CN113604428A - 一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离方法 - Google Patents

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沈琦
张文桦
梁辉
彭家伟
高昂
周诚
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Abstract

本发明涉及一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，用生理盐水清洗浸泡过乙醇水溶液的脐带，得到干净脐带组织；干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，得到脐带组织；脐带组织剪碎成组织块，大小为1‑3 mm3；用完全培养基清洗处理后的组织块，将组织块进行10～15天的贴壁培养并进行传代，得到从人脐带组织块中生长爬出的人脐带来源的间充质干细胞。本发明使用组织块法分离间充质干细胞操作简便，既可保证细胞数量又可保证原代细胞不会受到损伤。

Description

一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离方法。
技术背景
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。取材方便，无伦理争议，是目前较为理想的再生医学干细胞治疗的种子细胞之一。目前获得脐带间充质干细胞的方法主要有酶消化法和组织块贴壁法两种传统方法，但是酶消化法对组织的处理时间不定，不同环境和操作人员对操作的影响误差很大，并且每次都需要不断观察，耗时耗力，且会对原代脐带间充质干细胞造成损伤。
本发明拟使用组织块法分离间充质干细胞既可保证细胞数量又可保证原代细胞不会受到损伤。
发明内容
为解决脐带来源间充质干细胞分离困难，耗时耗力，分离过程易对细胞造成不可逆的损伤的问题，本发明目的在于：提供一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离方法。
本发明目的通过以下方案实现：一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，包括以下步骤：
（1）用生理盐水清洗浸泡过乙醇水溶液的脐带，得到干净脐带；
（2）将清洗过的干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，得到脐带组织；
（3）将步骤（2）得到的脐带组织剪碎成1-3 mm3的组织块；
（4）用含有5%血清和100单位双抗的α-MEM培养基清洗步骤（3）处理后的组织块，将组织块进行10～15天的贴壁培养并进行传代，得到从人脐带组织块中生长爬出的人脐带来源的间充质干细胞。
本发明可以快速简便的分离不受损的间充质干细胞。
其中，步骤（1）中，所述乙醇水溶液中，乙醇的浓度为75％。
步骤（4）中，所述贴壁培养需先倒置培养皿培养60-120分钟。
具体如下：
1、处理脐带组织：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中。
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织镊撕开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中。
（3）用组织剪将剩余组织剪成1-3 mm3大小的碎块。
2、间充质干细胞的原代分离
（1）将组织碎块放入新的10 cm灭菌培养皿中，碎块之间间隔0.5 cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出。
（2）以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养。
（3）完全静置72小时后，可观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5 ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养。
（4）从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态。原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代。
3、间充质干细胞的传代
（1）将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管。
（2）300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数。
（3）每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。
本发明提供的组织块法能够增加原代脐带间充质干细胞获得的数量，还能够减少对原代细胞的损伤，为间充质干细胞的规模化培养提供了技术支持。本发明使用组织块法分离间充质干细胞操作简便，既可保证细胞数量又可保证原代细胞不会受到损伤。
附图说明
图1为爬出的间充质干细胞显微镜下的图像；
图2为在培养皿中培养的组织块照片。
具体实施方式
实施例1
一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，按以下步骤：
1）、处理脐带组织：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织镊撕开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
2）、将步骤1）得到的脐带组织剪碎成1-3 mm3的组织块；
3）、间充质干细胞的原代分离
（1）用完全培养基清洗步骤（2）处理后的组织块，所述的完全培养基为含有5%血清和100单位双抗的α-MEM培养基，将组织碎块放入新的10 cm灭菌培养皿中，碎块之间间隔0.5 cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出，在培养皿中培养的组织块照片见图2；
（2）以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养；
（3）完全静置72小时后，可观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5 ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养；
（4）从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态，图1为爬出的间充质干细胞显微镜下的图像，原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代；
4）、间充质干细胞的传代
（1）将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管；
（2）300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数；
（3）每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。
实施例2
一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，与实施例1步骤近似，按以下步骤：
1）、处理脐带组织：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织剪剪开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（3）用组织剪将剩余组织剪成1-3 mm3大小的碎块；
2）、间充质干细胞的原代分离
（1）将组织碎块放入新的10 cm灭菌培养皿中，碎块之间间隔0.5 cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出。
（2）以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养。
（3）完全静置72小时后，可观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5 ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养；
（4）从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态，原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代；
3）、间充质干细胞的传代
（1）将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管；
（2）300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数；
（3）每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。
实施例3
一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，与实施例1步骤近似，按以下步骤：
1）、处理脐带组织：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织镊撕开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（3）用组织剪将剩余组织剪成3-5 mm3大小的碎块；
2）、间充质干细胞的原代分离
（1）将组织碎块放入新的10 cm灭菌培养皿中，碎块之间间隔0.5 cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出；
（2）以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养；
（3）完全静置72小时后，可观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5 ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养；
（4）从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态。原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代；
3）、间充质干细胞的传代
（1）将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管。
（2）300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数。
（3）每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。

Claims (9)

1.一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）处理脐带组织：用生理盐水清洗浸泡过乙醇水溶液的脐带，得到干净脐带，去除静脉和动脉，得到脐带组织；
（2）将步骤（1）得到的脐带组织剪碎成1-3 mm3的组织块；
（3）用完全培养基清洗步骤（3）处理后的组织块，所述的完全培养基为含有5%血清和100单位双抗的α-MEM培养基，将组织块进行10～15天的贴壁培养并进行传代，得到从人脐带组织块中生长爬出的人脐带来源的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，步骤（1）所述乙醇水溶液中，乙醇的浓度为75％。
3.根据权利要求1所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，步骤（4）所述贴壁培养需先倒置培养皿培养60-120分钟。
4.根据权利要求1所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，处理脐带组织的具体步骤为：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织镊撕开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中，备用。
5.根据权利要求1所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，步骤（3）中，包括间充质干细胞的原代分离，按下述步骤：
先将组织块放入新的10 cm灭菌培养皿中，组织块之间间隔0.5 cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出；然后，
以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养；
完全静置72小时后，观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5 ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养；
从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态，原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代。
6.根据权利要求1所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，间充质干细胞的传代按下述步骤：
将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管；
300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数；
每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。
7.根据权利要求1至6任一项所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，按以下步骤：
1）、处理脐带组织：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织镊撕开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
2）、将步骤1）得到的脐带组织剪碎成1-3 mm3的组织块；
3）、间充质干细胞的原代分离
（1）用完全培养基清洗步骤（2）处理后的组织块，所述的完全培养基为含有5%血清和100单位双抗的α-MEM培养基，将组织碎块放入新的10 cm灭菌培养皿中，碎块之间间隔0.5cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出；
（2）以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养；
（3）完全静置72小时后，可观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养；
（4）从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态，原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代；
4）、间充质干细胞的传代
（1）将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管；
（2）300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数；
（3）每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。
8.根据权利要求1至6任一项所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，按以下步骤：
1）、处理脐带组织：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织剪剪开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（3）用组织剪将剩余组织剪成1-3 mm3大小的碎块；
2）、间充质干细胞的原代分离
（1）将组织碎块放入新的10 cm灭菌培养皿中，碎块之间间隔0.5 cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出。
（2）以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养。
（3）完全静置72小时后，可观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养；
（4）从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态，原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代；
3）、间充质干细胞的传代
（1）将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管；
（2）300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数；
（3）每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。
9.根据权利要求1至6任一项所述的人脐带来源间充质干细胞的原代分离的方法，其特征在于，按以下步骤：
1）、处理脐带组织：
（1）将人脐带取出后放入10 cm灭菌培养皿中，使用无菌滴管吸取生理盐水清洗脐带组织的外表，使用镊子或手术刀片沿脐带外表向两头刮出脐带静脉中残留的血液，待组织呈干净半透明状，取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（2）用组织剪将脐带组织剪成1.5 cm长，沿着截面找出静脉腔，再沿着脐带外表皮和静脉腔外膜中间用组织镊撕开脐带，去除两根动脉和一根静脉，将剩余组织取出放入一个新的10 cm灭菌培养皿中；
（3）用组织剪将剩余组织剪成3-5 mm3大小的碎块；
2）、间充质干细胞的原代分离
（1）将组织碎块放入新的10 cm灭菌培养皿中，碎块之间间隔0.5 cm，将培养皿倒置后放入细胞培养箱中培养60-120分钟，使组织与培养皿贴紧，便于间充质干细胞爬出；
（2）以缓慢的速度沿培养皿边缘加入8 ml完全培养基，后放入细胞培养箱中培养；
（3）完全静置72小时后，可观察培养皿，如无异常，再过72小时后在每个培养皿中补充5ml完全培养基，在细胞培养箱中继续培养；
（4）从培养第七天开始，每两天将培养皿取出在显微镜下观察间充质干细胞的生长状态。原代间充质干细胞只生长在组织块周围，当局部细胞密度超过80%后即可传代；
3）、间充质干细胞的传代
（1）将0.05%胰酶回温至37℃，取3 ml至培养皿中，处理30-60秒，待间充质干细胞掉落后，取6 ml回温至37℃的完全培养基混合均匀，收集至15 ml离心管。
（2）300 g离心5分钟并取出上清液，加入5 ml新鲜完全培养基混合均匀，进行细胞计数。
（3）每个10 cm灭菌培养皿接种5*105个间充质细胞，补充8-10 ml完全培养基继续培养，待汇合度达80%后继续进行传代。
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