CN104694462A - 一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效的将人胚胎干细胞诱导分化为肝细胞的方法。该方法以肿瘤抑制因子P53及Wnt5a重组蛋白作为分化诱导剂，在分化培养初期采用低氧培养，之后在细胞发育不同时期添加包括甲胎蛋白（AFT）、胰岛素等在内的肝细胞生长因子促进诱导分化。本发明也提供了由所述方法获得的肝细胞，这些从人胚胎干细胞起源的肝细胞具有正常肝细胞的形态和亚细胞结构如毛细胆管等，表达肝细胞特异的蛋白质，如甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK18），而且还具有肝脏特异的糖原储存功能。

Description

一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法

技术领域

本发明公布了一种将胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的有效方法，属于再生医学技术领域。

背景技术

我国是肝病大国，每年因终末期肝病死亡者人数众多。目前，肝硬化、原发性肝癌、代谢性肝病等终末期肝病的治疗主要依赖于原位肝移植，原位肝移植仍然是治疗终末期肝病最有效的措施，但由于存在供肝严重短缺、免疫排斥和长期服用免疫抑制剂带来多种毒副作用等缺点，其临床应用受到很大抑制。以肝细胞移植（Hepatocyte transplantation，HT）作为原位肝移植的替代治疗是一种可用于治疗肝脏疾病的可行方案，但亦面临着肝细胞资源缺乏、体外培养的肝细胞增殖能力差等缺点限制了其应用。干细胞的研究为解决上述问题提供了新的思路。

胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）因其具有无限的增殖能力和分化为各个胚层细胞的潜能，是细胞替代治疗临床疾病理想的种源细胞。特别是ESCs分化为肝细胞样细胞（hepatocyte-like cells, HLCs）的研究，可为临床细胞替代治疗提供合适的细胞来源，亦在药物评估和肝脏发生等基础研究方面起重要作用。目前国内外已报道了人(Cai et al, 2007; Lavon et al, 2004)和小鼠(Gouon-evans et al, 2006; Hamazaki et al, 2001) ESCs体外分化为肝细胞或肝样细胞的研究，这些分化的细胞在形态上与成体肝细胞相似，并表达肝细胞相关的基因和蛋白，有些分化得到的细胞还具备肝细胞的功能，这些研究为以ESCs为种源细胞进行肝细胞替代治疗研究奠定了良好的基础。

近年来，ESCs的诱导分化已形成了多种方法和技术体系，其中以分化过程可分为：1.胚胎干细胞自发分化；2.胚胎干细胞直接以诱导剂诱导期分化；3.胚胎干细胞先形成拟胚体（EB），之后将一个球形EB直接接种，再添加各种诱导剂来诱导分化。在他们的研究中，主要通过4个阶段的诱导实现ES细胞向功能性肝细胞的分化，即内胚层的诱导分化、肝特异性细胞的诱导分化、成肝细胞的扩增和肝细胞的成熟。在这一过程中，每个阶段所要依靠的细胞因子各不相同，常用的早期诱导因子有激活素A、丁酸钠SB等。激活素A 可通过激活activin/nodal 信号通路诱导ESCs向内胚层分化。常用的中期诱导因子有HGF、FGF、BMP、DMSO 等。HGF可通过激活c-Jun 通路促进肝脏发育。FGF家族中与肝脏发育相关的主要因子有FGF2、FGF4、FGF7，来源于横隔间充质的BMP2和BMP4可与FGF联合诱导肝脏分化。晚期促成熟因子主要包括OSM和地塞米松，前者通过gp130信号转导通路诱导肝脏成熟，后者参与肝脏糖异生。

人类ESCs可以自发形成拟胚体，然后自发分化为各种组织特异性细胞系，其中10~30％分化成肝细胞和肝细胞样细胞；通过富集拟胚体的内胚层，分化成肝细胞和肝细胞样细胞的效率增长到50~65%；而目前在iPSC和ESC分化成肝细胞的过程中，持续添加各种组织特异性生长因子，其分化效率可达60~80%，诱导过程所需时间太长，需要20天左右；而缩短诱导时间，诱导效率则明显下降。早期诱导因子丁酸钠是一种细胞周期阻抑化合物（组蛋白脱乙酰化酶抑制剂），在诱导过程中会使细胞大量死亡，需要大量的hESCs才能诱导出少量的肝细胞。目前，诱导成功的肝细胞尽管满足了某些实验的需求，但是，对于临床要求来讲，还具有较大的距离。所以，如何在此基础上进一步优化，也是近年来研究人员一直在探讨的问题。

氧是细胞生存的必要条件之一，也是细胞生物学行为和生理功能的一种重要调节因子。细胞在体外培养下的生存和生长也必须有适宜的氧浓度，细胞培养本身又是研究氧生物学作用的重要方法。然而，多种细胞体外培养所需的最适氧浓度还不确定，不同氧浓度对细胞的作用及其机制尚不完全清楚。细胞的类型和机能状态、技术条件等因素都可影响细胞对氧浓度变化的反应。人和哺乳动物细胞体外培养的气相环境条件一般是恒温37℃，含5%～10% CO₂及饱和水蒸汽的空气。在细胞培养实验领域，人们普遍将标准CO₂培养箱内空气的O₂体积分数作为细胞培养气相环境的正常或常规氧体积分数，简称常氧( normoxia)，低于和高于常氧的氧浓度分别称为低氧( hypoxia) 和高氧( hyperoxia)。在胚胎发育早期，由于宫腔内血管尚未生长进入，所有的胚胎细胞处于低氧浓度的生理微环境（宫腔内氧含量为2%～5%）。低氧作为一种生理性的刺激因素，影响着胚胎干细胞的生长、分化。目前，对ESCs的体外分化研究多在常氧（约20%）条件下进行，难以反映体内的真实情况。

所以，针对上述技术背景和技术存在的问题，本发明拟在经典分化方法的基础上，在细胞分化过程中，对细胞因子种类和作用模式进行优化，探索可以高效定向诱导胚胎干细胞分化为成熟功能性肝细胞的方法，从而为研究肝细胞的发生发育和药物筛选建立一种新的体外模型，同时也为胚胎干细胞在临床肝脏疾病的治疗应用方面提供一定的理论基础和技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的诱导胚胎干细胞分化为肝细胞的优化方法，大大缩短了整个诱导分化所需的时间，且提高分化率。本发明是模拟宫腔内生理微环境，用低氧条件（4% O₂）预培养细胞，并运用P53联合Wnt5a作为前期诱导剂，联合肝细胞营养因子aFGF 、HGF、KGF、 AFP等，通过类胚体EB途径实现的。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1）胚胎干细胞的体外培养，培养体系为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，其中添加0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素，1000 U/mL重组小鼠白血病抑制因子（LIF），培养条件为常氧、5% CO₂、37℃；

步骤2）拟胚体的形成：培养体系为去除胚胎干细胞培养体系中的LIF，同时将胎牛血清浓度调整为15%即可；将胚胎干细胞以3×10⁴~5×10⁴/ml浓度接种于未经过促细胞黏附作用处理、瓶底光滑的玻璃培养瓶中摇动培养法，1天后便会有大量的拟胚体生成，形成成熟拟胚体；将成熟的囊性拟胚体用胰蛋白酶消化为单个细胞，培养条件为常氧、5% CO2、37℃；

步骤3）诱导分化阶段Ⅰ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅰ，培养条件为低氧4% O₂、5% CO₂、37℃，培养时间为2天；

步骤4）诱导分化阶段Ⅱ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅱ，培养条件为常氧、5% CO₂、37℃，培养时间为3天；

步骤5）诱导分化阶段Ⅲ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅲ，培养条件为常氧、5% CO₂、37℃，培养时间为3天；

步骤6）诱导分化阶段Ⅳ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅳ，培养条件为常氧、5% CO₂、37℃，培养时间为2天。

进一步的，所述的步骤3）中的诱导培养培养体系Ⅰ为将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入肿瘤抑制因子P53和肿瘤抑制因子Wnt5a制备而成。

进一步的，所述的步骤4）中的诱导培养培养体系Ⅱ为将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml甲胎蛋白（AFP），100ng/ml酸性纤维细胞生长因子（αFGF），30 ng/ml人成纤维细胞生长因子4（FGF4）制备而成。

进一步的，所述的步骤5）中的诱导培养培养体系Ⅲ为将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml肝细胞生长因子（HGF），10ng/ml制瘤素（OSM），20ng/ml角质细胞生长因子（KGF）制备而成。

进一步的，所述的步骤6）中的诱导培养培养体系Ⅳ为将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入10^-7M地塞米松（DEX），0.8%二甲基亚砜（DMSO），5ug/ml 胰岛素，5ug/ml 转铁蛋白制备而成。

进一步的，所述的诱导培养培养体系Ⅰ中的肿瘤抑制因子P53的浓度范围是0.5-1U/ml，优选0.16U/ml；肿瘤抑制因子Wnt5a浓度范围是50-200 ng/ml，优选100ng/ml。

本发明的主要优点在于：

（1）本发明将成熟EB经消化成为单细胞后接种进行诱导培养，让细胞与因子和胞外基质能够充分接触，从而能有效地以及快捷地诱导出肝细胞。

（2）本发明运用低氧条件（4% O₂）预培养细胞，模拟宫腔内生理微环境，促进ES细胞向肝细胞的分化，肝细胞相关基因的表达提高20%，使分化细胞更接近于真正的肝细胞。

（3）本发明首次运用P53联合Wnt5a作为前期诱导剂，避免诱导剂对干细胞本身的伤害，加速胚胎干细胞向内胚层的分化。同时，细胞诱导中后期培养系统中选择了采用促进肝细胞发生及生长的细胞生长因子TGF、aFGF 、HGF、KGF、 AFP、胰岛素等。细胞生长因子得到更合理优化，大幅度的提高肝细胞分化率，肝细胞分化率为95%。

（4）本发明方法大大缩短了胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的时间，整个分化过程仅需13天。

（5）本发明方法条件易于控制，分化过程中便于形态观察，操作简单，成本低廉。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法的实验流程图；

图2是本发明具体实施例中EB细胞在分化过程中的形态学变化结果（×100）。其中图2A、图2C、图2E为低氧预培养组细胞在分化第1、3、9天的细胞形态；图2B、图2D、图2F为常氧对照组细胞在分化第1、3、9天的细胞形态；

图3是本发明具体实施例中诱导第2、4、7、10天的两组分化细胞的RT-PCR检测结果；

图4是本发明具体实施例中Real time PCR分析肝细胞相关基因AFP、ALB、CK18在分化过程的变化；

图5是本发明具体实施例中免疫荧光化学染色结果（×200）；

图6是本发明具体实施例中诱导肝细胞糖原染色结果（×100）；

图7是本发明具体实施例中诱导肝细胞的ICG代谢能力评价结果（×100），其中图7A为导肝细胞吸收ICG的结果；图7B为诱导肝细胞释放ICG的结果。

具体实施方式

以下将结合附图，参照具体实施例详细描述本发明，如图1所示的本发明一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法的实验流程图，本发明可以按如下所述来选择细胞诱导培养所需试剂及器材：

1.       ES细胞：选用的人源H1 ES 细胞购自美国 WiCell 研究所；

2.       细胞培养试剂：

ES细胞培养基：DMEM(glucose，4.5 g/L)，20%胎牛血清，0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素，1000 U/mL重组小鼠白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）；

EB培养基：DMEM(glucose，4.5 g/L)，15%胎牛血清，0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素；

诱导培养培养体系Ⅰ：DMEM(glucose，4.5 g/L)，10%胎牛血清，0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素，100 ug/ml 链霉素，0.16U/ml 肿瘤抑制因子P53，100ng/ml 肿瘤抑制因子Wnt5a；

诱导培养培养体系Ⅱ：DMEM(glucose，4.5 g/L)，10%胎牛血清，0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素，100 ug/ml 链霉素，20ng/ml AFP，100ng/ml αFGF，30 ng/ml FGF4；

诱导培养培养体系Ⅲ：DMEM(glucose，4.5 g/L)，10%胎牛血清，0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素，100 ug/ml 链霉素，20ng/ml HGF，10ng/ml OSM，20ng/ml KGF；

诱导培养培养体系Ⅳ：DMEM(glucose，4.5 g/L)，10%胎牛血清，0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素，100 ug/ml 链霉素，10^-7M地塞米松，0.8%二甲基亚砜，5ug/ml 胰岛素，5ug/ml 转铁蛋白。

 实施例1. hES细胞的体外扩增培养：

在进行诱导前，首先需要将冻存的hES细胞进行体外扩增培养。

复苏：将冻存的hES细胞从液氮中取出后，迅速至于40℃的水浴锅中，震荡直到细胞悬液融化，用9 ml ES稀释细胞悬液，1500rpm，离心5min，弃上清，用ES细胞培养液将细胞重悬后加到一次性塑料培养皿中，在37℃，5%的CO₂培养箱中培养。

培养：每24小时更换培养液一次，并在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况。

传代：细胞接种后2-3天后传代。吸弃旧培养液，加入1ml 1mg/ml 胶原酶Ⅳ，置37℃，消化1min。加入3ml 新鲜培养液，用5ml 移液管轻轻吹打细胞集落数次，使其从培养皿的底部脱落下来，并被吹打成小片。将细胞悬液按照1:2或1:3分到新的预铺有培养液的培养皿中，37℃，5%的CO₂培养箱中培养。

冻存：当细胞扩增到需要的数目时，多余的细胞可以冻存。一般在细胞融合密度达到80%左右时，用1ml 1mg/ml 胶原酶Ⅳ将其消化，然后加入1ml ES细胞冻存液（ES培养基：DMSO=9:1），轻轻吹打重悬细胞集落，混匀后，4℃放置20分钟，再放入-20℃冰箱20分钟，再放入-80℃冰箱过夜，第二天移入液氮中长期保存。

 实施例2. hES细胞的体外诱导培养：

取实施例1中培养的hES细胞进行诱导：

1. 拟胚体EB的形成：用1ml 1mg/ml 胶原酶Ⅳ将hES细胞集落消化成小细胞团，加入EB培养液重悬，并将细胞悬液转至未经过促细胞黏附作用处理、瓶底光滑的玻璃培养瓶中摇动培养法，每1小时摇动细胞一次，使其悬浮生长发育为EBs，第2-3天每3小时摇动一次；EBs的发育分化期间每1-2 天换液一次，摇动培养3天；

EBs培养时换用玻璃培养瓶是因为玻璃培养瓶未经过促细胞黏附作用处理，瓶底光滑，易于EBs悬浮生长；摇动培养法操作时，开始培养EBs的第一天非常重要，因为此时的ES细胞尚处在向EBs分化初期，ES细胞黏附性强的特点使其容易贴壁，此时的悬浮生长对EBs的发育及形成良好的EBs结果非常重要，贴壁不但影响ES细胞向EBs的发育分化，还会阻碍正常EBs结构的形成及EBs的生长；第2-3天则影响相对较小；本试验未选用悬滴培养法，是因为摇动培养法产生EBs数量充足，而悬滴培养法产生的EBs数量非常小，难以满足本实验RT-PCR和ICC等方法检测对大量分化细胞的需求。

2. 将成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化为单个细胞：在显微镜下利用口吸管吸取技术选取培养3d的，大小较为均一的EB，将其置于含有磷酸缓冲液（PBS）的细菌皿中清洗两遍，然后显微镜下利用口吸管转移至预先添加有0.25%胰蛋白酶（Amresco）的细菌皿中进行消化，37℃，5%CO₂条件下孵育大约5分钟，直至轻轻吹打可以全部形成单个细胞，再加入含10%血清的培养基中止消化1分钟，用滴管将单细胞悬液转移至10ml离心管中，1000rpm，离心5分钟，弃上清。

将EB消化为单个细胞便于形态观察，同时让细胞与因子和胞外基质能够充分接触，从而能有效地以及快捷地诱导出肝细胞。

3. 肝细胞定向诱导分化：

分四个阶段对EB单细胞进行诱导分化培养。将挑选的单个细胞接种到预先包被有Ⅰ型胶原的培养板上，加入诱导培养培养体系Ⅰ，调节三气培养箱中的低氧条件为4% O₂、5% CO₂、37℃，将培养皿放入低氧培养箱中培养24h，处理完毕恢复常氧条件（约为20% O₂）继续培养1天，常氧组作为对照；之后换用诱导培养培养体系Ⅱ培养三天；诱导培养培养体系Ⅲ培养三天；最后用诱导培养培养体系Ⅳ培养两天。每天更换培养液，观察细胞定向诱导分化进程至获得肝细胞。定期取样，进行如实施例3-7中所述的形态结构观察以及基本表达和功能的试验。

实施例3. 细胞形态观察

EB 细胞体外分化功能性肝细胞可以分为 4 个阶段：内胚层的诱导分化阶段即诱导分化阶段Ⅰ（第 1 天~第 2 天）、肝特异性细胞的诱导分化阶段即诱导分化阶段Ⅱ（第 3 天~第 5天）、成肝细胞的扩增阶段即诱导分化阶段Ⅲ（第 6 天~第 8天）和肝细胞的成熟阶段即诱导分化阶段Ⅳ（第 9天~第 10 天）。通过在不同时间添加不同生长因子组合，可以在体外环境下模拟体内肝脏的发育过程，从而在体外条件下得到肝细胞样细胞。整个分化过程为 10 天，取第 1 天、第 3 天和第 9 天的两组细胞观察细胞形态。两组细胞在形态上差异不明显：分化的第 3 天是定型内胚层向肝前体转化阶段，这一时间的细胞呈鱼鳞状排布，更似肝脏细胞；在分化的第9天，可以见到细胞开始逐渐出现双核等肝细胞特征，在形态特征方面，细胞较前一阶段更为典型，更为接近真正的肝细胞（如图2所示）。

实施例4. ALB、CK18、AFP基因在培养系统中表达的RT-PCR及Q-PCR检测

在细胞诱导分化第2、4、7、10天以Trizol试剂裂解细胞，提取细胞总RNA，同时提取未分化细胞总RNA作为0天的对照。分别用下述引物：

 进行反转录合成cDNA，再所得反转录产物反应进行PCR反应，最后将PCR产物进行1.8%琼脂糖凝胶电泳，检测肝脏特异性基因AFP、ALB、CK18在mRNA水平上的表达（所有RT-PCR应用产品均购自TaKaRa公司）。

反转录体系：RNA 1.5 ul，oligoT 2 ul，10mM dNTPmix 2ul，RNAase抑制剂0.5 ul，5×AMV buffer 4ul，AMVase 1ul，DEPC水9ul；程序：室温10分钟，42℃1小时，72℃10分钟，4℃∞。

Real-time PCR反应体系：ddH₂O 5ul，SYBR 10ul，Primers 2ul，cDNA 8ul，total 25ul。反应条件: 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共60个循环；72℃ 10 min。

肿瘤抑制因子P53，是一种负调控Nanog表达的促分化的基因，P53可以结合到Nanog的启动子上，损伤DNA后抑制Nanog的转录，从而导致胚胎干细胞的分化。Wnt/β-catenin信号传导通路是一条在生物进化中极为保守的通路。当细胞外Wnt蛋白信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合后激活胞内的Dishevelled，导致一种被称为摧毁复合体中的元件失活，避免了β-catenin降解，使其能够稳定地进入细胞核，与转录因子复合物TCF/LEF结合，开启干细胞分化相关基因。Wnt5a就是Wnt家族成员中的一个。P53与Wnt5a的联合诱导既可以加快EB向内胚层分化，也可以避免对干细胞本身的伤害，缩短ES体外诱导分化为肝细胞的时间，提高分化效率。

AFP为内胚层早期标志物，ALB及CK18是成熟肝细胞标记物。结果显示，经过10天的诱导，诱导的细胞都能够不同程度地表达肝脏细胞特异性标志物AFP、ALB、CK18的mRNA，其中，低氧组较常氧组mRNA表达量较高，提高约20%，见图3、图4。

实施例5. 细胞免疫荧光反应分析

取用肝细胞诱导液诱导10天的低氧组细胞，用PBS洗涤三次，每次5min；4％多聚甲醛室温固定10min；PBS 洗三次，每次5min，然后用 0.1％Triton孵育10min以增加细胞膜的通透性；PBS洗涤三次，每次5min，加入5% BSA/PBS，37℃孵育30min，以封闭非特异性结合位点；去掉血清，分别加入兔抗人Alb多克隆抗体和抗人/小鼠 AFP 单克隆抗体工作液，阴性对照用PBS代替，置于湿盒中，4℃过夜；PBS洗涤三次，每次5min，加入荧光标记的二抗兔抗小鼠IgG-FITC工作液，37℃孵育30min，并用DAPI染核，PBS 冲洗后直接在荧光显微镜下观察。

检测结果：诱导分化细胞中的部分细胞AFP、Alb的表达为阳性（见附图5）。

实施例6. 肝细胞糖原合成能力检测

成熟肝细胞具有合成和储存糖原的能力。本实验中，我们采用 Polysciences公司的 PAS染色试剂盒（Cat NO.24200）进行肝糖原的鉴定。具体步骤如下：

1）  诱导9天的低氧组细胞用4%多聚甲醛固定 30min；

2）  PBS 洗 3 遍，每孔加入 0.5ml 0.5%Periodic Acid  室温孵育 5min；

3）  蒸馏水清洗 3 遍；

4）  每孔加入 0.5ml 的 Schiff’s Reagent 孵育 15min，预平衡至室温；

5）  吸弃 Schiff’s Reagent，然后用 0.55% Potassium Metabisulfite 清洗 3 遍，每次清洗 1min；

6）  用流水漂洗 10min，然后进行显色；

7）  加入 0.5ml Acidified Harris Hematoxylin 共染，室温下孵育 30s；

8）  流水清洗 5min，弃除多余的 Hematoxylin；

9）  加入 1ml 甘油封闭，在显微镜下观察照相。

染色结果显示：50%以上的细胞可被染为深紫色，其余细胞呈浅紫色或未被染色（图6）。这表明大多数细胞具有糖原合成和储存的能力，但是，少部分细胞不具备这一方面的功能特征或合成储备功能较弱，所以未被染色或染色较淡。

实施例7. 吲哚菁绿（ICG）摄取试验

正常肝细胞具有排泄和代谢转化功能，肝细胞能够摄取培养基中的 ICG，在细胞核中呈现绿色，在撤除 ICG 正常培养 4~6 小时后，肝细胞可以将摄取的 ICG释放出来，恢复无色状态。ICG 检测采用 Polysciences公司的 ICG 染色试剂盒（Cat NO.08263）的实验具体步骤如下：

1）用 100mg/ml 浓度的 DMSO 溶解 ICG；

2）吸弃原培养板中的培养基，向分化 21 天的低氧组细胞培养基中加入终浓度为1mg/ml 的 ICG 试剂，并于 37℃孵育 60min；

3）吸弃带有 ICG 的培养基，并用 PBS 洗 2 次；

4）在显微镜下观察细胞的 ICG 摄取情况；

5）在细胞中加入分化培养基，于 37℃孵箱中继续培养 6h；

6）在显微镜下观察细胞 ICG 分泌情况，并照相记录。

实验结果显示：ES 细胞衍生成熟肝细胞（分化第 10 天）在含有 ICG 的培养基中培养 60分钟后，细胞会吸收 ICG，显微镜下观察可见在细胞中含有明显的绿色物质（图7A），在撤除 ICG 正常培养 4~6 小时后，ES 细胞衍生的肝细胞可以将摄取的 ICG 释放出来，恢复无色状态（图7B）。这表明诱导后的细胞具有成熟肝细胞摄取和排泄ICG 的功能。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，将胚胎干细胞用培养瓶摇动培养出EB，EB经消化成单细胞后接种诱导培养，分化培养第一天采用低氧条件（4% O₂）预培养，并以肿瘤抑制因子P53及Wnt5a重组蛋白组合作为分化诱导剂，在细胞发育不同时期添加包括甲胎蛋白、胰岛素等在内的肝细胞生长因子，通过体外培养实现的。

2.根据权利要求1所述的一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）胚胎干细胞的体外培养，培养体系为含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基，其中添加0.1mmol/L 2-巯基乙醇，25 mM HEPES，100 U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素，1000 U/mL重组小鼠白血病抑制因子（LIF），培养条件为常氧、5% CO₂、37℃；

2）拟胚体的形成：培养体系为去除胚胎干细胞培养体系中的LIF，同时将胎牛血清浓度调整为15%即可；将胚胎干细胞以3×10⁴～5×10⁴/ml浓度接种于未经过促细胞黏附作用处理、瓶底光滑的玻璃培养瓶中摇动培养法，1天后便会有大量的拟胚体生成，形成成熟拟胚体；将成熟的囊性拟胚体用胰蛋白酶消化为单个细胞，培养条件为常氧、5% CO2、37℃；

3）诱导分化阶段Ⅰ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅰ，培养条件为低氧4% O₂、5% CO₂、37℃，培养时间为2天；

4）诱导分化阶段Ⅱ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅱ，培养条件为常氧、5% CO₂、37℃，培养时间为3天；

5）诱导分化阶段Ⅲ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅲ，培养条件为常氧、5% CO₂、37℃，培养时间为3天；

6）诱导分化阶段Ⅳ：培养体系为诱导培养培养体系Ⅳ，培养条件为常氧、5% CO₂、37℃，培养时间为2天。

3.根据权利要求2所述的一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，所述的诱导培养培养体系Ⅰ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入肿瘤抑制因子P53和肿瘤抑制因子Wnt5a制备而成。

4.根据权利要求3所述的诱导培养培养体系Ⅰ，其特征在于，所述的肿瘤抑制因子P53的浓度范围是0.5-1U/ml，优选0.16U/ml；肿瘤抑制因子Wnt5a浓度范围是50-200 ng/ml，优选100ng/ml。

5.根据权利要求2所述的一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，所述的诱导培养培养体系Ⅱ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml甲胎蛋白（AFP），100ng/ml酸性纤维细胞生长因子（αFGF），30 ng/ml人成纤维细胞生长因子4（FGF4）制备而成。

6.根据权利要求书2所述的一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，所述的诱导培养培养体系Ⅲ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入20ng/ml肝细胞生长因子（HGF），10ng/ml制瘤素（OSM），20ng/ml角质细胞生长因子（KGF）制备而成。

7.根据权利要求2所述的一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，其特征在于，所述的诱导培养培养体系Ⅳ是将胎牛血清浓度调整为10%的拟胚体形成阶段培养体系，并加入10^-7M地塞米松（DEX），0.8%二甲基亚砜（DMSO），5ug/ml 胰岛素，5ug/ml 转铁蛋白制备而成。