CN108042567A - 用于软骨修复的生物组合制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于软骨修复的生物组合制剂和应用。该生物组合制剂包括体积比为10～15∶1～10的尿液再生细胞的生理盐水混悬液与水凝胶；其中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为1×107～5×107个/mL；所述水凝胶为壳聚糖基水凝胶。该生物组合制剂能够适用于组织工程学技术进行软骨修复，且对软骨损伤的修复效果好，治疗省时、显效快。

Description

用于软骨修复的生物组合制剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物制剂，特别是涉及用于软骨修复的生物组合制剂及其应用。
背景技术
关节软骨损伤是引起关节疼痛或不适的关键因素，因软骨组织无血运供应，自愈能力非常有限，导致了疼痛的进行性加重及早期关节炎的发生。
目前已有多种治疗关节软骨损伤的方法，根据目的可分为非软骨修复型治疗和软骨修复型治疗两类。非软骨修复型治疗方法中，对于症状较轻的患者，有口服氨基葡萄糖；关节腔内注射玻璃酸钠、糖皮质激素药物；红外线治疗等治疗方法。均能达到缓解疼痛、延缓退行性病变的目的，但这些方法并未能从根本上解决引起疼痛的病因，随着时间的推移，软骨损伤仍会持续加重。然而，当关节软骨损伤较为严重时，解决患者疼痛的唯一方法是通过手术行人工关节置换，通过使用生物相容性及机械性能良好的金属假体置换关节面，以达到消除疼痛、切除病灶、恢复关节活动的目的。但该方法有相应的适应症和并发症，并不适合每一位软骨损伤的患者。
软骨修复型治疗方法中，包括微骨折技术、组织工程学技术、软骨及骨膜移植技术、基因治疗技术。其中微骨折技术是利用在软骨缺损区打孔释放的骨髓间充质干细胞、生长因子等形成显微血凝块，分化为纤维软骨组织，促进软骨再生。但临床观察发现，该技术进行修复的软骨其韧性和弹性均较透明软骨差。组织工程修复软骨需要具备足够数量的种子细胞，维持细胞表型特征的细胞因子，以及具备良好生物相容性、可无毒降解和孔隙率合适的三维支架。而种子细胞的选择中，脂肪干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞在促进软骨分化能力上已得到证实，但由于取材、培养技术及伦理方面等问题，未能得到广泛运用。自体软骨移植有利有弊，优点是不存在免疫排斥反应，缺点是低分化、低生物活性，且获取软骨细胞属于有创操作，易引起感染、术后疼痛等并发症，主要用于中小面积的软骨损伤。反之，异体骨膜移植来源充足，可修复较大面积的软骨损伤，但容易发免疫排斥反应。两种方法均限制了临床应用。基因治疗技术在软骨损伤中的应用目前仍停留在理论层面，基因的提取生和转染并在临床上成熟应用仍然在探索中。
发明内容
基于此，有必要提供一种用于软骨修复的生物组合制剂，该生物组合制剂能够适用于组织工程学技术进行软骨修复，且对软骨损伤的修复效果好，治疗省时、显效快。
一种用于软骨修复的生物组合制剂，包括体积比为10～15∶1～10的尿液再生细胞的生理盐水混悬液与水凝胶；
其中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为1×107～5×107个/mL；
所述水凝胶为壳聚糖基水凝胶。
在其中一个实施例中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液与水凝胶的体积比为10～12∶4～6；所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为2×107～4×107个/mL。
在其中一个实施例中，所述水凝胶为温敏性氯化壳聚糖/β-甘油磷酸钠基水凝胶。
在其中一个实施例中，所述水凝胶以氯化壳聚糖和β-甘油磷酸钠为原料，乙基纤维素为交联剂配制而成。
在其中一个实施例中，所述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
将氯化壳聚糖配制为1～5％w/v的氯化壳聚糖水溶液；
将β-甘油磷酸钠配制为5～15％w/v的β-甘油磷酸钠水溶液；
将羟乙基纤维素溶解于H-DMEM培养基中，配制为1～5％w/v的羟乙基纤维素溶液；
将所述氯化壳聚糖水溶液、β-甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液按照重体积比7～9:1～3:2～3混合，凝结，即可。
在其中一个实施例中，所述的用于软骨修复的生物组合制剂，还包括臭氧；所述臭氧与尿液再生细胞的生理盐水混悬液、水凝胶之间的体积比为1～10：10～15∶1～10；所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为1×107～5×107个/mL。
在其中一个实施例中，所述的用于软骨修复的生物组合制剂，还包括臭氧；所述臭氧与尿液再生细胞的生理盐水混悬液、水凝胶之间的体积比为4～6：10～12∶4～6；所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为2×107～4×107个/mL。
本发明还提供所述的用于软骨修复的生物组合制剂在制备治疗软骨修复的药物中的应用。
本发明的原理及优点如下：
区别于传统的干细胞治疗骨关节炎的方法，干细胞主要来源于人脐带、胎盘或羊膜的间充质干细胞，本发明用作种子细胞的尿液再生细胞来源于尿液。因尿液中存在一些从动物(包括人体)组织中脱落的细胞，可以提取出这些细胞，将它们重编程为尿液再生细胞，一种诱导性多能干细胞(iPS细胞)。鉴于iPS细胞能够分化为体内几乎任何一种类型的细胞，因此可将所产生的iPS细胞分化为不同研究所需的细胞。且除肾功能不全，透析和胆囊切除术患者之外，几乎任何性别、种族或年龄的个体的尿液均可成为种子细胞的来源，来源广泛。
支架则是种子细胞的载体，影响种子细胞的生物学行为和存活率。壳聚糖类水凝胶的主要组成壳聚糖，具有良好的生物相容性、微生物可降解性和促进伤口愈合的功效，能够广泛应用于生物医用领域。壳聚糖类水凝胶作为一种天然高分子材料由于其来源于自然，具有的生物可降解性、无毒、来源广泛等优良的性能。
本发明所述的用于软骨修复的生物组合制剂，以一定数量的尿液再生细胞作为种子细胞，配合壳聚糖类水凝胶作为三维支架，壳聚糖类水凝胶能够保证尿液再生细胞的存活，增加其粘附性，且使尿液再生细胞在软骨损伤处集中，且分布均匀，着床和生长效果好，进而获得较佳的软骨修复效果。
另外，生物组合制剂中所含尿液再生细胞的数量需要进行控制：如数量过多，会因营养供给不足而降低细胞存活率；数量过少，则会影响软骨修复效果，并导致所需剂量的增加。控制所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中尿液再生细胞的含量为1×107～5×107个/mL以及其与水凝胶的体积比，能够保证获得较高的尿液再生细胞存活率，从而获得优良的软骨修复效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的用于软骨修复的生物组合制剂，以一定数量的尿液再生细胞作为种子细胞，配合壳聚糖类水凝胶作为三维支架，能够有效改善关节软骨损伤相关的症状：缓解疼痛，消除炎症，改善关节活动性和功能，减少炎性积液。且便于操作、安全，患者易于接受，而且省时、显效快，避免了细胞活性的损失，作用持久，疗效显著且持续时间长。
进一步地，该生物组合制剂还包括臭氧，在对软骨损伤处进行处理时，能够氧化损伤组织中的炎性物质，使损伤部位暴露，使尿液再生细胞更充分的与损伤的组织接触，利于修复作用的发生。
附图说明
图1为采用实施例1所述的用于软骨修复的生物组合制剂对患者进行治疗前的核磁共振图；
图2为采用实施例1所述的用于软骨修复的生物组合制剂对患者进行治疗后的核磁共振图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的用于软骨修复的生物组合制剂及其应用作进一步详细的说明。
本发明实施例中采用的生理盐水是指生理学实验或临床上常用的，渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液，尿液再生细胞基本上是分散在生理盐水中，其与人体组织的渗透压一致，以其为溶剂，不会对尿液再生细胞产生损伤。
本发明实施例中的尿液再生细胞来源于健康人体的尿液，通过常规的贴壁分离和传代培养获得，并通过流式细胞仪对所分离的细胞进行鉴定，利用免疫荧光鉴定尿液干细胞的多向分化潜能后大约45天左右，达到所需的细胞数量，并配制为生理盐水混悬液。经过内毒素、细菌病毒等检测合格后，用于生物组合制剂的制备和临床治疗。
本发明实施例中的水凝胶为温敏性氯化壳聚糖/β-甘油磷酸钠基水凝胶，具体制备方法如下：
1、溶液配制
(1)2％(w/v)氯化壳聚糖溶液：氯化壳聚糖粉末0.2g，溶于10mL超纯水中，4℃溶解过夜，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后置于4℃冰箱保存备用。
(2)11.5％(w/v)β-甘油磷酸钠溶液：β-甘油磷酸钠粉末1.15g，溶于10mL超纯水中，充分溶解后以0.22μm微孔滤膜过滤，置于4℃冰箱保存备用。
(3)2.5％(w/v)羟乙基纤维素溶液：羟乙基纤维素粉末0.25g，铺于100mm直径的组织培养皿底，放置于超净工作台中紫外线照射2h灭菌，照射期间晃动培养皿3-4次，以保证粉末充分经过紫外线照射。照射后的羟乙基纤维素在无菌条件下溶解于10mL H-DMEM培养基中，获得2.5％的羟乙基纤维素溶液，4℃冰箱保存备用。
2、温敏性壳聚糖水凝胶的制备
调整2％氯化壳聚糖水溶液pH＝6.5，11.5％β-甘油磷酸钠(GP)水溶液pH＝8.0，2.5％羟乙基纤维素(HEC)为pH＝8.0。将上述三种溶液按照8:2:2.5的体积比在室温下混合成液态(pH＝7.2)，然后注入适当的模具中，放置到37℃孵箱中10min以内即可凝结成凝胶状。
实施例1
本实施例一种用于软骨修复的生物组合制剂，包括体积比为10∶5：5的尿液再生细胞的生理盐水混悬液、水凝胶与臭氧；其中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为3×107个/mL；所述水凝胶为温敏性壳聚糖基水凝胶。
上述用于软骨修复的生物组合制剂的配制方法如下：
取10mL密度为3×107个/mL的尿液再生细胞的生理盐水混悬液到50mL的无菌试管，然后用无菌注射器吸取5mL壳聚糖水凝胶，添加到无菌试管，与尿液再生细胞的生理盐水混悬液混匀，得生物组合物；对患者治疗前，再用该注射器抽取5mL臭氧至无菌试管中，与前述生物组合物混匀，制得所述生物组合制剂，为可注射的组合物，其在常温下显注射液状态，适于经皮注射给软骨损伤患者的关节腔内。
实施例2
本实施例一种用于软骨修复的生物组合制剂，包括体积比为10∶10：10的尿液再生细胞的生理盐水混悬液、水凝胶与臭氧；其中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为1×107个/mL；所述水凝胶为含羟基的聚合物接枝的壳聚糖。
上述用于软骨修复的生物组合制剂的配制方法类似实施例1。
实施例3
本实施例一种用于软骨修复的生物组合制剂，包括体积比为15∶1：1的尿液再生细胞的生理盐水混悬液、水凝胶与臭氧；其中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为5×107个/mL；所述水凝胶为含羟基的聚合物接枝的壳聚糖。
上述用于软骨修复的生物组合制剂的配制方法类似实施例1。
实施例4
本实施例一种用于软骨修复的生物组合制剂，包括体积比为10∶5的尿液再生细胞的生理盐水混悬液与水凝胶；其中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为3×107个/mL；所述水凝胶为含羟基的聚合物接枝的壳聚糖。
上述用于软骨修复的生物组合制剂的配制方法类似实施例1。
治疗方法：将实施例1-4所述的用于软骨修复的生物组合制剂注入患者受损软骨的关节腔中，每天一次，每次10mL，持续治疗3天，3个月至半年复查，以核磁共振检查来评估疗效。
疗效评估方式：评估关节腔积液的减少量百分比以及软骨损伤修复面积百分比，结果如表1所示。
表1
关节腔积液减少量百分比 软骨损伤修复面积百分比
实施例1 80％ 90％
实施例2 65％ 70％
实施例3 38％ 46％
实施例4 25％ 10％
采用实施例1所述的用于软骨修复的生物组合制剂对患者进行治疗前和治疗后的核磁共振分别如图1和2所示，对比可知，治疗后患者有软骨损伤的关节腔内积液明显减少，关节软骨损伤得到明显修复。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种用于软骨修复的生物组合制剂，其特征在于，包括体积比为10～15∶1～10的尿液再生细胞的生理盐水混悬液与水凝胶；
其中，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为1×107～5×107个/mL；
所述水凝胶为壳聚糖基水凝胶。
2.根据权利要求1所述的用于软骨修复的生物组合制剂，其特征在于，所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液与水凝胶的体积比为10～12∶4～6；所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为2×107～4×107个/mL。
3.根据权利要求1所述的用于软骨修复的生物组合制剂，其特征在于，所述水凝胶为温敏性氯化壳聚糖/β-甘油磷酸钠基水凝胶。
4.根据权利要求3所述的用于软骨修复的生物组合制剂，其特征在于，所述水凝胶以氯化壳聚糖和β-甘油磷酸钠为原料，乙基纤维素为交联剂配制而成。
5.根据权利要求4所述的用于软骨修复的生物组合制剂，其特征在于，所述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
将氯化壳聚糖配制为1～5％w/v的氯化壳聚糖水溶液；
将β-甘油磷酸钠配制为5～15％w/v的β-甘油磷酸钠水溶液；
将羟乙基纤维素溶解于H-DMEM培养基中，配制为1～5％w/v的羟乙基纤维素溶液；
将所述氯化壳聚糖水溶液、β-甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液按照重体积比7～9:1～3:2～3混合，凝结，即可。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于软骨修复的生物组合制剂，其特征在于，还包括臭氧；所述臭氧与尿液再生细胞的生理盐水混悬液、水凝胶之间的体积比为1～10：10～15∶1～10；所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为1×107～5×107个/mL。
7.根据权利要求6所述的用于软骨修复的生物组合制剂，其特征在于，还包括臭氧；所述臭氧与尿液再生细胞的生理盐水混悬液、水凝胶之间的体积比为4～6：10～12∶4～6；所述尿液再生细胞的生理盐水混悬液中，尿液再生细胞的含量为2×107～4×107个/mL。
8.权利要求1-7任一项所述的用于软骨修复的生物组合制剂在制备治疗软骨修复的药物中的应用。
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