CN113667641A - 自体cd34+细胞的提取方法、修复营养液和提取方法的应用 - Google Patents

自体cd34+细胞的提取方法、修复营养液和提取方法的应用 Download PDF

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Abstract

本申请提供了一种自体CD34+细胞的提取方法、修复营养液和提取方法的应用，其方法包括：利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；将得到的单个核细胞悬浮于混合缓冲液中，制成细胞悬浮液，其中，所述混合缓冲液由磷酸盐缓冲盐溶液和牛血清蛋白配制的；利用磁珠分选MACS技术，洗脱所述细胞悬浮液中的CD34‑细胞；利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34‑细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。本申请操作方法简单，提取成本低，将自体CD34+细胞用于皮肤修复营养液，可得到修复功能强修复营养液，显著延缓衰老，改善皮肤效果好的营养液，极大程度上提高了皮肤的自我修复能力。

Description

自体CD34+细胞的提取方法、修复营养液和提取方法的应用
技术领域
本申请涉及美容领域，具体地，涉及一种自体CD34+细胞的提取方法、修复营养液和提取方法的应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，人们对美容的期望越来越强烈，逐渐追求卓越的效果。
人类走向衰老，主要体现在外表的变化上，皮肤出现皱纹，脱垂，塌陷等直接影响的人们的面容，传统的护肤技术，是在皮肤表面涂抹护肤品，以达到保持皮肤良好状态的目的。
但是随着医疗美容技术的发展，人们已经不再满足于传统技术，向皮肤注射美容针成为医疗美容技术中护肤的主要手段。
普通注射液只能保持皮肤的水润，而不具有修复能力，人体的皮肤受损后，缺损周围上皮断端的基底层细胞向创面移动，上皮细胞分裂活跃，逐渐覆盖伤口表面，上皮进一步分化，重建失去的组织结构和功能，如皮肤可以出现上皮的角化等。
因此，亟待一种对人体无害，且修复能力强的注射液，以满足上述需求。
发明内容
本申请的主要目的在于提一种自体CD34+细胞的提取方法、修复营养液和提取方法的应用，通过采用磁珠分离的方法，可获得人体自身高浓度的CD34+细胞，利用该自体CD34+细胞配制的修复营养液修复功能强，能够实现皮肤的自我修复，达到延缓衰老，改善皮肤的作用。
第一方面，提供了一种自体CD34+细胞的提取方法，所述方法包括：
利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；
将得到的单个核细胞悬浮于混合缓冲液中，制成细胞悬浮液，其中，所述混合缓冲液由磷酸盐缓冲盐溶液和牛血清蛋白配制的；
利用磁珠分选MACS技术，洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；
利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。
可选的，上述方法的具体步骤为：
利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；
将54～108个单个细胞核悬浮于150～300uL的混合缓冲液中，并利用MACS磁性分离试剂盒制备成250～500uL的细胞悬浮液；其中所述混合缓冲液包含1～10wt％的牛血清蛋白和5～25mmol/L的磷酸盐缓冲盐溶液；
将分离柱固定于MACS磁场中，使所述细胞悬浮液缓慢通过分离柱，以洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；
将分离柱移出所述MACS磁场，利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。
第二方面，提供了一种修复营养液，所述修复营养液含采用上述任一的自体CD34+细胞的提取方法提取的自体CD34+细胞。
可选的，所述修复营养液包括下述组分：
自体CD34+细胞 10～50份；
自体胶原蛋白 10～20重量份；
成纤维细胞生长因子溶液 50～100重量份；
表皮细胞生长因子溶液 15～25重量份；
左旋维生素C 5～20重量份；
氨基酸 1～5重量份；
透明质酸 5～10重量份；
生理盐水 25～150重量份。
可选的，所述修复营养还包括下述组分：
自体脂肪干细胞 10-30份。
可选的，所述修复营养液还包括下述组分：
羊胎素提取液 10～20重量份；
烟酰胺 10～20重量份。
可选的，所述修复营养液还包括下述组分：
肉毒素 1～5重量份；
还原型谷胱甘肽 1～5重量份。
可选的，所述修复营养液包括下述组分：
自体CD34+细胞 10～20份；
自体胶原蛋白 10～15重量份；
成纤维细胞生长因子溶液 75～100重量份；
表皮细胞生长因子溶液 20～25重量份；
左旋维生素C 10～20重量份；
氨基酸 1～5重量份；
透明质酸 5～10重量份；
生理盐水 50～100重量份。
可选的，所述修复营养液包括下述组分：
自体CD34+细胞 15～20份；
自体胶原蛋白 15重量份；
成纤维细胞生长因子溶液 90重量份；
表皮细胞生长因子溶液 25重量份；
左旋维生素C 10重量份；
氨基酸 5重量份；
透明质酸 10重量份；
生理盐水 75重量份。
第三方面，提供了一种上述任一的自体CD34+细胞的提取方法的应用，采用上述的自体CD34+细胞的提取方法提取的自体CD34+细胞用于人体皮肤的修复。
本申请具有以下优点：本申请通过采用磁珠分离的方法，从周围血中可提取高纯度的自体CD34+细胞，操作方法简单，提取成本低，将自体CD34+细胞用于皮肤修复营养液，可得到修复功能强修复营养液，显著延缓衰老，改善皮肤效果好的营养液，极大程度上提高了皮肤的自我修复能力。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
首先，本申请的一些实施例，提供了一种自体CD34+细胞的提取方法，所述方法包括：利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；将得到的单个核细胞悬浮于混合缓冲液中，制成细胞悬浮液，其中，所述混合缓冲液由磷酸盐缓冲盐溶液和牛血清蛋白配制的；利用磁珠分选MACS技术，洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。
具体步骤为：利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；将54～108个单个细胞核悬浮于150～300uL的混合缓冲液中，并利用MACS磁性分离试剂盒制备成250～500uL的细胞悬浮液；其中所述混合缓冲液包含1～10wt％的牛血清蛋白和5～25mmol/L的磷酸盐缓冲盐溶液；将分离柱固定于MACS磁场中，使所述细胞悬浮液缓慢通过分离柱，以洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；将分离柱移出所述MACS磁场，利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。
更加具体的，利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；将108个单个细胞核悬浮于300uL的混合缓冲液中，并利用MACS磁性分离试剂盒制备成500uL的细胞悬浮液；其中所述混合缓冲液包含1wt％的牛血清蛋白和5mmol/L的磷酸盐缓冲盐溶液；将分离柱固定于MACS磁场中，使所述细胞悬浮液缓慢通过分离柱，以洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；将分离柱移出所述MACS磁场，利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。
根据本申请的一些实施例，提供了一种修复营养液，所述修复营养液含采用上述任一的自体CD34+细胞的提取方法提取的自体CD34+细胞。在本申请的一些实施例中，所述修复营养液包括下述组分：自体CD34+细胞10～50份；自体胶原蛋白10～20重量份；成纤维细胞生长因子溶液50～100重量份；表皮细胞生长因子溶液15～25重量份；左旋维生素C 5～20重量份；氨基酸1～5重量份；透明质酸5～10重量份；生理盐水25～150重量份。
本申请利用自体CD34+细胞，以及自体胶原蛋白、成纤维细胞生长因子溶液和表皮细胞生长因子溶液的自体修复功能，与其他活性组分按照给定的比例复配使用，起到协同增效的效果，使得在对人体皮肤实现自我修复的同时，能够延缓衰老、紧致皮肤，且由于主要使用了自体细胞生长液，具有零排异、效果维持时间长、效果自然，使用方便等特点。
自体CD34+细胞可从脐带血、外围血等提取，可用于癌症治疗等，发明人发现，其对人体自身皮肤有极强的修复作用。
自体胶原蛋白可选字市售产品，也可以采用下述方法制备：通过采血针对人体进行采血，血液经首次离心后进入全血分离器，并在全血分离器内进行二次离心，全血离心分为三层，自上而下依次为血浆层、白膜层和红细胞层，将血浆层、白膜层和红细胞层的液体分别通过导管导入不同的储存单元分开存放，由储存单元取出适量血浆层和白膜层液体按比例混合，并经层析单元进行初步纯化、透滤单元进一步纯化即得所需的自体胶原蛋白，置于4℃下冷藏。
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)有几种异构体，bFGF可以由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌，它的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走，能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞，具有深层修复的作用。在本申请中，推荐使用成纤维细胞生长因子溶液，最好是浓缩液，其质量溶度在80％以上为宜。在本申请的另一些实施例中，纤维细胞生长因子溶液为重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶液。
表皮细胞生长因子也称重组人表皮生长因子，因子是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是一种多功能的生长因子:在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。其在医学美容上有多种作用，如嫩肤作用，表皮细胞生长因子能剌激外胚层和内胚层起源的各种细胞如角膜上皮和内皮细胞、表皮、真皮层细胞(如纤维母细胞)、乳腺腺泡及间质细胞等,使其增殖迁移,加快新陈代谢,达到嫩肤的效果；滋润皮肤，表皮细胞生长因子能促进DNA、RNA和功能蛋白质的生物合成,能促进细胞外大分子的合成(如透明质酸、弹性纤维蛋白等),增加皮肤含水量,进而增加皮肤弹性,滋润肌肤；消除皱纹，表皮细胞生长因子促进细胞营养物质从细胞外主动运至细胞内,增加细胞内的营养。促进真皮层细胞分泌合成胶原纤维、多糖、糖蛋白等功能分子,使皮下真皮组织饱满、肌纤维排列整齐紧密,从而减少和消除皱纹；修复创伤，通过与表皮细胞生长因子受体结合剌激表皮细胞(包括多种组织来源的上皮细胞、各种间质细胞)进入细胞分裂周期,启动细胞内一些重要功能基因活化、表达、分泌生物活性蛋白质等。促使胶原纤维呈线状排列,表皮细胞快速规则生长并及时覆盖创面，明显加速美容、整容术后及其它皮肤创伤等伤口愈合,并保持创面平整光滑,使癍痕减少或消失及减少色素沉着；以及预防色斑，表皮细胞生长因子对表皮细胞的增殖有较强的促进作用,使用后表皮细胞变得年轻化,使得表皮组织中较少有色素及死亡细胞的残留等累积,使皮肤表现出嫩白无暇,消除色斑及色素沉着等异常皮肤表现。
本申请中的各种组分均可采用市售产品，对于其他组分不作过多介绍，均可参考现有技术，如氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸中的一种或几种。
在本申请的一些实施例中，为了进一步提高本申请提供的修复营养液的效果，所述修复营养液还包括：自体脂肪干细胞10-30份。
在本申请的另一些实施例中，所述修复营养液还包括：羊胎素提取液10～20重量份；烟酰胺10～20重量份。
在本申请的又一些实施例中，所述修复营养液还包括：肉毒素1～5重量份；还原型谷胱甘肽1～5重量份。
在上述配比的基础上，发明人对各个组分的含量进行了进一步的优化，得到了效果更加显著的技术方案，在较佳的实施例中，所述修复营养液包括下述组分：自体CD34+细胞10～20份；自体胶原蛋白10～15重量份；成纤维细胞生长因子溶液75～100重量份；表皮细胞生长因子溶液20～25重量份；左旋维生素C10～20重量份；氨基酸1～5重量份；透明质酸5～10重量份；生理盐水50～100重量份。
在另一些较佳的实施例中，所述修复营养液包括下述组分：自体CD34+细胞20份；自体胶原蛋白15重量份；成纤维细胞生长因子溶液90重量份；表皮细胞生长因子溶液25重量份；左旋维生素C10重量份；氨基酸5重量份；透明质酸10重量份；生理盐水75重量份。
根据本申请的一些实施例，本申请还提供了一种修复营养液的制备方法，所述制备方法依次包括：将各种组分按照粘度分为高粘组分、低粘组分和载体；在搅拌的条件下，将所述低粘组分溶解于所述载体中；以及，在搅拌的条件下，将所述高粘组分溶解于所述载体中，形成所述修复营养液。
也就是说，在本申请中，将不同的组分按照其性能划分为三个组，分别为高粘组分、低粘组分和载体，其中，生理盐水为载体，低粘组分是指粘度较小的组分，如小于50mPa·s的组分，该阈值本申请不作限制，可根据选用的原料设置，高粘组分是指粘度较大的组分，如大于50mPa·s的组分。由于粘度会严重影响组合物的分散，因此本申请设计先向载体中加入低粘组分，低粘组分不会影响整体的粘度或者影响很小，然后再向其中加入高粘组分，有助于高粘组分的分散。在本申请的一些实施例中，还采用超声波对制备得到的修复营养液进行分散。
实施例1：自体CD34+细胞的制备
利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；将108个单个细胞核悬浮于300uL的混合缓冲液中，并利用MACS磁性分离试剂盒制备成500uL的细胞悬浮液；其中所述混合缓冲液包含1wt％的牛血清蛋白和5mmol/L的磷酸盐缓冲盐溶液；将分离柱固定于MACS磁场中，使所述细胞悬浮液缓慢通过分离柱，以洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；将分离柱移出所述MACS磁场，利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。以下各实施例均采用实施例1制备的自体CD34+细胞。
实施例2
修复营养液，该修复营养液包括下述组分：自体CD34+细胞10重量份；自体胶原蛋白10重量份；成纤维细胞生长因子溶液100重量份；表皮细胞生长因子溶液15重量份；左旋维生素C 20重量份；甘氨酸5重量份；透明质酸5重量份；生理盐水150重量份。
其中，自体CD34+细胞、自体胶原蛋白、成纤维细胞生长因子溶液和表皮细胞生长因子溶液为高粘组分；左旋维生素C、甘氨酸和透明质酸为低粘组分；生理盐水为载体。
制备方法：在搅拌的条件下，将低粘组分溶解于载体中；然后将高粘组分溶解于载体中，采用超声波对制备得到的修复营养液进行分散。
实施例3
修复营养液，该修复营养液包括下述组分：自体CD34+细胞15重量份；自体胶原蛋白15重量份；成纤维细胞生长因子溶液90重量份；表皮细胞生长因子溶液25重量份；左旋维生素C10重量份；丙氨酸5重量份；透明质酸10重量份；生理盐水75重量份。
其中，自体CD34+细胞、自体胶原蛋白、成纤维细胞生长因子溶液和表皮细胞生长因子溶液为高粘组分；左旋维生素C、丙氨酸和透明质酸为低粘组分；生理盐水为载体。
制备方法：在搅拌的条件下，将低粘组分溶解于载体中；然后将高粘组分溶解于载体中，采用超声波对制备得到的修复营养液进行分散。
实施例4
修复营养液，该修复营养液包括下述组分：自体CD34+细胞20重量份；自体胶原蛋白15重量份；成纤维细胞生长因子溶液80重量份；表皮细胞生长因子溶液20重量份；左旋维生素C 8重量份；脯氨酸1重量份；透明质酸8重量份；生理盐水100重量份；自体脂肪干细胞30份；羊胎素提取液10重量份；烟酰胺20重量份。
其中，自体CD34+细胞、自体胶原蛋白、成纤维细胞生长因子溶液和表皮细胞生长因子溶液、羊胎素提取液、自体脂肪干细胞为高粘组分；左旋维生素C、烟酰胺、脯氨酸和透明质酸为低粘组分；生理盐水为载体。
制备方法：在搅拌的条件下，将低粘组分溶解于载体中；然后将高粘组分溶解于载体中，采用超声波对制备得到的修复营养液进行分散。
实施例5
修复营养液，该修复营养液包括下述组分：自体CD34+细胞30重量份；自体胶原蛋白10重量份；成纤维细胞生长因子溶液70重量份；表皮细胞生长因子溶液15重量份；左旋维生素C 6重量份；脯氨酸3重量份；透明质酸6重量份；生理盐水75重量份；自体脂肪干细胞10份；羊胎素提取液8重量份；烟酰胺15重量份；肉毒素4重量份；还原型谷胱甘肽4重量份。
其中，自体CD34+细胞、自体胶原蛋白、成纤维细胞生长因子溶液和表皮细胞生长因子溶液、羊胎素提取液、自体脂肪干细胞为高粘组分；左旋维生素C、烟酰胺、脯氨酸和透明质酸、肉毒素、还原型谷胱甘肽为低粘组分；生理盐水为载体。
制备方法：在搅拌的条件下，将低粘组分溶解于载体中；然后将高粘组分溶解于载体中，采用超声波对制备得到的修复营养液进行分散。
对比例1
修复营养液，该修复营养液包括下述组分：左旋维生素C 20重量份；甘氨酸5重量份；透明质酸5重量份；生理盐水150重量份。
制备方法：在搅拌的条件下，将各组分溶解于生理盐水中；然后采用超声波对制备得到的对比例修复营养液进行分散。
测试实施例
征募志愿者50名，年龄在25～40岁之前，分为5组，每组10人，各组分别采用实施例1-4和对比例1中制备的修复营养液，由专业人员进行注射。
7天、14天、28天后分别对志愿者皮肤质量改善进行调研，统计结果后，统计结果如表1所示，从表1可以看出，采用实施例1～4中，皮肤褶皱(包括皱纹)有减轻或消除的志愿者占总人数的95％以上，皮肤水分含量较高，注射后有不适感或副作用的人数为0人。在28天内，志愿者不作特殊的皮肤护理。
表1测试实施例结果
Figure BDA0003228284320000091
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种自体CD34+细胞的提取方法，其特征在于，所述方法包括：
利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；
将得到的单个核细胞悬浮于混合缓冲液中，制成细胞悬浮液，其中，所述混合缓冲液由磷酸盐缓冲盐溶液和牛血清蛋白配制的；
利用磁珠分选MACS技术，洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；
利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
利用淋巴细胞分离液从外周血分离单个核细胞；
将108个单个细胞核悬浮于300uL的混合缓冲液中，并利用MACS磁性分离试剂盒制备成500uL的细胞悬浮液；其中所述混合缓冲液包含1wt％的牛血清蛋白和5mmol/L的磷酸盐缓冲盐溶液；
将分离柱固定于MACS磁场中，使所述细胞悬浮液缓慢通过分离柱，以洗脱所述细胞悬浮液中的CD34-细胞；
将分离柱移出所述MACS磁场，利用所述混合缓冲液冲洗洗脱CD34-细胞后得到的细胞悬浮液，得到自体CD34+细胞。
3.一种修复营养液，其特征在于，所述修复营养液含采用权利要求1或2所述的自体CD34+细胞的提取方法提取的自体CD34+细胞。
4.根据权利要求3所述的修复营养液，其特征在于，所述修复营养液包括下述组分：
自体CD34+细胞10～50份；
自体胶原蛋白10～20重量份；
成纤维细胞生长因子溶液50～100重量份；
表皮细胞生长因子溶液15～25重量份；
左旋维生素C 5～20重量份；
氨基酸1～5重量份；
透明质酸5～10重量份；
生理盐水25～150重量份。
5.根据权利要求4所述的修复营养液，其特征在于，所述修复营养液还包括下述组分：
自体脂肪干细胞10-30份。
6.根据权利要求4所述的修复营养液，其特征在于，所述修复营养液还包括下述组分：
羊胎素提取液10～20重量份；
烟酰胺10～20重量份。
7.根据权利要求4所述的修复营养液，其特征在于，所述修复营养液还包括下述组分：
肉毒素1～5重量份；
还原型谷胱甘肽1～5重量份。
8.根据权利要求4所述的修复营养液，其特征在于，所述修复营养液包括下述组分：
自体CD34+细胞10～20份；
自体胶原蛋白10～15重量份；
成纤维细胞生长因子溶液75～100重量份；
表皮细胞生长因子溶液20～25重量份；
左旋维生素C10～20重量份；
氨基酸1～5重量份；
透明质酸5～10重量份；
生理盐水50～100重量份。
9.根据权利要求8所述的修复营养液，其特征在于，所述修复营养液包括下述组分：
自体CD34+细胞15～20份；
自体胶原蛋白15重量份；
成纤维细胞生长因子溶液90重量份；
表皮细胞生长因子溶液25重量份；
左旋维生素C10重量份；
氨基酸5重量份；
透明质酸10重量份；
生理盐水75重量份。
10.一种如权利要求1或2所述的自体CD34+细胞的提取方法的应用，其特征在于，采用权利要求1或2所述的自体CD34+细胞的提取方法提取的自体CD34+细胞用于人体皮肤的修复。
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