CN102250829A - 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 - Google Patents
人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102250829A CN102250829A CN2011101795322A CN201110179532A CN102250829A CN 102250829 A CN102250829 A CN 102250829A CN 2011101795322 A CN2011101795322 A CN 2011101795322A CN 201110179532 A CN201110179532 A CN 201110179532A CN 102250829 A CN102250829 A CN 102250829A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- umbilical cord
- cell
- piece
- stem cells
- cord tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 title claims abstract description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 24
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 23
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims abstract description 11
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 230000009194 climbing Effects 0.000 claims abstract description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 9
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims description 4
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 claims description 3
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 3
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 abstract 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 abstract 1
- MVORZMQFXBLMHM-QWRGUYRKSA-N Gly-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 MVORZMQFXBLMHM-QWRGUYRKSA-N 0.000 abstract 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 abstract 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 12
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 12
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 4
- 101710183399 Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种肝细胞的诱导培养方法。更具体的，本发明提供了一种将人脐带间充质干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法。更具体的，本发明涉及一种以细胞爬片技术从遗弃的脐带中提取人脐带间充质干细胞进行培养，并通过添加表皮生长因子、地塞米松、肝细胞生长因子、抑瘤素等，将人脐带间充质干细胞分阶段定向诱导分化为肝细胞的方法。
Description
技术领域
本诱导方法能利用人脐带间充质干细胞进行诱导定向分化为肝细胞。
背景技术
目前多应用胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞。但胚胎干细胞存在培养扩增难度大，成瘤性强，并存在伦理问题等；骨髓间充质干细胞来源受限，扩增难度大，而且对供者存在一定的损伤。因此诱导后的肝细胞来应用受限，无法满足大量需求，比如用于替代治疗肝脏疾病，以及进行细胞药物的筛选。目前的间充质干细胞(MSCs)向肝细胞分化的技术存在一定的缺陷和不足，比如分化成本过高，分化效率不高等等，不利于细胞分化过程的产业化、将来的药物筛选和临床使用。本分化方法通过对现有的阶段诱导法的诱导培养顺序和培养体系的调节，发现不需要应用碱性成纤维细胞生长因子，只用表皮生长因子联合肝细胞生长因子，即可将脐带间充质干细胞诱导分化为肝细胞，大大降低了分化成本。而且经过本方法的分化培养，间充质干细胞向肝细胞分化的效率能达到99％以上，非常有利于后续的分化后的细胞的应用。
发明内容
为了解决用来诱导分化为肝细胞的干细胞密切相关的问题，例如安全性、增殖能力、细胞来源，本方法采用人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)作为诱导培养的干细胞，包括人脐带间充质干细胞的分离和诱导两部分。
人脐带间充质干细胞来自于遗弃的脐带，不存在伦理问题；利用不同于传统酶消化法的细胞爬片方法分离得到脐带间充质干细胞，具有多潜能性、增殖性强；低免疫原性；易产业化和临床使用。不采用消化酶的一种脐带组织间充质干细胞爬片分离方法，其不采用消化酶，避免了MSCs分离过程中，消化酶对脐带MSCs引入动物源蛋白和动物源病原物的污染风险，且最大限度的保持了干细胞原有的生物特性和活性，细胞生长速度快，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。
正常的情况下，动物组织器官内的间充质干细胞处于静止状态。当组织器官受到损伤后，大量的炎性因子的释放，会激活间充质干细胞，促使其活化、增殖、趋化聚集到损伤部位，释放大量的细胞因子，发挥修复和再生的作用。本发明利用此原理，将脐带组织粉碎成小块，就会产生细胞损伤，释放炎性因子，从而活化脐带组织内的间充质干细胞，促使间充质干细胞趋化聚集到组织小块的周围，通过培养，可获得大量的间充质干细胞，而且细胞的生物特性和活性保持良好。与现有的酶消化法相比，本方法的优点为：操作简单快捷，避免了分离过程中胶原酶对脐带间充质干细胞的损伤作用以及动物源胶原酶中引入动物源蛋白和病原物的污染风险。还避免了酶消化过程中消化时间过长影响破坏细胞的活性，消化时间过短影响细胞得率这一问题。本发明中，脐带被均匀粉碎为直径1-1.5mm的小块，使得每小块脐带在相同的条件下，获得的MSCs均衡一致，利用本发明的方法，每根脐带被分成大量均一小块脐带，每个培养皿中接种14至16小块，可接种多个培养皿，五天后每个培养皿中的MSCs会大量繁殖增生，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合。对比现有的酶消化法，同样数量的脐带，本发明可获得更多的MSCs。本发明的方法对比现有的酶消化法，不用选择消化酶，不用控制消化时间，操作更简便，保持了细胞原有活性及生长状态，大大提高了MSCs得率，并能够长时间保存而不失其活性，解决此类资源得不到高效利用的现状，保证了临床应用中干细胞的数量和质量。
通过爬片方法从脐带中分离获得间充质干细胞后，流式细胞仪鉴定其表面标记，传代培养至第3代。使用阶段诱导法诱导MSC向肝细胞分化：首先使用含2％的Fetal bovin serum(FBS)、10-8mol/L的地塞米松(DXM)、50ng/ml的HGF(肝细胞生长因子)、10ng/ml的EGF(表皮生长因子)、1％ITS(25g/L胰岛素、25g/L转铁蛋白、25mg/L亚硒酸钠)的DMEM-F12培养基诱导培养2周；然后，使用含2％的FBS、20ng/ml的OSM(抑瘤素)、10-6mol/L的DXM、1％ITS的DMEM-F12培养基诱导培养2周。以含10％FBS的DMEM-F12培养的MSC作为阴性对照。
本诱导方法能充分高效的诱导间充质干细胞向肝细胞定向分化，解决大量应用所需诱导后的肝细胞来源问题。
附图说明
图1hUC-MSCs在向肝细胞分化的过程中形态变化。(A)没开始分化的hUC-MSCs的成纤维细胞样形态(40X)；(B)分化培养的一周后，hUC-MSCs的形态开始发生变化(40X)；(C)分化培养三周后，部分脐带间充质干细胞变成圆形或者椭圆形(40X)；(D)分化培养第四周，hUC-MSCs的形态变为典型的肝细胞样，圆形或者椭圆形(100X)。
图2免疫荧光检测法分别比较人Albumin(ALB)和CK-19的表达情况。在常规培养条件下脐带间充质干细胞不表达CK19(A)和ALB(C)，但经两阶段诱导分化培养后的细胞则可见CK19(B)和ALB(D)的表达。
图3流式细胞仪检测ALB表达明确诱导前及诱导后的分化率，接近100％。A图为在常规培养条件下的脐带间充质干细胞ALB表达情况；B图为经两阶段诱导分化培养后的表达ALB的细胞比例。
图4分化为肝细胞样细胞的hUC-MSCs和未分化的hUC-MSCs，低密度脂蛋白吸收实验。(A)未分化的hUC-MSCs不能吸收LDL，而(B)hUC-MSCs在分化为肝细胞样细胞后可以吸收LDL。
图5诱导前、诱导2周以及诱导培养4周后的间充质干细胞流式检测HLA-DR表达情况，在诱导培养的过程中，间充质干细胞均低水平表达HLA-DR。
具体实施方式
实施例1爬片分离技术获得人脐带间充质干细胞
取新生儿脐带，通过下述步骤分离获得脐带间充质干细胞：(1)将8g的NaCl、0.2g的KCl、1.15g的Na2HPO4、0.2g的KH2PO4用水定容为1L，制成磷酸缓冲液，以缓冲液反复冲洗脐带，去除残留的血液，获得干净脐带；(2)将干净的脐带粉碎，获得大量脐带组织块；(3)再将获得的脐带组织块滤过孔径1.5mm的粗滤网，收集粗滤网下的脐带组织块，去掉不符合要求的大脐带组织块，获得直径小于等于1.5mm的小脐带组织块；(4)再将获得的小脐组织带块滤过200目滤网，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块；(5)直径为1-1.5mm脐带块在200目滤网上沥干液体后，将200目滤网上脐带块接种于细胞培养皿中；(6)不加培养液，直接放置于5％CO2、37℃培养箱内，静置三小时；(7)然后加入含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液5mL，置于5％CO2、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合；(8)胰酶消化：先用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量5mL，吸弃洗液，吸取1mL的含0.25％胰酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，再将5mL含了20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液加入到培养皿中，反复吹打，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)消化液经200目滤网过滤，去掉脐带块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。
所述的步骤(2)中，粉碎采用剪切装置粉碎。
所述的剪切装置为剪刀。
所述的步骤(5)中，培养皿的规格为90mm×16mm，每个培养皿中接种14至16个脐带块，接种多个培养皿。
所述的步骤(7)中，培养液D-MEM/F12中培养基D-MEM与营养成分F12的比例是1∶1。
将通过爬片方法从脐带中分离获得的间充质干细胞，流式细胞仪鉴定其表面标记，确定其属于间充质干细胞。
实施例2人脐带间充质干细胞向肝细胞的定向诱导
将通过爬片方法从脐带中分离获得的间充质干细胞，传代培养至第3代。使用阶段诱导法诱导MSC向肝细胞分化：首先使用含2％的Fetal bovin serum(FBS)、10-8mol/L的地塞米松(DXM)、50ng/ml的HGF(肝细胞生长因子)、10ng/ml的EGF(表皮生长因子)、1％ITS(25g/L胰岛素、25g/L转铁蛋白、25mg/L亚硒酸钠)的DMEM-F12培养基诱导培养2周，然后，使用含2％的FBS、20ng/ml的OSM(抑瘤素)、10-6mol/L的DXM、1％ITS的DMEM-F12培养基诱导培养2周。以含10％FBS的DMEM-F12培养的MSC作为阴性对照。
细胞形态学的变化：脐带间充质干细胞G09163在向肝细胞分化的过程中细胞形态发生了一系列变化。未分化的脐带间充质干细胞成纤维细胞样形态；而诱导培养三周后，部分脐带间充质干细胞的形态变成圆形或者椭圆形；随着诱导培养时间的增加，更多的圆形细胞出现；分化培养四周后，间充质干细胞的形态变为典型的肝细胞样，圆形或者椭圆形(参见图1)。
肝样细胞表面标志的检测：使用免疫荧光检测法分别比较人Albumin(ALB)和CK-19在间充质干细胞诱导前后表达水平的变化，发现Albumin和CK-19在诱导分化后的细胞中有明显表达，而在常规培养条件下脐带间充质干细胞中不表达(参见图2)。此外，我们通过流式细胞术分别检测诱导前后细胞表面ALB的表达情况，发现经诱导后，几乎所有的细胞均表达ALB(参见图3)
脐带间充质干细胞被诱导分化为肝细胞后，低密度脂蛋白受体的表达是其标志之一。因此，我们进行了低密度脂蛋白(LDL)吸收检测试验，发现经过诱导培养后的细胞可吸收低密度脂蛋白，具有肝细胞的功能；而未分化的间充质干细胞则不具备吸收低密度脂蛋白的功能(参见图4)。
此外，我们还以流式细胞术检测了诱导前、诱导2周以及诱导培养4周后的间充质干细胞HLA-DR的表达。发现在诱导培养的过程中，间充质干细胞均低水平表达HLA-DR，说明间充质干细胞经过诱导培养后仍然具有低免疫原性水平。
Claims (3)
1.一种人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法，包括以细胞爬片技术提取人脐带间充质干细胞进行分离培养，并加入表皮生长因子、地塞米松、肝细胞生长因子、抑瘤素将所述细胞分阶段定向诱导分化为肝细胞。
2.权利要求1所述的诱导方法，其中所述分离培养的具体步骤为：
(1)将8g的NaCl、0.2g的KCl、1.15g的Na2HPO4、0.2g的KH2PO4用水定容为1L，制成磷酸缓冲液，以缓冲液反复冲洗脐带，去除残留的血液，获得干净脐带；
(2)将干净的脐带粉碎，获得大量脐带组织块；
(3)再将获得的脐带组织块滤过孔径1.5mm的粗滤网，收集粗滤网下的脐带组织块，去掉不符合要求的大脐带组织块，获得直径小于等于1.5mm的小脐带组织块；
(4)再将获得的小脐组织带块滤过200目滤网，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块；
(5)直径为1-1.5mm脐带块在200目滤网上沥干液体后，将200目滤网上脐带块接种于细胞培养皿中；
(6)不加培养液，直接放置于5％CO2、37℃培养箱内，静置三小时；
(7)然后加入含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液5mL，置于5％CO2、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合；
(8)胰酶消化：先用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量5mL，吸弃洗液，吸取1mL的含0.25％胰酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，再将5mL含了20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液加入到培养皿中，反复吹打，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；
(9)消化液经200目滤网过滤，去掉脐带块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；
(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。
3.权利要求1或2所述的诱导方法，其中所述分阶段定向诱导的具体步骤为：
(1)使用含2％的Fetal bovin serum(FBS)、10-8mol/L的地塞米松(DXM)、50ng/ml的HGF(肝细胞生长因子)、10ng/ml的EGF(表皮生长因子)1％ITS(25g/L胰岛素、25g/L转铁蛋白、25mg/L亚硒酸钠)的DMEM-F12培养基诱导培养2周；
(2)使用含2％的FBS、20ng/ml的OSM(抑瘤素)、10-6mol/L的DXM、1％ITS的DMEM-F12培养基诱导培养2周。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011101795322A CN102250829B (zh) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011101795322A CN102250829B (zh) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102250829A true CN102250829A (zh) | 2011-11-23 |
| CN102250829B CN102250829B (zh) | 2012-07-11 |
Family
ID=44978400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011101795322A Expired - Fee Related CN102250829B (zh) | 2011-06-29 | 2011-06-29 | 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102250829B (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586183A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-07-18 | 天津和泽干细胞科技有限公司 | 一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因的方法 |
| CN103396985A (zh) * | 2013-08-08 | 2013-11-20 | 哈尔滨埃文斯干细胞应用技术有限公司 | 诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用 |
| WO2015010417A1 (zh) * | 2013-07-25 | 2015-01-29 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞 |
| CN104694462A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-06-10 | 奥思达干细胞有限公司 | 一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法 |
| CN106075586A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-09 | 东华大学 | 基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法 |
| CN106119190A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 吉林省中科生物工程股份有限公司 | 抑瘤素m在制备促进间充质干细胞体外定向分化为骨细胞的产品中的应用 |
| CN106754367A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-31 | 吉林大学 | 通过静电纺丝制备载药细胞爬片的方法 |
| CN108823148A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-16 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法 |
| JP2021514680A (ja) * | 2018-03-29 | 2021-06-17 | エースソステム バイオストラテジーズ インコーポレイテッド | ヒト臍帯から幹細胞を分離する方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1844373A (zh) * | 2006-04-28 | 2006-10-11 | 华东理工大学 | 由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞生成的方法 |
| CN101033463A (zh) * | 2006-12-21 | 2007-09-12 | 浙江省绍兴市人民医院 | 一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法 |
-
2011
- 2011-06-29 CN CN2011101795322A patent/CN102250829B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1844373A (zh) * | 2006-04-28 | 2006-10-11 | 华东理工大学 | 由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞生成的方法 |
| CN101033463A (zh) * | 2006-12-21 | 2007-09-12 | 浙江省绍兴市人民医院 | 一种成体干细胞体外跨越分化肝细胞的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《世界华人消化杂志》 20080528 闫俊卿等 人脐带间充质干细胞生物学特性及向类肝细胞的分化 1639-1644 1 第16卷, 第15期 * |
| 《中国组织工程研究与临床康复》 20091203 迟作华等 Differentiation of human umbilical cord blood-mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells using in vitro combination of various growth differentiation factors 中文摘要和第9797页右栏第2段-第9798页左栏第2段 1 第13卷, 第49期 * |
| 《山东大学学报（医学版）》 20090630 张辉等 人脐带间充质干细胞的无动物血清培养及向肝细胞诱导分化 第89页1.2方法 1，3 第47卷, 第6期 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586183A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-07-18 | 天津和泽干细胞科技有限公司 | 一种体外诱导人脐带间充质干细胞高表达Nurr1基因的方法 |
| WO2015010417A1 (zh) * | 2013-07-25 | 2015-01-29 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞 |
| CN103396985A (zh) * | 2013-08-08 | 2013-11-20 | 哈尔滨埃文斯干细胞应用技术有限公司 | 诱导人脐带间充质干细胞分化为肝细胞的方法与应用 |
| CN104694462B (zh) * | 2015-03-17 | 2018-02-13 | 奥思达干细胞有限公司 | 一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法 |
| CN104694462A (zh) * | 2015-03-17 | 2015-06-10 | 奥思达干细胞有限公司 | 一种胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法 |
| CN106119190A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-11-16 | 吉林省中科生物工程股份有限公司 | 抑瘤素m在制备促进间充质干细胞体外定向分化为骨细胞的产品中的应用 |
| CN106075586B (zh) * | 2016-07-19 | 2019-05-24 | 东华大学 | 基于成体干细胞-再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法 |
| CN106075586A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-11-09 | 东华大学 | 基于成体干细胞‑再生丝素蛋白组织工程支架的人工肝修复材料的培养方法 |
| CN106754367A (zh) * | 2016-12-12 | 2017-05-31 | 吉林大学 | 通过静电纺丝制备载药细胞爬片的方法 |
| CN106754367B (zh) * | 2016-12-12 | 2019-06-21 | 吉林大学 | 通过静电纺丝制备载药细胞爬片的方法 |
| JP2021514680A (ja) * | 2018-03-29 | 2021-06-17 | エースソステム バイオストラテジーズ インコーポレイテッド | ヒト臍帯から幹細胞を分離する方法 |
| JP7064254B2 (ja) | 2018-03-29 | 2022-05-10 | エースソステム バイオストラテジーズ インコーポレイテッド | ヒト臍帯から幹細胞を分離する方法 |
| CN108823148A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-11-16 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞诱导分化为肝脏样细胞的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102250829B (zh) | 2012-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102250829B (zh) | 人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法 | |
| CN103805562B (zh) | 培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基 | |
| CN104164403B (zh) | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 | |
| Pal et al. | Phenotypic and functional comparison of optimum culture conditions for upscaling of bone marrow‐derived mesenchymal stem cells | |
| CN102757936B (zh) | 人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法 | |
| CN107299082B (zh) | 从组织中分离胎盘间质细胞并培养成间充质干细胞的方法 | |
| Nicoletti et al. | Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine | |
| US20180362920A1 (en) | Serum-free culture medium and preparation method and application therefor | |
| CN105112366B (zh) | 一种含小檗碱的间充质干细胞无血清培养基 | |
| JP2019510509A5 (zh) | ||
| CN109234229B (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| CN102978156A (zh) | 一种骨髓间充质干细胞的体外扩增纯化培养方法及培养基 | |
| CN105238750B (zh) | 一种复苏脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN105219707B (zh) | 一种复苏脂肪间充质干细胞的方法 | |
| CN102174468A (zh) | 诱导人脐带间充质干细胞分化为睾丸间质细胞的方法与应用 | |
| CN104673745A (zh) | 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 | |
| CN107653225A (zh) | 一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法 | |
| CN105420179A (zh) | 一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法 | |
| CN102433301A (zh) | 一种提取扩增单克隆间充质干细胞的方法及所用培养液 | |
| CN104830756A (zh) | 翘嘴红鲌精原干细胞分离培养方法 | |
| CN102965330A (zh) | 一种提供多种细胞协同生长的方法 | |
| CN104611292A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞大规模培养方法 | |
| CN110468101A (zh) | 一种骨髓间充质干细胞的增殖培养方法 | |
| CN110564675A (zh) | 一种毛囊干细胞的分离提取方法 | |
| CN102010850B (zh) | 一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20111123 Assignee: ALLIANCELLS BIOSCIENCE Co.,Ltd. Assignor: Tianjin Heze Stem Cell Technology Co.,Ltd. Contract record no.: 2012120000065 Denomination of invention: Inducing method for directional differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into liver cells Granted publication date: 20120711 License type: Exclusive License Record date: 20121029 |
|
| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190520 Address after: Room 405, 4th floor, 12 Meiyuan Road, Huayuan Industrial Zone, Tianjin City, 300 457 days Patentee after: Zhongyuan Concorde Biological Cell Storage Service (Tianjin) Co.,Ltd. Address before: 300381 Second Floor 202-B078, Ligang Building, 82 West Second Road, Hexi Airport Economic Zone, Tianjin Patentee before: Tianjin Heze Stem Cell Technology Co.,Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120711 |