CN101288779A - 基于温敏性壳聚糖水凝胶的可注射性心肌组织工程产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于温敏性壳聚糖水凝胶的可注射性心肌组织工程产品。具体涉及应用液态温敏性壳聚糖水凝胶为支架材料，结合不同来源的种子细胞，如胚胎干细胞、间充质干细胞、胎儿心肌细胞等，注射移植到动物心梗模型特定区域后观察其修复心肌梗死区域的情况。应用该支架材料构建的可注射性心肌组织工程产品可提高种子细胞的滞留率和存活率，促进心肌组织再生，增加梗死区室壁厚度、重塑原有心室形状、改善心脏功能。由于该产品具有可注射性的特征，便于治疗操作，从而避免了心脏停跳、体外循环等操作所带来的风险。本发明操作工艺简单、实施条件温和，为心肌组织工程提供了一种新的产品，对组织工程化心肌治疗心脏疾患的临床开展具有重要意义。

Description

基于温敏性壳聚糖水凝胶的可注射性心肌组织工程产品

技术领域

本发明属于组织工程领域，特别涉及一种采用温敏性壳聚糖水凝胶为支架制造的心肌组织工程产品。

发明背景

缺血性心脏病及随之发生的心力衰竭的发病率及死亡率在全球逐年上升，心血管系统疾病已经成为人群中尤其是老年人致死致残的主要原因之一，是当今医疗界的主要难题之一。目前治疗手段包括药物、冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路手术等，虽然这些手段在一定程度上可以缓解患者症状，但均难以从根本上恢复心肌细胞数量，改善心脏舒缩功能。心脏病患者在晚期往往需要进行器官移植，但因可供移植的器官数量有限，每年均有大批心脏病患者因得不到有效治疗而失去治疗机会。

心肌细胞是终末分化细胞，心梗发生后心肌不能再生，死亡的心肌由无收缩功能的纤维结缔组织代替而导致心功能衰竭。内源性再生机制不足以代偿心肌梗死后的心肌细胞死亡。药物治疗能延缓疾病的自然过程，但并不能逆转。因此，移植外源性细胞再生心肌策略得到越来越多的关注。动物实验和初期的临床研究表明细胞移植可取代坏死心肌细胞，改善心肌梗死区弹性，刺激血管新生，限制梗死区变薄，调整存活心肌细胞对梗死区的反应，防止左室扩大及进展性心衰。细胞移植作为一种治疗心肌梗死的新兴的组织工程学方法，成为近年来各国心血管病研究者关注的焦点。各种来源和不同发育阶段的细胞都已经被尝试移植到健康和患病的心脏中，包括胎儿心肌细胞，骨骼成肌细胞，骨髓细胞、内皮祖细胞、间充质干细胞、内在的心脏干细胞以及小鼠和人胚胎干细胞，克隆的胚胎中获得的c-kit阳性的胎儿肝干细胞。其中胚胎干细胞(ES)具有无限或几乎无限的自我更新能力并具有向心肌细胞分化的潜力使其成为基于细胞的心脏治疗的炙手可热的细胞来源。

尽管在大多数研究报道在不同的疾病模型中，心肌功能得到恢复。但是基于细胞的心脏修复领域中仍然存在很多挑战。首先是滞留的细胞数变化极大，使得移植物的体积不可预测；其次是移植细胞的大量死亡，许多研究指出大约90％的成功注射到心脏的细胞在第一周内就死亡了。建立简单易行的实验方法，使用可注射的生物材料作为一种细胞移植的基质，来增加细胞滞留及存活，将有助于这一策略应用到临床。目前，有研究证明纤维蛋白胶、Matrigel、海藻酸盐溶液可以改善梗死心肌中细胞移植物的保持力和存活力，控制梗死的扩大以及诱导新血管的生成。

壳聚糖的结构类似于细胞外基质糖胺聚糖，可生物降解，生物相容性好，具有止血、促进伤口愈合的能力，还具有降血脂和胆固醇、抑制癌细胞的功能。有研究发现壳聚糖与甘油磷酸钠复合物，常温下流动性好、生理体温(37℃)时发生凝胶化、形成水凝胶，是一种优良的可注射性细胞支架，目前主要应用于软骨及骨组织工程，但以其为支架，用于研制和开发可注射性心肌组织工程产品至今尚未见报道。

发明内容

本产品首次采用温敏性壳聚糖为液态支架构建可注射性组织工程心肌产品，将其注射到跳动的心脏缺血损伤心肌内，以期达到改善提高移植细胞滞留及存活，修复大面积心梗疤痕并且改善心脏功能的目的。本发明提供一种基于壳聚糖水凝胶的可注射性组织工程化心肌的产品，其特征是为心肌再生提供一种新的产品。

本发明的技术方案是：

1、温敏性壳聚糖水凝胶的制备

原料准备如下：1％-3％壳聚糖(C)溶液；10％-50％β-甘油磷酸钠(GP)水溶液；1％-4％羟乙基纤维素(HEC)溶液。

温敏性壳聚糖水凝胶制备方法：将上述三种溶液按照C∶GP∶HEC＝4∶1∶1的比例在室温下混合成液态，37℃条件下即可凝结为固态。

2、温敏性壳聚糖水凝胶分别与小鼠胚胎干细胞、重构胚来源的胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞诱导分化的心肌细胞，胎儿心肌细胞或干细胞混合制造可注射性心肌组织工程，进行体内注射移植。

A.将新鲜分离或经过扩增、或经过冷冻保存的细胞离心成细胞团，与壳聚糖水凝胶混合制成10⁷/ml的细胞悬液，

B.将细胞悬液在开胸状态下经心外膜注射到心梗部位；也可以在介入导管操作状态下经心内膜注射到心梗部位。

C.术后4周进行心脏超声检查评估心脏功能改变及心脏室壁厚度改变情况，经由侧颈总动脉心脏置管至左心室评估左心血流动力学改变情况。

D.术后24小时病理观察细胞滞留情况，术后4周功能检查结束后取心脏病理标本，明确心肌再生、血管新生组织学变化，观察室壁厚度、心室扩张状况。

有益效果

本发明采用了温敏性壳聚糖水凝胶作为可注射性液态支架，结合不同来源的种子细胞再生组织工程化心肌。该支架材料可以提高种子细胞的滞留率和存活率，促进心肌组织再生，增加梗死区室壁厚度、重塑原有心室形状、改善心脏功能。该产品具有可注射性的特征，便于治疗操作，避免心脏停跳、体外循环等操作所带来的风险。本发明操作工艺简单、实施条件温和，为心肌组织工程提供了一种新的产品，对组织工程化心肌治疗心脏疾患的临床开展具有重要意义。

附图说明

图1.壳聚糖水凝胶的组织相容性检测(HE染色)A：2周，×20；B：4周，×20；C：6周，×20；D：8周，×20；

图2.壳聚糖水凝胶注射和单纯心梗四周后梗死中间部位血管生成情况(VIII因子免疫组化染色)壳聚糖水凝胶注射，×20；B.单纯心梗，×20；

图3.壳聚糖水凝胶注射和单纯心梗四周后梗死中间部位心室壁厚度情况(HE染色)A.壳聚糖水凝胶注射，×4；B.单纯心梗，×4；

具体实施方式

壳聚糖水凝胶的制备：200mg壳聚糖置于10ml小烧杯，加入0.1％醋酸9ml，待壳聚糖完全溶解后，高压蒸汽灭菌(121℃、20min)，5gβ-甘油磷酸钠置于10ml小烧杯，加入10ml培养基并0.22μm滤膜过滤除菌，250mg羟乙基纤维素照射除菌后，用10ml培养基溶解成2.5％溶液，三者按4∶1∶1比例混合可以配制出PH值为中性，室温流动性好的液态凝胶。

壳聚糖水凝胶的组织相容性检测：壳聚糖水凝胶0.1ml注射植入SD大鼠的大腿肌肉中，分别于2、4、6、8周处死，每次取2只，取出标本后进行石蜡切片，作HE染色观察炎性反应的情况。植入后2周结果如图1A，可观察到材料周围有少量炎症细胞浸润，尚未形成包膜；4周时炎性反应较明显(图1B)，有较多的炎症细胞浸润，材料周围有包膜形成；植入后6周，材料周围的包膜已经消失，炎症细胞亦有大幅度的减少，同时可见植入的壳聚糖凝胶材料降解较明显(图1C)；8周时植入的壳聚糖材料已经基本降解完全，仅可见少量淋巴细胞和极少部分未降解的材料(图1D)。

壳聚糖水凝胶的促心肌血管生成功能检测：将240g左右的SD大鼠20只随机分为壳聚糖水凝胶注射组、单纯心肌梗死模型组、PBS注射组。随机选取SD大鼠8只，雌雄不限，戊巴比妥钠35mg/kg体重腹腔注射麻醉。通过大鼠冠状动脉结扎，致心肌梗死30分钟后，心肌缺血处注射壳聚糖水凝胶。术后1、2、4周，分别处死动物进行组织学、免疫组织化学检查。结果可见注射壳聚糖水凝胶的实验组较其它两个对照组明显提高了心梗部位的心室壁厚度，梗死部位的血管密度明显增加，存活的心肌数量增多，纤维化程度减轻(图2、图3)。

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备：处死孕13d-15d的BALB/C小鼠，无菌条件下取胚胎后去其头部和内脏，用PBS充分洗涤，并将其剪碎后悬浮于0.25％胰酶溶液中分阶段消化。适时终止消化，吸取上层悬液并离心收集细胞。台盼蓝拒染法鉴定细胞活力，计数后以5×10⁸cells/L重悬于含10％FBS的H-DMEM培养基中，37℃、5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱内培养过夜。次日将细胞冻存备用或直接制备为饲养层细胞：用含10mg/L丝裂霉素C的培养基处理MEF 2.5-3h，PBS充分洗涤以去除残留成分。加入含10％FBS的H-DMEM培养基即为MEF饲养层。

小鼠胚胎干细胞(mES)扩增及诱导分化为心肌细胞：复苏mES接种于备用的MEF饲养层，加入内含20％胎牛血清(FBS)、0.1mmol/L β-巯基乙醇、1％非必需氨基酸及1×10⁶U/L白血病抑制因子(LIF)的H-DMEM培养基维持培养。为保持其理想的未分化状态，当mES集落达到60％-70％融合时传代。mES细胞达到足够数量后诱导分化。取对数生长期mES，经0.25％胰酶消化制成单细胞悬液，置于经0.1％明胶包被的100mm组织培养皿中，37℃孵育30min，因饲养层细胞在较短时间内贴壁，吸取上层细胞悬液接种至另一细菌培养皿内，此时悬浮细胞大部分为mES。继续培养48h，即可见多个悬浮的EB形成。接下来加入0.1％稳定型维生素C条件培养基，继续悬浮培养7d，每隔2d换液。悬浮培养7d后，分别将EB接种至60mm培养皿(3个/cm²)，然后再添加该条件培养基继续贴壁培养，定期换液。每日观察EB分化情况，7d后出现跳动的心肌合胞体，12d后80％EB为跳动的心肌合胞体。用0.1％II型胶原酶消化心肌合胞体1-2h后即为单细胞悬液。

纯化小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞：9份Percoll液与1份8.5％NaCL混合为储存液，用0.85％NaCL稀释为使用浓度，40.5％为未分化为心肌的ES细胞密度，58.5％为心肌细胞在Percoll液中的漂浮密度。将3ml 58.5％的Percoll液加到离心管的底层，3ml 40.5％的Percoll液缓慢地加到58.5％的Percoll液上面，再将3ml收集的心肌细胞轻轻地加到顶层，1200g/min离心20min。收集分离的第4、5层细胞，用PBS洗2次，离心去除Percoll液，加完全培养基重悬。

小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞荧光标记：DAPI荧光染料用PBS配置为10mg/ml的储存液，取0.1ml加入20ml的细胞悬液中，使其终浓度为50ug/ml，37℃避光孵育30min，荧光显微镜下观察可见细胞核染色成功。

小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞与壳聚糖水凝胶混合制备可注射的心肌组织工程：将DAPI荧光标记后的心肌细胞调成密度为5×10⁹cells/L的细胞悬液，1200r/min离心3min，弃上清液，细胞团用新鲜配置的壳聚糖水凝胶0.1ml重悬，轻轻吹打3-5次使细胞混合均匀，放冰上待用。

小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞心梗部位注射移植：随机选取SD大鼠30只，雌雄不限，戊巴比妥钠35mg/kg体重腹腔注射麻醉。气管切开连接呼吸机，胸骨左侧1厘米，第四肋间隙横向切口开胸腔，6-0无损伤缝合线结扎冠状动脉，制成心肌梗死模型。心肌梗死30min后，将小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞与壳聚糖水凝胶混合制备的可注射的心肌组织工程0.1ml注射入大鼠心梗部位心内膜下心肌。观察注射部位没有出血后关胸、撤呼吸机、单笼饲养。

小鼠胚胎干细胞(mES)来源的心肌细胞与壳聚糖水凝胶混合制备的可注射的心肌组织工程心梗部位注射移植后24小时病理结果提示细胞滞留率及存活率比较单纯用PBS重悬细胞注射移植组明显提高，其4周病理结果提示小鼠胚胎干细胞来源的大量新生心肌细胞继续存在并与宿主细胞形成细胞连接。大鼠心肌梗死区室壁厚度明显提高，未发现室壁瘤形成。术后4周对其心脏进行超声检查，心功能明显改善。

Claims (3)

1.基于壳聚糖水凝胶的心肌组织工程产品的特征在于所用的支架为可注射的温敏性壳聚糖水凝胶。

2.按权利要求1所述的可注射的温敏性壳聚糖水凝胶支架的特征在于室温条件下为液态、注射到体内后，短时间内凝结为固态。

3.基于壳聚糖水凝胶的可注射性心肌组织工程产品的种子细胞可以选择胎儿心肌细胞、胚胎干细胞、重构胚来源的胚胎干细胞、间充质干细胞或肌肉干细胞定向诱导分化来源的心肌细胞、未诱导的干细胞中的一种或几种。

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