CN1844373A

CN1844373A - 由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞生成的方法

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Publication number: CN1844373A
Application number: CNA2006100261863A
Authority: CN
Inventors: 蔡海波; 谭文松; 金颖; 陈祎祺
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2006-10-11

Abstract

本发明涉及一种体外诱导生成肝细胞的方法，公开了一种由脐带血造血干细胞体外诱导生成肝细胞的方法。包括如下步骤：将脐带血单个核或CD34⁺细胞接种至含有胎牛血清以及人干细胞因子(SCF)、人白细胞介素3(IL－3)、白细胞介素6(IL－6)、人肝细胞生长因子(HGF)、人表皮细胞生长因子(EGF)、人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)的培养基中，在体外诱导肝细胞的生成。采用本发明的方法从脐带血造血干细胞诱导肝细胞，得到的培养物中所含的肝细胞比例高，诱导生成肝细胞的效果明显。

Description

由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞生成的方法

技术领域

本发明涉及一种体外诱导生成肝细胞的方法，具体地说涉及由脐带血造血干细胞在体外诱导生成肝细胞的方法。

背景技术

众所周知，每年由于各种肝病死亡的人数众多，而肝损伤、肝硬化和肝功能衰竭的患者人数更是巨大。

肝脏是人体重要的脏器之一，其对人体的功能主要体现在三个方面：(1)分泌胆汁：肝细胞不断地生成胆汁酸和分泌胆汁，帮助脂肪在小肠内的消化和吸收。(2)代谢功能：这主要包括糖代谢、蛋白质代谢、脂肪代谢、维生素代谢以及激素代谢。(3)解毒功能：肝脏是人体内主要的解毒器官，它可保护机体免受损害。外来的或体内代谢产生的有毒物质都要经过肝脏处理，使毒物成为比较无毒的或溶解度大的物质，随胆汁或尿液排出体外。可见肝脏对于人体有着重要的生理意义。

现今常用于重度肝病治疗的临床方法包括：肝脏原位移植、人工肝、肝细胞移植等。

肝脏的原位移植是最常用的一种治疗肝病的手段，临床实例表明原位移植可以有效地延长患者的生命，但是仍有少量患者术后出现肝内的复发。由于肝的原位移植需要找到合适的供者，且价格昂贵，以及手术并发症率和病死率较高等问题，使得原位肝移植的应用受到很大限制。

生物人工肝是细胞学技术、生物工程学技术发展的产物，近些年来对其的建立和临床试验成为研究热点，并已可望成为临时和长期肝支持治疗的方法。但是至今为止这些系统都过于庞大，一般都在体外实验，且并不完善，仍需对其进行深入的研究才能真正用于临床。

肝细胞的直接移植是另一个研究方向。它与肝脏的原位移植相比，其优点在于：(1)供体细胞保存方便，应用灵活，操作相对简单；(2)一个供体可供给多个受体使用；(3)对机体影响较小，移植失败或产生排斥反应对受体影响也不大；(4)价格相对低廉。因此，肝细胞移植越来越受到人们的重视。然而大多数关于肝细胞移植的研究是在基因型完全一致或几乎完全一致的同系之间进行，所以使用同种异体或异种肝细胞进行移植时必将面临着免疫排斥的问题。虽然肝细胞的免疫原性比肝内细胞和胆管细胞小得多，但这不能阻止排斥反应的发生。另外，肝细胞的增殖和肝功能支持时间也是肝细胞移植中尚待解决的问题。

体外培养增殖肝细胞是一种解决肝细胞移植细胞量不够问题的一种思路，但是供体中分离的干细胞在体外环境中不宜生长。近年来，研究者发现，干细胞不仅拥有纵向分化的能力，同时也拥有横向分化的潜能。这被称为干细胞的可塑性。采用胚胎干细胞(ES)作为细胞治疗的方法，在医学研究中是个非常活跃的领域。在成人器官和组织损伤中，如肝脏、肌肉、骨路等细胞都可以再生，而来自于骨髓源的胚胎干细胞，在一定条件下也可以分化为骨路、肌肉和神经细胞，反过来神经源胚胎干细胞也可转化为造血细胞。基于干细胞的这种特性，通过干细胞来诱导生成肝细胞来满足肝细胞移植需要变成一种新的思路。

根据研究发现肝脏的生理功能主要是由肝实质细胞来完成的。肝脏在受到损伤时一般可以自我修复，而当由于某种原因成熟的肝细胞再生发生障碍时，一种小的胆管上皮细胞可以从汇管区移出并分化为肝细，这种细胞称之为卵圆细胞(oval cell)或肝干细胞。Petersen等用大鼠骨髓移植模型证实部分大鼠骨髓细胞能在肝脏分化成卵圆细胞，后者进一步形成肝细胞和胆管上皮细胞。可以推测肝卵圆细胞可能来源于造血干细胞，也就是说造血干细胞可以在一定条件下分化成肝细胞。

已有研究发现，动物体内分离出骨髓造血细胞，在体外能够定向诱导分化成肝细胞。2000年Oh等人分离成年大鼠骨髓细胞，在含表皮细胞生长因子(EGF)的无血清DF(DME M/F12)培养基中培养，前5天加入剂量达lug/mL的肝细胞生长因子(HGF)诱导分化，共培养21天后采用RT-PCR可检测到分化后的类肝细胞内AFP、Alb和HGF的受体c-met的mRNA表达，组化染色亦可见到细胞内AFP、Alb、CK-8和CK-18的表达。后来Miyazaki等人改用优化后的更适于向肝细胞分化的HGM培养基代替oh等人采用的DF培养基培养Wister大鼠骨髓细胞，再次诱导出类肝细胞，且分化程度较诱导的肝细胞更成熟，RT-PCR监测到肝细胞分化终末阶段标志色氨酸-2，3-二氧合酶(tryptophan-2，3-dioxygenase)和酪氨酸氨基转移酶(tyrosine aminotransfe-rase)的mRNA。最近Yamazaki等人改用氮胞苷刺激小鼠骨髓细胞12小时后再置于肝脏非实质细胞的滋养细胞层上培养，并以肝衰竭患者血清、制瘤素M、地塞米松、50ng/mL肝细胞生长因子刺激诱导，2周后对细胞进行组化染色和RT-PCR均显示类肝细胞集落中可见肝细胞白蛋白、CK-8、CK-18和CK-19的表达。

利用造血干细胞体外诱导生成肝细胞的优势在于其来源广泛、采集方便。造血干细胞除了可以来源于骨髓外，还可以来源于外周血和脐带血。其中，从脐带血中分离的造血干细胞其免疫原性尚未发育成熟，可以减少GVHD的发生几率和降低异源病毒感染的危险性。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种从脐带血造血细胞体外诱导生成肝细胞的方法。

本发明的技术构思是这样的：

基于对以上事实的思考，发明人尝试从脐带血造血细胞开始体外诱导生成肝细胞。

根据造血干细胞的可塑性，造血干细胞拥有多向分化的潜能。在促进造血干细胞分化和适合肝细胞生长的培养环境中可以使造血干细胞向肝细胞定向分化，得到肝细胞。

发明人采用两种方法诱导肝细胞形成：

以脐带血单个核细胞为起始细胞，诱导时直接采用HGF+EGF+aFGF+bFGF+LIF+OSM细胞因子组合促使单个核细胞中造血干细胞向肝细胞分化；

CD34⁺细胞起始培养时，先在含有SCF+IL-3+IL-6三种细胞因子的扩增培养液中使CD34⁺细胞增殖，4～7天后再采用HGF+EGF+aFGF+bFGF+LIF+OSM细胞因子组合促使造血干细胞向肝细胞分化。

具体的说，本发明的方法，包括如下步骤：

将脐带血造血干细胞接种到含有胎牛血清以及人干细胞因子(SCF)、人白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、人肝细胞生长因子(HGF)、人表皮细胞生长因子(EGF)、人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)的培养基中，在体外诱导肝细胞的生成。

所说的脐带血造血干细胞为单个核细胞中的造血干细胞或为CD34⁺细胞。

按照本发明优选的技术方案，以单个核细胞起始诱导时，包括如下步骤：

(1)将分离来自于脐带血的单个核细胞接种到含胎牛血清及人干细胞因子(SCF)、人肝细胞生长因子(HGF)、人表皮细胞生长因子(EGF)、人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)的诱导培养基中，置于37℃，5％CO₂，100％湿度的培养箱中，培养20～30天。

所说的分离自脐带血的单个核细胞指的是脐带血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后收集的单个核细胞。

所说的培养基可采用常规的IMDM培养基，优选采用Lam AC，Li K，Zhang XB，Li CK，et al.Preclinical ex vivo expansion of cord bloodhematopoietic stem and progenitor cells：duration of culture；the media，serumsupplements，and growth factors used；and engraftment in NOD/SCID mice[J].Transfusion.2001，41(12)：1567-76.文献提到的IMDM培养基。

诱导培养基中各细胞因子的浓度范围为：人干细胞因子(SCF)：5-100ng/mL；人肝细胞生长因子(HGF)：5-100ng/mL；人表皮细胞生长因子(EGF)：5-100ng/mL；人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)：5-100ng/mL；人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：5-100ng/mL；人白血病抑制因子(LIF)：5-100ng/mL；制瘤素M(OSM)：5-100ng/mL。

接种浓度为2×10⁵cells/mL～2×10⁶cells/mL。

按照本发明优选的技术方案，以CD34⁺细胞起始诱导时，包括如下步骤：

(a)将分离自脐带血的单个核细胞悬浮在培养基中，加入磁珠偶联的小鼠抗人的CD34抗体，4℃反应20～40分钟，然后收集CD34⁺细胞，再重悬于培养基中。

按照本发明优选的技术方案，单个核细胞在IMDM培养基中的浓度为5×10⁷～1×10⁸cells/300uL，磁珠偶联的小鼠抗人的CD34抗体的加入量为20～100uL。

所说的收集CD34⁺细胞指的是，将与磁珠偶联的小鼠抗人的CD34抗体反应好的细胞，加入到置于磁场中的分离柱中，用含EDTA、人血清白蛋白的PBS洗涤，细胞悬液慢慢通过，非磁性细胞(非CD34⁺细胞)被洗脱，用PBS(含2mM EDTA)洗三遍。将分离柱撤离磁场，用含EDTA、人血清白蛋白的PBS洗涤，CD34⁺细胞被洗出。

(b)将分离得到的CD34⁺细胞接种到含胎牛血清、人干细胞因子(SCF)、人白细胞介素3(IL-3)和白细胞介素6(IL-6)的扩增培养基中，置于37℃，5％CO₂，100％湿度的培养箱中，培养4～7天后收集细胞，改换用含胎牛血清、人干细胞因子(SCF)、人肝细胞生长因子(HGF)、人表皮细胞生长因子(EGF)、人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)的诱导培养基，培养20～30天。

扩增培养基中，所采用的细胞因子组合中各种细胞因子的浓度范围为：人干细胞因子(SCF)：5-100ng/mL；人白细胞介素3(IL-3)：5-100ng/mL和白细胞介素6(IL-6)：5-100ng/mL。

接种浓度为1×10⁴cells/mL～1×10⁵cells/mL。

培养后对收集得的细胞计数，并进行组化染色、免疫荧光染色以及RT-PCR的检测，结果表明无论是从单个核细胞还是CD34⁺细胞起始，采用本发明的技术方法所诱导生成的细胞，均可表达肝细胞的特征蛋白—人血清白蛋白，采用RT-PCR技术可从诱导生成的细胞中检测到人血清白蛋白基因的表达，说明应用本发明的技术方法可在体外从造血细胞诱导生成肝细胞。

采用本发明的方法从脐带血造血干细胞诱导肝细胞，得到的培养物中所含的肝细胞比例高，诱导生成肝细胞的效果明显。

附图说明

图1为从单个核细胞起始诱导后的细胞中人血清白蛋白基因的表达。

图2为从单个核细胞起始诱导3周的细胞固定涂片。

图3为从单个核细胞起始诱导3周的细胞中人血清白蛋白抗原检测。

图4为从CD34⁺细胞起始诱导生成的细胞中人血清白蛋白基因的表达。

图5为从CD34⁺细胞起始诱导3周的细胞固定涂片。

图6为从CD34⁺细胞起始诱导3周的细胞中人血清白蛋白抗原检测。

图7为从CD34⁺细胞起始诱导4周的细胞固定涂片。

图8为从CD34⁺细胞起始诱导4周的细胞中人血清白蛋白抗原检测。

具体实施方式

实施例1

脐带血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养基洗涤两次。将分离得到的单核细胞以2×10⁶cells/mL的接种密度接种到含20％胎牛血清的IMDM培养基中，置于37℃，5％CO₂，100％湿度的培养箱中，每7天换一次液，并收集细胞，3周后结束培养。

提取培养后的细胞总RNA，采用RT-PCR技术检测培养后的细胞中人血清白蛋白基因的表达，体外诱导1周后的细胞即可检测到血清白蛋白的特异基因的表达(见箭头指示)，且基因的表达量随培养时间增加，见图1。图中，1：Marker；2：起始细胞；3：诱导1周后的细胞；4：诱导2周后的细胞；5：诱导3周后的细胞；

将培养后的细胞用80％丙酮固定于涂有多聚赖氨酸的玻片上，用5％BSA封闭30分钟，在37℃下与人血清白蛋白多克隆抗体(DAKO公司)反应60分钟，PBS浸洗2次，再与FITC荧光抗体(Sigma公司)反应30分钟，用水溶性封片剂封片，显微镜下观察。发现诱导3周后表达人血清白蛋白表面抗原的细胞可达50％以上，见图2、图3。绿荧光为表达人血清白蛋白抗原的细胞。

实施例2

脐带血经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心后，收集单个核细胞，并以IMDM培养基洗涤两次，将细胞悬浮在IMDM的培养基中，浓度为1×10⁸cells/300uL，加入50uL磁珠偶联的小鼠抗人的CD34抗体，4℃反应30分钟，用含2mM EDTA、0.5％人血清白蛋白的PBS洗涤，在磁场内将分离柱上的非CD34⁺细胞洗下，再在脱离磁场的条件下用含2mM EDTA、0.5％人血清白蛋白的PBS将CD34⁺细胞洗脱，重悬于IMDM培养基中。

将分离得到的CD34⁺细胞以1×10⁵cells/mL的接种密度接种到含20％胎牛血清的IMDM培养基中，置于37℃，5％CO₂，100％湿度的培养箱中。培养的前七天仅加入扩增的细胞因子人干细胞因子(SCF)、人白细胞介素3(IL-3)和白细胞介素6(IL-6)，然后再加入诱导的细胞因子，细胞共培养4周。诱导3周后生成的细胞中可检测到人血清白蛋白基因的表达条带和少量表达人血清白蛋白抗原的细胞，诱导4周后的细胞中人血清白蛋白基因的表达量增加，表达人血清白蛋白抗原的细胞比例也大幅增加，可达60％以上，结果见图4～图8。绿荧光为表达人血清白蛋白抗原的细胞。图4中，1：Marker，2：起始CD34⁺细胞；3：诱导3周后的细胞；4：诱导4周后的细胞。

Claims

1.一种由脐带血造血干细胞体外诱导肝细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将造血干细胞接种到含有胎牛血清以及人干细胞因子(SCF)、人白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素6(IL-6)、人肝细胞生长因子(HGF)、人表皮细胞生长因子(EGF)、人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)的培养基中，在体外诱导肝细胞的生成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的脐带血造血干细胞是单个核细胞中的造血干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的脐带血造血干细胞为CD34⁺细胞。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将分离自脐带血的单个核细胞接种到含胎牛血清及人干细胞因子(SCF)、人肝细胞生长因子(HGF)、人表皮细胞生长因子(EGF)、人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)的诱导培养基中，培养20～30天。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的培养基采用IMDM培养基。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，诱导培养基中各细胞因子的浓度范围为：人干细胞因子(SCF)：5-100ng/mL；人肝细胞生长因子(HGF)：5-100ng/mL；人表皮细胞生长因子(EGF)：5-100ng/mL；人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)：5-100ng/mL；人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：5-100ng/mL；人白血病抑制因子(LIF)：5-100ng/mL；制瘤素M(OSM)：5-100ng/mL，接种浓度为2×10⁵cells/mL～2×10⁶cells/mL。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将分离自脐带血的单个核细胞悬浮在培养基中，加入磁珠偶联的小鼠抗人的CD34抗体，反应20～40分钟，然后收集CD34⁺细胞，再重悬于培养基中，将分离得到的CD34⁺细胞接种到含胎牛血清、人干细胞因子(SCF)、人白细胞介素3(IL-3)和白细胞介素6(IL-6)的扩增培养基中，置于37℃，5％CO₂，100％湿度的培养箱中，培养4～7天后收集细胞，改换用含胎牛血清、人干细胞因子(SCF)、人肝细胞生长因子(HGF)、人表皮细胞生长因子(EGF)、人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人白血病抑制因子(LIF)和制瘤素M(OSM)的诱导培养基，培养20～30天。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所说的培养基为IMDM培养基。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，培养基中，所采用的细胞因子组合中各种细胞因子的浓度范围为：人干细胞因子(SCF)：5-100ng/mL；人白细胞介素3(IL-3)：5-100ng/mL和白细胞介素6(IL-6)：5-100ng/mL，诱导培养基中各细胞因子的浓度范围为：人干细胞因子(SCF)：5-100ng/mL；人肝细胞生长因子(HGF)：5-100ng/mL；人表皮细胞生长因子(EGF)：5-100ng/mL；人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)：5-100ng/mL；人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：5-100ng/mL；人白血病抑制因子(LIF)：5-100ng/mL；制瘤素M(OSM)：5-100ng/mL，单个核细胞在IMDM培养基中的浓度为5×10⁷～1×10⁸cells/300uL，磁珠偶联的小鼠抗人的CD34抗体的加入量为20～100uL。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，接种浓度为1×10⁴cells/mL～1×10⁵cells/mL。