CN108865991A - 一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺 - Google Patents

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罗文峰
唐郁宽
陈汉威
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Abstract

本发明涉及干细胞培养基制备，具体是指一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺，由以下配比的成分组成：10ml DMEM/F12培养基、2ml胎牛血清、300μl非必须氨基酸、300μl L‑谷氨酰胺、200ng血管细胞粘附分子‑1、250ng肿瘤坏死因子α、200ng白介素‑6；本发明的目的在于提供一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺，该培养基有VCAM1、TNFα、IL‑6等引起糖尿病足的特异性炎症因子，在该培养基中间充质干细胞能存活，并进行细胞传代、细胞超低温冻存，对干细胞及外泌体在糖尿病足炎症微环境中的体外研究有重要意义。

Description

一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺
技术领域
本发明涉及干细胞培养基制备，具体是指一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺。
背景技术
糖近年来随着人口老龄化的加剧以及人们饮食结构的改变，糖尿病的发病率快速上升，全世界糖尿病患者已超过4.15亿，其中中国拥有将近1亿糖尿病患者，由于糖尿病引发的下肢缺血性疾病(俗称“糖尿病足”)可导致截肢，甚至危及生命，有报道称，15％的糖尿病患者会出现糖尿病足，糖尿病足截肢率约25-50％，其截肢率是正常人的40倍，5年生存率约50％，因此糖尿病足越来越引起人们的关注。
糖尿病下肢血管病变是个复杂的病理生理过程，与多种因素有关，但发病机制尚未完全阐明，其中多数研究支持糖尿病足是一种慢性低度炎症状态的假说，研究表明，血管细胞黏附分子1(VCAM1)等炎症因子水平升高与难愈性糖尿病足(DF)发生、发展有直接关系，报道多因素logistic回归分析显示VCAM1、TNFα、FIB和Neu％为DF发生的独立风险因素，报道DF患者外周血清中ICAM-1、VCAM-1的表达程度明显升高，促进了糖尿病足的发生发展，在临床治疗过程中监测ICAM-1和VCAM-1炎症因子浓度的变化，为改善DF的治疗提供一定的帮助。
糖尿病足患者会出现血管形成能力受限，下肢持续反复感染，难愈性溃疡等情况，目前对于糖尿病足还缺少有效的治疗方法,所以研究糖尿病足的发病机制，并寻找一种精准、安全有效治疗新方法成为日益迫切的需要。
近年来，干细胞(StemCells)移植术发展迅速，在多种疾病的治疗试验中取得突破性的进展，得到越来越多的关注，由于干细胞具有自我增殖以及分化的潜能，使其成为目前再生医学研究领域用来作为种子细胞来源的首选，应用干细胞移植治疗糖尿病足也逐渐兴起，在一定的诱导条件下,间充质干细胞能分化为血管内皮前体细胞(EPCs)，EPCs迁移、增殖分化形成新生血管网，从而加强下肢动脉血供，改善缺血部位循环，促进局部血管组织再生。
但目前研究糖尿病足炎症微环境对干细胞的影响的报道不多，体外细胞研究干细胞在糖尿病足炎症微环境中的作用更少，直接原因是缺乏合适的干细胞培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺，该培养基有VCAM1、TNFα、IL-6等引起糖尿病足的特异性炎症因子，在该培养基中间充质干细胞能存活，并进行细胞传代、细胞超低温冻存，对干细胞及外泌体在糖尿病足炎症微环境中的体外研究有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺，由以下配比的成分组成：10mlDMEM/F12培养基、2ml胎牛血清、300μl非必须氨基酸、300μlL-谷氨酰胺、200ng血管细胞粘附分子-1、250ng肿瘤坏死因子α、200ng白介素-6。
作为改进，具体包括以下步骤：1)用移液管或移液枪精密量取由以下配比的成分组成：10ml DMEM/F12培养基、2ml胎牛血清、300μl非必须氨基酸、300μl L-谷氨酰胺、200ng血管细胞粘附分子-1、250ng肿瘤坏死因子α、200ng白介素-6，置于同一20ml试管中；
2)将步骤1)中的试管于自动涡旋器上涡旋10min，使成分充分混合；
3)将步骤2)中充分混合后的成分放入培养皿中并在4°的冰箱中冻存；
作为改进，所述的DMEM/F12培养基采用的配比组成为Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F12的比例为1:1。
本发明的有益效果是：该培养基包含对糖尿病足炎症微环境特异性高、代表性强的炎症因子，减少了其他与糖尿病足炎症微环境相关性不大的因子的干扰，从而减少了在研究干细胞对糖尿病足治疗的机制期间不必要的干扰条件；该培养基能保障间充质干细胞存活，不破坏间充质干细胞正常结构，并可进行细胞传代、细胞超低温冻存，为进一步研究干细胞治疗糖尿病足的机制提供了良好的体外环境；该培养基相容性良好，混合后各种有效成分稳定，酸碱度合适，无相互排斥，且剂量可控，操作简单；采用该培养基培养的间充质干细胞具有良好的活力，可进行干细胞分泌各种细胞因子、外泌体的研究；干细胞抑制炎症及调节免疫的研究、干细胞治疗糖尿病足的机制研究等体外研究；采用该培养基培养的间充质干细胞注入动物模型后，能充分模拟在糖尿病足炎症微环境的动物体内环境，并进行相关实验。
附图说明
图1是本发明一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的流程图。
具体实施方式
下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。
实施例一
用移液管或移液枪精密量取10ml DMEM/F12培养基、2ml胎牛血清、300μl非必须氨基酸、300μl L-谷氨酰胺、200ng血管细胞粘附分子-1、250ng肿瘤坏死因子α、200ng白介素-6，置于同一20ml试管中；将试管于自动涡旋器上涡旋10min，使成分充分混合；将充分混合后的成分放入培养皿中并在4°的冰箱中冻存；根据细胞数量、存活率，用该培养基调整细胞接种密度为1.0×104个活细胞/cm2，将细胞悬液加入培养瓶中，轻轻摇晃使细胞均匀分布；在培养器瓶上做好标记，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养。观察细胞状态，隔天换液；当细胞汇合度达到80-90％时，可进行传代处理。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺，其特征在于，由以下配比的成分组成：10ml DMEM/F12培养基、2ml胎牛血清、300μl非必须氨基酸、300μl L-谷氨酰胺、200ng血管细胞粘附分子-1、250ng肿瘤坏死因子α、200ng白介素-6。
2.根据权利要求1所述的一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：1)用移液管或移液枪精密量取10ml DMEM/F12培养基、2ml胎牛血清、300μl非必须氨基酸、300μl L-谷氨酰胺、200ng血管细胞粘附分子-1、250ng肿瘤坏死因子α、200ng白介素-6，置于同一20ml试管中；
2)将步骤1)中的试管于自动涡旋器上涡旋10min，使成分充分混合；
3)将步骤2)中充分混合后的成分放入培养皿中并在4°的冰箱中冻存。
3.根据权利要求1所述的一种模拟糖尿病足炎症微环境的培养基的制备工艺，其特征在于，所述的DMEM/F12培养基采用的配比组成为Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F12的比例为1:1。
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