CN110607278A - 肿瘤细胞培养物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤细胞培养物及其应用。该肿瘤细胞培养物包括细胞培养基及添加于细胞培养基的活性组分，活性组分包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子的终浓度为2ng/mL～30ng/mL，血管内皮生长因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL，干细胞因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL，层粘连蛋白的终浓度为12ng/mL～52ng/mL，表皮细胞生长因子的终浓度为5ng/mL～50ng/mL。采用上述肿瘤细胞培养物进行PDX模型构建的成功率较高。

Description

肿瘤细胞培养物及其应用
技术领域
本发明涉及生物学领域，特别是涉及一种肿瘤细胞培养物及其应用。
背景技术
目前，因癌症而死亡的人远远高于其他的疾病，癌症成为了死亡的第一杀手。由于癌症的特点，早期筛查难以准确地检测。当能够确诊的时候，已经是癌症的晚期，癌症的晚期时间很短，目前只能是医生根据以往经验来用药。一些研究通过构建动物模型以模拟病人的癌症情况，而进行药物筛选和药物评估。其中，PDX模型(Patient-Derived tumorXenograft，人源肿瘤异种移植模型)保持了肿瘤原有的分化程度、形态特征、结构特点及分子特性，与人本身的肿瘤特点更为接近，为肿瘤的生物学研究、诊断标志物的寻找和药物筛选的提供了重要的参考价值，实现了个体化治疗作用。一般地，采用肿瘤细胞培养基培养肿瘤细胞后再植入小鼠中，得到PDX模型。然而，采用现有的肿瘤细胞培养基进行PDX模型构建时，构建成功率较低。
发明内容
基于此，有必要提供一种PDX模型构建的成功率较高的肿瘤细胞培养物。
此外，还有必要提供一种肿瘤细胞培养物的应用。
一种肿瘤细胞培养物，包括细胞培养基及添加于所述细胞培养基的活性组分，所述活性组分包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，所述成纤维细胞生长因子的终浓度为2ng/mL～30ng/mL，所述血管内皮生长因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL，所述干细胞因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL，所述层粘连蛋白的终浓度为12ng/mL～52ng/mL，所述表皮细胞生长因子的终浓度为5ng/mL～50ng/mL。
本研究通过在细胞培养基中加入适量的成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，能够使离体后的肿瘤细胞保持活性，能够有效地促进肿瘤细胞的生长，以提高PDX模型的构建成功率。经试验验证，采用上述细胞培养基进行PDX模型构建的成功率为40％～80％。
在其中一个实施例中，所述活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和必需氨基酸，所述胰岛素的终浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，所述转铁蛋白的终浓度为5μg/mL～50μg/mL，所述维生素C的终浓度为10μg/mL～50μg/mL，所述牛血清白蛋白的终浓度为10μg/mL～50μg/mL，所述非必需氨基酸的终浓度为20ng/mL～100ng/mL，所述必需氨基酸的终浓度为10mmol/L～50mmol/L。
在其中一个实施例中，所述非必需氨基酸选自丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟谷氨酸、瓜氨酸及天门冬氨酸中的至少一种；
及/或，所述必需氨基酸选自赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及苏氨酸中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述细胞培养基包括终浓度为10mmol/L～50mmol/L且pH为6.8～7.8的缓冲液、终浓度为1mmol/L～10mmol/L的谷氨酰胺、终浓度为1000mg/L～5000mg/L的碳酸氢钠、终浓度为1000mg/L～5000mg/L的葡萄糖和终浓度为0.1mmol/L～5mmol/L的丙酮酸钠。
在其中一个实施例中，还包括生物凝胶，所述生物凝胶为温敏感型凝胶。
在其中一个实施例中，所述生物凝胶与所述细胞培养基的体积比为1:2～2:1。
在其中一个实施例中，所述肿瘤细胞培养物的pH为2～5。
在其中一个实施例中，还包括调节物，所述调节物选自乳酸及乳酸钠中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述调节物的终浓度为25μmol/L～100μmol/L。
上述肿瘤细胞培养物在培养肿瘤细胞或者构建PDX模型中的应用。
附图说明
图1为实施例1中肝癌肿瘤组织的实物图片；
图2为实施例1中测试组1移植肿瘤后小鼠的成瘤图；
图3为实施例2中测试组1移植肿瘤后小鼠的成瘤图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的肿瘤细胞培养物能够有效地促进肿瘤细胞的生长，以用于培养肿瘤细胞，提高PDX模型的构建成功率。其中，肿瘤细胞为肝癌细胞、肺癌细胞或肠癌细胞。需要说明的是，肿瘤细胞不限于上述指出的肿瘤细胞，还可以为其他肿瘤细胞。
进一步地，肿瘤细胞培养物包括细胞培养基及添加于细胞培养基的活性组分。活性组分包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子。成纤维细胞生长因子的终浓度为2ng/mL～30ng/mL。血管内皮生长因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL。干细胞因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL。层粘连蛋白的终浓度为12ng/mL～52ng/mL。表皮细胞生长因子的终浓度为5ng/mL～50ng/mL。
通过在细胞培养基中加入适量的成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，能够使离体后的肿瘤细胞保持活性，能够有效地促进肿瘤细胞的生长，以提高PDX模型的构建成功率。
细胞培养基能够提供维持肿瘤细胞活性的基本营养，以保持离体后的肿瘤细胞的活性。
在其中一个实施例中，细胞培养基包括终浓度为10mmol/L～50mmol/L且pH为6.8～7.8的缓冲液、终浓度为1mmol/L～10mmol/L的谷氨酰胺、终浓度为1000mg/L～5000mg/L的碳酸氢钠、终浓度为1000mg/L～5000mg/L的葡萄糖和终浓度为0.1mmol/L～5mmol/L的丙酮酸钠。此种设置的细胞培养基能够较好地维持肿瘤细胞的活性，促进肿瘤细胞的增殖。进一步地，缓冲液为pH为6.8～7.8的HEPES缓冲液。需要说明的是，缓冲液不限于为HEPES缓冲液，也可以为其他pH为6.8～7.8的缓冲液，可以根据需要进行设置。
进一步地，细胞培养基包括终浓度为20mmol/L～40mmol/L且pH为6.8～7.8的缓冲液、终浓度为3mmol/L～6mmol/L的谷氨酰胺、终浓度为2000mg/L～4000mg/L的碳酸氢钠、终浓度为2000mg/L～4000mg/L的葡萄糖和终浓度为2mmol/L～4mmol/L的丙酮酸钠。
需要说明的是，细胞培养基不限于上述指出的细胞培养基，还可以为其他细胞培养基，例如可以为IMDM培养基。
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)是一类具有传导生物信号、调节细胞生长、参与组织修复等功能的生物活性物质，能够促进成纤维细胞的有丝分裂和中胚层细胞的生长，还能够刺激血管的形成。FGF有几种异构体。其中。bFGF(basicfibroblast growth factor)能够调节细胞增殖、迁移和分化，有利于肿瘤的增殖分化。
在其中一个实施例中，成纤维细胞生长因子的终浓度为6ng/mL～25ng/mL。进一步地，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/mL～20ng/mL。更进一步地，成纤维细胞生长因子的终浓度为13ng/mL～18ng/mL。在其中一些实施例中，成纤维细胞生长因子的终浓度为2ng/mL、6ng/mL、10ng/mL、13ng/mL、15ng/mL、18ng/mL、20ng/mL、25ng/mL或30ng/mL。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，能够促进肿瘤生长、浸润和转移。
在其中一个实施例中，血管内皮生长因子的终浓度为20ng/mL～40ng/mL。进一步地，血管内皮生长因子的终浓度为25ng/mL～35ng/mL。在其中一些实施例中，血管内皮生长因子的终浓度为10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL或50ng/mL。
干细胞因子(SCF，Stem cell factor)又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)。它是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白，对肿瘤的生长有促进作用。
在其中一个实施例中，干细胞因子的终浓度为20ng/mL～40ng/mL。进一步地，干细胞因子的终浓度为25ng/mL～35ng/mL。在其中一些实施例中，干细胞因子的终浓度为10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL或50ng/mL。
层粘连蛋白(LN)是细胞黏着于基质的介质，并与多种基底膜成分结合，调节细胞生长和分化。LN与肿瘤浸润转移具有关系。在其中一个实施例中，层粘连蛋白的终浓度为20ng/mL～45ng/mL。进一步地，层粘连蛋白的终浓度为25ng/mL～40ng/mL。在其中一些实施例中，层粘连蛋白的终浓度为12ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL或52ng/mL。
表皮细胞生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽。EGF与靶细胞上的EGF受体特异性识别结合后，发生一系列生化反应，最终可促进靶细胞的DNA合成及有丝分裂。许多肿瘤中有EGF及其受体的异常表达，且与肿瘤转移和患者预后有密切关系，如胃癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等。
在其中一个实施例中，表皮细胞生长因子的终浓度为10ng/mL～45ng/mL。进一步地，表皮细胞生长因子的终浓度为20ng/mL～35ng/mL。在其中一些实施例中，表皮细胞生长因子的终浓度为5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、45ng/mL或50ng/mL。
在其中一个实施例中，活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和必需氨基酸。胰岛素的终浓度为0.5mg/mL～5mg/mL。转铁蛋白的终浓度为5μg/mL～50μg/mL。维生素C的终浓度为10μg/mL～50μg/mL。牛血清白蛋白的终浓度为10μg/mL～50μg/mL。非必需氨基酸的终浓度为20ng/mL～100ng/mL。必需氨基酸的终浓度为10mmol/L～50mmol/L。此种设置的活性组分能够提高肿瘤细胞的活性，加快肿瘤细胞的增殖，提高PDX模型构建成功率。
胰岛素能够与其他组分配合，促进肿瘤细胞的增殖。在其中一个实施例中，胰岛素的终浓度为1mg/mL～4mg/mL。进一步地，胰岛素的终浓度为2mg/mL～3mg/mL。在其中一些实施例中，胰岛素的终浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或者5mg/mL。
转铁蛋白能够促进肿瘤细胞增殖。在其中一个实施例中，转铁蛋白的终浓度为10μg/mL～40μg/mL。进一步地，转铁蛋白的终浓度为20μg/mL～30μg/mL。在其中一些实施例中，转铁蛋白的终浓度为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL。
维生素C能够为肿瘤细胞提供营养，促进肿瘤细胞增殖。在其中一个实施例中，维生素C的终浓度为20μg/mL～40μg/mL。进一步地，维生素C的终浓度为25μg/mL～35μg/mL。在其中一些实施例中，维生素C的终浓度为10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL。
牛血清白蛋白能够促进肿瘤细胞增殖。在其中一个实施例中，牛血清白蛋白的终浓度为20μg/mL～40μg/mL。进一步地，牛血清白蛋白的终浓度为25μg/mL～35μg/mL。在其中一些实施例中，牛血清白蛋白的终浓度为10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL、30μg/mL、35μg/mL、40μg/mL、45μg/mL或50μg/mL。
非必需氨基酸能够为肿瘤细胞提供营养，促进肿瘤细胞增殖。在其中一个实施例中，非必需氨基酸选自丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟谷氨酸、瓜氨酸及天门冬氨酸中的至少一种。
在其中一个实施例中，非必需氨基酸的终浓度为30ng/mL～90ng/mL。进一步地，非必需氨基酸的终浓度为40ng/mL～80ng/mL。更进一步地，非必需氨基酸的终浓度为50ng/mL～70ng/mL。在其中一些实施例中，非必需氨基酸的终浓度为20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。
必需氨基酸能够为肿瘤细胞提供营养，促进肿瘤细胞增殖。在其中一个实施例中，必需氨基酸选自赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及苏氨酸中的至少一种。进一步地，必需氨基酸为蛋氨酸。
在其中一个实施例中，必需氨基酸的终浓度为20mmol/L～40mmol/L。更进一步地，必需氨基酸的终浓度为25mmol/L～35mmol/L。在其中一些实施例中，必需氨基酸的终浓度为10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L、45mmol/L或者50mmol/L。
在其中一个实施例中，肿瘤细胞培养物还包括生物凝胶。生物凝胶为温敏感型凝胶。温敏感型凝胶能够在2℃～8℃条件下为液体状态，在室温以上为固体状态。温度敏感型凝胶有利于肿瘤细胞在体外培养时的立体生长。进一步地，温度敏感型凝胶为matrigel胶。需要说明的是，生物凝胶不限于为温度敏感型凝胶，也可以为其他生物凝胶，例如：明胶或者蛋白胶。
在其中一个实施例中，生物凝胶与细胞培养基的体积比为1:2～2:1。此种设置有利于肿瘤细胞的增殖，提高PDX模型构建成功率。
在其中一个实施例中，肿瘤细胞培养物的pH为2～5。此种设置有利于保持肿瘤细胞的活性。
在其中一个实施例中，还包括调节物。调节物选自乳酸及乳酸钠中的至少一种。通过添加调节物能够调节肿瘤细胞培养物的pH，以能够保持肿瘤细胞的活性。进一步地，调节物的终浓度为25μmol/L～100μmol/L。
上述实施方式的肿瘤细胞培养物中，通过在细胞培养基中加入适量的成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，能够使离体后的肿瘤细胞保持活性，能够有效地促进肿瘤细胞的生长，以提高PDX模型的构建成功率。
进一步地，上述实施方式的肿瘤细胞培养物能够较好地保留原代肿瘤的特性，能够用于肝癌细胞、肺癌细胞或肠癌细胞等多种肿瘤细胞的培养，以构建针对不同肿瘤细胞的PDX模型，进而对个体化治疗提供合适的模式动物。
此外，提供一种PDX模型的构建方法，包括如下步骤S110～S120：
S110、将肿瘤细胞与上述实施方式的肿瘤细胞培养物混合，得到待移植物。
在其中一个实施例中，S110包括：将肿瘤细胞与添加有活性组分的细胞培养基混合，加入生物凝胶，得到待移植物。需要说明的是，若肿瘤细胞培养物不含有生物凝胶时，可以将肿瘤细胞与添加有活性组分的细胞培养基混合后，外源添加生物凝胶混合，得到待移植物。
在其中一个实施例中，肿瘤细胞和生物凝胶的体积比为1:1～2:1。此种设置有利于提高PDX模型的构建成功率。
在其中一个实施例中，肿瘤细胞为肿瘤组织。进一步地，S110包括：将肿瘤组织剪碎后，与肿瘤细胞培养物混合，得到待移植物。更进一步地，将肿瘤组织剪碎至体积为0.1mm3～1mm3的肿瘤块后，与肿瘤细胞培养物混合，得到待移植物。具体地，肿瘤组织为临床肿瘤组织。
更进一步地，将肿瘤组织剪碎至2mm×2mm左右大小后，与肿瘤细胞培养物混合，得到待移植物。具体地，肿瘤组织为临床肿瘤组织。
需要说明的是，肿瘤组织为临床肿瘤组织时，在S110包括：将取下的肿瘤组织用PBS冲洗干净，与添加有活性组分的细胞培养基混合，再加入生物凝胶和调节物，得到待移植物。
需要说明的是，肿瘤细胞不限于为肿瘤组织，也可以为市售的肿瘤细胞。
S120、将待移植物移植入模式动物体内，正常饲养，得到PDX模型。
在其中一个实施例中，模式动物为小鼠。进一步地，模式动物为荷瘤小鼠。更进一步地，模式动物为免疫缺陷小鼠。具体地，模式动物为裸鼠。更具体地，模式动物为4周龄～8周龄、18g～22g的裸鼠。需要说明的是，免疫缺陷越严重的老鼠，成瘤率越高，越易成瘤。
在其中一个实施例中，移植的方式为皮下移植或者肾包膜移植。需要说明的是，移植的方式不限于上述指出的方式，也可以为其他移植方式，可以根据需要选择适合的移植方式。
在其中一个实施例中，S120包括：将待移植物移植入模式动物体内，正常饲养，形成体积在100mm3以上的肿瘤，得到PDX模型。
上述实施方式的PDX模型构建的方法中，采用上述实施方式的肿瘤细胞培养物，能够较好地保持肿瘤细胞的活性，促进肿瘤细胞的生长，PDX模型的构建成功率较高。
以下为具体实施例部分：
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
肝癌PDX模型的构建过程
1、实验分组：实验共分为9组，分别为测试组1～9。每组10只裸鼠(5周龄～6周龄、20g左右)。
2、每组实验所用的肿瘤细胞培养物的组成如下：
测试组1：肿瘤培养组合物包括：细胞培养基、添加于细胞培养基的活性组分、生物凝胶和调节物，细胞培养基包括10mmol/L、pH为6.8的HEPES缓冲液、1mmol/L的谷氨酰胺、1000mg/L的碳酸氢钠、1000mg/L的葡萄糖和0.1mmol/L的丙酮酸钠。活性组分包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子的终浓度为2ng/mL，血管内皮生长因子的终浓度为10ng/mL，干细胞因子的终浓度为10ng/mL，层粘连蛋白的终浓度为12ng/mL，表皮细胞生长因子的终浓度为5ng/mL。生物凝胶为温度敏感型凝胶，生物凝胶与细胞培养基的体积比为1:2。调节物为乳酸。调节物的终浓度为25μmol/L。
测试组2：测试组2的肿瘤细胞培养物的组成与测试组1的大致相同，不同之处在于，细胞培养基包括50mmol/L、pH为7.8的HEPES缓冲液、10mmol/L的谷氨酰胺、5000mg/L的碳酸氢钠、5000mg/L的葡萄糖和5mmol/L的丙酮酸钠。成纤维细胞生长因子的终浓度为30ng/mL，血管内皮生长因子的终浓度为50ng/mL，干细胞因子的终浓度为50ng/mL，层粘连蛋白的终浓度为52ng/mL，表皮细胞生长因子的终浓度为50ng/mL。生物凝胶与细胞培养基的体积比为2:1。调节物为乳酸钠。调节物的终浓度为100μmol/L。
测试组3：测试组3的肿瘤细胞培养物的组成与测试组1的大致相同，不同之处在于，细胞培养基包括30mmol/L、pH为7.3的HEPES缓冲液、6mmol/L的谷氨酰胺、3000mg/L的碳酸氢钠、3000mg/L的葡萄糖和2.5mmol/L的丙酮酸钠。成纤维细胞生长因子的终浓度为15ng/mL，血管内皮生长因子的终浓度为30ng/mL，干细胞因子的终浓度为30ng/mL，层粘连蛋白的终浓度为30ng/mL，表皮细胞生长因子的终浓度为30ng/mL。生物凝胶与细胞培养基的体积比为1:1。调节物为乳酸。调节物的终浓度为70μmol/L。
测试组4：测试组4的肿瘤细胞培养物的组成与测试组1的大致相同，不同之处在于，活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和必需氨基酸，胰岛素的终浓度为0.5mg/mL，转铁蛋白的终浓度为5μg/mL，维生素C的终浓度为10μg/mL，牛血清白蛋白的终浓度为10μg/mL，非必需氨基酸的终浓度为20ng/mL，非必需氨基酸为丙氨酸。必需氨基酸的终浓度为10mmol/L，必需氨基酸为色氨酸。
测试组5：测试组5的肿瘤细胞培养物的组成与测试组2的大致相同，不同之处在于，活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和蛋氨酸，胰岛素的终浓度为5mg/mL，转铁蛋白的终浓度为50μg/mL，维生素C的终浓度为50μg/mL，牛血清白蛋白的终浓度为50μg/mL，非必需氨基酸的终浓度为100ng/mL，非必需氨基酸为谷氨酸。必需氨基酸的终浓度为50mmol/L，必需氨基酸为赖氨酸。
测试组6：测试组6的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和蛋氨酸，胰岛素的终浓度为3mg/mL，转铁蛋白的终浓度为30μg/mL，维生素C的终浓度为30μg/mL，牛血清白蛋白的终浓度为30μg/mL，非必需氨基酸的终浓度为70ng/mL，非必需氨基酸为天门冬氨酸。必需氨基酸的终浓度为30mmol/L，必需氨基酸为蛋氨酸。
测试组7：测试组7的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，细胞培养基为Gibco IMDM培养基(购于赛默飞世尔公司)。
测试组8：测试组8的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，活性组分由成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子构成。成纤维细胞生长因子的终浓度为15ng/mL。表皮细胞生长因子的终浓度为30ng/mL。
测试组9：测试组9的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，测试组9的肿瘤细胞培养物不含有活性组分。
3、肝癌PDX模型的构建过程如下：
(1)收集肝癌V期患者基本的临床资料，并得到知情同意书；手术切除后得到离体的肿瘤组织，PBS冲洗一次，迅速放到已准备好的添加有活性组分的细胞培养基中，冰上运输并快速送往动物移植手术台上，取出肿瘤组织并转移到新鲜的添加有活性组分的细胞培养基中，去除多余的脂肪等附带组织，得到肿瘤处理物，肿瘤处理物中肿瘤组织与生物凝胶的质量比为1:1。其中，肿瘤组织的实物图详见图1。
(2)将肿瘤处理物中的肿瘤组织切成0.5mm3的小块，加入生物凝胶和调节物混合，得到待移植物。将待移植物转到动物放移植手术台上，对裸鼠进行麻醉后，左侧卧，在右肾处剪开皮肤和肌肉，暴露右肾，用眼科剪在肾的一段(即肾表面的一部分包膜)剪开一个小口，换成钝性镊子从小口处往里挖成一个小洞，再用镊子把待移植物移进小洞内部，退出镊子，把肾脏放回老鼠体内，缝合好伤口，小鼠放在红外治疗灯下苏醒，回笼，正常饮食饲养7天，每天观察肿瘤生长情况。
4、测试：
(1)将移植肿瘤后的小鼠正常饲养至7天时，对测试组1的小鼠进行拍照，得到测试组1移植肿瘤后小鼠的成瘤图，详见图2。图2为实施例1中测试组1移植肿瘤后小鼠的成瘤图。
从图2可以看出，将移植肿瘤后的小鼠正常饲养至7天后，小鼠身体上形成明显的肿块，说明肝癌细胞在小鼠体内正常的繁殖和生长。
(2)将移植肿瘤后的小鼠正常饲养至7天时，取出肿瘤并测定肿瘤的体积，若肿瘤体积不小于100mm3，则说明PDX模型构建成功。根据每组中各小鼠的肿瘤体积计算每组小鼠的肿瘤的平均值，并计算每组小鼠的PDX模型成功率。检测结果详见表1。
表1实施例1的测试组1～9的PDX模型的构建成功率
成功率(％)
测试组1 60.1
测试组2 63.5
测试组3 75.3
测试组4 70.5
测试组5 70.1
测试组6 80.2
测试组7 70.7
测试组8 53.9
测试组9 40.1
从表1可以看出，测试组1～7的肝癌PDX模型的成功率为60％～80％，明显优于测试组8～9，说明采用上述实施方式的肿瘤细胞培养物进行PDX模型构建的成功率较高。
实施例2
结直肠癌PDX模型的构建过程
1、实验分组：实验共分为9组，分别为测试组1～9。每组10只裸鼠(5周龄～6周龄、20g左右)。
2、每组实验所用的肿瘤细胞培养物的组成如下：
测试组1：肿瘤培养组合物包括：细胞培养基、添加于细胞培养基的活性组分、生物凝胶和调节物，细胞培养基包括10mmol/L、pH为6.8的HEPES缓冲液、1mmol/L的谷氨酰胺、1000mg/L的碳酸氢钠、1000mg/L的葡萄糖和0.1mmol/L的丙酮酸钠。活性组分包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，成纤维细胞生长因子的终浓度为2ng/mL，血管内皮生长因子的终浓度为10ng/mL，干细胞因子的终浓度为10ng/mL，层粘连蛋白的终浓度为12ng/mL，表皮细胞生长因子的终浓度为5ng/mL。生物凝胶为温度敏感型凝胶，生物凝胶与细胞培养基的体积比为1:2。调节物为乳酸。调节物的终浓度为25μmol/L。
测试组2：测试组2的肿瘤细胞培养物的组成与测试组1的大致相同，不同之处在于，细胞培养基包括50mmol/L、pH为7.8的HEPES缓冲液、10mmol/L的谷氨酰胺、5000mg/L的碳酸氢钠、5000mg/L的葡萄糖和5mmol/L的丙酮酸钠。成纤维细胞生长因子的终浓度为30ng/mL，血管内皮生长因子的终浓度为50ng/mL，干细胞因子的终浓度为50ng/mL，层粘连蛋白的终浓度为52ng/mL，表皮细胞生长因子的终浓度为50ng/mL。生物凝胶与细胞培养基的体积比为2:1。调节物为乳酸钠。调节物的终浓度为100μmol/L。
测试组3：测试组3的肿瘤细胞培养物的组成与测试组1的大致相同，不同之处在于，细胞培养基包括30mmol/L、pH为7.3的HEPES缓冲液、6mmol/L的谷氨酰胺、3000mg/L的碳酸氢钠、3000mg/L的葡萄糖和2.5mmol/L的丙酮酸钠。成纤维细胞生长因子的终浓度为15ng/mL，血管内皮生长因子的终浓度为30ng/mL，干细胞因子的终浓度为30ng/mL，层粘连蛋白的终浓度为30ng/mL，表皮细胞生长因子的终浓度为30ng/mL。生物凝胶与细胞培养基的体积比为1:1。调节物为乳酸。调节物的终浓度为70μmol/L。
测试组4：测试组4的肿瘤细胞培养物的组成与测试组1的大致相同，不同之处在于，活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和必需氨基酸，胰岛素的终浓度为0.5mg/mL，转铁蛋白的终浓度为5μg/mL，维生素C的终浓度为10μg/mL，牛血清白蛋白的终浓度为10μg/mL，非必需氨基酸的终浓度为20ng/mL，非必需氨基酸为丙氨酸。必需氨基酸的终浓度为10mmol/L，必需氨基酸为色氨酸。
测试组5：测试组5的肿瘤细胞培养物的组成与测试组2的大致相同，不同之处在于，活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和蛋氨酸，胰岛素的终浓度为5mg/mL，转铁蛋白的终浓度为50μg/mL，维生素C的终浓度为50μg/mL，牛血清白蛋白的终浓度为50μg/mL，非必需氨基酸的终浓度为100ng/mL，非必需氨基酸为谷氨酸。必需氨基酸的终浓度为50mmol/L，必需氨基酸为赖氨酸。
测试组6：测试组6的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和蛋氨酸，胰岛素的终浓度为3mg/mL，转铁蛋白的终浓度为30μg/mL，维生素C的终浓度为30μg/mL，牛血清白蛋白的终浓度为30μg/mL，非必需氨基酸的终浓度为70ng/mL，非必需氨基酸为天门冬氨酸。必需氨基酸的终浓度为30mmol/L，必需氨基酸为蛋氨酸。
测试组7：测试组7的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，细胞培养基为Gibco IMDM培养基(购于赛默飞世尔公司)。
测试组8：测试组8的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，活性组分由成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子构成。成纤维细胞生长因子的终浓度为15ng/mL。表皮细胞生长因子的终浓度为30ng/mL。
测试组9：测试组9的肿瘤细胞培养物的组成与测试组3的大致相同，不同之处在于，测试组9的肿瘤细胞培养物不含有活性组分。
3、结直肠癌PDX模型的构建过程如下：
(1)收集结直肠癌V期患者基本的临床资料，并得到知情同意书；手术切除后得到离体的肿瘤组织，PBS冲洗一次，迅速放到已准备好的添加有活性组分的细胞培养基中，冰上运输并快速送往动物移植手术台上，取出肿瘤组织并转移到新鲜的添加有活性组分的细胞培养基中，去除多余的脂肪等附带组织，得到肿瘤处理物，肿瘤处理物中肿瘤组织与生物凝胶的质量比为1:1。
(2)将肿瘤处理物中的肿瘤组织切成0.5mm3的小块，加入生物凝胶和调节物混合，得到待移植物。将待移植物转到动物放移植手术台上，对裸鼠进行麻醉后，仰卧位固定，选择小鼠右侧腋窝下进行移植。具体地，用酒精棉球擦拭小鼠右侧腋窝处的毛发和皮肤，用剪刀剪开皮肤，钝性眼科镊从口里进去，左右滑动形成一个洞窝，用镊子将待移植物夹进小洞内，退出镊子，缝合好伤口，小鼠放在红外治疗灯下苏醒，回笼，正常饮食饲养7天，每天观察肿瘤生长情况。
4、测试：
(1)将移植肿瘤后的小鼠正常饲养至7天时，对测试组1的小鼠进行拍照，得到测试组1移植肿瘤后小鼠的成瘤图，详见图3。图3为实施例2中测试组1移植肿瘤后小鼠的成瘤图。
从图3可以看出，将移植肿瘤后的小鼠正常饲养至7天后，小鼠身体上形成明显的肿块，说明结肠癌肿瘤细胞在小鼠体内正常的繁殖和生长。
(2)将移植肿瘤后的小鼠正常饲养至7天时，取出肿瘤并测定肿瘤的体积，若肿瘤体积不小于100mm3，则说明PDX模型构建成功。根据每组中各小鼠的肿瘤体积计算每组小鼠的肿瘤的平均值，并计算每组小鼠的PDX模型成功率。检测结果详见表2。
表2实施例2的测试组1～4的PDX模型的构建成功率
成功率(％)
测试组1 57.8
测试组2 55.6
测试组3 68.7
测试组4 61.1
测试组5 60.9
测试组6 73.3
测试组7 62.9
测试组8 42.1
测试组9 31.7
从表2可以看出，测试组1～7的肝癌PDX模型的成功率为55％～75％，明显优于测试组8～9，说明采用上述实施方式的肿瘤细胞培养物进行PDX模型构建的成功率较高。
综上所述，上述实施方式的肿瘤细胞培养物能够使离体后的肿瘤细胞保持活性，能够有效地促进肿瘤细胞的生长，PDX模型的构建成功率较高，能够用于肝癌细胞、肺癌细胞或肠癌细胞等多种肿瘤细胞的培养，以构建针对不同肿瘤细胞的PDX模型，进而对个体化治疗提供合适的模式动物。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种肿瘤细胞培养物，其特征在于，包括细胞培养基及添加于所述细胞培养基的活性组分，所述活性组分包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子、层粘连蛋白及表皮细胞生长因子，所述成纤维细胞生长因子的终浓度为2ng/mL～30ng/mL，所述血管内皮生长因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL，所述干细胞因子的终浓度为10ng/mL～50ng/mL，所述层粘连蛋白的终浓度为12ng/mL～52ng/mL，所述表皮细胞生长因子的终浓度为5ng/mL～50ng/mL。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，所述活性组分还包括胰岛素、转铁蛋白、维生素C、牛血清白蛋白、非必需氨基酸和必需氨基酸，所述胰岛素的终浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，所述转铁蛋白的终浓度为5μg/mL～50μg/mL，所述维生素C的终浓度为10μg/mL～50μg/mL，所述牛血清白蛋白的终浓度为10μg/mL～50μg/mL，所述非必需氨基酸的终浓度为20ng/mL～100ng/mL，所述必需氨基酸的终浓度为10mmol/L～50mmol/L。
3.根据权利要求2所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，所述非必需氨基酸选自丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟谷氨酸、瓜氨酸及天门冬氨酸中的至少一种；
及/或，所述必需氨基酸选自赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及苏氨酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，所述细胞培养基包括终浓度为10mmol/L～50mmol/L且pH为6.8～7.8的缓冲液、终浓度为1mmol/L～10mmol/L的谷氨酰胺、终浓度为1000mg/L～5000mg/L的碳酸氢钠、终浓度为1000mg/L～5000mg/L的葡萄糖和终浓度为0.1mmol/L～5mmol/L的丙酮酸钠。
5.根据权利要求1～4任一项所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，还包括生物凝胶，所述生物凝胶为温敏感型凝胶。
6.根据权利要求5所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，所述生物凝胶与所述细胞培养基的体积比为1:2～2:1。
7.根据权利要求5所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，所述肿瘤细胞培养物的pH为2～5。
8.根据权利要求5所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，还包括调节物，所述调节物选自乳酸及乳酸钠中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的肿瘤细胞培养物，其特征在于，所述调节物的终浓度为25μmol/L～100μmol/L。
10.权利要求1～9任一项所述的肿瘤细胞培养物在培养肿瘤细胞或者构建PDX模型中的应用。
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