CN101117626A - 人胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人胚胎干细胞(hES)体外定向诱导分化为肝细胞的方法,首先利用hES细胞的高度自我更新和增殖的生物学特性,采用胶原酶IV消化法进行传代扩增,获得大量干细胞;再将hES细胞接种到低吸附性的细菌皿中形成成熟拟胚体(EB);然后将成熟的囊性EB用0.25胰酶-0.02%EDTA消化为单个细胞后接种到预先包被有I型胶原的组织培养皿,以含有地塞米松和人胰岛素的条件诱导液培养,并观察鉴定其向肝细胞方向分化。本发明提供hES细胞高效分化为肝细胞的方法,同时此法使得后续的鉴定工作更加简单、有效,为干细胞移植或生物人工肝治疗重症肝炎、肝衰竭等疾病奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hES细胞)的生物学特性,获得类似早期胚胎的球体结构-拟胚体(embryoid body,EB),以地塞米松和人胰岛素联合I型胶原的方法,实现体外定向高效诱导人胚胎干细胞分化为肝细胞的技术。
背景技术
由各种原因(病毒、药物、肿瘤及遗传性疾病等)引发的终末期肝病严重威胁人类健康。目前,它的治疗主要依赖于原位肝移植,但是,供体的极度短缺、移植及手术本身相关的死亡、终生服用免疫抑制剂及其所致的致死性并发症等一系列问题极大的限制了这一治疗手段的广泛开展。肝细胞移植和生物人工肝作为肝移植的辅助方式,可以部分缓解上述问题,但其来源细胞同样也面临着存活期短,难以大量扩增,特别是随着培养时间的延长,肝功能逐渐降低等问题,因此,寻求合适的肝细胞来源已属迫在眉睫。
通过胚胎干细胞分化定向诱导获取肝细胞是解决肝细胞来源的有效途径。从不同角度来分,胚胎干细胞分化的分类方法有很多种,例如以诱导剂的不同分类、以分化过程的不同分类等,其中,以分化过程可分为:1.胚胎干细胞自发分化;2.胚胎干细胞直接以诱导剂诱导其分化;3.胚胎干细胞先形成拟胚体(即EB),之后将一个个球形EB(含有众多细胞、具有三维结构)直接接种,再添加各种诱导剂来诱导分化。其中,1998年,人ES细胞的成功建系打开了体外生产可供移植治疗的所有类型的人体细胞、组织乃至器官的大门。因此,体外定向诱导人ES细胞分化为肝脏细胞成为目前研究的热点(Lavon N,Benvenisty N.Study ofhepatocyte differentiation using embryonic stem cells.Journal of CellularBiochemistry,2005,96:1193-1202.)。
EB是ES细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体结构,其三胚层的形成与分化基本模拟了体内胚胎早期发育中组织细胞分化的过程,可以作为研究哺乳动物胚胎发育尤其是早期谱系决定、胚层相互诱导等现象的理想体外模型。然而,现有的诱导分化方法是将EB作为一个球体直接接种,这样会使细胞层叠,既不利于充分接触,操作中也只能通过其周边爬出的那些细胞来进行形态观察,因此,现有的诱导分化方法还有必要改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为肝细胞的方法。使该方法在操作中便于形态观察,同时让细胞与因子和胞外基质能够充分接触,从而能有效地以及快捷地诱导出肝细胞。
为实现上述目的,本发明人胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法,采用以下步骤:
1)扩增人胚胎干细胞;
2)形成成熟拟胚体;
3)将诱导的成熟拟胚体消化成单个细胞;
4)将单个细胞以条件培养液诱导分化,得到肝细胞。
上述方法中,更具体的步骤包括:
1)采用胶原酶IV消化法对hESCs进行传代扩增,获得大量干细胞;
2)将hESCs用拟胚体培养液悬浮、培养,接种到低吸附性的细菌皿中形成成熟拟胚体EB;
3)将成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化为单个细胞;
4)将单个细胞后接种到预先包被有I型胶原的组织培养皿,以含有地塞米松和人胰岛素的条件诱导液培养,通过观察鉴定得到肝细胞。
其中,所述步骤1)具体过程为:将人ES细胞系,接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,37℃,5%CO2条件下培养,培养液为无血清人ES细胞培养液:DMEM培养基、含20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM谷氨酰胺、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF、50IU/mL青霉素、50IU/mL链霉素,每天更换培养液;培养一周后,用1mg/mL胶原酶IV在37℃条件下孵育10~20分钟进行消化传代,离心,重悬,以1∶4~1∶6接种于新的培养皿,获得汇合生长的大量干细胞。
所述步骤2)具体过程为:将干细胞用胶原酶消化,离心,沉淀用拟胚体培养液悬浮,细胞悬液移入100mm的低吸附性细菌培养皿中,37℃,5%CO2条件下培养,每两天更换1次培养液,所述拟胚体培养液为无血清人胚胎干细胞培养液撤除bFGF因子:Knockout DMEM培养基、20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM谷氨酰胺、50IU/mL青霉素、50IU/mL链霉素;取呈集落状生长的人ES细胞,将其接种于低吸附性的细菌皿,1周左右成成熟EB。
所述步骤3)具体过程为:在显微镜下利用口吸管吸取技术选取培养7d的、大小较为均一的EB,将其先后置于两个含有PBS的细菌皿中洗涤两遍,然后显微镜下利用口吸管转移至预先添加有0.25%胰蛋白酶的细菌皿中进行消化,37℃,5%CO2条件下孵育大约5分钟,直至轻轻吹打可以全部形成单个细胞,再以血清中止消化,用滴管转移至10ml离心管中,1000rpm,离心5分钟,弃上清,沉淀即为所需单个细胞。
所述步骤4)具体过程为:将挑选的单个细胞接种到预先包被有I型胶原的培养板上,加入肝细胞诱导条件培养液,37℃,5%CO2条件下培养,每两天更换培养液,观察细胞定向诱导分化进程至获得肝细胞;所述肝细胞诱导条件培养液:IMDM培养基,含20%胎牛血清,50nM地塞米松,0.0625U/ml人胰岛素。
所述步骤4)中,诱导时间为21天。
本发明采用以上技术方案,利用人胚胎干细胞的生物学特性,形成成熟囊性拟胚体,通过地塞米松、人胰岛素等因子联合胞外基质I型胶原从体外定向诱导其分化为肝细胞。该方法用0.25胰酶-0.02%EDTA将EB消化为单个细胞,再进行接种并添加诱导剂诱导,操作中便于形态观察,同时单个细胞与因子和胞外基质能够充分接触,可以在20天左右诱导出肝细胞,较现有方法提前一周左右。本发明提供了一种新的种子细胞来源的方法,为细胞移植和生物人工肝的临床替代治疗等奠定了基础。
附图说明
图1:为人ES细胞及形成的EB图片。其中:(a)生长旺盛的人ES细胞,呈克隆样生长,形似鸟巢状(40×);(b~d)3d/7d(成熟)/14d(老化)的EB(100×)。
图2:为细胞诱导分化后形态学观察图片。其中:(e)光学显微镜下(40×),条件培养后分化出较多的上皮样细胞。(f)透射式电镜下,诱导14d后的细胞其内细胞器相当丰富,可见大量线粒体、光面内质网、糖原颗粒、溶酶体等细胞器,细胞表面出现类似指状突起的微绒毛(分别由箭头所示)。
图3:RT-PCR检测肝脏细胞特异性基因的表达。其中:1-6分别为DL2000分子量标准、AFP、ALB、CK19、CYP1B1和β-actin的扩增结果,A、B和C分别为诱导14d后的细胞、正常人胎肝细胞(阳性对照)和人EB的扩增结果。
图4:为免疫荧光化学检测图片。其中:圈示处为双核、多核细胞。
图5:为ICG摄取试验图片。其中:左边箭头示孵育30分钟内已摄取ICG的细胞,右边箭头示未摄取ICG的细胞。
图6:为PAS试验图片。其中:箭头示细胞内贮存的糖原颗粒。
图7:为分化细胞尿素和白蛋白的8h分泌量的图片。其中:1.未经诱导的人ES细胞;2.EB培养于条件诱导培养液14d;3.阳性对照(正常人胎肝细胞)
具体实施方式
实施例1、人ES细胞的培养及EB的形成
将人ES细胞系H9(外购于Wicell公司),接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(昆明小白鼠,血清、0.25胰酶-0.02%EDTA及DMEM培养基(外购于Hyclone公司)(经γ射线照射灭活有丝分裂活性,接种在0.1%明胶包被的培养皿中)上,培养液为无血清人ES细胞培养液:Knockout DMEM培养基(外购于Gibco公司)、含20%血清替代物(外购于Gibco)、0.1mMβ-巯基乙醇(外购于Gibco)、1mM谷氨酰胺(外购于Gibco)、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,外购于Chemicon)、50IU/mL青霉素、50IU/mL链霉素,1%的非必需氨基酸(外购于Gibco公司)。37℃,5%CO2条件下培养,每天更换培养液。一周左右细胞汇合生长,用1mg/mL胶原酶IV(外购于Gibco)在37℃条件下孵育10~20分钟进行消化传代,500rpm离心2min,重悬于新鲜制备的人ES细胞培养液中,以1∶4~1∶6的自身接种比率接种于新的培养皿。
汇合生长的细胞用胶原酶IV消化,500rpm离心2min,沉淀用拟胚体培养液(即无血清人胚胎干细胞培养液撤除bFGF因子)悬浮,细胞悬液移入100mm的低吸附性细菌培养皿(Greiner)中,37℃,5%CO2条件下培养,每两天更换1次培养液。
人ES细胞呈集落状生长,如图1a,将其接种于低吸附性的细菌皿后,ES细胞呈悬浮生长,逐渐聚集成小团,如图1b,约1周左右囊性变,如图1c,称为成熟EB,继续培养,光学显微镜下观察,EB逐渐形成中空的囊状,如图1d,成为老化的EB。
实施例2、EB消化为单个细胞
在显微镜下利用口吸管吸取技术选取培养7d的、大小较为均一的EB,将其先后置于两含有磷酸缓冲液(PBS)的细菌皿中洗涤两遍,然后转移(显微镜下利用口吸管转移)至预先添加有0.25%胰蛋白酶(Amresco)的细菌皿中进行消化,37℃,5%CO2条件下孵育大约5分钟,直至轻轻吹打可以全部形成单个细胞,再加入含10%血清(HYCLONE)的培养基中止消化1分钟,用滴管将单细胞悬液转移至10ml离心管中,1000rpm,离心5分钟,弃上清。实施例3、单个细胞向肝细胞的诱导分化
将实施例2中离心所得沉淀以肝细胞诱导条件培养液重悬,该培养液成分为IMDM培养基(Sigma),含20%胎牛血清(Gibco),50nM地塞米松(Sigma),0.0625U/ml人胰岛素(Lilly France S.A.S)。再接种到预先包被有I型胶原的培养板上。37℃,5%CO2条件下培养,每两天更换培养液,观察条件培养的定向诱导分化作用。
实施例4、诱导分化前后的细胞鉴定
1、细胞形态观察
光学显微镜下观察细胞诱导分化前后形态的变化,记录细胞诱导分化的过程。并取诱导分化21d的细胞,吸弃培养液,以PBS洗涤两遍,在4℃条件下以3%戊二醛于培养板原位前固定2h,再以1%锇酸后固定1h,用蔗糖缓冲液反复漂洗,梯度乙醇脱水、加入丙酮后,以树脂渗透、包埋、聚合,用ULTRACUTE/S型切片机超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅双重染色,Philips CM120透射电子显微镜观察细胞超微结构。
光学显微镜下观察到,在诱导之初,细胞处于旺盛的分裂状态,细胞大,核仁多个且明显,图2e为光学显微镜下观察到,条件培养后分化出较多的上皮样细胞。随着时间的推移,细胞逐渐由圆形变为长梭形或多角形,分化出较多的上皮样细胞,可见双核和多核细胞。透射式电镜下观察到,诱导14d后的细胞其内细胞器相当丰富,可见大量特征性的圆形或椭圆形、大小不一、嵴稀的线粒体、分布于光面内质网周围的簇状糖原颗粒、溶酶体、高尔基体等细胞器,,细胞表面出现类似指状突起的毛细胆管或微绒毛,符合肝细胞典型的超微结构,如图2f所示。
2、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测人ES细胞诱导前、后相关基因mRNA的表达变化
用TRIzol试剂(Invitrogen)提取诱导分化前及诱导分化21天(7天EB+14天条件培养)的细胞总RNA,分别用下述引物:
AFP(S:5′-TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGA-3′,
A:5′-CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA-3′),
ALB(S:5′-TGCTTGAAGGTGCTGATGACAGGG-3′,
A:5′-AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC-3′),
CK19(S:5′-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3′,
A:5′CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3′),
CYP1B1( S:5′-GAGAACGTACCGGCCACTATCACT-3′,
A:5′-GTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT-3′),
β-actin(S:5′-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3′,
A:5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′)
进行RT-PCR反应(反转录体系:RNA 1.5ul,oligodT 2ul,10mMdNTPmixture2ul,RNAase抑制剂0.5ul,5×AMV 4ul,AMVase 1ul,DEPC水9ul;程序:室温10分钟,42℃1小时,72℃10分钟,4℃∞)(PCR体系:引物2ul,cDNA 2ul,10×PCRbuffer 2ul,2.5mMdNTPmixture 1.6ul,rTaq 0.5ul,水11.9ul;程序:94℃5分钟,33个循环(94℃ 30秒,50℃-60℃ 30秒,72℃ 30秒),72℃延伸10分钟),PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,用Alpha Imager3300软件对结果进行分析。(所有RT-PCR应用产品均购自Takara公司)
电泳结果显示诱导后细胞弱表达原始肝细胞标志AFP和成熟肝细胞标志ALB,而强表达CK19和细胞色素P450(CYP)1B1,结果见图3。
3、间接免疫细胞化学检测
将诱导21d的细胞用PBS洗涤两遍,4%多聚甲醛固定30分钟,0.1%的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)破膜15分钟,山羊血清(中杉金桥生物技术有限公司)室温封闭抗原30分钟后,分别与甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)(R&D)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18,Santa Cruz)标记的一抗工作液(中杉金桥生物技术有限公司)4℃孵育过夜,再以不同荧光素(FITC、TRITC)标记的二抗(中杉金桥生物技术有限公司)避光继续孵育30分钟,DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚,Roche)衬染细胞核,置共聚焦显微镜下观察,用Laser-Sharp 2000软件分析图像。
间接免疫荧光结果从蛋白水平证实:以肝细胞条件诱导培养液培养后,部分细胞表达肝细胞早期标志AFP与成熟肝细胞特异性标志CK18(结果见图4)。
4、靛青绿(indocyanine green,ICG)(Sigma)的摄取、排泌实验
诱导分化21d的细胞用PBS充分洗涤后,加入1mg/mlICG于37℃孵育30分钟,显微镜下观察细胞颜色的变化;再用PBS冲洗2遍,换回完全培养液继续常规培养,并观察细胞颜色的变化。
结果显示,诱导后细胞约50%被染成深绿色,而其余的颜色无变化,见附图5;换回完全培养基常规培养6h之内,着色细胞的颜色完全退去,说明诱导后的细胞大约50%具有类似肝细胞的染料排泄功能。
5、糖原染色实验即高碘酸-雪夫反应(periodic acid-Schiff,PAS)
PAS试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)用于检测细胞内的糖原。将涂片滴加固定液固定3~5分钟,水洗,晾干;滴加过碘酸于涂片上氧化10分钟,水洗,晾干;放入雪夫氏溶液中,置37℃水浴箱5~10分钟;取出后流水洗涤10~20分钟,晾干,镜检。
镜检诱导后细胞发现,PAS阳性物呈红色颗粒或弥散状,定位于细胞浆中。红色的深度与所含糖原的量有关:量少呈淡红色,量多呈深红色,结果见图6,说明诱导后细胞具备类似肝细胞的贮存糖原的能力。
6、诱导分化14d的细胞经PBS冲洗换用无血清的IMDM培养基,加入0.15mol/L NH4Cl,常规培养8h后收集细胞培养上清,在全自动生化分析仪(Olympus,Tokyo,Japan)上检测培养上清中尿素和ALB的分泌量。
结果显示,诱导分化14d的细胞具有与正常肝细胞类似的分泌ALB和氨基代谢生成尿素的功能,而未加以诱导的ES细胞组几乎未测到尿素和ALB。
以上实验结果证明通过形成成熟拟胚体并将其消化为单个细胞,以细胞因子(地塞米松+人胰岛素)联合胞外基质(I型胶原)的方法能够在21d分化人胚胎干细胞为肝细胞,诱导分化高效,操作过程中易于观察从而为进一步优化诱导条件创造了条件。
Claims (7)
1.一种人胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法,采用以下步骤:
1)扩增人胚胎干细胞;
2)形成成熟拟胚体;
3)将诱导的成熟拟胚体消化成单个细胞;
4)将单个细胞以条件培养液诱导分化,得到肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,更具体步骤包括:
1)采用胶原酶IV消化法对hESCs进行传代扩增,获得大量干细胞;
2)将hESCs用拟胚体培养液悬浮、培养,接种到低吸附性的细菌皿中形成成熟拟胚体EB;
3)将成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化为单个细胞;
4)将单个细胞后接种到预先包被有I型胶原的组织培养皿,以含有地塞米松和人胰岛素的条件诱导液培养,通过观察鉴定得到肝细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤1)具体过程为:将人ES细胞系,接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,37℃,5%CO2条件下培养,培养液为无血清人ES细胞培养液:DMEM培养基、含20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM谷氨酰胺、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF、50IU/mL青霉素、50IU/mL链霉素,每天更换培养液;培养一周后,用1mg/mL胶原酶IV在37℃条件下孵育10~20分钟进行消化传代,离心,重悬,以1∶4~1∶6接种于新的培养皿,获得汇合生长的大量干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤2)具体过程为:将干细胞用胶原酶消化,离心,沉淀用拟胚体培养液悬浮,细胞悬液移入100mm的低吸附性细菌培养皿中,37℃,5%CO2条件下培养,每两天更换1次培养液,所述拟胚体培养液为无血清人胚胎干细胞培养液撤除bFGF因子:KnockoutDMEM培养基、20%血清替代物、1%非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM谷氨酰胺、50IU/mL青霉素、50IU/mL链霉素;取呈集落状生长的人ES细胞,将其接种于低吸附性的细菌皿,1周左右成成熟EB。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法,其特征在于,所述步骤3)具体过程为:在显微镜下利用口吸管吸取技术选取培养7d的、大小较为均一的EB,将其先后置于两个含有PBS的细菌皿中洗涤两遍,然后显微镜下利用口吸管转移至预先添加有0.25%胰蛋白酶的细菌皿中进行消化,37℃,5%CO2条件下孵育大约5分钟,直至轻轻吹打可以全部形成单个细胞,再以血清中止消化,用滴管转移至10ml离心管中,1000rpm,离心5分钟,弃上清,沉淀即为所需单个细胞。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述步骤4)具体过程为:将挑选的单个细胞接种到预先包被有I型胶原的培养板上,加入肝细胞诱导条件培养液,37℃,5%CO2条件下培养,每两天更换培养液,观察细胞定向诱导分化进程至获得肝细胞;所述肝细胞诱导条件培养液:IMDM培养基,含20%胎牛血清,50nM地塞米松,0.0625U/ml人胰岛素。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述步骤4)诱导时间为21天。
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