CN107006452A - 一种人脐带间充质干细胞源外泌体冻干保存方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞源外泌体的冻干保存方法及其应用，所述方法为：取所得100重量份的外泌体，加入1～15重量份的甘露醇，0.1‑1重量份的丝胶蛋白，混匀，过滤，再放置于‑50～‑80℃的温度下保存；然后进行冻干处理，得到人间充质干细胞源外泌体冻干粉。本发明所述冻干粉采用甘露醇作为冷冻保护剂，可以很好地保持人间充质干细胞源外泌体的形态和生物活性，而且具有良好的长期稳定性；具有极大的市场前景和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞源外泌体的冻干保存方法及其应用。
背景技术
外泌体是一种纳米级具有膜结构的囊泡样小体，可以来源于多种不同的细胞，包括肥大细胞、树突状细胞、B淋巴细胞、神经元、脂肪细胞、内皮细胞和上皮细胞等等。特别地，医学界已经证明，肿瘤细胞会比正常细胞产生和分泌更多数量的外泌体。外泌体已经在大部分的体液中被发现，不管是处于健康状态或者患病状态，包括血液、羊水、尿液、恶性腹水、脑脊液、乳汁、唾液、淋巴和胆汁等。
外泌体最早在1987年由Johnstone等人在研究网织红细胞向红细胞的成熟过程中发现。他们注意到，这些囊泡(后来命名：外泌体)来源于所培养的单层细胞，并保留了转铁蛋白受体和许多膜相关蛋白。起初，人们认为外泌体只是一种“细胞垃圾”，是细胞为了去除不必要的蛋白质和其他分子而释放出来的。不过，到了上世纪90年代中期，科学家们认识到了外泌体的免疫功能。进一步研究表明，外泌体作为一种细胞间通讯方式，在正常生理过程中，以及重要的生物学过程，例如哺乳、炎症、细胞增殖、免疫反应和神经功能等，有着非常重要的角色。
不同细胞来源、不同培养条件，以及不同分离方式收集得到的外泌体，包含不同种类的蛋白质、脂肪和mRNA等，不但直接影响到其生物活性的多样化，而且也对保存方式提出了不同的实际要求。因此，有必要针对一种新型的人间充质干细胞源外泌体开发一种有效的冻干保存方法。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术的空白瓶颈，从而提出一种人脐带间充质干细胞源外泌体的冻干保存方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明公开了一种人脐带间充质干细胞源外泌体的冻干保存方法，步骤如下：
取所得100重量份的外泌体，加入1～15重量份的甘露醇，0.1-1重量份的丝胶蛋白，混匀，过滤，再放置于-50～-80℃的温度下保存；然后进行冻干处理，得到人间充质干细胞源外泌体冻干粉。
优选的，所述冻干处理的温度为-50℃，冻干时间为24h。
优选的，所述外泌体的外膜为磷脂双层结构，所述外泌体内部含有micro-RNA、所述外泌体源细胞的mRNA、DNA和核酸中的至少一种。
优选的，所述外泌体为MSC分化得到的；所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
优选的，所述外泌体的获取方法步骤如下：
a)对人间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；
b)对培养后的干细胞进行预处理；
c)在预处理后的培养基的上清液中提取所述人脐带间充质干细胞源外泌体。
优选的，所述所述预处理的具体步骤为：
1)将人传代MSC进行无血清悬浮培养，并调整细胞浓度为1.0×106/ml；
2)按照106/150mm大培养皿接种，培养至细胞融合度至70-80％，培养时间为2-3天；
3)吸除培养皿中的液体，并用alpha-MEM液体培养基对培养皿进行洗涤；
4)在150mm培养皿中再次加入20ml的alpha-MEM；
5)依次加入重组人干扰素、PDGF-BB和EPO；
7)在37℃，5％的CO2条件下培养96小时，收集得到MSC培养液。
优选的，所述MSC培养液中干扰素的浓度为10U/ml～600U/ml、PDGF-BB的浓度为2ng/ml～60ng/ml，EPO的浓度为0.1IU/ml～5IU/ml。
优选的，所述步骤2)的预处理的具体为：
1)取所述MSC培养液的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；
2)然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。
优选的，所述步骤3)具体为：
1)取容积为5体积份的离心管，加入1体积份的外泌体分离试剂；
2)加入4体积份的经过预处理后的上清液，充分混匀；
3)静置处理后，再进行两次离心处理，得到所述外泌体。
本发明还公开了任一项所述冻干保存方法在美容制剂的制备领域中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述冻干粉采用甘露醇作为冷冻保护剂冷冻干燥在低温下进行，可以很好地保持外泌体中的蛋白质、DNA、RNA等生物成分的活力，特别适用于美容制剂。
(2)在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，可以最大程度地保留外泌体的生物活性成分。
(3)在冷冻干燥过程中，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此能保持外泌体中的生物成分的原始性状。
(4)由于在冻结的状态下进行干燥，因此体积几乎不变，不会发生浓缩现象。
(5)干燥后的外泌体疏松多孔，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的性状，适合即用即配。
(6)由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化的物质得到了保护。
(7)干燥能排除95～99％以上的水份，使干燥后产品能长期保存而不致变质。
具体实施方式
实施例1本实施例公开了一种外泌体冻干粉的制备方法
取所得外泌体，加入1～15重量份的甘露醇，0.1-1重量份的丝胶蛋白，混匀，过滤(0.22μm)，分装，再放置于超低温冰箱(-80℃)10h。然后，在10Pa的真空度下进行冻干(-50℃，24h)，得到人间充质干细胞源外泌体冻干粉。
实施例2本实施公开了实施例1所述外泌体的制备流程：
一、人MSC的培养及预处理
1.材料及试剂
1)人脐带、胎盘、骨髓、脂肪或其它来源的MSC，传代次数在6代以内均可。
2)人MSC无血清培养基
3)alpha-MEM
4)重组人干扰素
5)重组人EPO
6)重组人PDGF-BB
7)培养皿(直径150mm)
8)其它耗材
本实施例公开了一种人脐带间充质干细胞源外泌体的冻干保存方法
2、细胞培养
1)将人传代MSC消化后计数，使用MSC无血清完全培养基悬浮，调整细胞浓度为1.0×106/ml。
2)按照106/150mm大培养皿接种，培养至细胞融合度至70-80％。一般需要2-3天。
3)吸除培养皿中的液体，并用alpha-MEM液体培养基对培养皿进行洗涤。
4)加入alpha-MEM 20ml/150mm培养皿。
5)首先加入重组人干扰素、PDGF-BB，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时；然后，再加入EPO，在37℃，5％的CO2条件下培养72小时。
干扰素(终浓度为10U/ml～600U/ml)、PDGF-BB(2ng/ml～60ng/ml)及EPO(0.1IU/ml～5IU/ml)。
7)37℃，5％CO2条件下培养96小时。
8)收集上清进行以下处理。如不能及时处理，将上清置于-80℃保存。
二、人MSC培养上清的预处理
1.材料与试剂
1)离心管等耗材。
2)孔径为1μm，0.45μm及0.22μm的滤器。
2.操作步骤
1)收集细胞培养上清，室温或4℃条件下离心2000g，10分钟，去除细胞碎片。
2)将培养上清或体液分别经过直径为1μm，0.45μm及0.22μm滤膜过滤，以去除其中可能存在的凋亡小体。
三、外泌体的收获
1)取50ml离心管，加入外泌体分离试剂10ml。或取250ml离心管，加入外泌体试剂50ml。
2)加入经过处理的细胞培养上清40ml，充分混匀。或加入培养上清200ml。
3)置于4℃过夜，或至少6小时。
4)离心，2000g，30分钟。
5)移除液体，再次离心，2000g，5分钟。
6)用pipette小心吸除残留液体。
7)加入PBS或生理盐水500μl至1ml。或加入PBS或生理盐水2.5ml至5ml。
8)测定蛋白质浓度，或进行流式细胞学等仪器分析。
实验例
实验例1流式细胞仪分析：
采用常规方法，检测在不同保存时间以后，外泌体的CD29及CD73表达。结果表明，在六个月之后，所得外泌体的CD29及CD73表达基本维持不变。这表明了，所用冻干保存方法可以有效地维持所得外泌体的生物活性。
2、进行内皮细胞增殖试验
采用常规方法，将脐带内皮细胞接种于MatriGel中，体系中加入不同成分(包括：DMEM培养基、1μg/ml外泌体、10μg/ml外泌体、50μg/ml外泌体、100μg/ml外泌体、b-成纤维细胞生长因子)，24小时后计管网结构数量。在六个月之后，实施例1所得的外泌体仍然保留良好的内皮细胞增殖活性。
对比例
对照组1取所得外泌体，加入海藻糖(10％)，混匀，过滤(0.22μm)，分装，再放置于超低温冰箱(-80℃)10h。然后，在10Pa的真空度下进行冻干(-50℃，24h)，得到人间充质干细胞源外泌体冻干粉，该方法为现有技术。
对照组2取所得外泌体，加入葡萄糖(10％)，混匀，过滤(0.22μm)，分装，再放置于超低温冰箱(-80℃)10h。然后，在10Pa的真空度下进行冻干(-50℃，24h)，得到人间充质干细胞源外泌体冻干粉，该方法为现有技术。
检测对照组1、对照组2中的外泌体的CD29及CD73表达。结果表明，在六个月之后，所得外泌体的CD29及CD73表达有明显的变化。这表明了，本技术方案，在人间充质干细胞源外泌体的冻干保存方面，优于对照组1和对照组2所得的冻干粉，即优于现有技术。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种人脐带间充质干细胞源外泌体的冻干保存方法，其特征在于，
取所得100重量份的外泌体，加入1～15重量份的甘露醇，0.1-1重量份的丝胶蛋白，混匀，过滤，再放置于-50～-80℃的温度下保存；然后进行冻干处理，得到人间充质干细胞源外泌体冻干粉。
2.如权利要求1所述的冻干保存方法，其特征在于，所述冻干处理的温度为-50℃，冻干时间为24h，压强为10Pa。
3.如权利要求2所述的冻干保存方法，其特征在于，所述外泌体的外膜为磷脂双层结构，所述外泌体内部含有micro-RNA、所述外泌体源细胞的mRNA、DNA和核酸中的至少一种。
4.如权利要求3所述的冻干保存方法，其特征在于，所述外泌体为MSC分化得到的；所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的冻干保存方法，其特征在于，所述外泌体的获取方法步骤如下：
a)对人间充质干细胞进行培养，培养阶段在细胞培养基中添加干扰素、EPO和PDGF-BB；
b)对培养后的干细胞进行预处理；
c)在预处理后的培养基的上清液中提取所述人脐带间充质干细胞源外泌体。
6.如权利要求5所述的冻干保存方法，其特征在于，其特征在于，所述所述预处理的具体步骤为：
1)将人传代MSC进行无血清悬浮培养，并调整细胞浓度为1.0×106/ml；
2)按照106/150mm大培养皿接种，培养至细胞融合度至70-80％，培养时间为2-3天；
3)吸除培养皿中的液体，并用alpha-MEM液体培养基对培养皿进行洗涤；
4)在150mm培养皿中再次加入20ml的alpha-MEM；
5)依次加入重组人干扰素、PDGF-BB和EPO；
7)在37℃，5％的CO2条件下培养96小时，收集得到MSC培养液。
7.如权利要求6所述的冻干保存方法，其特征在于，其特征在于，所述MSC培养液中干扰素的浓度为10U/ml～600U/ml、PDGF-BB的浓度为2ng/ml～60ng/ml，EPO的浓度为0.1IU/ml～5IU/ml。
8.如权利要求7所述的冻干保存方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤2)的预处理的具体为：
1)取所述MSC培养液的上清液，进行离心处理，去除细胞碎片；
2)然后将上清液滤膜过滤处理，去除凋亡小体，得到预处理后的上清液。
9.如权利要求8所述的外泌体的获取方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：
1)取容积为5体积份的离心管，加入1体积份的外泌体分离试剂；
2)加入4体积份的经过预处理后的上清液，充分混匀；
3)静置处理后，再进行两次离心处理，得到所述外泌体。
10.如权利要求1-9任一项所述冻干保存方法在美容制剂的制备领域中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170804 |