CN107177543A

CN107177543A - 一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺

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Publication number: CN107177543A
Application number: CN201710263431.0A
Authority: CN
Inventors: 任怀娟; 邓东凯; 陈彦田; 齐念民
Original assignee: Shanghai Li Kun Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Quansheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明公开了一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，包括在细胞库中取装有1.75×10⁶cells/ml/管的干细胞，复苏后，接种到T175培养瓶培养，待融合度达到90‑95％时，转接到两层的细胞工厂中培养，再待细胞融合度达到90‑95％时，传代至十层的细胞工厂中培养，待融合度达到70％时，换成无血清培养基培养，使得BSA的含量降低至50ng/ml，同时，待细胞融合度达到90％‑95％后，将干细胞消化下来，得到大量的干细胞，使用时换成干细胞保存液。本发明利用了T瓶并结合细胞工厂来大规模制备干细胞产品，取代传统T瓶培养方式，缩短了生产周期及降低了细胞污染的风险，且生产的干细胞仍然保持了很好的干细胞特性，满足了生物制品三批样生产原则，为干细胞作为药品申报奠定了基础。

Description

一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，特别涉及一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺。

背景技术

随着饮食习惯的改变和人口老龄化的加剧，糖尿病发病率越来越高。糖尿病足作为糖尿病严重的慢性并发症之一，其严重威胁糖尿病患者的健康和生活质量，糖尿病足是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一，不但给患者造成痛苦，而且在各国均造成了巨大的医疗、社会、经济问题。

目前基于药物和手术的传统治疗，在改善下肢血管病早期有显著的疗效，但是对于晚期尤其是体弱患者疗效并不明显，因此如何建立有效的侧支循环，促进毛细血管的再生，减轻神经病变和促进伤口愈合，成为治疗糖尿病足的研究热点。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)是一群具有高度自我更新能力和分化潜能的成体干细胞。因其具有免疫调控、分泌细胞因子、取材方便等优点而倍受关注，成为细胞治疗的理想种子细胞。间充质干细胞表达转录因子Oct-4、Nanog和Sox-2，是一群比成体干细胞更为原始的细胞，因此具有更强的分化潜能。MSC可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、成肌细胞、成心肌细胞及神经细胞等细胞类型。而且，脐带间充质干细胞表达低水平的MHC-I类抗原，不表达MHC-II类抗原及FasL，也不表达相关的T细胞活化的共刺激分子。现在培养的MSC已被广泛地用于临床实验研究，如移植物抗宿主病(GVHD)、充血性心力衰竭、急性心肌梗死、II型糖尿病、脊髓损伤、软骨和骨损伤、克罗恩病等，而且在肾脏、肌肉和肺的损伤修复中也有初步进展。间充质干细胞形态均一、数量多，尤其适合工业化制备。

另外，体内外的实验都已经证明，干细胞可以缓解多种血管性疾病，包括心肌、脑、下肢等的缺血性疾病。目前应用干细胞治疗下肢缺血性疾病已经在动物模型体内证明有效，并且大量的临床研究也表明，干细胞在下肢缺血的部位局部多点肌肉注射有很好的治疗效果。患者的痛感、间歇性跛行、坏疽等症状明显好转，踝/臂指数(ABI)和下肢动脉造影(DSA)等相关检查也表明患者的下肢血管狭窄缓解，侧支循环增加，并且没有发现明显的不良反应。有文献显示，使用脐带充质干细胞进行治疗后，伤口愈合程度明显增强。通过免疫组织化学分析，发现干细胞能促进烧伤部位伤口愈合，维持表皮组织及毛囊完整性，脐带干细胞的移植减轻烧伤局部组织炎症反应。

随着国内法规对细胞产品的安全性、稳定性等质量要求的不断提高，干细胞行业竞争的加剧，许多干细胞生产企业都意识到，要建立起企业长期的产品优势、成本优势等竞争优势，就需要建立起包括用细胞工厂生产干细胞的技术体系，加强技术创新研究和应用，不断发展和巩固企业的核心竞争力。

细胞工厂(Cell Factory)是一种设计精巧的细胞培养装置，在有限的空间内利用了最大限度的培养表面。细胞工厂的材质为符合《美国药典》规定的聚苯乙烯，采用静止培养方式，培养表面经特殊处理，大大提高了细胞的吸附性。因细胞工厂培养面积相对较大，不仅可以节约操作时间，还大大增加了培养厂房的利用空间。细胞工厂培养技术在干细胞制备中，具有工业规模化生产的作用，降低培养过程中的污染，节省空间，大量生产干细胞，降低了成本，缩短了培养所需的时间和人员的投入，有效的保证操作的无菌性，最大限度降低批间差异，实现操作规程化。使用无血清培养基，解决了外源性因子免疫问题。具体来说：1)足够数量的种子干细胞：从组织中分离的干细胞量非常少，要通过一定的培养后才能够获得目标的细胞量，同时在传代的过程中，干细胞的代次会不断增加，当达到一定的传代次数后干细胞可能会出现不同程度的衰老。因而，如何实现种子细胞量又保证种子细胞的质量成为需要解决的关键问题。2)细胞工厂制备干细胞：与敞开式的平面扩增干细胞不同，细胞工厂为多层的半封闭的培养体系，虽同为贴壁培养，但培养面积更大，细胞接种均一性下降，层层的贴壁面使得每层的溶氧量不同，影响干细胞的增值能力以及衰老情况；同时收获干细胞的时间也变得不定。3)大规模培养的干细胞的质量及安全性：经过大规模培养后，收获细胞的状态不同，收获细胞的代次也可能提高，细胞的特性可能会出现一定程度的改变，建立评价干细胞质量的体系以及考察其安全性的指标成为关键技术。

发明内容

本发明提供了一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，包括细胞库的建立，利用细胞工厂制备干细胞以及治疗糖尿病足干细胞产品的制备，以解决干细胞在转向临床应用时，细胞数量不足、产品质量不达标以及不均一和稳定性不够的问题。

本发明的技术方案如下：

一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，包括以下步骤：

(1)细胞接种

在细胞库中取4支装有1.75×10⁶cells/ml/管的干细胞，将其复苏后，接种到四个T175培养瓶，接种密度为1.0×10⁴cells/cm²，并放置在37℃，5％CO₂培养箱中贴壁培养；

(2)细胞工厂制备干细胞

待干细胞融合度达到90-95％时，将T175培养瓶的干细胞接种到4个两层的细胞工厂中培养，接种密度为1.0×10⁴cells/cm²，再待两层细胞工厂的细胞融合度达到90-95％时，将细胞传代至4个十层的细胞工厂中培养，接种密度为1.0×10⁴cells/cm²；

(3)干细胞产品的制备

待十层的细胞工厂培养的干细胞融合度达到70％时，换成无血清培养基培养，使得BSA的含量降低至50ng/ml，同时，待细胞融合度达到90％-95％后，将干细胞消化下来，得到大量的干细胞。

优选为，步骤(2)和步骤(3)中，干细胞在T175培养瓶、两层的细胞工厂和十层的细胞工厂培养时，待细胞融合度达到30％时，要吸出旧的培养基同时添加新鲜配制的培养基，并且培养基的量也相应要增加50％，该步骤是保证干细胞在细胞工厂正常增殖的关键步骤，本发明通过对培养基量的控制，达到即不浪费培养基也能同时保证干细胞的正常增殖的目的，为工业化生产干细胞提供了很好的节约培养基、节约成本的途径。

优选为，还包括将步骤(3)得到的大量干细胞分装为2×10⁷cells/ml/管，并使用干细胞冻存液重悬，使用时将冻存液除去，换成干细胞保存液。

优选为，所述的干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、宫膜间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞或胎盘造血干细胞中的一种；更为优选，所述的干细胞为脐带间充质干细胞。

优选为，步骤(1)所述的干细胞是从组织中通过不同的分离提取方法得到，其中，脐带间充质干细胞的提取采用的是组织块法，脐带间充质干细胞细胞库的建立，包括以下步骤：

(1)获取经检测合格的脐带组织，保存至保存液中，48h内冷链运输至GMP车间；

(2)用灭菌的剪刀将脐带组织剪断为2-3cm的组织块，配合使用止血钳、镊子和剪刀，去除静脉和动脉三个血管，将去除血管的脐带组织块放到50mL的离心管中，加入无菌PBS缓冲液，拧紧盖子，上下颠倒反复清洗组织块3次以上；

(3)取出脐带组织，放到培养皿中，将脐带剪成小块0.5～1.5mm³，在每个培养皿中放一小块组织，完成接种，放到培养箱中2小时后，补加培养基3ml，3～4天后补加新鲜的培养基；

(4)1周后，除去组织块，3～4天后换液，当细胞长至95％时，将干细胞使用TrypLE消化下来计数，计算收获的细胞量；

(5)再转接种至T175培养瓶，培养3～4天后，显微镜下观察T175培养瓶中干细胞的增殖情况，当细胞融合至90-95％时，将干细胞消化进行传代至两层细胞工厂；

(6)经过4～5天的培养后，两层细胞工厂的细胞融合度达到90-95％，此时再次将干细胞消化接种至十层的细胞工厂培养，待细胞融合度达到90-95％，分装，每管1.75×10⁶cells/ml，即完成细胞库的建立，保证了干细胞临床研究的细胞用量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

一、本发明的一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，利用T瓶并结合细胞工厂来大规模制备干细胞产品，取代传统的T瓶培养方式，缩短了生产周期以及降低了细胞污染的风险；

二、本发明的一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，具有很好稳定性，且生产的干细胞仍然保持了很好的干细胞特性，将干细胞用于模拟的大鼠糖尿病足有很好的治疗效果，同时将细胞工厂设定为十层，满足了生物制品三批样生产原则，为干细胞作为药品申报的生产工艺的开发奠定了基础；

三、本发明在十层的细胞工厂培养干细胞时，待细胞融合度达到70％，使用无血清培养基替代现有的牛血清培养基，避免了BSA残留，防止使用干细胞产品时出现免疫反应，提高了产品的安全性，且符合药典要求。

附图说明

图1为利用常规培养皿培养干细胞与利用本发明工艺培养干细胞的细胞形态比较示意图；其中，A为常规培养皿培养干细胞；B为本发明工艺培养干细胞，即在十层的细胞工厂培养干细胞；

图2为本发明的一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺的三种培养系统收获细胞量比较示意图；

图3为将本发明制备得到的脐带间充质干细胞用于治疗鼠的糖尿病足的示意图，其中，从左到右分别为模型对照组，局部干细胞移植组，静脉干细胞移植组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

建立安全有效、数量足够的细胞库，细胞库中的细胞通过专业的第三方检定，并且细胞量能够满足临床研究的不断供给。

新生儿出生后获得脐带组织，其中捐献者必须进行过严格体检，包括各项病毒检测。在无菌室，从人体分离后的脐带转移至保存液，在48小时内，通过冷链运送到专业的细胞冻存中心，获得捐献者的信息、体检报告。

(1)将组织转移至GMP车间，并经过严格处理后，喷好酒精，转移至事先照好紫外的生物安全柜中；

(2)用无菌PBS缓冲液清洗组织3次以上；用灭菌的剪刀将脐带组织剪断为2-3cm的组织块，配合使用止血钳、镊子和剪刀，去除静脉和动脉三个血管。将去除血管的脐带组织块放到50ml的离心管中，加一定量的无菌PBS缓冲液，拧紧盖子，上下颠倒反复清洗组织块3次以上；

(3)从离心管中取出脐带组织，放到培养皿中；在一个培养皿用锋利的小剪刀将脐带剪碎，剪成小块0.5～1.5mm³，在每个培养皿中放一小块一小块的组织，即接种。放到培养箱中2小时后，补加培养基3ml，3～4天后补加新鲜的培养基；

(4)1周后，除去组织块，3～4天后换液；去除组织块后，当细胞长至95％时，将干细胞使用TrypLE消化下来计数，计算收获的细胞量；一般每个培养皿爬出来的细胞为15±5×10⁴cells，则总共收获的细胞量可达到5×10⁶cells，分装至3支冻存管中，记为P1；

(5)取一支P1的脐带间充质干细胞接种至T175培养瓶；培养3～4天后，显微镜下观察T175培养瓶中干细胞的增殖情况，当细胞融合至95％时，将干细胞消化进行传代至两层细胞工厂；

(6)经过4～5天的培养后，两层细胞工厂的细胞融合度能够达到95％，两层的细胞工厂收获量可达到6×10⁷cells，此时再次将干细胞消化接种至十层的细胞工厂，而十层的细胞工厂则能够收获到3.5×10⁸cells，冻存200支细胞，作为细胞库。

实施例2

本发明另一个重要的技术难点为临床用干细胞的制备，本发明干细胞制备工艺的重要部分是利用T瓶结合细胞工厂来大规模制备干细胞产品，并且制备临床级干细胞制剂。具体地包括以下步骤：

(1)取细胞库中脐带间充质干细胞4管，接种至四个T175培养瓶，接种量为1.75×10⁶cells/T175，即1.0×10⁴cells/cm²；第二天换液，除去未贴壁的细胞；

(2)培养四天后，在显微镜下观察细胞，当细胞融合到95％，将干细胞进行传代至4个两层的细胞工厂；4～5天后，两层细胞工厂的细胞融合度达到95％，则可将细胞传代至4个十层的细胞工厂；

(3)十层的细胞工厂在培养的第3天需要去除含血清的培养基，换成无血清培养基，目的是去除外源的牛血清白蛋白(BSA)，避免了干细胞临床应用时人体可能出现免疫反应；换成无血清培养基后需要密切关注细胞的培养状态，为了除去牛血清白蛋白(BSA)，干细胞的外排时间要保证两天及以上，才能使BSA的含量降低至50ng/ml。由于目前商品化的无血清培养基普遍存在营养不足的问题，无法维持干细胞的长期扩增，因此我们选定的限度为干细胞融合度达到70％时换成无血清培养基，干细胞经过一天的适应时间，两天后即能够达到90％～95％的融合度，即换液48小时后，干细胞融合度达到90％～95％时，这个时间点的控制非常严苛，若是不提前换液，在干细胞融合度达到并收获后，血清的残留不能够控制在药典规定的限度50ng以下；同时为了确保收获细胞的量及收获细胞的活性，在培养48小时，及时的将干细胞收获，才能够收获到高质量的脐带间充质干细胞。

(4)换无血清培养两天后，在显微镜下观察到细胞融合度达到90％后，如图1B所示，图1B为细胞工厂培养的干细胞表型，且为了与常规培养皿培养的干细胞作比较，图1A为常规培养皿培养的干细胞表型；从图1A和图1B可以看出，两者都呈现梭行，为正常干细胞形态，两者没有差别，然后将十层细胞工厂的干细胞消化下来，细胞离心后计数，得到大量的脐带间充质干细胞，此外，按照固定的细胞接种量，比较T瓶、两层的细胞工厂、十层的细胞工厂收获的细胞量，如图2所示，十层的细胞工厂收获的细胞量远远高于T瓶。

(5)配制临床级干细胞制剂，使用干细胞冻存液。

(6)调节细胞的密度为2×10⁷cells/ml/管，使用干细胞冻存液重悬，与传统的干细胞冻存一样，需要经过程序降温，再转移到液氮罐中，-196℃存储，此干细胞制剂复融稀释后可直接用于临床，注射进病人体内是安全有效的。

与现有技术相比，该制备工艺不仅能制备大量的干细胞，同时所制备的干细胞能保持了干细胞的特性，并且符合干细胞的临床使用级别，干细胞的质量符合各项标准，包括杂质要求等。

实施例3

将本发明制备的脐带间充质干细胞用于治疗鼠的糖尿病足，通过检测各项指标来反映脐带间充质干细胞的治疗效果，以表明本发明的脐带间充质干细胞可用于治疗糖尿病足。

实验方法

使用脐带间充质干细胞治疗Wistar雄性大鼠的糖尿病足试验：首先，将Wistar雄性大鼠随机分为造模组和对照组，其中，造模组使用高脂饲料喂养后，腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg；对照组注射等体积的高脂饲料缓冲液；然后，再监测两组大鼠的血糖、体重、饮水量和尿量，待出现血糖≥14mmol/L及多饮、多尿、体重减轻等糖尿病症状后，将两组大鼠足背部切除一块3cm×7cm矩形全层皮肤组织，建立糖尿病足溃疡模型，比较二组溃疡愈合时间。

造模结果及分组：糖尿病造模组注射链脲佐菌素(STZ)后，有21只大鼠出现血糖≥14mmol/L，并有多饮、多尿、消瘦等症状。链脲佐菌素(STZ)注射后5天，造模组大鼠平均血糖浓度为：20.15±3.08，造模14天造模组大鼠平均血糖浓度为：21.54±2.71，提示糖尿病模型稳定。除A组为正常对照组外，造模成功大鼠随机分为4组，每组5只，分别为：B组-模型对照组；C组-局部低剂量干细胞移植组(0.5×10⁶cells/只)；D组-局部高剂量干细胞移植组(1×10⁶cells/只)；E组-静脉干细胞移植组(2×10⁶cells/只)。局部干细胞移植组为将实施例2大规模制备的脐带间充质干细胞，经多点注射，移植于大鼠足背创面周围，静脉干细胞移植组为将实施例2大规模制备的脐带间充质干细胞，经大鼠尾静脉缓慢推注入大鼠体内。

实验结果

本发明将Wistar雄性大鼠随机分为造模组和对照组，其中，造模组高脂饲料喂养后，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg；对照组注射等体积的高脂饲料缓冲液。监测两组血糖、体重、饮水量、尿量，当两组大鼠出现血糖≥14mmol/L及多饮、多尿、体重减轻等糖尿病症状后，将两组大鼠足背部切除一块3cm×7cm矩形全层皮肤组织，建立糖尿病足溃疡模型，比较二组溃疡愈合时间，如表一所示。结果表明：与正常对照组相比，模型对照组的溃疡面积明显增加，表明糖尿病不利于伤口愈合；与模型对照组相比，局部注射1×10⁶个脐带间充质干细胞组和静脉注射2×10⁶个脐带间充质干细胞组的皮肤溃疡面积均明显缩小，此两组在促进溃疡愈合方面无明显差异，如图3所示。脐带间充质干细胞静脉或动脉移植具有较好的改善代谢、降低血糖、血脂、促进血管再生、伤口愈合及改善肾脏组织缺血后纤维化等功能，脐带间充质干细胞移植有可能成为糖尿病微血管病变新的预防和治疗方法。

表一：移植脐带间充质干细胞后溃疡面积的变化(mm²)(n＝5，Means±SD)

^*P＜0.05，^**P＜0.01 vs control group；^#P＜0.05 vs model group.

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims

1.一种利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)细胞接种

(2)细胞工厂制备干细胞

(3)干细胞产品的制备

2.根据权利要求1所述的利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，干细胞在T175培养瓶、两层的细胞工厂和十层的细胞工厂培养时，待细胞融合度达到30％时，要吸出旧的培养基同时添加新鲜配制的培养基，并且培养基的量也相应要增加50％。

3.根据权利要求1所述的利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，其特征在于，还包括将步骤(3)得到的大量干细胞分装为2×10⁷cells/ml/管，并使用干细胞冻存液重悬，使用时将冻存液除去，换成干细胞保存液。

4.根据权利要求1所述的利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，其特征在于，所述的干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、宫膜间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞或胎盘造血干细胞中的一种。

5.根据权利要求4所述的利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，其特征在于，所述的干细胞为脐带间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的利用细胞工厂制备用于治疗糖尿病足的干细胞工艺，其特征在于，步骤(1)中细胞库的建立，包括以下步骤：

(6)经过4～5天的培养后，两层细胞工厂的细胞融合度达到90-95％，此时再次将干细胞消化接种至十层的细胞工厂培养，待细胞融合度达到90-95％，分装，每管1.75×10⁶cells/ml，即完成细胞库的建立。