CN104888276B - 一种心肌组织工程产品及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

公开了一种心肌组织工程产品及其制备方法和用途。心肌组织工程产品的制备方法包括：(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及(2)构建并培养心肌细胞‑大网膜脱细胞基质复合体。本发明的心肌组织工程产品包含心肌细胞和大网膜脱细胞基质支架材料。由于大网膜脱细胞基质具有良好的三维网状空间结构，且富含生长因子，因此其有利于心肌细胞的生长以及营养物质与代谢产物的运输，对未来应用该心肌组织工程产品进行心肌损伤修复以及以其为模型进行心肌治疗性药物筛选等具有重要意义。

Description

一种心肌组织工程产品及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种以大网膜脱细胞基质为支架材料的心肌组织工程产品及其构建方法。

背景技术

心肌组织工程是融合细胞生物学、生物材料学和工程学的原理和技术，将具有形成心肌组织能力的种子细胞与具有良好生物相容性、可降解性与一定的生物力学特性的生物支架材料复合，体外构建出能够进行心肌移植、修复心肌损伤的工程化心肌组织，其主要研究内容涉及种子细胞、支架材料以及工程化心肌组织构建等三个方面。其中，生物支架材料的选择是开展工程化心肌组织构建的关键。

组织工程支架材料需要具备良好的生物相容性，没有免疫原性，合适的降解时间，且应该具有一定的结构和力学特性支持细胞的生长和分化。心肌组织工程对支架材料的要求又有其特殊性：首先，心脏是全身灌注率和耗氧率最高的器官之一，与其他组织相比，心肌细胞对缺血异常敏感，因此支架材料应具有良好的生物通透性，有利于营养物质与代谢产物的运输。其次，心肌细胞的活动要求支架材料有足够的弹性、可拉伸性以及机械稳定性。第三，体内移植后容易血管化，从而便于与宿主整合。

目前，心肌组织工程常用的支架材料包括人工合成支架材料以及天然生物材料，这些材料至今都无法完全满足以上这些标准。因此，研究人员一直致力于对现有的支架材料进行优化或研发新型的生物支架材料以更好的满足心肌组织工程对生物支架材料的要求。

脱细胞技术的出现为心肌组织工程支架材料的选择指出了新的方向。利用脱细胞技术去除组织中各种细胞成分以及遗传物质而获得的天然生物支架材料及脱细胞基质材料，保留了细胞外基质的三维结构和天然成分，有利于细胞粘附、增殖、分化及其生物学功能的发挥。目前，研究人员已经获得了各种不同组织来源的脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、角膜、肺、肝、肾等。尽管如此，上述脱细胞基质材料均不能满足心肌组织工程支架材料的特殊需求。而心脏脱细胞基质本身也存在供体来源短缺的问题。因此，亟需开发新的基于脱细胞技术的心肌组织工程支架材料。

大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜组织，从胃与肠之间向前膨出，在肠的前方下垂形成皱襞，呈围裙状遮被空、回肠。大网膜来源广泛，高度血管化，富含各类生长因子，且具有很好的力学性能，目前已广泛用于各类移植物的体内移植平台。然而，目前大网膜脱细胞基质相关研究刚刚起步，尚未见以大网膜脱细胞基质为支架材料，构建工程化心肌组织的相关报道。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供了心肌组织工程产品的制备方法，其包括：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体。

根据本发明的另一方面，提供了心肌组织工程产品的制备方法，其按照以下操作步骤进行：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料

将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1∶1∶0.2-1混合而成的脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r/min；将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于由十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶组成的脱细胞液中处理，脱细胞液中十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶含量分别为1-3％重量比的十二烷基硫酸钠、3500-4500U/L的DNA酶、0.1-0.5％重量比的胰蛋白酶，浸泡时间为12-24h，震荡频率为100-200r/min；将经脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体

将1×10⁶-1×10⁷/mL的心肌细胞悬液1-3mL接种于步骤(1)制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2h，然后添加DMEM培养液8-15mL，继续培养至第7-21天，每12h更换一次培养液，培养结束即可获得心肌组织工程产品。

根据本发明的再一方面，提供了根据上述方法获得的心肌组织工程产品，其包含心肌细胞和大网膜脱细胞基质支架材料。

与其他方式构建的心肌组织工程产品相比，本发明中构建的心肌组织工程产品以大网膜脱细胞基质为支架材料，由于大网膜脱细胞基质具有良好的三维网状空间结构，且富含生长因子，因此其有利于心肌细胞的生长以及营养物质与代谢产物的运输，对未来应用该心肌组织工程产品进行心肌损伤修复以及以其为模型进行心肌治疗性药物筛选等具有重要意义。

根据本发明的再一方面，提供了上述心肌组织工程产品在制备用于心肌细胞再生的药物中的用途。

根据本发明的再一方面，提供了上述心肌组织工程产品在制备用于心肌组织修复的药物中的用途。

附图说明

图1大网膜脱细胞基质的扫描电镜观察。

图2基于大网膜脱细胞基质的心肌组织工程产品Live/Dead染色×200。

图3心肌组织工程产品cTnT免疫组织化学染色×200。

图4超声心动图检测心脏功能(二尖瓣水平短轴切面)。

具体实施方式

在本申请中，缩写词的含义如下：

DMEM：Dulbecco′s modified eagle medium培养液，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基；

HEPEs：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；

PBS：磷酸盐缓冲液；

SDS：十二烷基硫酸钠；

VEGF：血管外源性内皮生长因子；

bFGF：碱性成纤维细胞生长因子；

HE染色：苏木精-伊红染色；

EthD-III：溴化乙锭同型二聚体-III；

calcein AM：二乙酰甲酯

DNA酶：脱氧核糖核酸酶；

min：分钟。

根据本发明的一个方面，提供了心肌组织工程产品的制备方法，其包括：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体。

在某些实施方案中，步骤(1)还包括脱脂处理步骤。在示例性实施方案中，脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。在某些优选的实施方案中，该脱脂处理的步骤使用体积比为1∶1∶0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。在某些更优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1∶1∶0.4-0.7。在最优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1∶1∶0.5。

在某些实施方案中，在进行脱细胞处理的过程中还进行震荡。

在某些具体的实施方案中，在脱细胞处理的步骤中，将大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于包含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液中处理，脱细胞液中十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的含量分别为1-3％重量比的十二烷基硫酸钠、3500-4500U/L DNA酶、0.1-0.5％重量比的胰蛋白酶。在某些更具体的实施方案中，脱细胞液由十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶组成。

在某些示例性的实施方案中，脱细胞液中十二烷基硫酸钠的含量可以为1.0％重量比、1.1％重量比、1.2％重量比、1.3％重量比、1.4％重量比、1.5％重量比、1.6％重量比、1.7％重量比、1.8％重量比、1.9％重量比、2.0％重量比、2.1％重量比、2.2％重量比、2.3％重量比、2.4％重量比、2.5％重量比、2.6％重量比、2.7％重量比、2.8％重量比、2.9％重量比或3.0％重量比。

在某些示例性的实施方案中，脱细胞液中DNA酶的含量可以为3500U/L、3600U/L、3700U/L、3800U/L、3900U/L、4000U/L、4100U/L、4200U/L、4300U/L、4400U/L或4500U/L。

在某些示例性的实施方案中，脱细胞液中胰蛋白酶的含量可以为0.1％重量比、0.2％重量比、0.3％重量比、0.4％重量比或0.5％重量比。

根据本发明的另一方面，提供了心肌组织工程产品的制备方法，其按照以下操作步骤进行：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料

将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1∶1∶0.2-1混合而成的脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r/min；将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于由十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶组成的脱细胞液中处理，脱细胞液中十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶含量分别为1-3％重量比的十二烷基硫酸钠、3500-4500U/L的DNA酶、0.1-0.5％重量比的胰蛋白酶，浸泡时间为12-24h，震荡频率为100-200r/min；将经脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体

将1×10⁶-1×10⁷/mL的心肌细胞悬液1-3mL接种于步骤(1)制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2h，然后添加DMEM培养液8-15mL，继续培养至第7-21天，每12h更换一次培养液，培养结束即可获得心肌组织工程产品。

在某些实施方案中，步骤(1)中新鲜的大网膜组织来源于猪、牛、羊等哺乳类动物。

在本申请中，大网膜是可商购的，可以购自例如屠宰场。

根据本发明的再一方面，提供了根据上述方法获得的心肌组织工程产品，其包含心肌细胞和大网膜脱细胞基质支架材料。

与其他方式构建的心肌组织工程产品相比，本发明中构建的心肌组织工程产品以大网膜脱细胞基质为支架材料，由于大网膜脱细胞基质具有良好的三维网状空间结构，且富含生长因子，因此其有利于心肌细胞的生长以及营养物质与代谢产物的运输，对未来应用该心肌组织工程产品进行心肌损伤修复以及以其为模型进行心肌治疗性药物筛选等具有重要意义。

根据本发明的再一方面，提供了上述心肌组织工程产品在制备用于心肌细胞再生的药物中的用途。

根据本发明的再一方面，提供了上述心肌组织工程产品在制备用于心肌组织修复的药物中的用途。

通过以下实施例对本发明做详细描述，然而以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。

以下实施例中使用的基于大网膜脱细胞基质的组织工程皮肤构建所需试剂的配制：

1)PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.491g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，溶解于1L超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。

2)脱脂溶液：将400mL甲醇、400mL氯仿与200mL乙醚混匀。

3)脱细胞液：称取20g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶与胰蛋白酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到4000U/L，胰蛋白酶浓度为0.2％重量比，调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。

4)DMEM细胞培养基：DMEM干粉培养基一袋，3.7g NaHCO₃，2.383g HEPES，溶解于1L超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。使用时添加10％胎牛血清(FBS)。

5)4％多聚甲醛固定液：加热0.1M的PB溶液1L至沸腾，加入40g多聚甲醛，搅拌溶解，调节pH值为7.2-7.4，过滤除杂质，4℃保存。

6)戊巴比妥钠溶液：1.5％戊巴比妥钠溶解于生理盐水中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，室温保存。

实施例中所用心肌细胞由中国人民解放军总医院医学捐赠。

实施例1制备心肌细胞悬液

在无菌条件下将心肌组织剪成1mm³大小。PBS清洗后加入0.25％胰蛋白酶溶液，轻轻吹打，吸取上清液并加入含10％血清的全培养液中终止消化。重复以上步骤，直至消化完全。用200目筛网过滤收集消化液，离心收集细胞，并培养液重悬细胞，接种在10cm细胞培养皿中，置于CO₂恒温培养箱。差速贴壁1h去除成纤维细胞，收集尚未贴壁细胞，并以2×10⁶个/皿的接种密度接种于10cm细胞培养皿中，置于CO₂培养箱中培养。

随后，将培养的心肌细胞通过胰蛋白酶消化，用DMEM培养液重悬细胞，并制备细胞密度为5×10⁶/mL的心肌细胞悬液。

实施例2大网膜脱细胞基质的制备

新鲜的小型猪腹膜大网膜组织(购自屠宰场)，于PBS中清洗3遍。将清洗后的组织震荡浸泡于2L脱脂溶液中处理24h，震荡频率为200r/min。随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液中处理18h，震荡频率为150r/min。将经脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌，常温保存。

实施例3大网膜脱细胞基质的扫描电镜观察

利用2％戊二醛将制备的大网膜脱细胞基质固定24h，常规脱水、真空干燥、喷金，利用扫描电子显微镜观察并摄像。结果未见细胞组分残留，且大网膜脱细胞基质交织成网状立体三维支架，孔隙均一(图1)。

实施例4基于大网膜脱细胞基质的心肌组织工程产品的制备

将实施例1中制备的5×10⁶/mL心肌细胞悬液2mL接种于制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物。将复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2h，然后添加DMEM培养液10mL，继续培养至第14天，每12h更换一次培养液，培养结束即可获得心肌组织工程产品。

实施例5基于大网膜脱细胞基质的心肌组织工程产品的细胞活性检测

取培养14天的心肌组织工程产品于新的培养皿中，用移液枪吸取20μl 2mM EthD-III溶液加到10mL PBS中，得到4μM EthD-III工作液，再将5μl 4mM calcein AM溶液转移到EthD-III工作液中，配制成混合液(2μM calcein AM和4μM EthD-III)。随后添加足量的Live/Dead混合液以覆盖组织工程皮肤，然后于室温孵育30-45min，PBS溶液清洗三次。在荧光显微镜下观察荧光标记的细胞。

经染色，由于活细胞具有酯酶活性，可以把非荧光calcein AM转化成能发绿色荧光的calcein，而由于死细胞的细胞膜失去选择性，EthD-1进入细胞结合到细胞核上，使死细胞呈现红色荧光。live/dead染色结果可见，培养14天的心肌组织工程产品中大量心肌细胞存活良好(绿色)，仅有少量心肌细胞死亡(红色)出现，表明基于大网膜脱细胞基质的心肌组织工程产品具有良好的活性(图2)。

实施例6基于大网膜脱细胞基质的心肌组织工程产品cTnT免疫组织化学染色

使用4％的多聚甲醛溶液固定制备的心肌组织工程产品，浓度酒精脱水，石蜡包埋，制备厚为度4μm切片。切片置于病理组织漂烘仪上烘干2h。随后，组织切片经过酒精(浓度由高到低)的水化，蒸馏水冲洗切片。加3％双氧水作用10min，去除内源性过氧化物酶；PBS漂洗三次，每次5min；利用抗原修复液进行微波修复，修复后冷却室温，PBS漂洗三次，每次5min；1％牛血清白蛋白37℃封闭30min；滴加抗cTnT抗体，4℃过夜。用0.01M PBS清洗3次，滴加山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30min，PBS清洗3次，每次5min；避光下DAB显色10min，蒸馏水冲洗切片；酒精脱水(浓度由低到高)，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察染色结果并拍照。

结果可见，通过本发明制备的心肌组织工程产品能够大量表达心血管谱系特异性标志物cTnT，表明本发明制备的大网膜脱细胞基质支架材料能够支持心肌细胞的生长。(图3)。

实施例7动物心梗模型的制备

利用戊巴比妥钠将SD大鼠麻醉，连接小动物呼吸机。行开胸术，剪开心包，暴露心脏。在左心耳下缘2mm处，用0-7号丝线缝扎。结扎后左室壁变苍白，室壁运动减弱。心电监护见I、II导联的ST段明显抬高，表明冠状动脉梗死动物模型制备成功。

实施例8：工程化心肌组织移植与心脏功能检测

将SD大鼠随机分为工程化心肌组织移植组与心肌梗死组。大鼠心肌梗死14天后，再次开胸进行工程化心肌组织移植。打开胸腔暴露心脏，在肉眼可见的梗死区域周围的健康心肌上进行这缝合移植，使工程化心肌组织的中央正好覆盖于梗死部位上方。移植4周后对各实验组大鼠进行心脏超声检查，结果表明，与单纯心梗组相比，工程化心肌组织移植组大鼠的心脏功能明显改善(图4)。

Claims (17)

1.一种心肌组织工程产品的制备方法，其包括：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料，其包括使用含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤；以及

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)还包括脱脂处理步骤。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述脱脂处理步骤使用体积比为1∶1∶0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述脱脂处理步骤使用体积比为1∶1∶0.4-0.7的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述脱脂处理步骤使用体积比为1∶1∶0.5的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。

6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中在进行脱细胞处理的过程中还进行震荡。

7.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中在脱细胞处理的步骤中，将大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于包含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液中处理，脱细胞液中十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的含量分别为1-3％重量比的十二烷基硫酸钠、3500-4500U/L的DNA酶和0.1-0.5％重量比的胰蛋白酶。

8.如权利要求6所述的方法，其中在脱细胞处理的步骤中，将大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于包含十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的脱细胞液中处理，脱细胞液中十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶的含量分别为1-3％重量比的十二烷基硫酸钠、3500-4500U/L的DNA酶和0.1-0.5％重量比的胰蛋白酶。

9.一种心肌组织工程产品的制备方法，其特征在于，按照以下操作步骤进行：

(1)制备大网膜脱细胞基质支架材料

将新鲜的大网膜组织震荡浸泡于由甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1∶1∶0.2-1混合而成的脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r/min；将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗，并震荡浸泡于由十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶组成的脱细胞液中处理，脱细胞液中十二烷基硫酸钠、DNA酶和胰蛋白酶含量分别为1-3％重量比的十二烷基硫酸钠、3500-4500U/L的DNA酶、0.1-0.5％重量比的胰蛋白酶，浸泡时间为12-24h，震荡频率为100-200r/min；将经脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌；

(2)构建并培养心肌细胞-大网膜脱细胞基质复合体

将1×10⁶-1×10⁷/mL的心肌细胞悬液1-3mL接种于步骤(1)制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物；将复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1-2h，然后添加DMEM培养液8-15mL，继续培养至第7-21天，每12h更换一次培养液，培养结束即可获得心肌组织工程产品。

10.如权利要求1至5、8和9中任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的新鲜的大网膜组织来源于哺乳类动物。

11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的新鲜的大网膜组织来源于哺乳类动物。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的新鲜的大网膜组织来源于哺乳类动物。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的新鲜的大网膜组织来源于猪、牛或羊。

14.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的新鲜的大网膜组织来源于猪、牛或羊。

15.根据权利要求1-14中任一权利要求所述的方法获得的产品，其包含心肌细胞和大网膜脱细胞基质支架材料。

16.权利要求15所述的产品在制备用于心肌细胞再生的药物中的用途。

17.权利要求15所述的产品在制备用于心肌组织修复的药物中的用途。