CN102010850B

CN102010850B - 一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法

Info

Publication number: CN102010850B
Application number: CN2009102423758A
Authority: CN
Inventors: 刘拥军; 刘广洋; 徐萌
Original assignee: HEZE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HEZE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2029-12-15
Also published as: CN102010850A

Abstract

本发明涉及一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，包括：取新生儿脐带，磷酸缓冲液冲洗干净；脐带粉碎；将粉碎后脐带过粗滤网及200目滤网，获得直径为1-1.5mm脐带组织块；沥干后，将脐带组织块接种于培养皿中；培养皿放于5％CO₂、37℃培养箱内，三小时后；加入含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液，放回培养箱，五天后；将胰蛋白酶加入培养皿中，干细胞入消化液；消化液经200目滤网过滤；将滤液离心，去除上清，获得脐带组织间充质干细胞。本发明操作更简便，保持细胞原有活性及生长状态，提高MSCs得率，避免胶原酶对干细胞的损伤作用以及动物源胶原酶中引入动物源蛋白和病原物的污染风险。

Description

一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法

[技术领域]

本发明涉及利用干细胞的趋化特性，通过让干细胞爬片方式分离的方法，特别是关于一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法。

[背景技术]

间充质干细胞(英文：mesenchymal stem cells，简称：MSCs)是干细胞的一种类型，具备干细胞的两个重要特征：很强的自我增殖能力和多分化潜能。MSCs起源于中胚层，理论上讲，它可以向其它中胚层组织分化。近期研究表明，在适宜的体内或体外环境下MSCs不仅可以分化为中胚层来源的间质组织，还保持有内胚层的分化潜能，可分化为神经细胞、上皮细胞、心肌细胞等。

近年来，人们对MSCs的生物学特性和潜在的临床应用的认识有了显著的提高。MSCs具有高度的分化潜能，易于分离培养和扩增，易于外源基因转染和表达，易于获得、移植且可避免排斥反应，使其具有重要的研究和应用前景，特别在细胞治疗和基因治疗中有重要的临床应用价值。其中也包括间充质干细胞移植治疗白血病、糖尿病、烧伤、红斑狼疮、肝硬化，以及神经疾病如帕金森氏症、脊髓损伤和心脏病等方面的疾病，并都有明显的疗效。

MSCs广泛分布于胎儿的胎肝、乳牙、脐带、脐带血和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌中。其中从胎儿身体的组织中分离获取MSCs有悖于伦理道德，很少应用；脐带来自于胎儿生产后的废弃物，从脐带中获取MSCs，资源丰富、质量高、较纯净，日益成为人们关注的焦点；从成人身体组织中获取MSCs细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者MSCs的采集过程存在一定痛苦，致使来源受到限制，很少采用。因此，脐带成为MSCs的理想来源。随着医学研究的进一步发展，MSCs已经用于治疗多种疾病，预计在不久的将来还会有干细胞药物面世，干细胞生产将步入产业化。因此，这就要求必须严格控制干细胞的生产过程，确保干细胞产量及其功能的稳定性，在保证后期使用效果的前提下，充分利用有限的资源。

目前，通常采用酶消化法从脐带组织中获取MSCs，多使用胶原酶，其原理为：细胞外含有多种胞外蛋白将细胞间粘连起，可用胶原酶消化，使动物组织细胞间的胶原纤维和胞外蛋白酶解，获得单个细胞。但胶原酶消化过度会导致细胞表面一些生活物质的改变进而影响细胞活力，对细胞具有损伤作用。对酶消化脐带组织的时间有一定的要求，消化时间过长会影响破坏所得细胞的活性，消化时间过短又会影响细胞得率。加之待消化的脐带组织又不是一个完全均一的体系，很难保证所有细胞消化程度的统一性。因此也很难把握最佳的消化时间，影响了所得细胞的数量和质量，进而影响以后的研究及使用。另由于现有胶原酶来源于动物内脏，应用酶消化法在分离培养时，存在动物源蛋白和动物源病原物的污染，增加了临床应用干细胞的风险。

[发明内容]

本发明的目的在于克服以上技术的不足，而提出不采用消化酶的一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其不采用消化酶，避免了MSCs分离过程中，消化酶对脐带MSCs引入动物源蛋白和动物源病原物的污染风险，且最大限度的保持了干细胞原有的生物特性和活性，细胞生长速度快，有利于其在后期研究和临床应用中发挥更明显稳定的作用。

本发明提供一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，该方法是由下述步骤组成：(1)首先取新生儿的脐带，由8g的NaCl、0.2g的KCl、1.15g的Na₂HPO₄、0.2g的KH₂PO₄用水定容为1L的方法制作而成磷酸缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；(2)将干净的脐带粉碎，获得大量脐带组织块；(3)再将获得的脐带组织块滤过孔径1.5mm的粗滤网，收集粗滤网下的脐带组织块，去掉不符合要求的大脐带组织块，获得直径小于等于1.5mm的小脐带组织块；(4)再将获得的小脐组织带块滤过200目滤网，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块；(5)直径为1-1.5mm脐带组织块在200目滤网上沥干液体后，将200目滤网上脐带组织块接种于细胞培养皿中；(6)不加培养液，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，静置三小时；(7)然后加入含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液5mL，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合；(8)胰蛋白酶消化：先用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量5mL，吸弃洗液，吸取1mL的含0.25％胰蛋白酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，再将5mL含了20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液加入到培养皿中，反复吹打，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)消化液经200目滤网过滤，去掉脐带组织块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。

所述的步骤(5)中，培养皿的规格为90mm×16mm，每个培养皿中接种14至16个脐带组织块，接种多个培养皿。

所述的步骤(2)中，粉碎采用剪切装置粉碎。

所述的剪切装置为剪刀。

所述的步骤(7)中，培养液D-MEM/F12中培养基D-MEM与营养成分F12的比例是1∶1。

正常的情况下，动物组织器官内的间充质干细胞处于静止状态。当组织器官受到损伤后，大量的炎性因子的释放，会激活间充质干细胞，促使其活化、增殖、趋化聚集到损伤部位，释放大量的细胞因子，发挥修复和再生的作用。本发明利用此原理，将脐带组织粉碎成小块，就会产生细胞损伤，释放炎性因子，从而活化脐带组织内的间充质干细胞，促使间充质干细胞趋化聚集到组织小块的周围，通过培养，可获得大量的间充质干细胞，而且细胞的生物特性和活性保持良好。

与现有的酶消化法相比，本方法的优点为：操作简单快捷，避免了分离过程中胶原酶对脐带间充质干细胞的损伤作用以及动物源胶原酶中引入动物源蛋白和病原物的污染风险。还避免了酶消化过程中消化时间过长影响破坏细胞的活性，消化时间过短影响细胞得率这一问题。本发明中，脐带被均匀粉碎为直径1-1.5mm的小块，使得每小块脐带在相同的条件下，获得的MSCs均衡一致，利用本发明的方法，每根脐带被分成大量均一小块脐带，每个培养皿中接种14至16小块，可接种多个培养皿，五天后每个培养皿中的MSCs会大量繁殖增生，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合。对比现有的酶消化法，同样数量的脐带，本发明可获得更多的MSCs。本发明的方法对比现有的酶消化法，不用选择消化酶，不用控制消化时间，操作更简便，保持了细胞原有活性及生长状态，大大提高了MSCs得率，并能够长时间保存而不失其活性，解决此类资源得不到高效利用的现状，保证了临床应用中干细胞的数量和质量。

[附图说明]

图1为本发明一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法工艺流程图；

图2为本发明方法中小块脐带组织细胞在培养皿中培养三天后MSCs的细胞形态图；

图3为本发明方法中小块脐带组织细胞在培养皿中培养五天后MSCs的细胞形态图；

图4为本发明方法获得的原代脐带组织MSCs培养十天后的细胞形态图；

图5为本发明方法获得的脐带组织MSCs随时间的生长曲线图；

图6为酶消化法获得的脐带组织MSCs随时间的生长曲线图；

图7为本发明方法获得的脐带间组织充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化示意图。

[具体实施方式]

为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其具体实施方式、特征及其功效，说明如后。

本发明提供的一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其工艺流程如图1所示，由下述步骤组成：(1)取新生儿的脐带，通过磷酸缓冲液(简称：PBS，英文全称：Phosphate buffer saline)反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带，该磷酸缓冲液是由8g的NaCl、0.2g的KCl、1.15g的Na₂HPO₄、0.2g的KH₂PO₄用水定容为1L(升)的方法制作而成，该缓冲液用来维持脐带细胞内外渗透压、维持离子强度和PH值，维持细胞存活状态；(2)然后将干净的脐带粉碎，获得大量脐带组织块；(3)再将获得的脐带组织块滤过孔径为1.5mm的粗滤网，收集粗滤网下的脐带组织块，去掉不符合要求的大脐带组织块，获得直径小于等于1.5mm以下的小脐带组织块；(4)再将获得的小脐带组织块滤过200目滤网，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块；(5)直径为1-1.5mm脐带组织块在200目滤网上沥干液体后，将200目滤网上脐带组织块接种于细胞培养皿中，每个培养皿中接种14至16个脐带组织块，接种多个培养皿；(6)不加培养液，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，静置三小时，使得脐带组织块帖壁，加入培养液后，脐带组织块不会漂浮；(7)然后每个培养皿中加入含20％牛血清、10ng/mL EGF(中文全称：表皮生长因子，英文全称：Epidermal Growth Factor)的D-MEM/F12(英文全称：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient F-12Ham’s，一种培养基)培养液5mL，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合；(8)然后用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量5mL，吸弃洗液，吸取1mL的含0.25％胰蛋白酶和0.1％EDTA(中文全称：乙二胺四乙酸钠，英文全称：ethylenediaminetraacetic acid)的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，胰蛋白酶消化使细胞与细胞、细胞与培养皿间的粘连成分酶解，获得单个细胞，在倒置显微镜下观察细胞，确保细胞完全消化下来，再将5mL含了20％牛血清、10ng/mLEGF的D-MEM/F12培养液加入到培养皿中，反复吹打，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)消化液经200目滤网过滤，去掉脐带组织块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。上述步骤中所使用器材和试剂均需事先经过消毒和灭菌。

步骤(7)中，培养液D-MEM/F12中培养基D-MEM与营养成分F12的比例是1∶1。

本发明方法获得的脐带组织间充质干细胞最大限度的保持了干细胞原有的生物特性和活性，细胞繁殖增生速度快。在本发明方法获得的脐带组织间充质干细胞按1∶3传代置于培养器皿中，即将长于n个培养皿中的细胞接种到3n个培养皿上；然后在培养器皿中加入含10％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液5mL；再将培养器皿置于5％CO₂、37℃培养箱内培养；五天后，在培养器皿中间充质干细胞增生将达到80％融合，即将分离出的间充质干细胞按1∶3传代进行了扩增。可以采用同样的方法对扩增后的干细胞再进行1∶3传代扩增。连续传20代，细胞形态无明显改变。

细胞形态学观察显示：本发明方法分离的原代干细胞多于24-48小时内爬出组织，请参见图2所示，可以看出原代干细胞培养三天后，组织块边缘有间充质干细胞爬出，图中深色部分为接种的脐带组织块；图3为本发明方法中小块脐带组织细胞在培养皿中培养五天后MSCs的细胞形态图，可以看出，培养五天后，MSCs已经爬出组织并蔓延生长开来，图中深色部分为接种的脐带组织块。

采用本方法分离的原代干细胞培养1-2周，倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，增长速度较快，请参见图4所示，原代干细胞培养十天后，脐带间充质干细胞长满整个培养皿底部；2周以后成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，于第2-3周可形成80％融合贴壁细胞层。连续传20代，细胞形态无明显改变，细胞活率较传统酶消化法高。

本发明方法获得的脐带组织间充质干细胞增殖较快，在对数生长期，细胞倍增时间均约为24h左右，即细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，以最大的速率生长和分裂，导致细胞数量呈对数增加的时期约为24h左右。

脐带组织间充质干细胞繁殖生长曲线的测定方法如下：将贴壁干细胞用1mL的含0.25％胰蛋白酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液消化后，按1×10⁴细胞/孔接种在24孔板内，每隔24h用含0.25％胰蛋白酶和0.1％EDTA消化3个孔，收集干细胞，并用0.4％的胎盼兰计数活细胞，以时间为横坐标，以细胞数为纵坐标绘制生长曲线，时间单位为天，细胞数单位为×10⁴个，如图5所示；图6为酶消化法采用相同测定方法获得的MSCs随时间的生长曲线图。由图可以看出，本发明方法获得脐带组织间充质干细胞繁殖生长能力优于酶消化法获得的脐带组织间充质干细胞。图7为本发明方法获得的脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化示意图，图中7A、7C表示未分化的脐带间充质干细胞；7B表示脐带间充质干细胞向成骨细胞分化图；7D用油红-O染料显示的脐带间充质干细胞向脂肪细胞分化图。由7A和7B、7C和7D对比可以看出，本发明方法获得的脐带间充质干细胞具有很好的成骨细胞和脂肪细胞分化活性。

实施例1：

一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，取新生儿的脐带一根，用50mL的磷酸缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；用剪切装置粉碎，获得大量脐带组织块；过孔径为1.5mm的粗滤网，去掉不符合要求的大块脐带组织，获得直径小于等于1.5mm以下的小脐带组织块；粗滤网下接200目滤网，收集200目滤网上的小脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块，直径1-1.5mm的脐带组织块在200目滤网上沥干液体后，将200目滤网上脐带组织块接种于规格为90mm×16mm的细胞培养皿中，每个培养皿中接种15个脐带组织块，可接种20个培养皿，不加培养液，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，待三小时后加入5mL含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合，然后用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量5mL，吸弃洗液，吸取1mL的含0.25％胰蛋白酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；消化液经200目滤网过滤，去掉脐带组织块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；将滤液离心，去除上清，使用3mLD-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞，一根脐带获得的约干细胞的数量为1.5×10⁷-2.0×10⁷个。

所述的剪切装置为剪刀。

与现有的酶消化法相比，本方法的优点为：操作简单快捷，避免了分离过程中胶原酶对脐带间充质干细胞的损伤作用以及动物源胶原酶中引入动物源蛋白和病原物的污染风险。还避免了酶消化过程中消化时间过长影响破坏细胞的活性，消化时间过短影响细胞得率这一问题。本发明中，脐带被均匀粉碎为直径1-1.5mm的小块，使得每小块脐带在相同的条件下，获得的MSCs均衡一致，利用本发明的方法，每根脐带被分成大量均一小块脐带组织，每个培养皿中接种14至16小块，可接种多个培养皿，五天后每个培养皿中的MSCs会大量繁殖增生，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合。对比现有的酶消化法，同样数量的脐带，本发明可获得更多的MSCs。本发明的方法对比现有的酶消化法，不用选择消化酶，不用控制消化时间，操作更简便，保持了细胞原有活性及生长状态，大大提高了MSCs得率，并能够长时间保存而不失其活性，解决此类资源得不到高效利用的现状，保证了临床应用中干细胞的质量。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的。

Claims

1.一种脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其特征在于，该方法是由下述步骤组成：(1)首先取新生儿的脐带，由8g的NaCl、0.2g的KC1、1.15g的Na₂HPO₄、0.2g的KH₂PO₄用水定容为1L的方法制作而成磷酸缓冲液反复冲洗干净，去除残留的血液，获得干净脐带；(2)将干净的脐带粉碎，获得大量脐带组织块；(3)再将获得的脐带组织块滤过孔径1.5mm的粗滤网，收集粗滤网下的脐带组织块，去掉不符合要求的大脐带组织块，获得直径小于等于1.5mm的小脐带组织块；(4)再将获得的小脐组织带块滤过200目滤网，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉不符合要求的过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块；(5)直径为1-1.5mm脐带组织块在200目滤网上沥干液体后，将200目滤网上脐带组织块接种于细胞培养皿中；(6)不加培养液，直接放置于5％CO₂、37℃培养箱内，静置三小时；(7)然后加入含20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液5mL，置于5％CO₂、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养皿中脐带组织间充质干细胞增生达到80％融合，其中，培养液D-MEM/F12中培养基D-MEM与营养成分F12的比例是1∶1；(8)胰蛋白酶消化：先用磷酸缓冲液清洗培养皿两次，每次用量5mL，吸弃洗液，吸取1mL的含0.25％胰蛋白酶和0.1％EDTA的磷酸缓冲液，加入到培养皿内，消化3-5分钟，再将5mL含了20％牛血清、10ng/mL EGF的D-MEM/F12培养液加入到培养皿中，反复吹打，脐带组织间充质干细胞进入消化液中；(9)消化液经200目滤网过滤，去掉脐带组织块，获得含脐带组织间充质干细胞的滤液；(10)将滤液在900rpm下离心5分钟，去除上清，使用3mL的D-MEM/F12培养液重新悬浮均匀细胞，获得脐带组织间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，培养皿的规格为90mm×16mm，每个培养皿中接种14至16个脐带组织块，接种多个培养皿。

3.如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，粉碎采用剪切装置粉碎。

4.如权利要求3所述的脐带组织间充质干细胞爬片分离的方法，其特征在于，所述的剪切装置为剪刀。