CN101180082A - 利用siv-pedf载体治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过色素上皮衍生因子(PEDF)有效的给药来治疗眼组织细胞内伴随凋亡变性的疾患的新的治疗方法。作为防止青光眼的最终病变即神经节细胞死亡的方法，本发明着眼于PEDF。并且，作为PEDF的有效的给药方法，本发明着眼于SIV载体，并构建了SIV－PEDF载体。将SIV－PEDF载体对缺血再灌注模型以及NMDA－诱导模型进行视网膜下给药，观察到对神经节细胞死亡有显著的抑制效果，并且表明SIV－PEDF载体作为青光眼等伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品是有效的。

Description

利用SIV-PEDF载体治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药物

技术领域

本发明是涉及一种使用携带有神经营养因子的慢病毒载体治疗青光眼的方法。

技术背景

青光眼是指视神经乳头以及视野的特征性变化至少出现了一项，通常情况下，通过充分降低眼内压可以改善视神经损害或者阻止进一步恶化的眼部功能性结构异常为特征的疾患。关于青光眼，如果不能够得到适当的治疗，常常会导致失明，青光眼引起的失明占我国后天失明原因的第二位。

青光眼可以分为原发性青光眼(primary glaucoma)、续发性青光眼、先天性青光眼三种，原发性青光眼又分为原发性开角型青光眼(广义)、原发性闭角型青光眼、原发性混合型青光眼。广义上的原发性开角型青光眼包括原发性开角型青光眼(狭义)及正常眼压性青光眼，正常眼压性青光眼不论眼内压在正常范围内(21mmHg以下、平均15.5mmHg)与否，是视神经受到伤害的一种疾患。据报道40岁以上的人群中大约5.8％患有青光眼，依据2000年的统计，我国的40岁以上的人口大约有6,500万人来推算，40岁以上的青光眼患者超过370万人。

青光眼的视神经损害的发生及恶化过程中，“眼内压”为重要的风险因素(Risk Factor)，在以前认为降低眼内压是唯一确实可行的治疗方法。作为降低眼内压的治疗方法，眼药水(β受体阻滞剂、前列腺素类药品、碳酸脱水酶抑制剂药品等)、内服或注射药品(碳酸脱水酶抑制剂药品、高渗透压药品)、手术(激光手术、外科手术)等方法都很常见。

但是另一方面，表明青光眼也有所谓视神经的微循环损害及脆弱等的“眼内压”以外的因子参与，指出了眼内压降低疗法的局限性。因此需要开发与眼内压降低疗法不同的青光眼治疗方法。其中最受人们关注的一种就是抑制青光眼最终病态的视网膜神经节细胞死亡(凋亡)的方法，即视网膜神经节细胞保护疗法。

一方面，神经营养因子是一类促进未分化的成神经细胞的增殖以及分化，或者成熟的神经细胞的生存以及功能维持的因子。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor：PEDF)是神经营养因子的一种。作为PEDF的生物活性，目前为止，报道告有神经分化保护和血管新生抑制两种作用。PEDF在最开始，1989年时作为促进人视网膜神经母细胞瘤Y-79细胞株的神经分化因子，从人类胎儿视网膜色素上皮细胞的培养上清中精制而来(非专利文献1)。目前有报道在体外、体内试验中对各种神经细胞具有抑制其分化诱导以及伤害导致的神经凋亡性死亡的作用。关于其机理，利用培养未成熟小脑颗粒细胞进行了研究，报道指出与转录因子NFκB的活性相关，而且诱导抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-x、以及神经营养因子NGF、BDNF的表达(非专利文献2)。另一方面，同样是以培养未成熟小脑颗粒细胞为对象的点阵芯片研究中，虽然PEDF的添加诱导了各种神经营养因子(NGF，Neurotrophin-3，GDNF)的表达，但是在利用中和抗体的分析报道中，被诱导的神经营养因子对PEDF的神经保护效果没有影响(非专利文献3)，表明保护效果是PEDF直接作用的结果。另外在1999年，报道PEDF在体外试验中，对FGF-2诱导的血管内皮细胞的迁移(migration)抑制是浓度依赖性的，其效果比血管生成抑制素及内皮抑素要高，另外在体内试验中对FGF-2诱导的角膜血管新生抑制具有统计学意义(非专利文献4)。之后，关于抑制各种血管新生模型、肿瘤血管新生现象的报告也很多。其详细的机理虽然尚不清楚，但是可以认为(1)PEDF诱导血管内皮细胞中FasL的表达，而且在血管新生过程中的血管内皮细胞内Fas有高表达，也许是Fas/FasL介导的内皮细胞凋亡可以抑制血管新生(非专利文献5)、(2)可能有细胞外的磷酸化参与(非专利文献6)、以及(3)可能涉及与细胞外基质的结合。

通过上述的凋亡抑制作用研究了神经营养因子对神经节细胞的保护方法。目前为止，已知有二例利用视网膜缺血再灌注模型进行的PEDF基因治疗的研究例子。在这些研究例中，与青光眼一样，使用神经节细胞受到伤害产生凋亡性死亡现象的“视网膜缺血再灌注模型”大鼠，来研究PEDF对细胞损害的抑制效果。上述研究例中，一个是PEDF蛋白(非专利文献7)、一个是携带有PEDF的腺病毒载体(非专利文献8)对动物的玻璃体内进行给药，在组织学上抑制了缺血再灌注引起的视网膜神经节细胞伤害。

然而，神经营养因子的分子量很大。持续地使大分子量的蛋白质到达视网膜，用目前的药物传输系统(drug delivery system)是很困难的。另外，腺病毒载体作为转导的基因在细胞核内作为游离体存在，不能被整合到染色体DNA中，随着细胞的增殖，作为不具自我复制功能的转导基因被稀释，转导基因的表达只是暂时性的。考虑到青光眼为一种进行性疾患，只期待用暂时性效果的给药方法作为青光眼的治疗方法是不合适的。另一方面，逆转录病毒载体一般通过稳定地整合到分裂细胞的染色体中，可以长期进行基因表达，目前为止，尚无利用插入有PEDF的逆转录病毒载体进行青光眼治疗的研究例。

专利文献1：国际申请序号PCT/JP2002/005225  国际公开序号WO2002/101057

专利文献2：国际申请序号PCT/JP00/03955  国际公开序号WO00/078987

非专利文献1：Tombran-Tink J，Chader GG，Johnson LV.PEDF：apigment epithelium-derived factor with potent neuronal differentiative activity.Exp Eye Res.1991 Sep；53(3)：411-4.

非专利文献2：Yabe T，Wilson D，Schwartz JP.NFkappaB activation isrequired for the neuroprotective effects of pigment epithelium-derived factor(PEDF) on cerebellar granule neurons. J Biol Chem. 2001 Nov16；276(46)：43313-9.

非专利文献3 Yabe T，Herbert JT，Takanohashi A，Schwartz JP.Treatment of cerebellar granule cell neurons with the neurotrophic factorpigment epithelium-derived factor in vitro enhances expression of otherneurotrophic factors as well as cytokines and chemokines.J Neurosci Res.2004Sep 1；77(5)：642-52.

非专利文献4：Dawson DW，Volpert OV，Gillis P，Crawford SE，Xu H，Benedict W，Bouck NP.Pigment epithelium-derived factor：a potent inhibitor ofangiogenesis.Science.1999 Jul 9；285(5425)：245-8.

非专利文献5：Volpert OV，Zaichuk T，Zhou W，Reiher F，Ferguson TA，Stuart PM，Amin M，Bouck NP.Inducer-stimulated Fas targets activatedendothelium for destruction by anti-angiogenic thrombospondin-1 and pigmentepithelium-derived factor.Nat Med.2002 Apr；8(4)：349-57.

非专利文献6：Maik-Rachline G，Shaltiel S，Seger R.Extracellularphosphorylation converts pigment epithelium-derived factor from a neurotrophicto an antiangiogenic factor.Blood.2005 Jan 15；105(2)：670-8.Epub 2004 Sep16.

非专利文献7： Ogata N，Wang L，Jo N，Tombran-Tink J，Takahashi K，Mrazek D，Matsumura M. Pigment epithelium derived factor as aneuroprotective agent against ischemic retinal injury.Curr Eye Res.2001Apr；22(4)：245-52.

非专利文献8：Takita H，Yoneya S，Gehlbach PL，Duh EJ，Wei LL，MoriK.Retinal neuroprotection against ischemic injury mediated by intraocular genetransfer of pigment epithelium-derived factor.Invest Ophthalmol Vis Sci.2003Oct；44(10)：4497-504.

非专利文献9：Miyazaki M，Ikeda Y，Yonemitsu Y，Goto Y，Sakamoto T，Tabata T，Ueda Y，Hasegawa M，Tobimatsu S，Ishibashi T，Sueishi K.Simianlentiviral vector-mediated retinal gene transfer of pigment epithelium-derivedfactor protects retinal degeneration and electrical defect in Royal College ofSurgeons rats.Gene Ther.2003 Aug；10(17)：1503-11.

发明内容

本发明为鉴于上述状况的发明，本发明要解决的问题是通过有效传输PEDF，构建用于治疗青光眼等的伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药物。

本发明解决的是发现一种新的治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的方法。

为解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，着眼于逆转录病毒载体——来自猴子的慢病毒，特别是猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiencyvirus：SIV)的载体，利用该载体作为PEDF给药的方式。本发明人通过所谓的猴免疫缺陷病毒(SIV)载体的视网膜下给药的基因转导法，使治疗基因在视网膜内长期稳定地表达成为可能，还可以超越目前的药物传输系统的限制。也就是说，通过SIV载体的基因转导可以期待以下几点：(i)不受血脑屏障(BRB)的影响，(ii)可以维持治疗有效浓度，减轻副作用，(iii)可以降低治疗制剂的多次给药所产生的成本。另外，本发明人将加入有PEDF的SIV载体给药到视网膜色素变性模型动物，并且验证了对视细胞死亡(凋亡)具有明显的统计学意义的抑制效果(非专利文献9)。综上所述，携带有神经营养因子的SIV载体给药可以成为有效的青光眼视网膜神经节细胞死亡的神经保护疗法。

本发明人在研究应用加入有PEDF的SIV载体(以下记述为“SIV-PEDF载体”)对青光眼进行治疗之际，使用了改造型的SIV载体。改造型的SIV载体是对以前的SIV载体的安全性以及性能提高进行改造的载体。改造点有：第一、在用于SIV载体制造的基因转染换载体中转导cPPT(centralpolypurine tract)序列以及WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptionalregulatory element)序列，以提高基因转导效率以及表达效率。第二、从包装载体除去辅助基因(vif，vpr，tat)，然后通过将rev序列转移到其它载体以提高安全性。

本发明人，利用缺血再灌注模型动物以及NMDA-诱导模型动物，对上述的改造型SIV-PEDF载体对青光眼的应用进行了研究。严格意义上来讲，对小动物进行青光眼造模是一件很困难的事情，通常来说，将由于青光眼而受伤害的神经节细胞进行人为伤害的上述模型被用于对青光眼的研究。缺血再灌注模型是通过提高眼内压造成缺血状态后再灌注，使神经节受到急剧伤害的模型。NMDA-诱导模型是一种通过NMDA给药，只对神经节细胞选择性地伤害的模型。研究如下进行。将SIV-PEDF载体给药到动物(大鼠)的视网膜下以后，通过缺血再灌注或者NMDA对神经节细胞进行伤害。在这之后，将DAPI(4′，6-diamidino-2-phenylindole，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)注入到两眼视上丘，对神经节细胞进行标记，计数标记神经节细胞的数量，不论哪种模型式，在SIV-PEDF载体给药组中，都可以观察到神经节细胞数量的减少受到了显著的抑制。通过这些结果，首次证明SIV-PEDF载体可以有效地保护神经节细胞，是一种有效的青光眼治疗药品。进而，本发明的SIV-PEDF对伴随凋亡变性的其它眼科疾患与青光眼一样有效。也就是说，本发明涉及SIV-PEDF载体对伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗，更具体的发明说明如下。

[1]用于治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药物，该药物包含带有色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor：PEDF)基因的重组猴免疫缺陷病毒载体、以及药学可使用的介质。

[2]项[1]中记述的药物，其中所述的猴免疫缺陷病毒载体包括cPPT序列和/或WPRE序列。

[3]项[1]或者[2]中记述的药物，其中所述猴免疫缺陷病毒载体已用VSV-G假型化。

[4]项[1]到[3]任意一项记述的药物，其中所述猴免疫缺陷疫病毒载体来自agm株。

[5]项[1]到[4]中任意一项记述的药物，其中所述伴随着眼组织细胞凋亡变性的疾患为青光眼、视网膜色素变性、视网膜脱落、视网膜缺血性疾患中的任意一项。

[6]治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的方法，其包括用带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷疫病毒载体进行给药。

[7]项[6]中记述的方法，包括用带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行视网膜下给药，玻璃体内给药，或者前房内给药的步骤。

[8]项[1]到项[5]任意一项中记述的药物的制造方法，该方法使用基因转移载体，该载体包含在序列号：1中记述的碱基序列中插入PEDF基因的碱基序列。

[9]项[8]中记述的药物的制造方法，该方法利用包含序列号：2中记述的碱基序列的基因转移载体。

[10]项[8]或者项[9]中记述的药物的制造方法，包含向包装细胞中导入所述基因转移载体的步骤，所述包装细胞为已经向其中导入了包含序列号：3的碱基序列的包装载体的包装细胞。

[11]编码猴免疫缺陷病毒基因组RNA的载体，包含序列号：1中记述的碱基序列或者在该序列中插入了外源基因的序列。

[12]项[11]中记述的载体，其中所述外源基因是PEDF。

[13]猴免疫缺陷病毒，包含从项[11]或者[12]中记述的载体所转录的基因组RNA。

[14]项[13]中记述的猴免疫缺陷病毒，其已用VSV-G假型化。

附图说明

图1：表示改造型基因转移载体、改造型包装载体、rev表达载体、VSV-G表达载体结构示意图。

图2A：说明从原始型基因转移载体构建改造型基因转移载体工艺的示意图。(α)为图2B工艺的延续。

图2B：为图2A延续的示意图。(α)表示图2A工艺的延续。

图3：说明从原始型包装载体构建改造型包装载体工艺的示意图。

图4A：说明rev表达载体的构建工艺的示意图。(β)表示图4B工艺的延续。

图4B：图4A延续的示意图。(β)表示图4A工艺的延续。

图5：(a)说明单独携带cPPT、单独携带WPRE、同时携带cPPT以及WPRE的原始型基因转移载体的结构示意图。(b)利用单独携带cPPT、单独携带WPRE、同时携带cPPT以及WPRE的各基因转移载体，以MOI为15感染细胞时，观察到的SIV载体的产量的照片。左上：原始型的无cPPT和WPRE的载体(对照)(-cPPT，-WPRE)、右上：单独携带cPPT的载体(+cPPT，-WPRE)、左下：单独携带WPRE的载体(-cPPT，+WPRE)、右下：同时携带cPPT以及WPRE的载体(+cPPT，+WPRE)。

图6：利用单独携带cPPT、单独携带WPRE、同时携带cPPT以及WPRE的各基因转移载体时的SIV载体的产量对外源基因(EGFP)阳性细胞数量之比的研究结果。(a)表中的MOI表示每1个细胞中感染的载体粒子数量，0.3，1.5，7.5，15表示的是实际进行感染实验的MOI(载体粒子数/细胞数)的数值。在cPPT或者WPRE后面记述的(+)表示载体中含有cPPT或者WPRE，(-)表示的是载体中不含cPPT或者WPRE。表中数字为EGFP阳性细胞的比例(百分率：％)。(b)图为是(a)表数值的图形化表示。图的纵坐标表示的是EGFP阳性细胞的比例(百分率：％)。

图7：表示的是利用单独携带cPPT、单独携带WPRE、同时携带cPPT以及WPRE的各基因转移载体，以MOI为15感染细胞时，相对细胞数量的蛋白表达量的比较结果。数值表示的是荧光强度的相对值(为蛋白表达量的比较尺度)。

图8：是对缺血再灌注模型给予SIV-PEDF载体时所观察到的标记的神经节细胞的结果照片。无载体给药/非缺血再灌注损害组(未进行缺血再灌注损害处理也未进行载体给药的大鼠)、无载体给药/缺血再灌注损害组(未进行载体给药的缺血再灌注损害大鼠)、SIV-空载体给药组(载体对照组、对缺血再灌注损害模型给予空载体的大鼠)、SIV-hPEDF给药组(治疗组、对缺血再灌注损害模型给予SIV-hPEDF载体的大鼠)。

图9：是对缺血再灌注模型给予SIV-PEDF载体时的标记的神经节细胞数量的示意图。无载体给药/缺血再灌注损害组(未接受载体给药的缺血再灌注损害大鼠)、SIV-空载体给药组(载体对照组、对缺血再灌注损害模型给予空载体的大鼠)、SIV-hPEDF给药组(治疗组、对缺血再灌注损害模型给予SIV-hPEDF载体的大鼠)。

图10：对NMDA-诱导模型给予SIV-PEDF载体时，观察标记的神经节细胞的结果照片。(a)为SIV-空载体视网膜下给药组、(b)为SIV-hPEDF载体视网膜下给药组。

图11：对NMDA-诱导模型给予SIV-PEDF载体时的标记的神经节细胞数量示意图。无载体给药/非NMDA-诱导组(未进行NMDA处理也未进行载体给药的大鼠)、无载体给药/NMDA-诱导组(未进行载体给药的NMDA-诱导的大鼠)、SIV-空载体给药组(载体对照组、NMDA-诱导模型给予空载体的大鼠)、SIV-hPEDF给药组(治疗组、NMDA-诱导模型给予SIV-hPEDF载体的大鼠)。

本发明涉及治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药品，特征在于包含带有色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor：PEDF)基因的重组猴免疫缺陷病毒载体、以及药学可使用介质用医。

病毒的生命周期大致可以分为感染和增殖两个阶段。特征在于，一般来讲病毒载体利用病毒的感染系统，将基因有效地导入宿主细胞内。为了确保安全性，去掉了多数病毒载体的增殖系统，使其缺乏自我复制能力，防止在导入的细胞内增殖。

简要地说明一下载体粒子的构造，载体粒子中有被叫做衣壳的蛋白质外壳。衣壳是由gag基因产物的结构蛋白质构成的。其衣壳的外侧有被叫做被膜的膜结构。被膜具有决定所感染细胞种类的功能。在衣壳中，存在2份载体基因组RNA拷贝和pol基因产物的逆转录酶。病毒载体一旦感染宿主细胞、载体基因组RNA会通过自己的上述逆转录酶进行逆转录，之后整合进宿主染色体中，成为前病毒DNA，而具有感染能力。

一般来说病毒载体可以通过包装载体和基因转移载体进行制备。包装载体携带有除去了包装信号的病毒DNA。病毒DNA中含有病毒蛋白质序列。将包装载体导入宿主后，在宿主细胞(包装细胞)中，由于没有包装信号，所以形成空的病毒颗粒。另一方面，基因转移载体携带有整合进宿主染色体DNA所必要的来源于病毒的基因序列及要转导的外源基因。将这个基因转移载体导入到包装细胞中后，由基因转移载体提供的载体基因组DNA被整合进宿主染色体，通过转录形成载体基因组RNA。该载体基因组RNA被包埋进包装细胞产生的病毒颗粒中，生成具有导入核酸分子进入宿主内部能力的病毒颗粒。

在本发明中的“病毒载体”是指缺乏自我复制能力，具有导入核酸分子进入宿主内部能力的病毒颗粒。“重组”病毒载体是指通过基因重组技术构建的病毒载体而言的。利用编码病毒基因组的DNA和包装细胞构建的病毒载体包含在重组病毒载体中。

本发明中的“猴免疫缺陷病毒(SIV)载体”是指在病毒颗粒中的核酸分子内，作为病毒载体功能所必需的序列为SIV基因组由来序列的载体。本发明中的“作为病毒载体功能所必需的序列”是指从5’端开始顺次为5’LTR的R区域、U5区域、包装信号

、RRE、3’LTR的启动子区域以外的U3区域、R区域的序列。从5’LTR区域开始到包装信号的碱基序列表示为序列号：4、RRE序列表示为序列号：5、缺失3’LTR的启动子区域的U3区域到R区域的碱基序列表示为序列号：6。本发明中的SIV载体只要与上述定义相符也可加以改造，例如，“作为病毒载体功能所必需的序列”只要来自SIV，其他来自SIV的序列或者来自SIV以外的序列也可以包含在内。作为可包含的最适序列来讲，例如可以列举后面记述的cPPT、内部启动子(CMV)、WPRE。

在本发明中，猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus；SIV)包括有SIV的所有株系以及其亚型。作为SIV单离株来说，可以例举出SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm、SIVsyk等，但并不仅限于这些病毒株。

猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)是作为猴子的HIV样病毒被发现的，与HIV一起构成灵长类慢病毒(Primates Lentivirus)群(井户荣治，速水正宪，サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染·病原性.蛋白质核酸酵素：Vol..39，No.8.1994)。进而这个群又大致分类为四个群：1)包含成为人类获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficiencysyndrome，AIDS)病原的HIV-1和从黑猩猩分离的SIVcpz的HIV-1群、2)从白顶白眉猴(Cercocebus atys)分离的SIVsmm和从猕猴(Macaca mulatta)分离的SIVmac、以及对人类感染频率较低的，具有病原性的HIV-2(Jaffar，S.et al.，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.，16(5)，327-32，1997)构成的HIV-2群、3)由非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)中分离出来的SIVagm为代表的SIVagm群、4)由山魈(Papio sphinx)分离出来的SIVmnd为代表的SIVmnd群组成。

其中，SIVagm以及SIVmnd没有自然宿主的病原性报道(Ohta，Y.et al.，Int.J.Cancer，15，41(1)，115-22，1988；Miura，T.et al.，J.Med.Primatol.，18(3-4)，255-9，1989；速水正宪，日本临床，47，1，1989)、特别是在本实施例中使用的SIVagm中的一种TYO-1株，据报道即使是在自然宿主中，对食蟹猴(Macaca facicularis)、猕猴(Macaca mulatta)的感染实验中也未表现出病原性(Ali，M.et al，Gene Therapy，1(6)，：367-84，1994；Honjo，S.et al.，J.Med.Primatol.，19(1)，9-20，1990)。由于没有关于SIVagm对人类感染、致病的报道，对人类的病原性不得而知，一般来说，灵长类的慢病毒的种特异性很高，从自然宿主致使其他种类感染、致病的病例很少，并且具有其致病频率低或者进程缓慢的倾向。(Novembre，F.J.et al.，J.Virol.，71(5)，4086-91，1997)。因此，以SIVagm、特别是SIVagm TYO-1株为基础制备的病毒载体同以HIV-1以及其他慢病毒为基础制备的载体相比，安全性更高，最适合在本发明中使用。SIVagm TYO-1株的基因组碱基序列用序列号：7来表示。

本发明的猴免疫缺陷病毒载体可以拥有其它逆转录病毒的基因组RNA序列的一部分。例如，具有将人类免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus；HIV)、猫免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus：FIV)(Poeschla，E.M.et al.，Nature Medicine，4(3)，354-7，1998)、山羊关节炎脑炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus：CAEV)(Mselli-Lakhal，L. et al.，Arch.Virol.，143(4)，681-95，1998)等其他慢病毒的基因组序列的一部分与猴免疫缺陷病毒基因组一部分相置换而成的嵌合序列的载体也包含在本发明的猴免疫缺陷病毒载体中。

带有本发明的色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor：PEDF)基因的重组猴免疫缺陷病毒载体(SIV-PEDF载体)是指携带PEDF基因的重组SIV载体。将人类PEDF(hPEDF)的cDNA序列用序列号：8表示。本发明的SIV-PEDF载体只要符合上述定义，是与种类以及结构无关的，最优选的例子为利用含有在序列号：1中记述的碱基序列中插入PEDF基因的碱基序列的基因转移载体来制备的SIV载体，更优选的例子是利用含有序列号：2中记述的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体。

本发明的SIV-PEDF载体可以进行VSV-G假型化。VSV-G假型化是指，使载体的被膜包含水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的表面糖蛋白质VSV-G蛋白而言的。VSV-G蛋白可以是来源于任意VSV株的蛋白质。例如，可以使用来自Indiana血清型毒株(J.Virology 39：519-528(1981))的VSV-G蛋白，但不仅限于此。另外，VSV-G蛋白可以是天然蛋白质的衍生物，通过一个或者多个氨基酸置换，缺失，和/或增加得到的修饰蛋白质。VSV-G假型化载体可以在病毒产生时通过与VSV-G蛋白共存来制备。例如，通过VSV-G表达载体的转染、来自整合入宿主染色体DNA的VSV-G基因的表达诱导、或者通过使VSV-G在包装细胞内进行表达，经由这个细胞产生的病毒颗粒可以被VSV-G假型化。由于VSV-G蛋白是一种糖蛋白会形成稳定的3聚体，存在于细胞膜上，因此纯化过程中不会引起载体粒子的破坏，可以用离心进行高浓度的浓缩(Yang，Y.et al.，HumGene Ther：Sep，6(9)，1203-13.1995)。

本发明的SIV-PEDF载体可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白质。例如，作为这种蛋白质，最好的是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白质。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒兼嗜性病毒被膜蛋白等。作为这种逆转录病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV10Al的被膜蛋白(例如pCL-10Al(Imgenex)(Naviaux，R.K.et al.，J.Virol.70：5701-5705(1996))。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出，例如单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白、EB病毒的gp350，gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。

对于本发明的重组猴免疫缺陷病毒载体来说，可以对LTR(long terminalrepeat)进行改造。LTR为逆转录病毒特征性序列，位于病毒基因组的两端。5′LTR作为启动子发挥作用，促进来自前病毒的mRNA的转录。因此，如果将包装在病毒颗粒内的具有编码病毒RNA基因组的基因转移载体的5′LTR的启动子活性的部分置换为其它的强有力的启动子的话，可増加基因转移载体的mRNA转录量，提高包装效率，使载体滴度提高。进而，例如慢病毒的情况下，已知5′LTR的转录活性被病毒蛋白质tat促进，将5′LTR置换成不依赖tat蛋白质的启动子时，可以从包装载体中删除tat。另外，感染细胞并侵入细胞内的病毒RNA发生逆转录之后，形成使两端的LTR结合在一起的环状结构，结合部位与病毒的整合酶偶联，而被整合进细胞的染色体中。由前病毒转录的mRNA是从5′LTR内的转录起始点开始至下游3′LTR polyA的序列，5′LTR的启动子部分未被包装在病毒内。因此，即使置换启动子，插入靶细胞的染色体的部分也不发生变化。综上所述，5′LTR的启动子的置换实现了更高的滴度与更高安全性的载体制备。因此，可以进行基因转移载体的5′端启动子的置换以及提高被包装载体的滴度。

另外，删除部分3′LTR的序列，通过制备防止从靶细胞载体全长mRNA转录的自我失活型载体(SelfInactivating Vector：SIN载体)，可以提高其安全性。侵染到靶细胞染色体的慢病毒的前病毒，形成3′LTR的U3部分与5′端结合的形式。因此，基因转移载体的转录产物在逆转录后，处于整合进靶细胞染色体的状态，U3定位于5′端，在此与来自基因转移载体的转录产物具有同样结构的RNA可以被转录。假设在靶细胞内有慢病毒或者其类似蛋白质存在的情况下，转录的RNA被再次包装，有可能对其它细胞进行再次感染。另外通过3′LTR的启动子，位于病毒基因组的3′端的来自宿主的基因有可能被表达(Rosenberg，N.，Jolicoeur，P.，Retoroviral Pathogenesis.Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press，475-585，1997)。这种现象在逆转录病毒载体中已经被视为一种问题，作为回避方法，开发了SIN载体(Yu，S.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，83(10)，3194-8，1986)。通过使基因转移载体上的3′LTR的U3部分缺失，令靶细胞内没有5′LTR及3′LTR的启动子，就不会发生全长RNA及宿主基因的转录。然后，只有来自内部启动子的目的基因进行转录，以实现安全性提高，以及载体表达提高。这样的载体最适用于本发明。SIN载体的构建可以按照常规方法或者本发明人的专利申请：国际公开号WO2002/101057(专利文献1)的实施例1-4中记述的方法等进行。

使用逆转录病毒载体等在其基因组中包含LTR序列的病毒载体进行基因治疗的问题之一是导入的基因表达逐渐下降。原因之一是这些载体一旦被整合进宿主基因组中，由于宿主的作用机理造成其LTR被甲基化，导入基因的表达受到抑制。(Challita，P.M.and Kohn，D.B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2567，1994)。自我失活(SIN)型载体一旦被整合进宿主基因组就会丢失大部分LTR序列，优点是不受LTR的甲基化引起的基因表达钝化的影响。本发明人通过将基因转移载体的3′LTR的U3区域置换为其它启动子序列制备的自我失活型载体在导入灵长类ES细胞之后，已证实可以维持两个月以上的稳定表达(专利文献1)。这样，通过改造LTR U3区进行自我失活设计的SIN载体特别适用于本发明。具体来说，3′LTR的U3区域的1或者多个碱基通过置换，缺失，和/或增加等进行改造的载体归属于本发明。这个U3区域既可以仅为缺失，也可以为在该区域内插入其它的启动子。作为这样的启动子来说，例如可以列举出CMV启动子、EF1启动子、或者CAG启动子等。

另外，最优选的设计为，通过LTR以外的启动子转录编码本发明载体的PEDF基因。例如，如上所述，将LTR U3区域置换成非LTR启动子的情况下，最优选的是，通过这种改造的LTR驱动PEDF基因的表达。或者如实施例所示，在与LTR区域不同的位置上加入非LTR启动子，通过连接其下游PEDF基因，可以诱导非LTR依赖的PEDF基因的表达。本发明人，通过构建非LTR启动子驱动的外源基因表达的SIV载体表明在ES细胞中的外源基因可以长期稳定地表达(专利文献1)。同样，在PEDF基因的上游连接非LTR启动子，由该启动子导致的PEDF基因转录的载体特别适用于本发明。作为非LTR启动子来说，例如可列举出CMV启动子、EF1启动子、或者CAG启动子，尤其是CMV启动子最好。在本实施例中使用的CMV启动子的碱基序列用序列号：9来表示。这种载体，尤其是在上述自我失活(SIN)型载体构建中会发挥较高的效果。

以HIV载体为首的慢病毒载体，在宿主基因组带有全部HIV前病毒的情况下，有报道指出外源载体和内源性前病毒之间会发生重组，担心会不会出现可复制的病毒。这在将来实际给HIV感染患者使用HIV载体时确实是一个很大的问题。这次使用的SIV载体由于几乎没有与HIV相同的序列，是删除掉80％以上的病毒来源序列的不可复制病毒，因此这种危险性极小，与其他慢病毒载体相比安全性很高。本发明的SIV-PEDF载体是删除了上述“作为病毒载体功能所必需的序列”以外的一定百分比的SIV基因组序列的载体，最优选的是这个载体中来源自SIV的基因组序列的40％以上、或者是50％以上、或者是60％以上、或者是70％以上、更优选的是80％以上被删除掉的不可复制病毒。

在逆转录病毒的产生中，使宿主细胞中包含包装信号的基因转移载体DNA发生转录，在gag，pol蛋白以及被膜蛋白质存在的情况下，形成病毒颗粒。包装细胞内的gag，pol蛋白可以使用包装载体进行提供。被膜蛋白也可由包装载体进行提供，也可以由其它载体进行提供。例如实施例所示，可以由VSV-G表达载体进行提供。

本发明的基因转移载体最基本地要具有5’LTR、包装信号序列、PEDF基因或者FGF2基因和3’LTR序列。LTR序列也可以进行上述的SIV载体改造的LTR改造。另外，也可以加入上述的cPPT序列、CMV序列、RRE序列等。基因转移载体DNA中编码的包装信号序列，为了能维持该序列形成的结构功能，最好尽可能长地加入进去，另一方面，为了抑制该载体DNA上的包装信号与供给gag，pol蛋白的包装载体之间发生重组出现的野生型病毒的频率，需要将这些载体间的重复序列控制在最小限度范围内。因此，在基因转移载体DNA的构建中，为了使包装效率以及安全性二者都得到满足，最好使用包含有尽可能短的包装所必需的序列。

例如，使用来自SIVagm的包装载体的情况下，由于来自HIV的基因转移载体未被包装，因此，作为用于基因转移载体DNA的包装信号来源，只受SIV的限制。但是，使用来自HIV的包装载体的情况下，由于来自SIV的基因转移载体也会被包装，使重组病毒的出现频率下降，所以可以将来自不同慢病毒的基因转移载体和包装载体进行组合并形成载体粒子。如此制备的SIV载体也包括在本发明的载体中。在这种情况下，最优选的是灵长类慢病毒之间产生的组合(例如，HIV和SIV)。

在基因转移载体DNA中，最好将gag蛋白改造为非表达。病毒gag蛋白对于生命体来说，被作为异物识别，有可能表现出抗原性。另外，也有可能影响到细胞的功能。要使gag蛋白不表达，可以通过gag起始密码子的下游碱基的增加或者缺失等进行框移改造。另外，最好是在gag蛋白的编码区域产生部分缺失。一般来说，在病毒的包装中，gag蛋白质的编码区域的5′端是必要的。因此，在基因转移载体中，最好是使gag蛋白的C末端的编码区域缺失。在不对包装效率产生很大影响的范围内，尽可能大范围地删除gag编码区域。另外，最好将gag蛋白的起始密码子(ATG)置换成ATG以外的密码子。置换的密码子应适宜地选择对包装效率没有影响的。具有依此构建的包装信号的基因转移载体DNA，通过导入到适当的包装细胞中，就可以进行病毒载体生产了。生产的病毒载体比如可以从包装细胞的培养上清中进行回收。

进而，在基因转移载体DNA中，最好进行以提高PEDF基因的导入效率以及表达效率的改造。比如进行提高导入效率的改造例子，可以列举cPPT(central polypurine tract)序列的导入。cPPT原本是存在于SIV基因组的一个序列。在HIV病毒中很久以前就有报道(P.Charneau et al.：J.Virol 65：2415-2431，1991)，报道指出，在HIV载体中导入cPPT后，载体基因组向细胞核的移动加快，基因导入效率提高(A.Sirven et al.：Blood 96：4103-4110，2000)。在本实施例中使用的cPPT碱基序列用序列号：10来表示。另外作为提高表达效率的改造例子，可以列举WPRE(woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element)序列的转导。WPRE是具有提高基因表达效率功能的因子(US Patent 6284469：RNA export element and methodsof use)。有报道指出在其它的慢病毒载体中，同时导入cPPT和WPRE两个因子，最终可以进一步提高各自的效果(SC.Barry et al.：Hum.Gene Ther.12：1103-1108，2001)。在本实施例中使用的WPRE碱基序列用序列号：11来表示。在本发明的SIV-PEDF载体中，cPPT可以采用与常见的慢病毒载体的定位一样的定位。例如、cPPT可以定位在启动子与外源基因之间，或者定位在RRE序列的上游，最好是定位在驱动PEDF转录的上述非LTR启动子的上游。WPRE可以定位在PEDF基因的下游。作为这种基因转移载体最好的具体实例，可以举出使用包含在序列号：1中记述的碱基序列中插入PEDF基因的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体，更好的例子为，使用包含序列号：2中记述的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体。

在本发明中，包装载体可以使用删除了PEDF基因的转导非必需的序列的载体。作为非必需序列，可以列举出被称作修饰基因的vif，vpr和调控基因的tat，rev。有报道指出修饰基因产物在载体中是非必需的(V.Kim et al.：J.Virol 72：811-816，1998)，近年来，为了提高安全性，经常使用删除了修饰基因的载体。另外，tat也可删除，rev可用其它质粒移走，使安全性进一步提高，是开发中的所谓第三代载体。从包装载体中去除掉rev的情况下，可以另外构建rev表达载体，在本发明的SIV-PEDF载体的制备中可以使用该rev表达载体。SIVagm TYO-1株的rev的碱基序列用序列号：12来表示。按上述方法构建的包装载体，例如，可以进行包括启动子序列、病毒核心蛋白质序列(gag)、逆转录酶序列(pol)、polyA序列在内的构建，如实施例所示，在上述构建中再加上RRE序列。另外rev表达载体可以将调控该序列的启动子放置在rev序列的上游、将polyA序列放置在rev序列的下游进行构建。

作为用于包装细胞的细胞来说，通常来讲只要是用于病毒生产的细胞株都可以。考虑到应用于人类的基因治疗，细胞来源以人类的或者猴子的较为适宜。可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293EBNA细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。

本发明的SIV-PEDF载体实质上可以进行完全纯化。纯化方法包括过滤器过滤，离心分离，以及柱层析纯化等已知的纯化/分离方法来进行。例如将载体悬液通过0.45μm的过滤器进行过滤后，42500×g、90分钟、4℃下进行离心，可以对载体进行沉淀和浓缩。

本发明的SIV-PEDF载体可以用于伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗以及预防。如实施例中所示，本发明人用疾病模型动物确认了SIV-PEDF载体对视网膜神经节细胞的保护极其有效。青光眼的最终病变是视网膜神经节细胞的凋亡。也就是说，本发明的SIV-PEDF载体通过抑制视网膜神经节细胞的凋亡，具有抑制青光眼的恶化、预防、治疗等效果。另外，除了青光眼之外，还可以广泛应用于伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗。本发明的SIV-PEDF载体可以根据需要在药理学可使用的所希望的载体材料或者介质进行适当组合，作为伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品。“药学可使用的介质”是指可以与载体一起给药，所述介质是对基因的导入没有统计学意义上的抑制的材料。具体来讲，例如可以考虑使用灭菌水、生理盐水、培养液、血清、生理盐水的磷酸盐缓冲液(PBS)等适当的组合。此外，其它的还可以含有稳定剂、杀菌剂等。用含有本发明的SIV-PEDF的伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患治疗用医药品进行给药的情况下，只要能得到视网膜神经节细胞保护的效果，对给药途径没有特别要求，最好是视网膜下给药、玻璃体内给药、前房内给药、最优选的是视网膜下给药、玻璃体内给药。包含本发明的SIV-PEDF的药物的给药量(每一个眼球用量)，例如可以是2.5×10⁵TU-2.5×10⁸TU、最优选用量是5.0×10⁵TU-5.0×10⁷TU。

另外，在本说明书中引用的全部前期技术文献都作为参考编入本说明书中。

实施例

以下实施例有助于理解本发明。但不限于本发明以下的实施例内容。

实施例1 VSV-G假型SIV载体的构建

载体的构建使用了如图1中所示的4种质粒(基因转移载体、包装载体、rev表达载体、VSV-G表达载体)。关于其中基因转移载体、包装载体、及rev表达载体这3种，它们是通过改造原始型载体质粒(PCT/JP00/03955)而制备的。关于VSV-G表达载体使用没有经过改造的原始型载体。

在质粒制备时，使用了市场上出售的各种试剂盒。限制性内切酶使用New England Biolabs公司的产品，质粒DNA的提取，纯化，回收使用QIAGEN的试剂盒(QIAquick PCR purification kit，QIAquick NucleotideRemoval kit，QIAquick Gel extraction kit，Plasmid Maxi kit)。PCR使用TaKaRa的EX Taq酶，所用引物对外委托SIGMA GENOSYS JAPAN合成。DNA末端的脱磷酸化使用TaKaRa的碱性磷酸酶(来自E.coli C75)。连接时使用TaKaRa的DNA Ligation kit ver.2，转化使用TOYOBO的DH5αCOMPETENT high感受态细胞。

1-1.基因转移载体的改造

向原始型基因转移载体中导入cPTT(中心多嘌呤管道，central polypurinetract)以及WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控因子，woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element)，以改造基因转移载体的性能(图2A，B)。使用的原始型基因转移载体为非病原性的非洲绿猴免疫缺陷病毒的克隆株SIVagm作为基本载体，顺次具有5’LTR区域、RRE、CMV(巨细胞病毒，cytomegalovirus)启动子、EGFP(增强型绿色荧光蛋白，enhanced greenfluorescent protein)基因、3’LTR。该原始型基因转移载体是本发明人构建出来的载体，并已对构建方法等进行了报道(专利文献2)。该原始型基因转移载体的碱基序列用序列号：13来表示。

具体的载体改造方法如下。首先，用限制性内切酶Sac II酶切原始型的基因转移载体，样品进行电泳，去除CMV启动子和EGFP基因后，进行自我连接。其次，为了消除质粒的Not I位点，用Not I酶切上述载体，将酶切末端用T4 DNA聚合酶平滑化处理，然后进行自我连接。

接下来，将上述载体用限制性内切酶Sac II酶切，进行BAP处理，将酶切末端脱磷酸化处理。以原始型的基因转移载体作为模板，用引物1F(序列号：14)和1R(序列号：15)进行PCR反应，将PCR产物用Sac II酶切，制备成在CMV启动子(序列号：9)的末端添加有Sac II位点的片断。将该CMV启动子片断连接到BAP处理过的上述载体的Sac II位点上。

将载体依次用Not I、BamH I进行酶切，在其酶切位点将两种合成的寡聚DNA2F(序列号：16)和2R(序列号：17)进行退火制备好的接头连接上，以改变限制性内切酶的位点。将载体用限制性内切酶Sac II酶切，进行BAP处理，将酶切末端进行脱磷酸化处理。

为了得到导入用的cPTT片断(序列号：10)，将含有SIVagmTYO1基因组(序列号：7)的质粒pSA212作为模板，用引物3F(序列号：18)和3R(序列号：19)进行PCR反应。将该PCR扩増片断的末端用SAC II酶切，制备成在cPPT的两端添加有SAC II位点的片断。将cPPT片断连接到BAP处理的上述载体的Sac II位点上。

将载体用BamH I酶切，进行BAP处理，将酶切末端进行脱磷酸化处理。为了得到导入的WPRE片断，以装有WPRE cDNA(序列号：11)的质粒作为模板，用引物4F(序列号：20)和4R(序列号：21)进行PCR反应。将得到的PCR扩増产物的末端用BamH I和Bgl II酶切，制备成在WPRE的末端添加有限制性内切酶位点的片断。将上述WPRE片断连接在载体的BamH I位点上，最终得到无携带基因的改造型基因转移载体(序列号：1)。

制备携带基因片断，并加入到上述的改造型基因转移载体Not I位点上。EGFP片断以装有EGFP cDNA(序列号：22)的质粒作为模板，用引物5F(序列号：23)和5R(序列号：24)进行PCR反应，用Not I酶切后进行制备。PEDF片断以装有hPEDF cDNA(序列号：8)的质粒作为模板，用引物7F(序列号：25)和7R(序列号：26)进行PCR反应，进行pGEM-TEasy vector载体(Promega公司)的TA克隆，用Not I酶切进行制备。

另外，在构建含有cPPT，WPRE的质粒的同时，为了确认cPPT，WPRE的效果，分别制备了单独加入有cPPT或者单独加入有WPRE的基因转移载体。

1-2.包装载体的改造

在原始型包装载体中除了gag，pol之外，还包括被称作修饰基因vif，vpr和被称作调控基因的tat，rev。然而，已知修饰基因产物在载体中是非必须的(V.Kim et al.：J.Virol 72：811-816，1998)，近年来，为了提高安全性，使用删除了修饰基因的载体。另外，tat也被删除，rev通过其它的质粒移去，而更加安全，开发了被称作第三代的载体，目前，载体的第三代化成为当务之急。因此即使在本发明中，从原始型包装载体(序列号：27)中去除辅助的基因(vif，vpr，tat)，将rev转移至别的质粒，提高了安全性(图3)。方法基本上为以前报道的HIV载体的方法(T.Dull.et al.：J.Virol72：8463-8471，1998)。

具体来讲，首先，将包装载体的质粒用限制性内切酶Not I酶切，接着用EcoT22I酶切。样品进行电泳，除去EcoT22I-Not I片断，回收片断较大的载体片断和作为pol基因一部分的EcoT22I-EcoT22I片断。

将这两种合成寡聚DNA1 F(序列号：28)和1R(序列号：29)进行退火而制备好的接头与上述载体的EcoT22I-Not I位点进行连接。接下来将载体用EcoT22I酶切，进行BAP处理，将酶切末端脱磷酸化处理，在BAP处理的EcoT22I位点加入回收好的pol基因的EcoT22I片断。

将上述载体用Not I酶切，进行BAP处理，将酶切末端脱磷酸化处理。为了得到RRE片断，将原始型的包装载体(序列号：27)作为模板，用引物8F(序列号：30)和8R(序列号：31)进行PCR反应，进行pGEM-T Easyvector载体(Promega公司)的TA克隆。用Not I将RRE片断切出。连接RRE片断于脱磷酸化处理的载体Not I位点，最终得到改造型包装载体(序列号：3)。

1-3.rev表达载体的构建

rev蛋白目前为止依靠原始型的包装载体供给，随着上述包装载体改造，将rev蛋白以其它的表达质粒的形式进行供给，重新构建了表达载体。Rev在基因组上的内含子被分成为两部分，将它们连接在一起，加入到表达质粒中(图4A，B)。

首先，以原始的包装载体作为模板，通过PCR制备成两条片断。5’端的片断使用引物1F(序列号：32)和1R(序列号：33)，3’端的片断使用引物2F(序列号：34)和2R(序列号：35)进行扩増。回收两种PCR片断，混合，作为PCR的模板，使用引物1F和2R进行扩増，得到以连接两个片断为目的的rev基因断片(序列号：12)。将PCR扩増的rev片断TA克隆到pGEM-T Easy vector载体。接下来，将该载体用EcoR I酶切，回收添加有EcoR I位点的rev片断。另一方面，将蛋白表达pCI载体(Promega公司)用EcoR I酶切，对酶切位点进行BAP处理。将回收的rev片断和pCI表达载体连接起来，作为rev表达载体备用。

实施例2对携带有cPPT，WPRE的SIV载体的功能评价

为了调查cPPT和WPRE的导入效果，除了cPPT和WPRE同时携带的载体外，还生产出单独携带cPPT的载体，单独携带WPRE的载体，与原始型的对照进行比较。所使用的全部基因转移载体都携带EGFP。包装载体使用原始型(序列号：27)。

2-1.SIV载体的制备

将来自人类胎儿肾细胞的细胞株293T细胞按照每一个15cm塑料培养皿大约1×10⁷(次日密度为70-80％)进行接种，在20ml含10％胎牛血清的D-MEM培养基(Gibco BRL)中进行24小时培养。24小时培养后，将培养基用10ml的OPTI-MEM培养基(Gibco BRL)进行置换，作为转染细胞备用。

按照每一个培养皿基因转移载体为6μg、包装载体3μg、VSV-G表达载体1μg溶解在1.5ml的OPTI-MEM培养基中，加入40μl的PLUS Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌，在室温下放置15分钟。基因转移载体使用cPPT和WPRE同时携带的载体，单独携带cPPT的载体，单独携带WPRE的载体或者原始型(cPPT和WPRE都不携带)的载体。在其中加入1.5ml的OPTI-MEM培养基稀释的60μl的LIPOFECTAMINE Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌，在室温下放置15分钟。

将上述的DNA复合物滴加到15cm培养皿的细胞上，小心振荡混合，在37℃，5％CO₂的孵育器中进行3小时的孵育。孵育后，在培养皿中加入13ml的含20％胎牛血清的D-MEM培养基进行培养。转染的第二天，用新鲜的含10％胎牛血清的D-MEM培养基30ml换液后进行培养。转染2天后，回收上清，用0.45μm的过滤器进行过滤，作为载体悬液备用。

2-2.SIV载体的滴度测定

SIV载体滴度包括由表达所携带基因的蛋白的细胞数目计算出的功能滴度(Functional titer：TU/ml)和由载体粒子数目计算出的数值(颗粒滴度Particle titer：颗粒/ml)。因为cPPT和WPRE的性能评价要在一致的颗粒滴度条件下对细胞进行感染和评价，因此，如下所示用斑点印迹法对颗粒滴度进行了测定。

首先，用市场上出售的试剂盒(QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA minikit)从如上述生产出来的载体悬液抽取RNA。其次，利用狭隙杂交装置在HybondN+滤膜(Amersham公司)上对RNA加样。同时通过定量曲线计算出所用质粒DNA的摩尔数量。另外，RNA的处理方法按照滤膜产品附带提供的实验步骤进行。将DNA加热并迅速冷却。将滤膜用碱固定后，进行杂交。杂交使用罗氏公司的DIG标记的信号检测系统。探针利用DIG标记的NTP进行制备，杂交后的操作使用DIG Easy Hyb，DIG Wash and BlockBuffer Set试剂盒(罗氏公司)。利用anti-DIG AP conjugate antibody抗体(罗氏公司)以及CSPD(罗氏公司)，进行化学发光，用鲁米诺图像分析仪(富士写真胶卷：LAS-1000)，对信号进行检测定量。

2-3.SIV载体对细胞的基因导入及评价

测定好颗粒滴度的4种载体如以下所示以不同感染复数(MOI，multiplicity of infection)对细胞进行感染，进行FACS分析。将293T细胞按照每1孔为1×10⁶个接种到6孔塑料培养板上，在37℃、5％CO₂下培养过夜。次日，用血球计数板计算培养板每1孔的细胞数量，除去培养板的培养基，分别加入用新鲜的含10％胎牛血清的2ml D-MEM培养基稀释的载体，使MOI(病毒颗粒/细胞，Particles/cell)分别为0.3，1.5，7.5，15。感染1天后，将细胞的培养基用2ml的新鲜培养基进行交换。感染2天后，在荧光显微镜下观察通过载体进行基因导入的EGFP，测定EGFP阳性细胞的比例，并测定荧光强度(作为EGFP蛋白量水平的数值)。

2-4.载体功能评价的结果

以原始型的基因转移载体作为对照，生产了单独携带cPPT，单独携带WPRE，同时携带cPPT和WPRE的4种载体。载体设计的模式图如图5-(a)所示。

在测定生产出来的载体颗粒滴度的时候，未发现4种载体粒子产量的差异。用载体粒子数对MOI值(每一个细胞所感染的载体粒子数)进行统一，并将基因导入293T细胞，在荧光显微镜下进行观察。MOI为15的情况下，如图5-(b)所示，不含cPPT和WPRE的原始型的对照(-cPPT，-WPRE)中，EGFP阳性细胞的数量少，荧光弱。单独携带cPPT(+cPPT，-WPRE)时EGFP阳性细胞的数量增加。单独携带WPRE(-cPPT，+WPRE)时EGFP阳性细胞的数量与对照相比仅稍有增加，但EGFP蛋白的荧光增强。同时携带cPPT和WPRE(+cPPT，+WPRE)时，两个因子发挥了协同效果，细胞数量、荧光强度二者都比单独携带cPPT或单独携带WPRE时有大幅度的増加，得到了超出预期的结果。

在用FACS调查EGFP阳性细胞比例时(图6)，所有的基因插入比例均呈MOI依赖性的増加，而且同时携带cPPT和WPRE与对照相比，导入效率大约上升了10倍。也就是说，实际上的功能滴度(产量)上升了10倍。

另外，在调查EGFP阳性细胞的平均荧光强度时，(图7)，表明同时携带cPPT和WPRE的比单独携带WPRE的要高出很多，细胞基础的蛋白表达量也大幅度增加。

实施例3 携带治疗基因的SIV载体的大量制备及浓缩

如图1中所示的以改造型基因转移载体、包装载体、rev表达载体、以及VSV-G表达载体4种质粒为基础，对SIV载体进行如下制备。携带PEDF治疗基因的载体以每20个15cm培养皿为单位进行生产。

按照每一个15cm的塑料培养皿大约1×10⁷(次日密度为70-80％)接种293T细胞，在20ml的含10％胎牛血清的D-MEM培养基中进行24个小时培养。24小时培养后，将培养基用10ml的OPTI-MEM培养基进行置换，用于转染。按照每一个培养皿基因转移载体为10μg、包装载体5μg、rev表达载体2μg、VSV-G表达载体2μg溶解在1.5ml的OPTI-MEM培养基后，加入40ul的PLUS Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌，在室温下放置15分钟。在其中加入用1.5ml的OPTI-MEM培养基中稀释的60μl的LIPOFECTAMINE Reagent进行搅拌，在室温下放置15分钟。将该DNA复合物滴加到上述的15cm培养皿的细胞中，小心振荡混合，在37℃，5％CO₂的孵育器中进行3小时的孵育。在上述培养皿中加入13ml的含20％胎牛血清的D-MEM培养基进行培养。

转染后的次日，用新鲜的30ml含10％胎牛血清的D-MEM培养基进行交换培养。转染两天后，回收上清，加入20ml新鲜的培养基。回收的上清用0.45μm的过滤器进行过滤，在4℃下保存。转染三天后，回收上清，用0.45μm的过滤器进行过滤，与前一天回收的载体混合，利用高速离心机，进行浓缩操作。将回收的载体悬液加入到经过灭菌处理的试管中分装，在42500G，4℃下进行1小时的离心。这种离心操作重复二次，将载体悬液浓缩成500倍-1000倍。载体作为沉淀物进行沉淀，沉淀物在含5％胎牛血清的PBS中进行溶解。浓缩后的载体进行小量分装后，在-80℃下进行保存，一部分被用来进行颗粒滴度测定。颗粒滴度的测定如前述方法同样进行。

实施例4 SIV-PEDF对缺血再灌注模型动物青光眼治疗效果的探讨

把青光眼模型动物进行缺血再灌注模型建模，以探讨SIV-PEDF载体对青光眼治疗的可能性。首先将本发明的载体：SIV-hPEDF、或者不带外源基因的空载体：SIV-空载体(2.5×10⁷TU/ml、TU：转导单位)悬液对4周龄的Wistar系大鼠的视网膜下腔进行给药。载体转导14天后，使上述大鼠眼内压力置于110mmHg压力下进行60分钟缺血处理，对视网膜神经节细胞进行伤害。损害4天后，利用脑立体定位仪，将荧光色素DAPI(4′，6-diamidino-2-phenylindole)注入到两眼视上丘，对神经节细胞进行标记。视网膜神经节细胞损害7天后(载体导入21天后)摘出眼球，铺平用荧光显微镜进行观察，计数距离视神经1mm处每1mm²被标记的神经节细胞数量。

作为对照，用BSS溶液替代载体悬液给药于视网膜下腔，未进行缺血再灌注损害处置的「无载体给药/非缺血再灌注损害组」、以及用BSS溶液替代载体悬液给药于视网膜下腔，缺血再灌注损害处置的「无载体给药/缺血再灌注损害组」，按照同样的方法在荧光显微镜下进行观察，并对标记的神经节细胞数量进行计数。

显微镜的观察结果如图8所示。另外标记神经节细胞数量如图9所示。计数的神经节细胞的数量为，无载体给药/缺血再灌注损害组：177.4/mm²、SIV-空载体给药组：185.3/mm²、SIV-hPEDF给药组：217.8/mm²。这些结果表明，SIV-hPEDF对神经节细胞具有保护效果。

实施例5 SIV-PEDF对NMDA-诱导模型青光眼治疗效果的探讨

把青光眼模型动物进行NMDA-诱导模型的建模，以探讨SIV-PEDF载体对青光眼治疗的可能性。首先，将本发明的载体SIV-hPEDF、或者不带有外源基因的空载体SIV-空载体(2.5×10⁷TU/ml、TU：转导单位)悬液对4周龄的Wistar系大鼠的视网膜下腔给药。载体转导14天后，将NMDA40mM，5μl对玻璃体内给药，神经节细胞层会受到选择性伤害。损害4天后，利用脑立体定位仪将蛍光色素DAPI(4′，6-diamidino-2-phenylindole)注入到两眼视上丘，对神经节进行标记。视网膜神经节细胞损害7天后(载体导入21天后)摘出眼球，铺平用荧光显微镜进行观察，计数距离视神经1mm处每1mm²所标记的神经节细胞数量。

作为对照，用BSS溶液替代载体悬液给药于视网膜下腔，没有进行NMDA处置的「无载体给药/非NMDA-诱导组」、以及用BSS溶液替代载体悬液给药于视网膜下腔，NMDA处置的「无载体给药/NMDA-诱导组」也按照同样的方法在荧光显微镜下观察，并计数标记的神经节细胞数量。

荧光显微镜的结果如图10所示。另外，标记的神经节细胞数量如图11所示。所计数的神经节细胞数量与缺血再灌注模型的情况相同，-在NMDA-诱导模型中证明SIV-hPEDF载体对神经节细胞具有保护效果。

工业化利用的可能性

通过本发明，提供了一种将PEDF有效地送达到眼组织细胞的载体。本发明中的SIV-PEDF载体提供了一种伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的新治疗手段。也就是说，通过将本发明中的SIV-PEDF载体对伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的患者给药，PEDF会在患者的细胞内持续提供，同时可以抑制青光眼等的最终状变——视网膜神经节细胞的凋亡。考虑到许多伴随凋亡变性的眼病为慢性病，本发明中的SIV-PEDF是一种针对上述疾患极其有效的医药品，并已得到证实。

序列表

<110>生物载体株式会社(DNAVEC CORPORATION)

<120>利用SIV-PEDF载体治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药物

<130>D4-A0403P

<150>JP 2005-047951

<151>2005-02-23

<160>35

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>7062

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的载体序列

<400>1

ggtacctcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat     60

tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc    120

atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat    180

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa    240

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt    300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta    360

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt    420

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc    480

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca    540

gtacaccaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat    600

tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa    660

caactgcgat cgcccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc    720

tatataagca gagctcgctg gcttgtaact cagtctctta ctaggagacc agcttgagcc    780

tgggtgttcg ctggttagcc taacctggtt ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta    840

gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc    900

tcactctctt gaacgggaat cttccttact gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa    960

ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa   1020

ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta   1080

ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag cctagttaga ggactaggag aggccgtagc    1140

cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag    1200

cactaaatag gagacaatta gaccaatttg agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga    1260

aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg caggcaagga gatggagcgc ttcggcctcc    1320

atgagaggtt gttggagaca gaggaggggt gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc    1380

tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa gtctgttcaa tcttgtgtgc gtgctatatt    1440

gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca cagaggaagc agtagcaaca gtaagacaac    1500

actgccatct agtggaaaaa gaaaaaagtg caacagagac atctagtgga caaaagaaaa    1560

atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg gcagtcagaa ttttccagcg caacaacaag    1620

gaaatgcctg ggtacatgta cccttgtcac cgcgcacctt aaatgcgtgg gtaaaagcag    1680

tagaggagaa aaaatttgga gcagaaatag tacccatgtt tcaagcccta tcgaattccc    1740

gtttgtgcta gggttcttag gcttcttggg ggctgctgga actgcaatgg gagcagcggc    1800

gacagccctg acggtccagt ctcagcattt gcttgctggg atactgcagc agcagaagaa    1860

tctgctggcg gctgtggagg ctcaacagca gatgttgaag ctgaccattt ggggtgttaa    1920

aaacctcaat gcccgcgtca cagcccttga gaagtaccta gaggatcagg cacgactaaa    1980

ctcctggggg tgcgcatgga aacaagtatg tcataccaca gtggagtggc cctggacaaa    2040

tcggactccg gattggcaaa atatgacttg gttggagtgg gaaagacaaa tagctgattt    2100

ggaaagcaac attacgagac aattagtgaa ggctagagaa caagaggaaa agaatctaga    2160

tgcctatcag aagttaacta gttggtcaga tttctggtct tggttcgatt tctcaaaatg    2220

gcttaacatt ttaaaaatgg gatttttagt aatagtagga ataatagggt taagattact    2280

ttacacagta tatggatgta tagtgagggt taggcaggga tatgttcctc tatctccaca    2340

gatccatatc cgcggcaatt ttaaaagaaa gggaggaata gggggacaga cttcagcaga    2400

gagactaatt aatataataa caacacaatt agaaatacaa catttacaaa ccaaaattca    2460

aaaaatttta aattttagag ccgcggtagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta    2520

gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc    2580

tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg    2640

ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg    2700

gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa    2760

tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac    2820

atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg    2880

cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg    2940

agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca    3000

ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta    3060

gtgaaccgtc agatccagcg gccgcaagct tggatcctta agttaatcaa cctctggatt    3120

acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg    3180

gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct    3240

cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc    3300

aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca    3360

ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac    3420

tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt    3480

ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct    3540

ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc    3600

cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga    3660

cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcagatccg cactttttaa aagaaaaggg    3720

aggactggat gggatttatt actccgatag gacgctggct tgtaactcag tctcttacta    3780

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aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagcta acttgtttat tgcagcttat    4140

aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg    4200

cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tcgaccgatg    4260

cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc    4320

gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc    4380

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc    4440

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tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg    4620

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg    4680

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cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc    4800

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ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc    6000

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<210>2

<211>8363

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的载体序列

<400>2

ggtacctcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat     60

tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc    120

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aaaaatttta aattttagag ccgcggtagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta    2520

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tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg    2640

ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg    2700

gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa    2760

tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac    2820

atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg    2880

cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg    2940

agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca    3000

ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta    3060

gtgaaccgtc agatccagcg gccgcgaatt cactagtgat taggatgcag gccctggtgc    3120

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ccacggccct ctcggccctc tcgctgggag cggagcagcg aacagaatcc atcattcacc    3420

gggctctcta ctatgacttg atcagcagcc cagacatcca tggtacctat aaggagctcc    3480

ttgacacggt cactgccccc cagaagaacc tcaagagtgc ctcccggatc gtctttgaga    3540

agaagctgcg cataaaatcc agctttgtgg cacctctgga aaagtcatat gggaccaggc    3600

ccagagtcct gacgggcaac cctcgcttgg acctgcaaga gatcaacaac tgggtgcagg    3660

cgcagatgaa agggaagctc gccaggtcca caaaggaaat tcccgatgag atcagcattc    3720

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tgaccttgat agaggagagc ctcacctccg agttcattca tgacatagac cgagaactga    4020

agaccgtgca ggcggtcctc actgtcccca agctgaagct gagttacgaa ggcgaagtca    4080

ccaagtccct gcaggagatg aagctgcaat ccttgtttga ttcaccagac tttagcaaga    4140

tcacaggcaa acccatcaag ctgactcagg tggaacaccg ggctggcttt gagtggaacg    4200

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ttctcttcat tggcaagatt ctggacccca ggggccccta atataaaatc gaattcccgc    4380

ggccgcaagc ttggatcctt aagttaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt    4440

gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc    4500

tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg    4560

gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac    4620

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tactccgata ggacgctggc ttgtaactca gtctcttact aggagaccag cttgagcctg    5100

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aagctaataa acttgcctgc attagagctc ttacgcgtgc tagcccgggc tcgagatccg    5220

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ctaggctttt gcaaaaagct aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca    5460

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ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtcgaccgat gcccttgaga gccttcaacc    5580

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ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc    6060

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atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat    6600

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc    6660

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg    6720

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ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca    6840

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ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg    6960

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc    7020

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ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg    7140

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag    7200

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat    7260

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atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca    7380

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca    7440

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat    7500

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag    7560

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgcgccc    7620

tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt    7680

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ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta    7800

cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc    7860

tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg    7920

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ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat    8040

tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttcc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg    8100

gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc ccaagctacc atgataagta    8160

agtaatatta aggtacggga ggtacttgga gcggccggcc gcaataaaat atctttattt    8220

tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatcgatag tactaacata cgctctccat    8280

caaaacaaaa cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtgcaggt    8340

gccagaacat ttctctatcg ata                                            8363

<210>3

<211>10023

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的载体序列

<400>3

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gtagccgtaa ctactctggg caagtagggc aggcggtggg tacgcaatgg gggcggctac    120

ctcagcacta aataggagac aattagacca atttgagaaa atacgacttc gcccgaacgg    180

aaagaaaaag taccaaatta aacatttaat atgggcaggc aaggagatgg agcgcttcgg    240

cctccatgag aggttgttgg agacagagga ggggtgtaaa agaatcatag aagtcctcta    300

ccccctagaa ccaacaggat cggagggctt aaaaagtctg ttcaatcttg tgtgcgtact    360

atattgcttg cacaaggaac agaaagtgaa agacacagag gaagcagtag caacagtaag    420

acaacactgc catctagtgg aaaaagaaaa aagtgcaaca gagacatcta gtggacaaaa    480

gaaaaatgac aagggaatag cagcgccacc tggtggcagt cagaattttc cagcgcaaca    540

acaaggaaat gcctgggtac atgtaccctt gtcaccgcgc accttaaatg cgtgggtaaa    600

agcagtagag gagaaaaaat ttggagcaga aatagtaccc atgtttcaag ccctatcaga    660

aggctgcaca ccctatgaca ttaatcagat gcttaatgtg ctaggagatc atcaaggggc    720

attacaaata gtgaaagaga tcattaatga agaagcagcc cagtgggatg taacacaccc    780

actacccgca ggacccctac cagcaggaca gctcagggac cctcgcggct cagatatagc    840

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gtacaaccca gtatcagtcc tagacattag gcagggacct aaagagccct tcaaggatta    1020

tgtggacaga ttttacaagg caattagagc agaacaagcc tcaggggaag tgaaacaatg    1080

gatgacagaa tcattactca ttcaaaatgc taatccagat tgtaaggtca tcctgaaggg    1140

cctaggaatg caccccaccc ttgaagaaat gttaacggct tgtcaggggg taggaggccc    1200

aagctacaaa gcaaaagtaa tggcagaaat gatgcagacc atgcaaaatc aaaacatggt    1260

gcagcaggga ggtccaaaaa gacaaagacc cccactaaga tgttataatt gtggaaaatt    1320

tggccatatg caaagacaat gtccggaacc aaggaaaaca aaatgtctaa agtgtggaaa    1380

attgggacac ctagcaaaag actgcagggg acaggtgaat tttttagggt atggacggtg    1440

gatgggggca aaaccgagaa attttcccgc cgctactctt ggagcggaac cgagtgcgcc    1500

tccttcaccg agcggcacca ccccatacga cccagcaaag aagctcctgc agcaatatgc    1560

agagaaaggg aaacaactga gggagcaaaa gaggaatcca ccggcaatga atccggattg    1620

gaccgaggga tattctttga actccctctt tggagaagac caataaagac agtgtatata    1680

gaaggggtcc ccattaaggc actgctagac acaggggcag atgacaccat aattaaagaa    1740

aatgatttac aattatcagg tccatggaga cccaaaatta tagggggcat aggaggaggc    1800

cttaatgtaa aagaatataa cgacagggaa gtaaaaatag aagataaaat tttgagagga    1860

acaatattgt taggagcaac tcccattaat ataataggta gaaatttgct ggccccggca    1920

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gctttacagg aaatatgttc ccaattagag caggaaggaa aaatcagtag agtaggagga    2100

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cccacagtga ataatcaggg acccgggatt aggtatcaat tcaactgtct cccgcaaggg    2400

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gaaagagagg tatgggaaca atggtgggcg gattactggc aggtaagctg gattcccgaa    3180

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catgaagccc cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat    5400

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gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca    6900

ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact    6960

acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg    7020

gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt    7080

ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct    7140

tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga    7200

gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa    7260

tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac    7320

ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga    7380

taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc    7440

cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca    7500

gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta    7560

gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg    7620

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gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg    7740

ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt    7800

ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt    7860

cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata    7920

ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc    7980

gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac    8040

ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa    8100

ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct    8160

tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat    8220

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc    8280

cacctgggtc gatcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc    8340

attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc    8400

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aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca    8520

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attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg    8820

gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc    8880

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tcggggctgt ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg    9900

cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt    9960

tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga   10020

att                                                                 10023

<210>4

<211>982

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>4

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ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc    120

ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc tcactctctt gaacgggaat cttccttact    180

gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg    240

agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc    300

gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag    360

cctagttaga ggactaggag aggccgtagc cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg    420

gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag cactaaatag gagacaatta gaccaatttg    480

agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg    540

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gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa    660

gtctgttcaa tcttgtgtgc gtgctatatt gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca    720

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caacagagac atctagtgga caaaagaaaa atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg    840

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<210>5

<211>614

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>5

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aaactcctgg gggtgcgcat ggaaacaagt atgtcatacc acagtggagt ggccctggac    300

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tttggaaagc aacattacga gacaattagt gaaggctaga gaacaagagg aaaagaatct    420

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atggcttaac attttaaaaa tgggattttt agtaatagta ggaataatag ggttaagatt    540

actttacaca gtatatggat gtatagtgag ggttaggcag ggatatgttc ctctatctcc    600

acagatccat atcc                                                      614

<210>6

<211>185

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>6

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<210>7

<211>9171

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>7

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cctagttaga ggactaggag aggccgtagc cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg    420

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caacagagac atctagtgga caaaagaaaa atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg     840

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cgcgcacctt aaatgcgtgg gtaaaagcag tagaggagaa aaaatttgga gcagaaatag     960

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gggaccctcg cggctcagat atagcaggga ccaccagctc agtacaagaa cagttagaat    1200

ggatctatac tgctaacccc cgggtagatg taggtgccat ctaccggaga tggattattc    1260

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gacctaaaga gcccttcaag gattatgtgg acagatttta caaggcaatt agagcagaac    1380

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cggcttgtca gggggtagga ggcccaagct acaaagcaaa agtaatggca gaaatgatgc    1560

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taagatgtta taattgtgga aaatttggcc atatgcaaag acaatgtccg gaaccaagga    1680

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caaagaagct cctgcagcaa tatgcagaga aagggaaaca actgagggag caaaagagga    1920

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ggcagatgac accataatta aagaaaatga tttacaatta tcaggtccat ggagacccaa    2100

aattataggg ggcataggag gaggccttaa tgtaaaagaa tataacgaca gggaagtaaa    2160

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gaagaaggac aaatcccagt ggaggatgct agtagacttt agagagttaa ataaggcaac    2520

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aaagaaaact tatgctccgc caagagaagg acatttgcaa tgcaggtcca cagtcactgg    7200

gatgacagtt gagcttaatt ataatagtaa aaacagaacc aacgtgacac taagtcccca    7260

gatagaatct atctgggcgg ctgaattggg cagatacaaa ttagtggaaa tcacaccaat    7320

tggctttgca cccacagaag taaggcgtta tacgggagga catgagaggc aaaagagagt    7380

cccgtttgtg ctagggttct taggcttctt gggggctgct ggaactgcaa tgggagcagc    7440

ggcgacagcc ctgacggtcc agtctcagca tttgcttgct gggatactgc agcagcagaa    7500

gaatctgctg gcggctgtgg aggctcaaca gcagatgttg aagctgacca tttggggtgt    7560

taaaaacctc aatgcccgcg tcacagccct tgagaagtac ctagaggatc aggcacgact    7620

aaactcctgg gggtgcgcat ggaaacaagt atgtcatacc acagtggagt ggccctggac    7680

aaatcggact ccggattggc aaaatatgac ttggttggag tgggaaagac aaatagctga    7740

tttggaaagc aacattacga gacaattagt gaaggctaga gaacaagagg aaaagaatct    7800

agatgcctat cagaagttaa ctagttggtc agatttctgg tcttggttcg atttctcaaa    7860

atggcttaac attttaaaaa tgggattttt agtaatagta ggaataatag ggttaagatt    7920

actttacaca gtatatggat gtatagtgag ggttaggcag ggatatgttc ctctatctcc    7980

acagatccat atccaccaag tggggaaggg acggccagac aacgccgacg agccaggaga    8040

aggtggagac aacagcagga tcaaattaga gtcttggtag aaagactcca agagcaggtg    8100

tatgcagttg accgcctggc tgacgaggct caacacttgg ctatacaaca gttgcctgac    8160

cctcctcatt cagcttagga aagcttttca atacctgcaa tatgggctcg cagaactcaa    8220

aaccggcgca caagaaatac tccaaactct ggcaggcgtt gcacaaaacg catgtcacca    8280

gatatggctt gcttgcagat ccgcttatag gaacatcgtc aacagtccaa gaagagtgcg    8340

acaaggcctt gaggaaatcc ttaattagga aacaaaatgg caacatgacg gaagagggaa    8400

ggaggcttca agaaggagac acctgggaag agtggtcgga tgatgaggaa gaagtgggat    8460

ttccagtgag accaagagta cccttaaggc aaatgactta taaacttgca gtggattttt    8520

cgcacttttt aaaagaaaag ggaggactgg atgggattta ttactccgat aggagaaata    8580

agatcctgaa tctgtatgct cttaatgaat gggggataat tgatgattgg aatgcctggt    8640

cgaagggacc aggaataaga ttccctaaat gctttgggtt ctgctttaag ctagtgccag    8700

tggacttaca tgaggaagca caaacatgtg aaagacattg cctagtccat ccagcgcaga    8760

tgggagaaga tccagatggt atcagccatg gagagatctt ggtgtggaag tttgatccta    8820

tgttggcaat acagtacgac cccaatcggg agtactttac tgacatgcat gggctggtga    8880

agaggaagta gccagaccgc aagcctgcgg ttagaacatc accatggaga tgacattaaa    8940

aactgctgac gggactttcc agcgaaggga ctttccaagg cgggacatgg gcggtccggg    9000

gagtggcttt accctcagaa ctgcataaaa gcagatgctc gctggcttgt aactcagtct    9060

cttactagga gaccagcttg agcctgggtg ttcgctggtt agcctaacct ggttggccac    9120

caggggtaag gactccttgg cttagaaagc taataaactt gcctgcatta g             9171

<210>8

<211>1257

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

atgcaggccc tggtgctact cctctgcatt ggagccctcc tcgggcacag cagctgccag      60

aaccctgcca gccccccgga ggagggctcc ccagaccccg acagcacagg ggcgctggtg     120

gaggaggagg atcctttctt caaagtcccc gtgaacaagc tggcagcggc tgtctccaac     180

ttcggctatg acctgtaccg ggtgcgatcc agcatgagcc ccacgaccaa cgtgctcctg     240

tctcctctca gtgtggccac ggccctctcg gccctctcgc tgggagcgga gcagcgaaca     300

gaatccatca ttcaccgggc tctctactat gacttgatca gcagcccaga catccatggt     360

acctataagg agctccttga cacggtcact gccccccaga agaacctcaa gagtgcctcc     420

cggatcgtct ttgagaagaa gctgcgcata aaatccagct ttgtggcacc tctggaaaag     480

tcatatggga ccaggcccag agtcctgacg ggcaaccctc gcttggacct gcaagagatc     540

aacaactggg tgcaggcgca gatgaaaggg aagctcgcca ggtccacaaa ggaaattccc     600

gatgagatca gcattctcct tctcggtgtg gcgcacttca aggggcagtg ggtaacaaag     660

tttgactcca gaaagacttc cctcgaggat ttctacttgg atgaagagag gaccgtgagg     720

gtccccatga tgtcggaccc taaggctgtt ttacgctatg gcttggattc agatctcagc     780

tgcaagattg cccagctgcc cttgaccgga agcatgagta tcatcttctt cctgcccctg     840

aaagtgaccc agaatttgac cttgatagag gagagcctca cctccgagtt cattcatgac     900

atagaccgag aactgaagac cgtgcaggcg gtcctcactg tccccaagct gaagctgagt     960

tacgaaggcg aagtcaccaa gtccctgcag gagatgaagc tgcaatcctt gtttgattca    1020

ccagacttta gcaagatcac aggcaaaccc atcaagctga ctcaggtgga acaccgggct    1080

ggctttgagt ggaacgagga tggggcggga accaccccca gcccagggct gcagcctgcc    1140

cacctcacct tcccgctgga ctatcacctt aaccagcctt tcatcttcgt actgagggac    1200

acagacacag gggcccttct cttcattggc aagattctgg accccagggg cccctaa       1257

<210>9

<211>590

<212>DNA

<213>CMV

<400>9

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg     60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt    120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca    180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc    240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta    300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac    360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg    420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg    480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt    540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc               590

<210>10

<211>125

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>10

caattttaaa agaaagggag gaataggggg acagacttca gcagagagac taattaatat     60

aataacaaca caattagaaa tacaacattt acaaaccaaa attcaaaaaa ttttaaattt    120

tagag                                                                125

<210>11

<211>591

<212>DNA

<213>土拨鼠肝炎病毒

<400>11

ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg     60

ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc    120

gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt    180

tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca    240

ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc    300

ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc    360

tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc    420

tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc    480

tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc    540

ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg c             591

<210>12

<211>255

<212>DNA

<213>猴免疫缺陷病毒

<400>12

atgcccctag gaccagaaga aagaagattc gttcgcttaa tttggctcct ttacagcacc     60

aatccatatc caccaagtgg ggaagggacg gccagacaac gccgacgagc caggagaagg    120

tggagacaac agcaggatca aattagagtc ttggtagaaa gactccaaga gcaggtgtat    180

gcagttgacc gcctggctga cgaggctcaa cacttggcta tacaacagtt gcctgaccct    240

cctcattcag cttag                                                     255

<210>13

<211>7060

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的载体序列

<400>13

ggtacctcaa tattggccat tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat      60

tggctattgg ccattgcata cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc     120

atgtccaata tgaccgccat gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat     180

tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa     240

tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt     300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta     360

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt     420

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc     480

tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca     540

gtacaccaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat     600

tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa     660

caactgcgat cgcccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc     720

tatataagca gagctcgctg gcttgtaact cagtctctta ctaggagacc agcttgagcc     780

tgggtgttcg ctggttagcc taacctggtt ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta     840

gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc     900

tcactctctt gaacgggaat cttccttact gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa     960

ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa    1020

ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta    1080

ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag cctagttaga ggactaggag aggccgtagc    1140

cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag    1200

cactaaatag gagacaatta gaccaatttg agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga    1260

aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg caggcaagga gatggagcgc ttcggcctcc    1320

atgagaggtt gttggagaca gaggaggggt gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc    1380

tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa gtctgttcaa tcttgtgtgc gtgctatatt    1440

gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca cagaggaagc agtagcaaca gtaagacaac    1500

actgccatct agtggaaaaa gaaaaaagtg caacagagac atctagtgga caaaagaaaa    1560

atgacaaggg aatagcagcg ccacctggtg gcagtcagaa ttttccagcg caacaacaag    1620

gaaatgcctg ggtacatgta cccttgtcac cgcgcacctt aaatgcgtgg gtaaaagcag    1680

tagaggagaa aaaatttgga gcagaaatag tacccatgtt tcaagcccta tcgaattccc    1740

gtttgtgcta gggttcttag gcttcttggg ggctgctgga actgcaatgg gagcagcggc    1800

gacagccctg acggtccagt ctcagcattt gcttgctggg atactgcagc agcagaagaa    1860

tctgctggcg gctgtggagg ctcaacagca gatgttgaag ctgaccattt ggggtgttaa    1920

aaacctcaat gcccgcgtca cagcccttga gaagtaccta gaggatcagg cacgactaaa    1980

ctcctggggg tgcgcatgga aacaagtatg tcataccaca gtggagtggc cctggacaaa    2040

tcggactccg gattggcaaa atatgacttg gttggagtgg gaaagacaaa tagctgattt    2100

ggaaagcaac attacgagac aattagtgaa ggctagagaa caagaggaaa agaatctaga    2160

tgcctatcag aagttaacta gttggtcaga tttctggtct tggttcgatt tctcaaaatg    2220

gcttaacatt ttaaaaatgg gatttttagt aatagtagga ataatagggt taagattact    2280

ttacacagta tatggatgta tagtgagggt taggcaggga tatgttcctc tatctccaca    2340

gatccatatc cgcggtagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc    2400

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa    2460

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac    2520

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca    2580

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg    2640

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt    2700

agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg    2760

gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg    2820

gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat    2880

gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca    2940

gatccgctag cgctaccggt cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg    3000

gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc    3060

ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc    3120

ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc    3180

ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa    3240

ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc    3300

gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc    3360

aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc    3420

tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac    3480

atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac    3540

ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac    3600

cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact    3660

ctcggcatgg acgagctgta caagtaagcg gccgcggatc cgcacttttt aaaagaaaag    3720

ggaggactgg atgggattta ttactccgat aggacgctgg cttgtaactc agtctcttac    3780

taggagacca gcttgagcct gggtgttcgc tggttagcct aacctggttg gccaccaggg    3840

gtaaggactc cttggcttag aaagctaata aacttgcctg cattagagct cttacgcgtg    3900

ctagcccggg ctcgagatcc gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact    3960

ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta    4020

atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag    4080

tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc taacttgttt attgcagctt    4140

ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac    4200

tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtcgaccga    4260

tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg    4320

tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc    4380

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta    4440

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag    4500

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg    4560

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg    4620

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg    4680

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga    4740

agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc    4800

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt    4860

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact    4920

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg    4980

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt    5040

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt    5100

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct    5160

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg    5220

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt    5280

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt    5340

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc    5400

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg    5460

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc    5520

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg    5580

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca    5640

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga    5700

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct    5760

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg    5820

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca    5880

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata    5940

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct    6000

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact    6060

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa    6120

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc    6180

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga    6240

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga    6300

aaagtgccac ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg    6360

cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct    6420

tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta    6480

gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt    6540

tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg    6600

ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat    6660

tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt    6720

taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ccattcgcca    6780

ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag    6840

cccaagctac catgataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtacttgg agcggccgca    6900

ataaaatatc tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac    6960

taacatacgc tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc    7020

ccagtgcaag t gcaggtgcc aga acatttc tctatcgata                        7060

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>14

atatccgcgg tagttatt aa tagtaatc                                         28

<210>15

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>15

tggccgcggc cgctggatct gacggttcac taaaccagc                              39

<210>16

<211>13

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>16

ggccgcaagc ttg                                                          13

<210>17

<211>13

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>17

gatccaagct tgc                            13

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>18

ttgccgcggc aatttt aaaa gaaagggagg a        31

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>19

gagccgcggc tctaaaattt aaaatttttt g         31

<210>20

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>20

taaggatcct taagt taatc aacctctgga ttaca    35

<210>21

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>21

cgcagatctg cggggaggcg gcccaaag              28

<210>22

<211>720

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的核苷酸序列

<400>22

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac     60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa    720

<210>23

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>23

ccatggcggc cgccatggtg agcaagggcg agga                                 34

<210>24

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>24

agtagcggcc gctacttact tgtacagctc gtccat                               36

<210>25

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>25

aggatgcagg ccctggtgct actcct                                        26

<210>26

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>26

ttatattagg ggcccctggg gtccaga                                        27

<210>27

<211>11471

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的载体序列

<400>27

gctcgagact agtgacttgg tgagtaggct tcgagcctag ttagaggact aggagaggcc     60

gtagccgtaa ctactctggg caagtagggc aggcggtggg tacgcaatgg gggcggctac    120

ctcagcacta aataggagac aattagacca atttgagaaa atacgacttc gcccgaacgg    180

aaagaaaaag taccaaatta aacatttaat atgggcaggc aaggagatgg agcgcttcgg    240

cctccatgag aggttgttgg agacagagga ggggtgtaaa agaatcatag aagtcctcta    300

ccccctagaa ccaacaggat cggagggctt aaaaagtctg ttcaatcttg tgtgcgtact    360

atattgcttg cacaaggaac agaaagtgaa agacacagag gaagcagtag caacagtaag    420

acaacactgc catctagtgg aaaaagaaaa aagtgcaaca gagacatcta gtggacaaaa    480

gaaaaatgac aagggaatag cagcgccacc tggtggcagt cagaattttc cagcgcaaca    540

acaaggaaat gcctgggtac atgtaccctt gtcaccgcgc accttaaatg cgtgggtaaa    600

agcagtagag gagaaaaaat ttggagcaga aatagtaccc atgtttcaag ccctatcaga    660

aggctgcaca ccctatgaca ttaatcagat gcttaatgtg ctaggagatc atcaaggggc    720

attacaaata gtgaaagaga tcattaatga agaagcagcc cagtgggatg taacacaccc    780

actacccgca ggacccctac cagcaggaca gctcagggac cctcgcggct cagatatagc    840

agggaccacc agctcagtac aagaacagtt agaatggatc tatactgcta acccccgggt     900

agatgtaggt gccatctacc ggagatggat tattctagga cttcaaaagt gtgtcaaaat     960

gtacaaccca gtatcagtcc tagacattag gcagggacct aaagagccct tcaaggatta    1020

tgtggacaga ttttacaagg caattagagc agaacaagcc tcaggggaag tgaaacaatg    1080

gatgacagaa tcattactca ttcaaaatgc taatccagat tgtaaggtca tcctgaaggg    1140

cctaggaatg caccccaccc ttgaagaaat gttaacggct tgtcaggggg taggaggccc    1200

aagctacaaa gcaaaagtaa tggcagaaat gatgcagacc atgcaaaatc aaaacatggt    1260

gcagcaggga ggtccaaaaa gacaaagacc cccactaaga tgttataatt gtggaaaatt    1320

tggccatatg caaagacaat gtccggaacc aaggaaaaca aaatgtctaa agtgtggaaa    1380

attgggacac ctagcaaaag actgcagggg acaggtgaat tttttagggt atggacggtg    1440

gatgggggca aaaccgagaa attttcccgc cgctactctt ggagcggaac cgagtgcgcc    1500

tccttcaccg agcggcacca ccccatacga cccagcaaag aagctcctgc agcaatatgc    1560

agagaaaggg aaacaactga gggagcaaaa gaggaatcca ccggcaatga atccggattg    1620

gaccgaggga tattctttga actccctctt tggagaagac caataaagac agtgtatata    1680

gaaggggtcc ccattaaggc actgctagac acaggggcag atgacaccat aattaaagaa    1740

aatgatttac aattatcagg tccatggaga cccaaaatta tagggggcat aggaggaggc    1800

cttaatgtaa aagaatataa cgacagggaa gtaaaaatag aagataaaat tttgagagga    1860

acaatattgt taggagcaac tcccattaat ataataggta gaaatttgct ggccccggca    1920

ggtgcccggt tagtaatggg acaattatca gaaaaaattc ctgtcacacc tgtcaaattg    1980

aaggaagggg ctcggggacc ctgtgtaaga caatggcctc tctctaaaga gaagattgaa    2040

gctttacagg aaatatgttc ccaattagag caggaaggaa aaatcagtag agtaggagga    2100

gaaaatgcat acaatacccc aatattttgc ataaagaaga aggacaaatc ccagtggagg    2160

atgctagtag actttagaga gttaaataag gcaacccaag atttctttga agtgcaatta    2220

gggatacccc acccagcagg attaagaaag atgagacaga taacagtttt agatgtagga    2280

gacgcctatt attccatacc attggatcca aattttagga aatatactgc ttttactatt    2340

cccacagtga ataatcaggg acccgggatt aggtatcaat tcaactgtct cccgcaaggg    2400

tggaaaggat ctcctacaat cttccaaaat acagcagcat ccattttgga ggagataaaa    2460

agaaacttgc cagcactaac cattgtacaa tacatggatg atttatgggt aggttctcaa    2520

gaaaatgaac acacccatga caaattagta gaacagttaa gaacaaaatt acaagcctgg    2580

ggcttagaaa ccccagaaaa gaaggtgcaa aaagaaccac cttatgagtg gatgggatac    2640

aaactttggc ctcacaaatg ggaactaagc agaatacaac tggaggaaaa agatgaatgg    2700

actgtcaatg acatccagaa gttagttggg aaactaaatt gggcagcaca attgtatcca    2760

ggtcttagga ccaagaatat atgcaagtta attagaggaa agaaaaatct gttagagcta    2820

gtgacttgga cacctgaggc agaagctgaa tatgcagaaa atgcagagat tcttaaaaca    2880

gaacaggaag gaacctatta caaaccagga atacctatta gggcagcagt acagaaattg    2940

gaaggaggac agtggagtta ccaattcaaa caagaaggac aagtcttgaa agtaggaaaa    3000

tacaccaagc aaaagaacac ccatacaaat gaacttcgca cattagctgg tttagtgcag    3060

aagatttgca aagaagctct agttatttgg gggatattac cagttctaga actcccgata    3120

gaaagagagg tatgggaaca atggtgggcg gattactggc aggtaagctg gattcccgaa    3180

tgggattttg tcagcacccc acctttgctc aaactatggt acacattaac aaaagaaccc    3240

atacccaagg aggacgttta ctatgtagat ggagcatgca acagaaattc aaaagaagga    3300

aaagcaggat acatctcaca atacggaaaa cagagagtag aaacattaga aaacactacc    3360

aatcagcaag cagaattaac agctataaaa atggctttgg aagacagtgg gcctaatgtg    3420

aacatagtaa cagactctca atatgcaatg ggaattttga cagcacaacc cacacaaagt    3480

gattcaccat tagtagagca aattatagcc ttaatgatac aaaagcaaca aatatatttg    3540

cagtgggtac cagcacataa aggaatagga ggaaatgagg agatagataa attagtgagt    3600

aaaggcatta gaagagtttt attcttagaa aaaatagaag aagctcaaga agagcatgaa    3660

agatatcata ataattggaa aaacctagca gatacatatg ggcttccaca aatagtagca    3720

aaagagatag tggccatgtg tccaaaatgt cagataaagg gagaaccagt gcatggacaa    3780

gtggatgcct cacctggaac atggcagatg gattgtactc atctagaagg aaaagtagtc    3840

atagttgcgg tccatgtagc cagtggattc atagaagcag aagtcatacc tagggaaaca    3900

ggaaaagaaa cggcaaagtt tctattaaaa atactgagta gatggcctat aacacagtta    3960

cacacagaca atgggcctaa ctttacctcc caagaagtgg cagcaatatg ttggtgggga    4020

aaaattgaac atacaacagg tataccatat aacccccaat ctcaaggatc aatagaaagc    4080

atgaacaaac aattaaaaga gataattggg aaaataagag atgattgcca atatacagag    4140

acagcagtac tgatggcttg ccatattcac aattttaaaa gaaagggagg aataggggga    4200

cagacttcag cagagagact aattaatata ataacaacac aattagaaat acaacattta    4260

caaaccaaaa ttcaaaaaat tttaaatttt agagtctact acagagaagg gagagaccct    4320

gtgtggaaag gaccagcaca attaatctgg aaaggggaag gagcagtggt cctcaaggac    4380

ggaagtgacc taaaggttgt accaagaagg aaagctaaaa ttattaagga ttatgaaccc    4440

aaacaaagag tgggtaatga gggtgacgtg gaaggtacca ggggatctga taactaaatg    4500

gcagggaata gtcagatatt ggatgagaca aagaaatttg aaatggaact attatatgca    4560

ttaccaaatt acatgggctt ggtacaccat gagtagatat gtaataccaa taggaaaaca    4620

tggggaaata tgtgtagacc tatattggca tttaacacca gagcaaggat ggctatccac    4680

atatgcagta ggtatacaat atgtaagcaa tttagaatct aaatatagaa cagaattaga    4740

ccctgctaca gcagatagta taatacatgg tcactatttt aattgtttta aagaaagagc    4800

catccaacaa gctctgaggg gccacagatt tgtcttctgt cagtttccag aagggcataa    4860

aagcacagga caggtaccat ctttgcagta cctagctctg ctcgcacatc aaaatggcct    4920

cagggagaga tccaagagag gcaagaccag gagaagtaga aatttgggat ctaagcaggg    4980

agccgtggga cgaatggcta agagatatgt tacaagatct caaccaggag gcgaggctgc    5040

attttgggag agaactcctg ttccaagtat ggaactactg tcaggaggaa ggagaaagac    5100

atggtactcc catgatggaa agggcctaca aatattatag gctagtacaa aaggctctct    5160

ttgtgcattt tcgatgtggg tgcaggagaa ggcagccctt tgaaccatac gaggagagga    5220

gagatggaca agggggaggc agagcaaatc gtgtcccacc aggacttgag tgaagactat    5280

cagaagcctc tgcagacttg taaaaataaa tgtttttgca aaaaatgttg ttaccactgt    5340

cagctttgct ttctgcaaaa aggcctaggt gttacctatc atgcccctag gaccagaaga    5400

aagaagattg cttcgcttga tttggctcct ttacagcacc agtaagtaga attcttttat    5460

tgtaagatgg attggttttt aaattactta aataataaaa catgggatgc agaccataat    5520

ttttgtagca gcaaaaagaa aggacacgca ccaggaccat gtgtacaaag gacgtatgtt    5580

gcttgccata tcaggtctgt aataaatgat tggtataccc tatcaaagaa aacttatgct    5640

ccgccaagag aaggacattt gcaatgcagg tccacagtca ctgggatgac agttgagctt    5700

aattataata gtaaaaacag aaccaacgtg acactaagtc cccagataga atctatctgg    5760

gcggctgaat tgggcagata caaattagtg gaaatcacac caattggctt tgcacccaca    5820

gaagtaaggc gttatacggg aggacatgag aggcaaaaga gagtcccgtt tgtgctaggg    5880

ttcttaggct tcttgggggc tgctggaact gcaatggaag cagcggcgac agccctgacg    5940

gtccagtctc agcatttgct tgctgggata ctgcagcagc agaagaatct gctggcggct    6000

gtggaggctc aacagcagat gttgaagctg accatttggg gtgttaaaaa cctcaatgcc    6060

cgcgtcacag cccttgagaa gtacctagag gatcaggcac gactaaactc ctgggggtgc    6120

gcatggaaac aagtatgtca taccacagtg gagtggccct ggacaaatcg gactccggat    6180

tggcaaaata tgacttggtt ggagtgggaa agacaaatag ctgatttgga aagcaacatt    6240

acgagacaat tagtgaaggc tagagaacaa gaggaaaaga atctagatgc ctatcagaag    6300

ttaactagtt ggtcagattt ctggtcttgg ttcgatttct caaaatggct taacatttta    6360

aaaatgggat ttttagtaat agtaggaata atagggttaa gattacttta cacagtatat    6420

ggatgtatag tgagggttag gcagggatat gttcctctat ctccacagat ccatatccac    6480

caagtgggga agggacggcc agacaacgcc gacgagccag gagaaggtgg agacaacagc    6540

aggatcaaat tagagtcttg gtagaaagac tccaagagca ggtgtatgca gttgaccgcc    6600

tggctgacga ggctcaacac ttggctatac aacagttgcc tgaccctcct cattcagctt    6660

agctagcggc cgcaattcac tcctcaggtg caggctgcct atcagaaggt ggtggctggt    6720

gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt ttccctctgc caaaaattat    6780

ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct aataaaggaa atttattttc    6840

attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg gaaggacata tgggagggca    6900

aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt tggcaacata tgcccatatg    6960

ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct    7020

gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt    7080

tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc    7140

agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatggaga    7200

tccctcgacc tgcagcccaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa    7260

ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg    7320

gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca    7380

gtcgggaaac ctgtcgtgcc agcggatccg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg    7440

cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat    7500

ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc    7560

cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct aacttgttta    7620

ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat    7680

ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct    7740

ggatccgctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg    7800

ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt    7860

atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa    7920

gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc    7980

gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag    8040

gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt    8100

gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg    8160

aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg    8220

ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg    8280

taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac    8340

tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg    8400

gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt    8460

taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg    8520

tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc    8580

tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt    8640

ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt    8700

taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag    8760

tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt    8820

cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc    8880

gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc    8940

cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg    9000

ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac    9060

aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg    9120

atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc    9180

tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact    9240

gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc    9300

aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat    9360

acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc    9420

ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac    9480

tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa    9540

aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact    9600

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg    9660

atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg     9720

aaaagtgcca cctgggtcga tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt     9780

acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat     9840

ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt     9900

cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa     9960

actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc    10020

aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct    10080

acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg    10140

ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt    10200

ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg    10260

gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag    10320

agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa    10380

aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc    10440

gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc    10500

gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt    10560

tcttttctgt ggctgcgtga aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg    10620

agcggctcgg ggggtgcgtg cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg    10680

ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg    10740

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ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt    11460

ggcaaagaat t                      11471

<210>28

<211>9

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>28

tcagctggc                            9

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>29

ggccgccagc tgatgca                 17

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>30

cccgtttgtg ctagggttct tagg         24

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>31

ggatatggat ctgtggagat agag        24

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>32

atgcccctag gaccagaaga aag                   23

<210>33

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>33

acttggtgga tatggattgg tgctgtaaag gagccaa     37

<210>34

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>34

ttggctcctt tacagcacca atccat atcc accaagt    37

<210>35

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>35

ctaagctgaa tgaggagggt cag                   23

Claims (14)

1.用于治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药物，该药物包含带有色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor：PEDF)基因的重组猴免疫缺陷病毒载体、以及药学可使用的介质。

2.权利要求1中记述的药物，其中所述的猴免疫缺陷病毒载体包括cPPT序列和/或WPRE序列。

3.权利要求1或者2中记述的药物，其中所述猴免疫缺陷病毒载体已用VSV-G假型化。

4.权利要求1到3任意一项记述的药物，其中所述猴免疫缺陷疫病毒载体来自agm株。

5.权利要求1到4中任意一项记述的药物，其中所述伴随着眼组织细胞凋亡变性的疾患为青光眼、视网膜色素变性、视网膜脱落、视网膜缺血性疾患中的任意一项。

6.治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的方法，其包括用带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷疫病毒载体进行给药。

7.权利要求6中记述的方法，包括用带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行视网膜下给药，玻璃体内给药，或者前房内给药的步骤。

8.权利要求1到权利要求5任意一项中记述的药物的制造方法，该方法使用基因转移载体，该载体包含在序列号：1中记述的碱基序列中插入PEDF基因的碱基序列。

9.权利要求8中记述的药物的制造方法，该方法利用包含序列号：2中记述的碱基序列的基因转移载体。

10.权利要求8或者权利要求9中记述的药物的制造方法，包含向包装细胞中导入所述基因转移载体的步骤，所述包装细胞为已经向其中导入了包含序列：3的碱基序列的包装载体的包装细胞。

11.编码猴免疫缺陷病毒基因组RNA的载体，包含序列号：1中记述的碱基序列或者在该序列中插入了外源基因的序列。

12.权利要求11中记述的载体，其中所述外源基因是PEDF。

13.猴免疫缺陷病毒，包含来自权利要求11或者12中记述的载体所转录的基因组RNA。

14.权利要求13中记述的猴免疫缺陷病毒，其已用VSV-G假型化。

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