CN108719274A - 一种组织保存液 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织保存液。每50mL所述组织保存液中含有如下组分：DMEM/F12 50ml，bFGF 90—110μL，N2 240—260μL，B27 480—520μL，Y‑27632 40‑60μL，BDNF 400‑500ng，NT3 400‑500ng。运用本发明的组织保存液，可以在较长时间内保持新鲜肿瘤细胞的活性，从而提高获得PDX模型的效率。与常规保存液相比，使用该保存液的PDX模型成瘤率大大增加，肿瘤利用率大大提升，成瘤和原代细胞培养时间显著缩短。并且，使用该方法可以增强脊索瘤样本的活性，从而使得脊索瘤PDX模型实验的成本降低，能够使更多患者通过PDX模型进行肿瘤的精准医疗，从而提高脊索瘤治愈的可能。

Description

一种组织保存液

技术领域

本发明属生物医学领域，具体涉及来源于患者脊索瘤组织的肿瘤移植模型制备的快速高效优化方法，具体涉及通过本配方来提高肿瘤样本活性来建立患者原代脊索瘤组织的肿瘤移植(Patient-derived xenograft，PDX)模型的方法及获得高纯度原代肿瘤细胞的方法。

背景技术

脊索瘤是局部的侵袭性或恶性肿瘤，来源于胚胎时期残留或迷走的脊索组织。可以发生于沿脊柱中轴的任何部位，但以斜坡嘴侧和骶尾部最常见。脊索瘤局部破坏性很强，因肿瘤继续生长而危害人体，且手术后极易复发，故仍属于恶性肿瘤，目前没有很好的药物能够彻底的治愈该肿瘤。

PDX肿瘤模型乃是将通过手术切除病人的肿瘤组织接种于免疫缺陷鼠体内而建立的新一代肿瘤模型。PDX肿瘤模型保留了患者的肿瘤组织即完整的细胞环境，因此PDX肿瘤模型保留了原代肿瘤的组织学、遗传学特征并维持了病人肿瘤的异质性。将这些小鼠作为检测药物反应的平台，模拟出不同药物在体内对该肿瘤的治疗效果，其药效学结果与临床有很高的相关性，其药效结果同临床一致性更高、可避免使用对患者无效的药物、缩短了治疗周期、节省费用、减少了无效治疗的毒副反应，大大提高了治愈成功率，降低了治疗脊索瘤的门槛。

目前国内对于脊索瘤还并无好的临床用药指导，利用PDX模型可以实现个体化精准医疗服务。样本肿瘤的活性强度可以在很大程度上决定PDX肿瘤模型建立的成功与否，而一般临床实验中，样本的长途运输以及低温保存会导致活性大大降低。

在以往的肿瘤组织运输或培养液中，均含有胎牛血清。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养。胎牛血清取自剖腹产的胎牛。胎牛血清可提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。但是血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成分虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件不同而异。而血清容易使脊索瘤肿瘤细胞分化，降低恶性增值能力。因此会导致肿瘤样本分化，活性降低，导致PDX肿瘤模型的建膜成功率降低，增加成本用量，增强实验难度，用含有血清的培养液培养肿瘤组织，易获得有成纤维细胞污染的肿瘤细胞，在后期使用中很难去掉成纤维细胞，使原代肿瘤细胞的应用受到了限制。

而本培养液使用添加了N2、B27和其他生长因子的DMEM/F12培养基代替了胎牛血清。此混合液所含的营养成分可保证肿瘤细胞的快速增殖且批次稳定，不会有未知成分的血清从中影响。N2、B27和其他生长因子富含抗氧化成分，能够减少细胞的氧化损伤。Y-27632及其他生长因子可有效抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。本培养液成分确定，不含血清，批次稳定，可推广使用。使用本培养液可以有效保存新鲜脊索瘤样本活性，筛选出活性高的肿瘤细胞，对脊索瘤PDX肿瘤模型的建立具有十分大的帮助。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种组织保存液。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

每50mL所述组织保存液中含有如下组分：DMEM/F12 50ml，bFGF 90-110μL，N2240-260μL，B27 480-520μL，Y-27632 40-60μL，BDNF 400-500ng，NT3 400-500ng。

其中DMEM/F12的配方为：

其中bFGF的配制方法为：

1、准备无菌细胞专用水100ml。

2、把1mg的bFGF粉加入准备好的细胞专用水中进行稀释，混匀。

3、将得到的bFGF溶液分装为每管1ml，密封。

4、放入-20°冰箱保存。

其中Y-27632的配制方法为：

1、准备无菌细胞专用水3.12ml。

2、把50mg的Y-27632粉加入准备好的细胞专用水中进行稀释，混匀。

3、将得到的Y-27632溶液分装为每管200μL，密封。

4、放入-20°冰箱保存。(取用时稀释比例为1:1000)

优选地，每50mL所述组织保存液中含有如下组分：DMEM/F12 50ml，bFGF 100μL，N2250μL，B27 500μL，Y-27632 50μL，BDNF 500ng，NT3 500ng。

其中，所述组织是新鲜脊索瘤组织。

下面对本发明做进一步说明：

其中DMEM是dulbecco's modified eagle medium的缩写，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。此保存液选用DMEM/F12，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，能够促进肿瘤干细胞生长。N2添加剂是神经元无血清培养常用的添加剂，含有硒、腐胺、铁传递蛋白和孕酮等成分。B27添加剂是在N2的基础上进一步添加了激素、抗氧化剂等成分，初始是为培养胚胎海马神经元设计的。它常用于神经干细胞和神经肿瘤细胞的培养，所含的营养成分可保证干细胞和肿瘤细胞的快速增殖。而Y-27632是一种选择性ROCK1(p160ROCK)抑制剂，比对其他激酶包括PKC，cAMP依赖性蛋白激酶，MLCK和PAK的作用强200多倍。可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。

将以上液体混合得到本发明组织液。本培养液使用了添加N2、B27和其他生长因子的DMEM/F12培养基来代替常用保护液中的胎牛血清，与常用保护液相比较来说，本培养液成分确定，批次稳定，不含血清，可有效保存肿瘤组织活性，增加实验成功率，可进行推广使用。

取出25ml组织保存液放入另两只支50ml的无菌离心管中。无菌条件下取出新鲜典型脊索瘤肿瘤组织放入上述两只离心管，分别送往无菌细胞培养房进行原代培养，送到SPF级动物房进行肿瘤接种。

本培养液使用添加了N2、B27和其他生长因子的DMEM/F12培养基代替了胎牛血清。此混合液所含的营养成分可保证肿瘤细胞的快速增殖且批次稳定，不会有未知成分的血清从中影响。N2、B27和其他生长因子富含抗氧化成分，能够减少细胞的氧化损伤。Y-27632可有效抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。本培养液成分确定，不含血清，批次稳定，可推广使用。使用本培养液可以有效保存样本活性，筛选出活性高的脊索瘤细胞，对脊索瘤PDX肿瘤模型的建立具有十分大的帮助。

总之，本发明改善了以往的保存液中血清成分不明的缺点，使得肿瘤样本在保存和运输中不可避免的活性降低减到最低。该保存液性比价高，易制成，使得PDX的成膜率显著增加，造膜时间缩短，且肿瘤利用率高，可在脊索瘤的建模实验中广泛使用，有效的提高脊索瘤PDX的造膜成功率，有利于临床运用，具有较高的商业应用价值。运用本发明的组织保存液，可以在较短时间内获得PDX模型，与常规保存液相比，使用该保存液的PDX模型成瘤率大大增加，肿瘤利用率大大提升，成瘤时间显著缩短。并且，使用该方法可以增强脊索瘤样本的活性，从而使得脊索瘤PDX模型实验的成本降低，大大增加脊索瘤治愈的可能。

附图说明

图1：为使用两种保存液下的肿瘤在同样时间内肿瘤生长速率折线图；

图2：为使用两种保存液下相同时间内肿瘤大小对比图，其中上图为使用普通保存液的NSG小鼠，下图为使用本发明保存液的NSG小鼠；

图3：为使用两种保存液下在同样时间内原代肿瘤细胞生长情况。

具体实施方式

1、本发明组织保存液的配置

配制本发明组织保存液的方法:

取50ml无菌离心管

取出25ml组织保存液放入另一支50ml的无菌离心管中。无菌条件下取出新鲜典型脊索瘤肿瘤组织放入上述离心管，送往无菌细胞培养房进行原代培养。

2、原代培养

(1)选取大小新鲜的脊索瘤样本放置于10cm²的无菌培养皿中

(2)用无菌的PBS缓冲液冲洗

(3)冲洗后，用刀片切取样本为0.5cm*0.5cm的小块，移到到培养皿盖上，加1ml组织保存液，预防组织细胞干死

(4)将选出的小块样本再切细为直径2mm的小块，切取20块左右。

(5)用1ml的带针注射器将直径为2mm的小组织块挑到培养瓶底部，放置5min。

(6)每个培养瓶加入5ml组织保存液，禁止吹打组织块。

将培养瓶轻轻放倒，使组织块慢慢被保存液浸泡，放到37摄氏度细胞培养箱内培养。

3、开始PDX建模

取出25ml组织保存液放入另一支50ml的无菌离心管中。无菌条件下取出新鲜典型脊索瘤肿瘤组织放入上述离心管，送往SPF级动物房进行肿瘤接种。

(1)将已经使用本发明侵泡过的病人的肿瘤样本组织(至少浸泡6小时)进行处理，将非肿瘤组织(脂肪、血块、坏死组织)除去。

(2)用手术刀将冲洗干净的肿瘤切成2～3mm的小块，放入保存液中，浸泡，静置5min，后取出肿瘤块放入Matrigel中混匀备用。

(3)对四周龄大小的NSG鼠进行抓取并于胸腹部进行剪毛，去毛时小心处理，不要剪破小鼠皮肤。

(4)用75％乙醇涂抹于接种口(接种口一般选于腋下两侧)，用剪刀在小鼠的接种口剪开一个3mm长的口子，然后将接种针从接种口沿着皮下向腋下伸入，造成一个深度达2.5cm左右的通道，拔出接种针。

(5)用尖头镊夹住混有Matrigel的肿瘤块，将肿瘤块放入接种口，然后用接种针将该肿瘤块植入通道深处。

(6)用75％乙醇涂抹伤口消毒。将手术后的小鼠放回笼子内，注意给足水和食物。

(7)每天观察小鼠状态和肿瘤的形态变化对比，记录小鼠的体重和肿瘤的大小。筛选PDX造膜成功的小鼠，待肿瘤组织达到适宜大小后，可收获肿瘤组织。

通过本发明的步骤，可以在较短时间内获得PDX模型，与常规保存液相比，使用该保存液的PDX模型成瘤率大大增加，肿瘤利用率大大提升，成瘤时间显著缩短。并且，使用该方法可以增强脊索瘤样本的活性，从而使得脊索瘤PDX模型实验的成本降低，大大增加脊索瘤治愈的可能。用于建造脊索瘤PDX模型的保存液具有批次稳定、成瘤率高、肿瘤样本利用率高、操作简单、成分简单等特点。

Claims (3)

1.一种组织保存液，其特征在于，每50mL所述组织保存液中含有如下组分：DMEM/F1250ml，bFGF 90-110μL，N2 240-260μL，B27 480-520μL，Y-27632 40-60μL，BDNF 400-500ng，NT3 400-500ng。

2.如权利要求1所述的组织保存液，其特征在于，每50mL所述组织保存液中含有如下组分：DMEM/F12 50ml，bFGF 100μL，N2 250μL，B27 500μL，Y-27632 50μL，BDNF 500ng，NT3500ng。

3.如权利要求1或2所述的组织保存液，其特征在于，所述组织是新鲜肿瘤组织。