CN103060378A - 一种siv载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SIV载体的制备方法,采用磷酸钙共沉淀转染法,将培养皿用胶原蛋白进行处理,在转染过程中使用Opti-MEM培养基,在转染过程中增加DNA浓度。本发明构思巧妙,生产成本低,所制备的托伐普坦片剂体外溶出度高,药物的生物利用度和临床疗效好。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种SIV载体的制备方法。
背景技术
SIV(Simian Immunodeficiency Virus)即猴免疫缺陷病毒,SIV载体是一种基于猴免疫缺陷病毒(SIV)的载体。
目前,常见的SIV载体的制备方法是磷酸钙共沉淀转染法,该方法受pH的值变化的影响比较大。该制备方法工艺复杂,生产效率低,无法满足大规模工业化生产的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足,提供一种SIV载体的制备方法。该制备方法构思巧妙、流程简单,生产成本低,生产效率大幅提高,满足了SIV载体大规模工业化生产的要求。
为实现上述目的,本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种SIV载体的制备方法,将培养皿用胶原蛋白进行处理,在转染过程中使用Opti-MEM培养基,在转染过程中增加DNA浓度。
本发明通过优化SIV载体生产时的转染条件,获得原有技术约2倍的SIV载体生产量,达到事半功倍的效果,对促进SIV载体的实用化具有重大意义。具体包括:1) 使用Collagen处理过的培养皿提高SIV载体生产量的技术;2) 转染时使用Opti-MEM培养基提高SIV载体生产量的技术;3) 转染时增加DNA浓度提高SIV载体生产量的技术。
本发明的有益效果在于:本发明构思巧妙、流程简单,生产成本低,生产效率大幅提高,可以实现SIV载体的大规模工业化生产。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明,其中:
图1是本发明实施例1生产量评价结果图;
图2是本发明实施例2生产量评价结果图;
图3是本发明实施例3生产量评价结果图;
图4是本发明实施例4生产量评价结果图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征,或公开的所有方法或过程中的步骤,除了互相排斥的特征和/或步骤以外,均可以以任何方式组合。
实施例1:选用3个直径10cm的普通培养皿(dish)和3个Collagen-Type I处理过的同尺寸培养皿,采用相同方法进行SIV-GFP的生产,比较使用两种培养皿在SIV载体生产性上的差别。
具体方法为:(DNA 32μg +1.5ml 2xBES Buffer)和1.5ml 167mM CaCl2混合20分钟后与12ml DMEM培养基混合,5ml/dish分别加入3个长有293T/17细胞(添加前用DMEM洗一遍细胞)的培养皿中,3小时后以5ml/dish加入含20%FBS的DMEM培养基过夜培养,第2天去掉培养液,用DMEM洗一遍后,以10ml/dish加入含10mM NaB的DMEM过夜,转染48小时后收取上清,检测SIV-GFP的滴度。
现有技术中使用普通细胞培养瓶进行SIV载体的生产,本发明使用Collagen处理培养皿可以改善细胞生长状态,有利于提高SIV载体的生产量。实验结果表明,使用Collagen处理过的培养皿进行SIV载体的生产可以提高约30%的生产量。
实施例2:选用直径10cm的普通培养皿(3个/组),采用同样条件配制DNA混合物,将DNA混合物分别和DMEM培养基,IMDM培养基,Opti-MEM培养基这3种不同培养基混合后添加进培养皿来进行SIV-GFP的生产,比较转染时使用不同培养基在SIV载体生产性上的差别。
现有技术中使用DMEM培养基进行转染,具体方法同实施例1。磷酸钙共沉淀转染法受pH的变化的影响比较大,使用pH较稳定的培养基可改善转染效率,从而有利于提高SIV载体的生产量。Opti-MEM是Invitrogen公司开发的培养基,pH比较稳定,可以广泛用于各种转染试剂的转染。实验结果发现转染时使用Opti-MEM进行SIV载体的生产可以提高约40%的生产量。
实施例3:选用直径10cm的普通培养皿(3个/条件),分别采用不同条件(1倍 DNA浓度,1.5倍 DNA浓度,2.0倍 DNA浓度)配制DNA混合物,将DNA混合物和DMEM培养基混合后添加进培养皿来进行SIV-GFP的生产,具体方法同实施例1。比较转染时使用不同DNA浓度在SIV载体生产性上的差别。
SIV载体是使用磷酸钙共沉淀转染法来生产的,转染时的DNA浓度对转染效率有一定影响,虽然过量DNA的使用会对细胞产生毒性,但在允许范围内适当提高DNA浓度会改善转染效率,从而有利于提高SIV载体的生产量。实验结果发现使用原有技术2倍DNA浓度进行转染,可以提高约43%的SIV载体生产量。
实施例4:选用225cm2方瓶,在相同细胞条件下分别采用1倍 DNA浓度配制DNA混合物、DMEM培养基和2.0倍 DNA浓度、Opti-MEM培养基进行SIV-GFP的生产。
实验结果发现采用2.0倍 DNA浓度、Opti-MEM培养基进行SIV-GFP的生产可以提高约100%的SIV载体生产量。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合,以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
Claims (1)
1.一种SIV载体的制备方法,采用磷酸钙共沉淀转染法,其特征在于:将培养皿用胶原蛋白进行处理,在转染过程中使用Opti-MEM培养基,在转染过程中增加DNA浓度。
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CN2011103245327A CN103060378A (zh) | 2011-10-24 | 2011-10-24 | 一种siv载体的制备方法 |
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2011
- 2011-10-24 CN CN2011103245327A patent/CN103060378A/zh active Pending
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