcDNA3.1_GFP vector V1.A.4
<400> 5
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgccaccat ggaatccgat gagtctggcc tgcccgccat 960
ggaaatcgag tgcagaatca ccggcaccct gaacggcgtg gaatttgagc tcgtgggcgg 1020
aggcgagggc acacctgaac agggcagaat gaccaacaag atgaagtcca ccaagggggc 1080
cctgaccttc agcccctacc tgctgtctca cgtgatgggc tacggcttct accacttcgg 1140
cacctacccc agcggctacg agaacccttt cctgcacgcc atcaacaacg gcggctacac 1200
caacacccgg atcgagaagt acgaggacgg cggcgtgctg cacgtgtcct tcagctacag 1260
atacgaggcc ggcagagtga tcggcgactt caaagtgatg ggcaccggat tccccgagga 1320
cagcgtgatc ttcaccgaca agatcatccg gtccaacgcc accgtggaac atctgcaccc 1380
catgggcgac aacgacctgg acggcagctt caccagaacc ttctccctgc gggatggcgg 1440
ctactacagc agcgtggtgg acagccacat gcacttcaag agcgccatcc accccagcat 1500
cctccagaac ggcggaccca tgttcgcctt cagacgggtg gaagaggacc acagcaacac 1560
cgagctgggc atcgtggaat accagcacgc cttcaagacc cccgatgccg atgccggcga 1620
ggaatgagtc gagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 1680
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1740
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 1800
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 1860
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg 1920
gggctctagg gggtatcccc acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 1980
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 2040
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 2100
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 2160
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 2220
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 2280
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 2340
gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt 2400
ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 2460
gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 2520
ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg 2580
cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc 2640
gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta 2700
ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt tcggatctga tcaagagaca 2760
ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct 2820
tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc 2880
gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc 2940
ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc 3000
gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg 3060
ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc 3120
atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac 3180
caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat 3240
caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc 3300
aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg 3360
aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg 3420
gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc 3480
gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc 3540
gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg 3600
accaagcgac gcccaacctg ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa 3660
ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc 3720
tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 3780
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 3840
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga 3900
gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 3960
cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 4020
aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 4080
agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 4140
ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 4200
ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 4260
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 4320
tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 4380
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 4440
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 4500
tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 4560
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 4620
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 4680
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 4740
actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 4800
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt 4860
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 4920
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 4980
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 5040
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 5100
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 5160
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 5220
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 5280
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 5340
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 5400
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 5460
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 5520
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 5580
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 5640
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 5700
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 5760
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 5820
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 5880
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 5940
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 6000
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 6060
cacctgacgt c 6071
<210> 6
<211> 6068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pcDNA3.1_RFP vector V1.A.6
<400> 6
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgccaccat gagcgagctg atcaaagaaa acatgcacat 960
gaagctgtac atggaaggca ccgtgaacaa ccaccacttc aagtgcacca gcgagggcga 1020
gggcaagcct tacgagggca cccagaccat gaagatcaag gtggtggaag gcggccctct 1080
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ccacacccag ggcatccccg atttcttcaa gcagagcttc cccgagggct tcacctggga 1200
gcggatcacc acatacgagg acggcggagt gctgaccgcc acccaggata ccagcttcca 1260
gaacggctgc atcatctaca acgtgaagat taacggcgtg aacttcccca gcaacggccc 1320
cgtgatgcag aagaaaacca gaggctggga ggccaacacc gagatgctgt accctgccga 1380
tggcggcctg agaggccatt ctcagatggc cctgaaactc gtgggcggag gctacctgca 1440
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gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 840
gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat 900
gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca 960
gatcaggtac catggccccc aagaaaaagc ggaaagtggg catccacggc gtgccagctg 1020
caggcggctc tatgagccag ttcgacatcc tgtgcaagac cccacctaag gtgctcgtgc 1080
ggcagttcgt ggaaagattc gagaggccta gcggcgagaa gatcgcctct tgtgctgccg 1140
agctgaccta cctgtgctgg atgatcaccc acaacggcac cgccatcaag cgggccacct 1200
tcatgagcta caataccatc atcagcaaca gcctgagctt cgacatcgtg aacaagagcc 1260
tgcagttcaa gtacaagacc cagaaggcca ccatcctgga agccagcctg aagaaactga 1320
tccccgcctg ggagtttacc atcatcccat acaatggcca gaaacatcag agcgacatta 1380
ccgatatcgt gtccagcctc cagctgcagt tcgagagtag cgaagaagcc gacaagggca 1440
acagccacag caagaagatg ctgaaggccc tgctgagcga gggcgagagc atctgggaga 1500
tcacagagaa gatcctgaac agcttcgagt acaccagccg gttcaccaag accaagaccc 1560
tgtaccagtt cctgttcctg gccaccttta tcaactgcgg ccggttctcc gacatcaaga 1620
acgtggaccc caagagcttc aagctggtgc agaacaagta cctgggcgtg atcattcagt 1680
gcctcgtgac cgagacaaag accagcgtgt cccggcacat ctactttttc agcgccagag 1740
gccggatcga ccccctggtg tacctggacg agttcctgag aaacagcgag cccgtgctga 1800
agagagtgaa ccggaccggc aacagcagct ccaacaagca ggaataccag ctgctgaagg 1860
acaacctcgt gcggtcctac aacaaggccc tgaagaaaaa cgccccctac cccatcttcg 1920
ccattaagaa cggccccaag tcccacatcg gccggcacct gatgaccagc tttctgagca 1980
tgaagggcct gacagagctg accaacgtcg tgggcaattg gagcgacaag agggcctctg 2040
ccgtggccag aaccacctac acccaccaga tcacagccat ccccgaccac tacttcgccc 2100
tggtgtctcg gtactacgcc tacgacccca tcagcaaaga gatgatcgcc ctgaaggacg 2160
agacaaaccc catcgaggaa tggcagcaca tcgagcagct gaagggcagc gccgagggca 2220
gcatcagata ccctgcctgg aacggcatca tctcccagga agtgctggac tacctgagca 2280
gctacatcaa ccggcggatc tgatctagac ctgatcataa tcaagccata tcacatctgt 2340
agaggtttac ttgctttaaa aaacctccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 2400
atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2460
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2520
aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tctgcggatc caatctcgag ctgggcctca 2580
tgggccttcc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 2640
catggtcata gctgtttcct tgcgtattgg gcgctctccg cttcctcgct cactgactcg 2700
ctgcgctcgg tcgttcgggt aaagcctggg gtgcctaatg agcaaaaggc cagcaaaagg 2760
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 2820
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 2880
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 2940
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 3000
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 3060
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 3120
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 3180
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 3240
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 3300
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 3360
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 3420
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 3480
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 3540
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 3600
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 3660
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaacc acgctcaccg gctccagatt 3720
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 3780
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 3840
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 3900
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 3960
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 4020
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 4080
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 4140
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 4200
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 4260
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 4320
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 4380
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 4440
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 4500
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 4542
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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1 5 10 15
Ala Ala Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala
20 25 30
Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Thr
35 40
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<211> 2762
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<213> Artificial Sequence
<220>
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cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 2700
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_2 vector V2.J.1
<400> 89
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cac 2763
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<220>
<223> AAVSI_sg-sp-opti_3 vector V2.J.6
<400> 90
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gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180
gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300
acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattggcgg aaggccgtca 360
aggccgcatg gatccaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 420
ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca 480
aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 540
ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 600
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tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttcagacatc catagatcta gctcgagttt 780
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tgtcgtgcca gctgcattaa catggtcata gctgtttcct tgcgtattgg gcgctctccg 900
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcgggt aaagcctggg gtgcctaatg 960
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tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 1200
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 1260
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acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 1980
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ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 2160
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 2220
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 2280
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attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 2400
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 2460
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 2520
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 2580
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 2640
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 2700
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 2760
ac 2762
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gctgtcaagt ccagttctac g 21
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<220>
<223> TRBC2-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.10
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cttgctggta agactcggag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> TRBC2-probe-FAM ddPCR primer/probe 1.G.2
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caaacccgtc acccagatcg tca 23
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ctgatcctct tgtcccacag ata 23
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<223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.10
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gacttgtcac tggatttaga gtctct 26
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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tgcctccttg ccctttg 17
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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cgtccctaac accaagaag 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Myc-Tag_GT_R1 ddPCR primer/probe 20.H.10
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Linker-Myc_Probe_Fam ddPCR primer/probe 20.H.9
<400> 104
cttttgttct ccagatccag atccacc 27
Claims (23)
- 第1の部分が遺伝子操作された抗原提示細胞システム(eAPCS)であり、第2の部分が遺伝子操作されたTCR提示細胞システム(eTPCS)である、eAPC:eTPC組合せ分析システムを構成する二部構成デバイスであって、
前記eAPCSが
遺伝子操作された抗原提示細胞(eAPC)である第1の成分(成分1Aと呼ぶ)(ここで、成分1Aは、被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも1つのファミリーの内因性表面発現を欠き、aAPX及び/又はaAMをコードする1又は2以上のORFの組込みのための更なる成分(成分1Bと呼ぶ)である合成ゲノム受容部位を含有する)、及び
aAPX及び/又はaAMをコードするORFの1Bへの送達及び組込みのための遺伝子ドナーベクターである第3の成分(成分1Cと呼ぶ)(ここで、成分1Cは成分1Bにマッチしており、成分1Cは、aAPX及び/又はaAMをコードする1又は2以上のORFを送達するように設計されてる)を含んでなり、
ここで、前記1又は2以上のORFは、必要に応じて、組込みの選択マーカーをコードし、aAPX及び/又はaAMは成分1Aにより発現され得る、二部構成デバイス。 - 前記eTPCSが
遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)である第1の成分(成分2Aと呼ぶ)(ここで、成分2Aは、被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも1つのファミリーの内因性表面発現を欠き、TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、被分析物TCRα、β、δ又はγ鎖の少なくとも1つをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFの組込みのための更なる成分(2Bと呼ぶ)ゲノム受容部位、及び
被分析物TCR鎖をコードするORFの送達のための遺伝子ドナーベクターである第2の成分(成分2Cと呼ぶ)(ここで、成分2Cは成分2Bにマッチしており、成分2Cは
a.被分析物TCRα、β、δ及び/又はγ鎖の少なくとも1つをコードする単一ORF、及び/又は
b.被分析物TCR鎖対をコードする2つのORF
を送達するよう設計されており、a及び/又はbは、必要に応じて、組込みの選択マーカーをコードする)
を含んでなり、被分析物TCR鎖はCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分Aに発現され得る、請求項1に記載の二部構成デバイス。 - eAPCSが
a.eAPC-p、及び/又は
b.eAPC-a、及び/又は
c.eAPC-pa、及び/又は
d.a及び/又はb及び/又はcの1又は2以上のライブラリー
から選択される1又は2以上の被分析物eAPCを提供する、請求項1又は2に記載の二部構成デバイス。 - eAPC-p、eAPC-a又はeAPC-paが
a.aAPX、又は
b.aAM、又は
c.aAPX:aAM、又は
d.aAPX:CM、又は
e.それらの組合せ
から選択される被分析物抗原を発現する、請求項3に記載の二部構成デバイス。 - eTPCSが
a.eTPC-t、及び/又は
b.1又は2以上のそのライブラリー
から選択される1又は2以上の被分析物eTPCを提供する、請求項1~4のいずれか1項に記載の二部構成デバイス。 - 被分析物TCR鎖対が、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(被分析物TCRsp)として被分析物eTPCにより発現される、請求項5に記載の二部構成デバイス。
- eTPCが、eTPCのゲノムに対して遺伝子操作された合成TCRシグナル応答エレメントを表す成分2Fを含有し、被分析物TCRspとeAPC-p、-a又は-paにより提示される被分析物抗原との間での複合体形成を報告するために用いられ、eTPCにおいてシグナル応答を生じる、請求項6に記載の二部構成デバイス。
- 1又は2以上の被分析物eAPCが1又は2以上の被分析物eTPCと組み合わされている、請求項1~7のいずれか1項に記載の二部構成デバイス。
- 組合せが被分析物TCRspと請求項4に規定する被分析物抗原との間の接触を生じ、該接触がシグナル応答を生じてもよいし生じなくてもよい、請求項8に記載の二部構成デバイス。
- 接触が被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成を生じてもよい、請求項9に記載の二部構成デバイス。
- 複合体形成が、生じる場合には、被分析物eTPC及び/又は被分析物eAPCにおいてシグナル応答を誘導することができる、請求項10に記載の二部構成デバイス。
- シグナル応答が、シグナル応答を有するか若しくは有しない被分析物eTPC若しくは被分析物eTPCのプール及び/又はシグナル応答を有するか若しくは有しない被分析物eAPC若しくは被分析物eAPCのプールを選択するために用いられる、請求項8~10のいずれか1項に記載の二部構成デバイス。
- 得られるeAPC:eTPC分析システム内で、被分析物TCRspを発現する被分析物eTPCの被分析物抗原に対するシグナル応答の特徴決定に用いるための、請求項1~12のいずれか1項に記載の二部構成デバイスから得られる被分析物eTPC。
- 請求項1~13のいずれか1項に記載の二部構成デバイスから得られる入力の被分析物eTPC又は請求項1~13のいずれか1項に記載の二部構成デバイスから得られる被分析物eTPCのライブラリーから1又は2以上のeTPCを選択して、1又は2以上の被分析物eTPCを得る方法であって、発現されたTCRspが請求項4に規定される1又は2以上の被分析物抗原に結合し、
a.1又は2以上の被分析物eTPCを1又は2以上の被分析物eAPCと組み合わせて被分析物TCRspと被分析物抗原との間の接触を生じさせること、及び下記
b.形成される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間の複合体の形成を測定すること、及び/又は
c.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間の複合体形成により誘導される被分析物eTPCによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
d.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間の複合体形成により誘導される被分析物eAPCによるシグナル応答を測定すること、及びe.工程b、c及び/又はdに基いて1又は2以上のeTPCを選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によりなされる
の少なくとも1つを含んでなる方法。 - 選択工程が単一細胞選別及び/又はプールへの細胞選別により行われる、請求項14に記載の方法。
- 選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、請求項15に記載の方法。
- 選別が選別された細胞プールの拡大に先行する、請求項15に記載の方法。
- 選択されたeTPCがシグナル応答の特徴決定に付され、下記:
a.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
b.eTPCが成分2Fを含有する場合には、合成シグナル伝達応答を決定すること
を更に含んでなる、請求項14~17のいずれか1項に記載の方法。 - 被分析物TCRspを発現する請求項1~11のいずれか1項に記載の二部構成デバイスから得られる1又は2以上の被分析物eTPCの発現した被分析物抗原に対するシグナル応答を誘導する被分析物抗原を同定するための請求項1~12のいずれか1項に規定される二部構成デバイスから得られるeAPC。
- 請求項1~13のいずれか1項に記載の二部構成デバイスから得られる入力の被分析物eAPC又は請求項1~13のいずれか1項に記載の二部構成デバイスから得られる被分析物eAPCのライブラリーから1又は2以上のeAPCを選択して、1又は2以上の被分析物eAPCを取得する方法であって、被分析物eAPCは、請求項4に規定される発現した被分析物抗原に対する、被分析物TCRspを発現する1又は2以上の被分析物eTPCのシグナル応答を誘導し、
下記:
a.1又は2以上の被分析物eAPCと1又は2以上の被分析物eTPCとを組み合わせて、被分析物eAPCにより提示される被分析物抗原と1又は2以上の被分析物eTPCの被分析物TCRspとの間の接触を生じさせること、及び
b.形成する場合、1又は2以上の被分析物抗原と1又は2以上の被分析物TCRspとの間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
c.誘導される場合、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される1又は2以上の被分析物eTPCにおけるシグナル応答を測定すること、及び/又は
d.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eAPCによるシグナル応答を測定すること、及び
e.工程b、c及び/又はdから1又は2以上のeAPCを選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされる
を含んでなる方法。 - 選択工程が単一細胞選別及び/又はプールへの細胞選別により行われる、請求項20に記載の方法。
- 選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、請求項21に記載の方法。
- 選別が選別された細胞プールの拡大に先行する、請求項21に記載の方法。
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