CN110195038A - 一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法。其包括间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，该方法不仅可提高外泌体产量，而且所得到的外泌体具有纯度高、粒径适当等特点。该方法操作简单、成本低，适合大量提取外泌体，有利于临床应用，对应用间充质干细胞外泌体治疗临床疾病有重大意义。

Description

一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法。
背景技术
外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清中，是细胞核内体(也称多囊泡体)与细胞膜融合后释放到细胞外的直径为30-150nm，密度为1.10～1.18g/ml的膜性囊泡。外泌体可以通过向靶细胞运输各种生物活性分子如蛋白质、mRNA和miRNA等方式改变靶细胞的基因调控网络[5]。
胎盘间充质干细胞的外泌体(MSC exosomes)可以增强血管再生，对缺血性疾病的治疗有奇异的效果。间充质干细胞的外泌体可以激活VEGF的受体，可加速下肢缺血组织的恢复。miR-320调控内皮生长因子(VEGF),成纤维生长因子(FGF)产生以干预糖尿病血管内皮细胞凋亡。[6]Prakash等[7]报道干细胞外泌体通过miRNA-210-3p刺激VEGF受体基因高表达及激活SRC,AKT,ERK等促血管生成通路，以起到大量分泌VEGF，最终改善微循环。
现有间充质干细胞来源的外泌体可以通过收集间充质干细胞上清来获取，主要提取方法有超速离心法、凝胶色谱法、超滤法、免疫磁珠法和试剂盒提取法。
干细胞分泌的外泌体(Exosomes)作用巨大，但尚未大规模应用临床，主要原因是其产量低下，无法满足临床应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法。该方法不仅可提高外泌体产量，而且所得到的外泌体具有纯度高、粒径适当等特点。该方法操作简单、成本低，适合大量提取外泌体，有利于临床应用，对应用间充质干细胞外泌体治疗临床疾病有重大意义。
本发明所采用的技术方案为：一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法，其包括
间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，其具体步骤如下：
步骤一：脐带间充质干细胞培养基配比如下：100ml DMEM/F12培养基+2ml非必须氨基酸+2ml L-谷氨酰胺+2ug VCAM1试剂；
步骤二：从低温容器中取出间充质干细胞(MSC)，迅速置于37℃水浴中连续晃动，1分钟内快速解冻；
步骤三：无菌条件下，将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml细胞培养基的离心管中；1500rpm离心5分钟，吸弃离心后上清；
步骤四：加入适量的新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数及活率检测；
步骤五：根据细胞数量及活率，用培养基调整细胞接种密度为1.0×105个活细胞/cm2，将细胞悬液加入培养器皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布；在培养器皿上做好标记，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养；
步骤六：观察细胞状态，隔天换液；当细胞汇合度达到80-90％时，可进行传代处理；
步骤七：在4℃下进行外泌体分离：48小时后提取细胞上清离心，分别应用1500rpm离心5分钟，2000g离心10分钟，10000g离心20分钟；
步骤八：最后，通过Beckman Coulter超速离心机Type 70Ti转子以100000g超速离心120分钟来分离外泌体。收集沉淀的外泌体，并重悬于无菌PBS中；
步骤九：随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化外泌体。将外泌体储存在-80℃。
本发明所述的提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法在糖尿病足中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提出应用VCAM1提高外泌体产量，以及经过多次试验后提出其加入的含量。加入2ug VCAM1试剂后，外泌体产量显著提升10倍以上。
本发明相比传统超速离心法，本发明提出采用100000g超速离心120分钟来分离外泌体，该离心速度及时间收集的外泌体纯度较高，且不会引起外泌体破裂。
应用该方法所产生的外泌体绝大多数粒径介于30-150nn之间，粒径分布与传统制备方法相比，粒径更加接近国际上定义的标准。
该方法操作比凝胶色谱法等方法简单。
该方法相比试剂盒方法价格低，适合大量提取外泌体。
附图说明
图1为采用该方法提取80ml细胞上清离心后重悬于无菌100ulPBS中(放大39000)观察图。
图2为采用该方法提取80ml细胞上清离心后重悬于无菌100ulPBS中(放大65000倍)观察图。
图3为采用该方法提取40ml细胞上清离心后重悬于无菌400ulPBS中，再稀释100倍检测液体的浓度及粒径分布图。
图4为本发明的整体结构流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法，其包括
间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，其具体步骤如下：
步骤一：脐带间充质干细胞培养基配比如下：100ml DMEM/F12培养基+2ml非必须氨基酸+2ml L-谷氨酰胺+2ug VCAM1试剂；
步骤二：从低温容器中取出间充质干细胞(MSC)，迅速置于37℃水浴中连续晃动，1分钟内快速解冻；
步骤三：无菌条件下，将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml细胞培养基的离心管中；1500rpm离心5分钟，吸弃离心后上清；
步骤四：加入适量的新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数及活率检测；
步骤五：根据细胞数量及活率，用培养基调整细胞接种密度为1.0×105个活细胞/cm2，将细胞悬液加入培养器皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布；在培养器皿上做好标记，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养；
步骤六：观察细胞状态，隔天换液；当细胞汇合度达到80-90％时，可进行传代处理；
步骤七：在4℃下进行外泌体分离：48小时后提取细胞上清离心，分别应用1500rpm离心5分钟，2000g离心10分钟，10000g离心20分钟；
步骤八：最后，通过Beckman Coulter超速离心机Type 70Ti转子以100000g超速离心120分钟来分离外泌体。收集沉淀的外泌体，并重悬于无菌PBS中；
步骤九：随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化外泌体。将外泌体储存在-80℃。
本发明临床应用及科学研究，适用于所有疾病的外泌体治疗，特别是糖尿病足。
本发明提出应用VCAM1提高外泌体产量，以及经过多次试验后提出其加入的含量。加入2ug VCAM1试剂后，外泌体产量显著提升10倍以上。
本发明相比传统超速离心法，本发明提出采用100000g超速离心120分钟来分离外泌体，该离心速度及时间收集的外泌体纯度较高，且不会引起外泌体破裂。
应用该方法所产生的外泌体绝大多数粒径介于30-150nn之间，粒径分布与传统制备方法相比，粒径更加接近国际上定义的标准。
该方法操作比凝胶色谱法等方法简单。
该方法相比试剂盒方法价格低，适合大量提取外泌体。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的。

Claims (2)

1.一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法，其特征在于：包括
间充质干细胞培养和干细胞外泌体提取，其具体步骤如下：
步骤一：脐带间充质干细胞培养基配比如下：100ml DMEM/F12培养基+2ml非必须氨基酸+2ml L-谷氨酰胺+2ug VCAM1试剂；
步骤二：从低温容器中取出间充质干细胞(MSC)，迅速置于37℃水浴中连续晃动，1分钟内快速解冻；
步骤三：无菌条件下，将完全解冻的细胞悬液转移至含有10ml细胞培养基的离心管中；1500rpm离心5分钟，吸弃离心后上清；
步骤四：加入适量的新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数及活率检测；
步骤五：根据细胞数量及活率，用培养基调整细胞接种密度为1.0×105个活细胞/cm2，将细胞悬液加入培养器皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布；在培养器皿上做好标记，转移至5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养；
步骤六：观察细胞状态，隔天换液；当细胞汇合度达到80-90％时，可进行传代处理；
步骤七：在4℃下进行外泌体分离：48小时后提取细胞上清离心，分别应用1500rpm离心5分钟，2000g离心10分钟，10000g离心20分钟；
步骤八：最后，通过Beckman Coulter超速离心机Type 70Ti转子以100000g超速离心120分钟来分离外泌体。收集沉淀的外泌体，并重悬于无菌PBS中；
步骤九：随后通过蔗糖梯度离心进一步纯化外泌体。将外泌体储存在-80℃。
2.根据权利要求1所述的一种提高间充质干细胞外泌体产量的制备方法，其特征在于：利用权利要求1的制备方法在糖尿病足中的应用。
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