CN107287159A - 一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，该方法具体步骤如下：取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上；细胞培养至汇合状态后，消化后接种于新的饲养层细胞上；制备单细胞悬液，将细胞悬液接种至六孔培养板中，培养3‑4d对胚胎干细胞进行预诱导；将细胞种至0.9％甲基纤维素的半固体培养基中，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，消化传代，接种于新的饲养层细胞上，得到造血干细胞。本发明提供了一种胚胎干细胞通过人工诱导分化为造血干细胞的方法，胚胎干细胞具有非特异性，能够进行长期的增殖和自我更新，同时还具有分化能力，所述制备方法为大量获取造血干细胞提供了一种有效途径，对临床治疗中造血干细胞的移植具有重要意义。

Description

一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法。
背景技术
造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。
血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。1961年TillJE,McCulloch EA用小鼠体内脾结节方法第一次证实了造血干细胞的存在。八十年代后，Weissman等多个实验室相继通过细胞表面标记分离出高度纯化的不同阶段的造血干祖细胞。在小鼠造血干细胞的研究中，造血干细胞的分离是通过细胞表面标记Lineage Sca-1c-kit或者细胞代谢方面的特性(侧群细胞)借助于流式细胞仪实现的。九十年代通过引入CD34这个细胞表面标记区分小鼠中长期造血干细胞和短期造血干细胞。进入二十一世纪后，基于SLAM家族分子(CD41，CD48和CD150)进一步富集造血干细胞，SLAM分子在造血干细胞的表达比较稳定，并且能够广泛的应用于各品系的实验小鼠。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，所述制备方法为大量获取造血干细胞提供了一种有效途径，对临床治疗中造血干细胞的移植具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，该方法具体步骤如下：
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上；
S2、培养过程中每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，消化后接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；
S3、取生长良好的胚胎干细胞，制备单细胞悬液，将细胞悬液接种至六孔培养板中，六孔培养板中加入DMEM/F12培养液，培养3-4d对胚胎干细胞进行预诱导；
S4、将S3中预诱导结束的细胞PBS反复吹打，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后3-4×107/L的细胞密度接种至0.9％甲基纤维素的半固体培养基中，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入2-3mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5，得到造血干细胞。
进一步地，S1中所述培养基成分为：DMEM/F12培养基中加入0.5％N2，0.5％B27，20-30ng/ml bFGF和2-5ng/ml TGFβ。
进一步地，所述S2中37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代。
进一步地，S3中所述DMEM/F12培养液中加入0.1mol/L的地塞米松、50μg/mL链霉素和50μg/mL青霉素。
进一步地，所述半固体培养基中加入15％FBS、30-40ng/mL SCF、1000-1200U/mLIL-3、10-15ng/mL IL-6。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种胚胎干细胞通过人工诱导分化为造血干细胞的方法，体外培养的胚胎干细胞通过DMEM/F12培养基一步诱导后，继续接种至半固体培养基中，胚胎干细胞具有非特异性，能够进行长期的增殖和自我更新，同时还具有分化能力，所述制备方法为大量获取造血干细胞提供了一种有效途径，对临床治疗中造血干细胞的移植具有重要意义。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入0.5％N2，0.5％B27，20ng/ml bFGF和2ng/ml TGFβ；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5；
S3、取生长良好的胚胎干细胞，制备单细胞悬液，将细胞悬液接种至六孔培养板中，六孔培养板中加入DMEM/F12培养液，培养3d对胚胎干细胞进行预诱导，其中DMEM/F12培养液中加入0.1mol/L的地塞米松、50μg/mL链霉素和50μg/mL青霉素；
S4、将S3中预诱导结束的细胞PBS反复吹打，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后3×107/L的细胞密度接种至0.9％甲基纤维素的半固体培养基中，培养基中加入15％FBS、30ng/mL SCF、1000U/mL IL-3、10ng/mL IL-6,置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入2mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5，得到造血干细胞。
实施例2
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入0.5％N2，0.5％B27，30ng/ml bFGF和5ng/ml TGFβ；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:6；
S3、取生长良好的胚胎干细胞，制备单细胞悬液，将细胞悬液接种至六孔培养板中，六孔培养板中加入DMEM/F12培养液，培养4d对胚胎干细胞进行预诱导，其中DMEM/F12培养液中加入0.1mol/L的地塞米松、50μg/mL链霉素和50μg/mL青霉素；
S4、将S3中预诱导结束的细胞PBS反复吹打，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后4×107/L的细胞密度接种至0.9％甲基纤维素的半固体培养基中，培养基中加入15％FBS、40ng/mL SCF、1200U/mL IL-3、15ng/mL IL-6,置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入3mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5，得到造血干细胞。
实施例3
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入0.5％N2，0.5％B27，25ng/ml bFGF和3ng/ml TGFβ；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5.5；
S3、取生长良好的胚胎干细胞，制备单细胞悬液，将细胞悬液接种至六孔培养板中，六孔培养板中加入DMEM/F12培养液，培养3.5d对胚胎干细胞进行预诱导，其中DMEM/F12培养液中加入0.1mol/L的地塞米松、50μg/mL链霉素和50μg/mL青霉素；
S4、将S3中预诱导结束的细胞PBS反复吹打，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后3.5×107/L的细胞密度接种至0.9％甲基纤维素的半固体培养基中，培养基中加入15％FBS、35ng/mL SCF、1100U/mL IL-3、12ng/mL IL-6,置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入2.5mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5，得到造血干细胞。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上；
S2、培养过程中每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，消化后接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；
S3、取生长良好的胚胎干细胞，制备单细胞悬液，将细胞悬液接种至六孔培养板中，六孔培养板中加入DMEM/F12培养液，培养3-4d对胚胎干细胞进行预诱导；
S4、将S3中预诱导结束的细胞PBS反复吹打，离心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后3-4×107/L的细胞密度接种至0.9％甲基纤维素的半固体培养基中，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入2-3mg/ml胶原酶Ⅳ进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5，得到造血干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，其特征在于：S1中所述培养基成分为：DMEM/F12培养基中加入0.5％N2，0.5％B27，20-30ng/mlbFGF和2-5ng/ml TGFβ。
3.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，其特征在于：所述S2中37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代。
4.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，其特征在于：S3中所述DMEM/F12培养液中加入0.1mol/L的地塞米松、50μg/mL链霉素和50μg/mL青霉素。
5.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为造血干细胞的方法，其特征在于：所述半固体培养基中加入15％FBS、30-40ng/mL SCF、1000-1200U/mL IL-3、10-15ng/mL IL-6。
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