CN105238750B - 一种复苏脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种复苏脐带间充质干细胞的方法。该方法将传代至P3‑P5代的脐带间充质干细胞用完全培养基培养后，再用无血清的DMEM/F12培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，将各上清离心后再取上清混合，获得条件培养基；将冻存的脐带间充质干细胞解冻，并加入到条件培养基中离心去上清，然后再次加入条件培养基重悬并培养至细胞融合度达到要求。本发明以培养过脐带间充质干细胞的培养基上清为复苏时的培养基，替代现有方法中普遍采用的间充质干细胞完全培养基，依靠其中包含的多种细胞在增殖过程中分泌的活性物质来促进复苏后的脐带间充质干细胞的生长，进而提高其活力。

Description

一种复苏脐带间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种复苏脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

脐带间充质干细胞(umbilical cord mesencymal stem cells，UC-MSCs)是来源于胎儿脐带沃顿氏胶的间充质干细胞，与骨髓、脂肪间充质干细胞一样，其具有较强的自我更新及多向分化潜能，同时脐带间充质干细胞能分泌GM-CSF G-CSF，而骨髓、脂肪间充质则不能。间充质干细胞在分离培养后需要通过低温冷冻保存，在使用时再经过复苏进行组织器官损伤修复。

文献《人脐带间充质干细胞冻存复苏后的生物学特征》(王有为，韩之波等，中国组织工程研究与临床康复，第14卷，第10期2010–03–05出版)记载了当前复苏脐带间充质干细胞的普遍方法：

UC-MSCs于液氮中冻存1个月后，从液氮中取出细胞，立即投入42℃水浴中融化。PBS洗涤后，以完全培养基于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中培养或进行其他物学特征检测。

虽然上述复苏的方法比较简单、快捷，但是该方法复苏后的细胞活力偏低，不利于后续的进行组织器官损伤修复等临床应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复苏脐带间充质干细胞的方法，使得所述方法能够提高复苏后脐带间充质干细胞的活力，并且仍然保持可以分化为成骨细胞、成脂细胞的能力。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种复苏脐带间充质干细胞的方法，包括：

步骤1、将传代至P3-P5代的脐带间充质干细胞先用间充质干细胞完全培养基培养后，再用无血清的DMEM/F12培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，将各时间段上清离心后再取上清混合，获得条件培养基；

步骤2、将冻存的脐带间充质干细胞解冻，并加入到步骤1收集的条件培养基中离心去上清，然后再次加入条件培养基重悬并培养至细胞融合度达到要求。

针对现有方法复苏冻存的脐带间充质干细胞后细胞活力不高的问题，本发明在复苏时不采用传统方法中惯用的商业培养基(间充质干细胞完全培养基)进行复苏，而是采用培养过脐带间充质干细胞的条件培养基来进行复苏，可显著改善复苏后细胞活力不高的现象。本发明发现利用条件培养液可有效提高复苏细胞或组织的活力，而且不同来源的条件培养液对不同细胞、组织的活力有不同的促进或抑制作用。

其中，作为优选，步骤1为：

将传代至P3-P5代的脐带间充质干细胞按照5000-10000/cm²的细胞密度用间充质干细胞完全培养基培养24h，用Hanks清洗后，再用无血清的DMEM/F12培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，1000-2000rpm离心5-10min，去除沉淀，收集所有上清混合，滤膜过滤后获得条件培养基。

对于本发明所述条件培养基中的细胞接种密度、离心操作的参数、培养时间和环境等可根据实际情况进行调节，本发明仅是给出比较优选的参数，但并不仅限于这些参数及其组合，对于本发明其他方法步骤中出现的类似参数也不仅限于所提供的优选参数及其组合。

作为优选，所述间充质干细胞完全培养基为含10％FBS的DMEM/F12培养基。

对于P3-P5代的脐带间充质干细胞可按照本领域常规的分离方法以及传代方法来获得，本发明提供了如下优选的获得方法：

将脐带沃顿氏胶组织接种于培养皿中，加入间充质干细胞完全培养基培养7天后换液，每2-3天换液，待细胞融合度达到80％-90％，获得P0代；

用胰酶消化P0代细胞，离心后用间充质干细胞完全培养基重悬沉淀并传代培养，按照所述方式传代至P3-P5代。

更进一步优选的，将脐带沃顿氏胶组织剪碎至1.0-20.0cm³后，将组织块接种于培养皿中，加入间充质干细胞完全培养基放置在37℃，5％CO₂培养箱静置培养7天后换液，每2-3天换液，待细胞融合度达到80％-90％，获得P0代；

用0.25％胰酶消化P0代细胞，离心后用间充质干细胞完全培养基重悬沉淀，5000-10000/cm²细胞密度接种培养皿中继续培养，按照所述方式传代至P3-P5代。

在步骤2复苏环节，将本发明所采用的条件培养基替代现有经常采用的商业培养基，按照一般的做法复苏即可。

作为优选，步骤2为：

将冻存的脐带间充质干细胞放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育30-60秒，然后加入到5-10倍体积的条件培养基中，以1000-2000rpm离心3-5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀，吹打混匀，并按照5000-10000/cm²的细胞密度用条件培养基放置在37℃、5％CO₂培养箱静置培养24小时后，更换条件培养基继续培养至细胞融合度达到80％-90％。

运用本发明所述方法复苏冻存的脐带间充质干细胞，相比采用现有方法(《人脐带间充质干细胞冻存复苏后的生物学特征》中记载的复苏方法)复苏后的细胞，其活力显著提高，且依然保持间充质干细胞良好的生物学特征，具有分化为成骨细胞和成脂细胞的能力。基于此，本发明提供了所述条件培养基在复苏脐带间充质干细胞中的应用。本发明所述条件培养基在不使用时可放置在-20℃培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。需要使用时，恢复到37℃常温使用。

由以上技术方案可知，本发明以培养过脐带间充质干细胞的培养基上清为复苏时的培养基，替代现有方法中普遍采用的间充质干细胞完全培养基，依靠其中包含的多种细胞在增殖过程中分泌的活性物质来促进复苏后的脐带间充质干细胞的生长，进而提高其活力。

附图说明

图1所示为本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏后活力柱形图；

图2所示为本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏且培养72h后的细胞总数柱形图；

图3所示为空白组细胞表面抗原流式细胞仪检测图；

图4所示为实验组细胞表面抗原流式细胞仪检测图；

图5所示为复苏后细胞成骨诱导的镜检图；

图6所示为复苏后细胞成脂诱导的镜检图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种复苏脐带间充质干细胞的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种复苏脐带间充质干细胞的方法进行详细说明。

实施例1：脐带间充质干细胞的培养及条件培养基的收集

将脐带沃顿氏胶组织剪碎至1.0-20.0cm³后，将组织块接种于培养皿中，加入完全培养基(DMEM/F12+10％FBS)放置在37℃，5％CO₂培养箱静置培养7天后换液，每2-3天换液，待细胞融合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化细胞，离心后用完全培养基重悬沉淀，7×10³/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。

条件培养基收集：用于条件培养基的脐带间充质干细胞，先按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用Hanks清洗后，加入无血清的DMEM/F12培养基，在24小时、48小时、72小时后，分别收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000pm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22μm滤膜过滤，收集在无菌培养瓶中。放置在-20℃培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80℃保存1年以上。需要使用时，恢复到常温使用。

实施例2：脐带间充质干细胞的复苏

将冻存的脐带间充质干细胞从液氮中取出，放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中细胞悬液以1000rpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀；轻轻吹打混匀，并按照7×10³/cm²细胞密度接种培养皿中，用条件培养基培养。放置在37℃，5％CO₂培养箱静置24小时后，更换条件培养基继续培养，每日观察细胞扩增情况，细胞进行继续培养至细胞融合度达到80％-90％。

实施例3：复苏细胞活力对比

实验组：按照实施例1制备获得条件培养基，将冻存的脐带间充质干细胞从液氮中取出，放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育60秒，细胞解冻后，立即将冻存液加入到5倍体积的条件培养基中，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞活力检测，其余细胞悬液以1000rpm离心5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀；轻轻吹打混匀，并按照7×10³/cm²细胞密度接种六孔板中，用条件培养基培养。放置在37℃，5％CO₂培养箱培养72小时，用胰酶消化离心细胞，用条件培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数仪进行细胞总量计数

对照组：从液氮中取出脐带间充质干细胞(与实验组为相同来源的脐带间充质干细胞)立即放入42℃水浴锅内融化,PBS洗涤后，取出细胞进行细胞活力检测，以1000rpm离心5分钟，去上清，用完全培养基重悬细胞，按照7×10³/cm²细胞密度接种六孔板中，并放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养72小时。用胰酶消化离心细胞，用含10％FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，取少量细胞悬液，加入台盼蓝，放置在细胞活力计数进行细胞总量的计算

两者对比结果见图1和图2，由图1可以明显看出，经由本发明方法复苏后的脐带间充质干细胞的活力接近95％，而现有方法复苏后的细胞活力在85％左右，两者相比具有显著差异。同时，由图2可以看出，在细胞复苏且经过72h的培养后，经过本发明方法培养的细胞总数远远超过了现有方法，表明经过本发明复苏方法复苏后的细胞活力较高，增殖能力强。

实施例4：流式细胞仪检测复苏后的脐带间充质干细胞表面标志

按照实施例1、2复苏培养细胞，待复苏后细胞融合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，并计数后每管加入2×10⁵细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD45、及HLA-DRA抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原，结果见图3和图4。

由图3和图4可知，间充质干细胞阴性表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90均呈现阳性。说明复苏后脐带间充质干细胞依然保持间充质干细胞的良好生物学特征。

实施例5：复苏脐带来源的间充质干细胞诱导成骨分化鉴定

按照实施例1、2复苏培养细胞，待复苏后细胞融合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成骨诱导培养基进行培养24h后，每隔2-3天换液，21天后进行茜素红染色，结果见图5。

复苏后的间充质干细胞，经过成骨诱导3周后，由茜素红染色可见钙化结节说明经过条件培养基复苏的脐带间充质干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。

实施例6：复苏脐带来源的间充质干细胞诱导成脂分化鉴定

按照实施例1、2复苏培养细胞，待复苏后细胞汇合度达到80％-90％，用0.25％胰酶消化离心细胞，收集细胞后，并按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。四周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图6。

复苏后的脐带间充质干细胞，经过成脂诱导4周后，由油红O染色可见红色油滴，说明经过条件培养基复苏的脐带间充质干细胞仍然保持向成脂分化的潜能。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种复苏脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将传代至P3-P5代的脐带间充质干细胞按照5000-10000/cm²的细胞密度用含10％FBS的DMEM/F12培养基培养24h，用Hanks清洗后，再用无血清的DMEM/F12培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，1000-2000rpm离心5-10min，去除沉淀，收集所有上清混合，滤膜过滤后获得条件培养基；

步骤2、将冻存的脐带间充质干细胞放置在35-42℃的水浴锅中，震荡温育30-60秒，然后加入到5-10倍体积的条件培养基中，以1000-2000rpm离心3-5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀，吹打混匀，并按照5000-10000/cm²的细胞密度用条件培养基放置在37℃、5％CO₂培养箱静置培养24小时后，更换条件培养基继续培养至细胞融合度达到80％-90％。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述P3-P5代脐带间充质干细胞通过以下方法获得：

将脐带沃顿氏胶组织接种于培养皿中，加入间充质干细胞完全培养基培养7天后换液，每2-3天换液，待细胞克隆汇合度达到80％-90％，获得P0代；

用胰酶消化P0代细胞，离心后用间充质干细胞完全培养基重悬沉淀并传代培养，传代至P3-P5代。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述P3-P5代脐带间充质干细胞通过以下方法获得：

将脐带沃顿氏胶组织剪碎至1.0-20.0cm³后，将组织块接种于培养皿中，加入间充质干细胞完全培养基放置在37℃，5％CO₂培养箱静置培养7天后换液，每2-3天换液，待细胞融合度达到80％-90％，获得P0代；

用0.25％胰酶消化P0代细胞，离心后用间充质干细胞完全培养基重悬沉淀，5000-10000/cm²细胞密度接种培养皿中继续培养，按照所述方式传代至P3-P5代。

4.权利要求1中所述条件培养基在复苏脐带间充质干细胞中的应用。