CN110283783A - 一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人源脐带间充质干细胞的培养和冻存方法，所述培养方法包括先从脐带组织中分离培养原代种子细胞，然后将原代种子细胞进行扩大培养的步骤，本发明通过在原代种子细胞培养阶段，创造性的采用第二次原代贴壁培养的方法，大幅缩短了原代种子细胞分离培养时间，提高了原代种子细胞数量，提高了原代种子细胞纯度，为临床研究和应用提供了充足的标准化种子细胞和培养方法。本发明制备得到的人源脐带间充质干细胞，在体、内外均可以向成骨、成软骨、成脂分化。本发明所述冻存方法通过采用无血清冻存液冻存体系，保证了所冻存细胞无动物源成分，且不使细胞受损，复苏后细胞活性好。

Description

一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源脐带间充质干细胞的培养及冻存方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell.UC.MSC)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，体外可诱导分化为骨、软骨、成脂分化、心肌、肝细胞样细胞，可广泛用于各种损伤和退变性疾病治疗，因其具有材料来源丰富、适于标准化制备、临床应用免疫原性低等特点，将成为未来干细胞临床应用的理想选择。Mitchell等首次从脐带华通胶中分离出成纤维样细胞，并且证实具有多向分化潜能后，通常对于脐带原代组织的培养方法主要有酶消化法、组织贴壁法以及两者结合的酶组织法，均分离得到脐带间充质干细胞。酶消化法成本高，消化时间难于控制，消化液黏稠而不易分离，而且胶原酶对细胞有直接损伤作用。传统的组织贴壁法较为简单，成本低，但是细胞爬出时间过长，通常需要10d左右，两者结合的酶组织法为贴壁培养酶消化后的组织块，方法虽也简易，细胞易于爬出。但是操作步骤比较繁琐。细胞接触东西比较多，容易污染，3种方法各有利弊，且现大部分脐带间充质干细胞制备体系采用胎牛血清，存在引进外源病毒等风险。脐带间充质干细胞的临床应用，必须建立简单、高效、稳定、规范的原代脐带间充质干细胞制备与鉴定技术，获得足够数量并符合临床要求的标准化的间充质干细胞，才能保证临床应用的安全性和有效性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，所述方法通过采用两次原代贴壁培养，大幅提高了原代种子细胞的数量，缩短了原代种子细胞分离培养时间，提高了原代种子细胞纯度。
本发明的技术方案为：
一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)从脐带组织中取华通氏胶部分组织，剪切得到组织块；将所述组织块置于培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中倒置培养2～4h，完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中，进行第一次原代贴壁培养，培养至第10～12天，先加入TrypLETM Express进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第一次原代种子细胞；
(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行第二次原代贴壁培养，培养至第6～8天，先加入TrypLETM Express进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第二次原代种子细胞；
(3)将第一次原代种子细胞与第二次原代种子细胞合并，得到总的原代种子细胞；将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，培养至细胞生长至80～90％融合时，先加入TrypLETM Express进行消化，再加入细胞培养液终止消化，然后分种至新的培养瓶中进行传代培养，经数次所述传代培养，得到纯化的人源脐带间充质干细胞；
所述细胞培养液的原料组分为：DMEM+2％血清替代物+2～10ng/mlVEGF+2～10ng/ml BFGF+2mmol/L L-Gln。
优选的，步骤(1)中，所述组织块的大小为1mm3，进行所述第一次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1～1:2；所述TrypLETMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状，进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm2。
优选的，步骤(2)中，进行所述第二次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1～1:2；所述TrypLETMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状；进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm2。
优选的，步骤(3)中，所述接种密度为2～3×104个/cm2；所述原代种子细胞与所述细胞培养液之间的比例为2～3×104:0.2；所述TrypLETM Express的加入量为0.02～0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状；所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm2；所述分种的分种率为1:3～1:6。
所述方法制备得到的人源脐带间充质干细胞。
一种所述人源脐带间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
(1)向人源脐带间充质干细胞中加入TrypLETM Express进行消化，然后加入细胞培养液终止消化，完毕后离心弃去上清，加入无血清冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞密度，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液分装至冻存管中，降温至-80℃，保持24～72h，然后转移至液氮中保存。
优选的，步骤(1)中，所述离心的转速为1000～1500rpm，所述离心的时间为3～7min。
优选的，步骤(1)中，所述离心的转速为1200rpm，所述离心的时间为5min。
优选的，步骤(1)中，所述调整至细胞密度为2×106～1×107个/mL。
优选的，步骤(2)中，所述降温至-80℃的具体步骤为先由室温降温至4℃，保持20min，再降温至-20℃，保持30min，然后降温至-80℃。
本发明的有益效果为：
1、本发明所述人源脐带间充质干细胞的培养方法，首次采用第二次原代贴壁培养培养原代种子细胞，原因在于，本申请发明人经大量试验研究发现，脐带组织经过第一次原代贴壁培养后，组织块中的华通胶才得以充分暴露，使得第二次原代贴壁培养时细胞更易于爬出。试验证明，一根18～22cm的脐带组织，第一次原代贴壁培养中，第5～7天有脐带间充质干细胞爬出，第10～12天细胞融合至80％，收集得到的原代种子细胞数量为2×107～4×107个，流式细胞分析CD73、CD90、CD105的阳性表达率分别为95.17～95.88％、96.12～96.88％、95.62～95.81％，CD34、HLADR、CD45的阳性表达率分别为0.49～0.66％、0.56～0.65％、0.51～0.88％；第二次原代贴壁培养后，第2～3天即有脐带间充质干细胞爬出，第6～8天细胞融合至80％，收集得到的原代种子细胞数量为4×107～6×107个，流式细胞分析CD73、CD90、CD105的阳性表达率分别为98.56～99.45％、98.95～99.29％、97.79～98.90％，CD34、HLADR、CD45的阳性表达率分别为0.26～0.46％、0.22～0.45％、0.38～0.58％。即通过采用第二次原代贴壁培养，大幅缩短了原代种子细胞分离培养时间，提高了原代种子细胞数量，提高了原代种子细胞纯度，为临床研究和应用提供了充足的标准化种子细胞和培养方法。
2、本发明所述人源脐带间充质干细胞的培养方法，采用的细胞培养液为无血清培养液，完全避免了引入外源消化酶等刺激以及外源牛血清对得率及活性的影响，同时也降低了变异的几率，完全符合《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》临床级干细胞制备标准，确保了干细胞临床应用的安全性。
3、本发明方法制备得到的人源脐带间充质干细胞，在体、内外均可以向成骨、成软骨、成脂分化，细表面标志CD73、CD90、CD105表达95％以上，CD34、HLADR、CD45几乎不表达。
4、本发明所述人源脐带间充质干细胞的冻存方法，采用无血清冻存液冻存体系，保证了所冻存细胞无动物源成分，且不使细胞受损，复苏后细胞活性好。
附图说明
图1：本发明实施例1第一次原代贴壁培养第6天得到的人源脐带间充质干细胞形态图；
图2：本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞形态图；
图3：本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞成脂分化油红O染色；
图4：本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞成骨(茜素红染色)分化；
图5：本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞成软骨分化；
图6：流式细胞仪检测本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞表面标志CD90的表达结果；
图7：流式细胞仪检测本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞表面标志CD44的表达结果；
图8：流式细胞仪检测本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞表面标志CD105的表达结果；
图9：流式细胞仪检测本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞表面标志CD73的表达结果；
图10：流式细胞仪检测本发明实施例1得到的P3代人源脐带间充质干细胞表面标志CD34、CD45、HLADR的表达结果；
其中1为同型对照，2为人源脐带间充质干细胞表面标志CD90(图6)\CD44(图7)\CD105(图8)\CD73(图9)阳性表达率均大于95％，CD34、CD45、HLADR(图10)阳性率小于2％。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
以下实施例中，TrypLETM Express、细胞培养液购自GIBCO，无血清冻存液购自BI公司(货号：05-712-1E)。
本实施例提供一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)无菌环境下打开脐带组织样本采样装置，取样做微生物检测，确保脐带组织来源无污染；将一根20cm的脐带组织用DPBS反复冲洗3次，充分洗去外表面淤血后，剪成2cm脐带小段，并去除脐带两端部分，然后浸泡在含有0.1％的BSA的DPBS的无菌培养皿中；用眼科剪将脐带小段从静脉剪开，用组织镊去除两根动脉和一根静脉，去掉静脉后，用组织镊取下华通氏胶部分组织，用眼科剪剪成1mm3大小的组织块；将所述组织块置于培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中倒置培养2h，完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中，进行第一次原代贴壁培养，培养至第10天，细胞融合至80％，用DPBS洗三遍后，先加入TrypLETM Express消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，将细胞吸入加入适量DPBS的50ml离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，收集得到3×107个原代种子细胞；进行所述第一次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1；所述TrypLETM Express的加入量为0.02mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2min，进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02mL/cm2。
(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行第二次原代贴壁培养，培养至第6天，细胞融合至80％，用DPBS洗三遍后，先加入TrypLETM Express进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，将细胞吸入加入适量DPBS的50ml离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，收集得到5×107个原代种子细胞；进行所述第二次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1；所述TrypLETM Express的加入量为0.02mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2min；进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02mL/cm2。
表1两次原代贴壁培养数据对比
(3)将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，培养至细胞生长至80％融合时，先加入TrypLETMExpress进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，然后分种至新的培养瓶中进行传代培养，经三次所述传代培养，得到纯化的P3代人源脐带间充质干细胞；所述接种密度为2×104个/cm2；所述原代种子细胞与所述细胞培养液之间的比例为2×104:0.2；所述TrypLETM Express的加入量为0.02mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2min；所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02mL/cm2；所述分种的分种率为1:3。
所述细胞培养液的原料组分为：DMEM+2％血清替代物+2ng/mlVEGF+10ng/ml BFGF+2mmol/L L-Gln。
经鉴定，P3代人源脐带间充质干细胞细胞活性大于90％、细胞形态呈典型的间充质干细胞特征：长梭形，旋涡状生长(见图2)；多向分化能力鉴定显示：具有向成脂、成骨、成软骨细胞分化能力(见图3～5)；流式表型分析细胞表面标志CD73、CD90、CD105表达均为95％以上，CD34、CD45、HLADR几乎不表达(见图6～10)。
进一步，提供一种所述人源脐带间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
(1)P3代人源脐带间充质干细胞冻存前12h，换新鲜细胞培养液，使细胞一直处于对数生长期，待细胞生长至80％融合时，加入0.02mL/cm2的TrypLETMExpress进行消化2min，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，加入0.02mL/cm2的细胞培养液终止消化，完毕后以1000rpm转速离心7min，弃去上清，加入无血清冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为2×106个/mL，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液分装至冻存管中，每管1mL，先由室温降温至4℃，保持20min，再降温至-20℃，保持30min，然后降温至-80℃，保持24h，最后转移至液氮中保存。
实施例2
本实施例提供一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)无菌环境下打开脐带组织样本采样装置，取样做微生物检测，确保脐带组织来源无污染；将一根22cm的脐带组织用DPBS反复冲洗5次，充分洗去外表面淤血后，剪成2cm脐带小段，并去除脐带两端部分，然后浸泡在含有0.1％的BSA的DPBS的无菌培养皿中；用眼科剪将脐带小段从静脉剪开，用组织镊去除两根动脉和一根静脉，去掉静脉后，用组织镊取下华通氏胶部分组织，用眼科剪剪成1mm3大小的组织块；将所述组织块置于培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中倒置培养4h，完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中，进行第一次原代贴壁培养，培养至第12天，细胞融合至80％，用DPBS洗三遍后，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，先加入TrypLETM Express消化，再加入细胞培养液终止消化，将细胞吸入加入适量DPBS的50ml离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，收集得到4×107个原代种子细胞；进行所述第一次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:2；所述TrypLETM Express的加入量为0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为5min，进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.06mL/cm2。
(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行第二次原代贴壁培养，培养至第8天，细胞融合至80％，先加入TrypLETM Express进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，将细胞吸入加入适量DPBS的50ml离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，收集得到6×107个原代种子细胞；进行所述第二次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:2；所述TrypLETM Express的加入量为0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为5min；进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.06mL/cm2。
表2两次原代贴壁培养数据对比
(3)将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，培养至细胞生长至90％融合时，先加入TrypLETMExpress进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，然后分种至新的培养瓶中进行传代培养，经三次所述传代培养，得到纯化的P3代人源脐带间充质干细胞；所述接种密度为3×104个/cm2；所述原代种子细胞与所述细胞培养液之间的比例为3×104:0.2；所述TrypLETM Express的加入量为0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为5min；所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.06mL/cm2；所述分种的分种率为1:6。
所述细胞培养液的原料组分为：DMEM+2％血清替代物+10ng/mlVEGF+2ng/ml BFGF+2mmol/L L-Gln。
经鉴定，P3代人源脐带间充质干细胞细胞活性大于90％、细胞形态呈典型的间充质干细胞特征：长梭形，旋涡状生长；多向分化能力鉴定显示：具有向成脂、成骨、成软骨细胞分化能力；流式表型分析细胞表面标志CD73，CD90，CD105表达均为95％以上，CD34，HLADR，CD45几乎不表达。
进一步，提供一种所述人源脐带间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
(1)P3代人源脐带间充质干细胞冻存前24h，换新鲜细胞培养液，使细胞一直处于对数生长期，待细胞生长至80％融合时，加入0.06mL/cm2的TrypLETMExpress进行消化3min，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，加入0.06mL/cm2的细胞培养液终止消化，完毕后以1500rpm转速离心3min，弃去上清，加入无血清冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×107个/mL，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液分装至冻存管中，每管1mL，先由室温降温至4℃，保持20min，再降温至-20℃，保持30min，然后降温至-80℃，保持72h，最后转移至液氮中保存。
实施例3
本实施例提供一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)无菌环境下打开脐带组织样本采样装置，取样做微生物检测，确保脐带组织来源无污染；将一根18cm的脐带组织用DPBS反复冲洗4次，充分洗去外表面淤血后，剪成2cm脐带小段，并去除脐带两端部分，然后浸泡在含有0.1％的BSA的DPBS的无菌培养皿中；用眼科剪将脐带小段从静脉剪开，用组织镊去除两根动脉和一根静脉，去掉静脉后，用组织镊取下华通氏胶部分组织，用眼科剪剪成1mm3大小的组织块；将所述组织块置于培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中倒置培养3h，完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中，进行第一次原代贴壁培养，培养至第11天，细胞融合至80％，用DPBS洗三遍后，先加入TrypLETM Express消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，将细胞吸入加入适量DPBS的50ml离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，收集得到2×107个原代种子细胞；进行所述第一次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1；所述TrypLETM Express的加入量为0.05mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为3min，进行所述消化至细胞呈圆球状，进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.05mL/cm2。
(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行第二次原代贴壁培养，培养至第7天，细胞融合至80％，用DPBS洗三遍后，先加入TrypLETM Express进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，将细胞吸入加入适量DPBS的50ml离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，收集得到4×107个原代种子细胞；进行所述第二次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1；所述TrypLETM Express的加入量为0.05mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为3min；进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.05mL/cm2。
表3两次原代贴壁培养数据对比
(3)将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，培养至细胞生长至80％融合时，先加入TrypLETMExpress进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，再加入细胞培养液终止消化，然后分种至新的培养瓶中进行传代培养，经三次所述传代培养，得到纯化的P3代人源脐带间充质干细胞；所述接种密度为3×104个/cm2；所述原代种子细胞与所述细胞培养液之间的比例为2×104:0.2；所述TrypLETM Express的加入量为0.05mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为3min，进行所述消化至细胞呈圆球状；所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.05mL/cm2；所述分种的分种率为1:4。
所述细胞培养液的原料组分为：DMEM+2％血清替代物+10ng/mlVEGF+2ng/ml BFGF+2mmol/L L-Gln。
经鉴定，P3代人源脐带间充质干细胞细胞活性大于90％、细胞形态呈典型的间充质干细胞特征：长梭形，旋涡状生长；多向分化能力鉴定显示：具有向成脂、成骨、成软骨细胞分化能力；流式表型分析细胞表面标志CD73，CD90，CD105表达均为95％以上，CD34，HLADR，CD45几乎不表达。
进一步，提供一种所述人源脐带间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
(1)P3代人源脐带间充质干细胞冻存前20h，换新鲜细胞培养液，使细胞一直处于对数生长期，待细胞生长至80％融合时，加入0.05mL/cm2的TrypLETMExpress进行消化3min，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，加入0.05mL/cm2的细胞培养液终止消化，完毕后以1200rpm转速离心5min，弃去上清，加入无血清冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×107个/mL，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液分装至冻存管中，每管1mL，先由室温降温至4℃，保持20min，再降温至-20℃，保持30min，然后降温至-80℃，保持48h，最后转移至液氮中保存。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从脐带组织中取华通氏胶部分组织，剪切得到组织块；将所述组织块置于培养皿中，于37℃，5％CO2的培养箱中倒置培养2～4h，完毕后向所述培养皿中添加细胞培养液，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中，进行第一次原代贴壁培养，培养至第10～12天，先加入TrypLETMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第一次原代种子细胞；
(2)将经过第一次原代贴壁培养后的组织块置于含有细胞培养液的新的培养皿中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行第二次原代贴壁培养，培养至第6～8天，先加入TrypLETMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，收集得到第二次原代种子细胞；
(3)将第一次原代种子细胞与第二次原代种子细胞合并，得到总的原代种子细胞；将原代种子细胞接种至含有细胞培养液的培养瓶中，然后置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，培养至细胞生长至80～90％融合时，先加入TrypLETMExpress进行消化，再加入细胞培养液终止消化，然后分种至新的培养瓶中进行传代培养，经数次所述传代培养，得到纯化的人源脐带间充质干细胞；
所述细胞培养液的原料组分为：DMEM+2％血清替代物+2～10ng/mlVEGF+2～10ng/mlBFGF+2mmol/L L-Gln。
2.根据权利要求1所述的人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述组织块的大小为1mm3，进行所述第一次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1～1:2；所述TrypLETMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状，进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm2。
3.根据权利要求1所述的人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，进行所述第二次原代贴壁培养的组织块与细胞培养液之间的体积比为1:1～1:2；所述TrypLETMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状；进行所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm2。
4.根据权利要求1所述的人源脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述接种密度为2～3×104个/cm2；所述原代种子细胞与所述细胞培养液之间的比例为2～3×104:0.2；所述TrypLETMExpress的加入量为0.02～0.06mL/cm2，所述消化的温度为37℃，所述消化的时间为2～5min，进行所述消化至细胞呈圆球状；所述终止消化的细胞培养液的加入量为0.02～0.06mL/cm2；所述分种的分种率为1:3～1:6。
5.权利要求1-4任一项所述方法制备得到的人源脐带间充质干细胞。
6.一种权利要求5所述人源脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向人源脐带间充质干细胞中加入TrypLETMExpress进行消化，然后加入细胞培养液终止消化，完毕后离心弃去上清，加入无血清冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞密度，得到细胞悬液；
(2)将细胞悬液分装至冻存管中，降温至-80℃，保持24～72h，然后转移至液氮中保存。
7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心的转速为1000～1500rpm，所述离心的时间为3～7min。
8.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心的转速为1200rpm，所述离心的时间为5min。
9.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，步骤(1)中，所述调整至细胞密度为2×106～1×107个/mL。
10.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于，步骤(2)中，所述降温至-80℃的具体步骤为先由室温降温至4℃，保持20min，再降温至-20℃，保持30min，然后降温至-80℃。
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