CN103534346A - 细胞合成颗粒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞合成的生物颗粒，制造细胞合成颗粒的方法以及将这类细胞合成颗粒组装到组织和器官的方法。这些颗粒在体外培养基中通过活体细胞合成，这些活体细胞生产天然的细胞外基质。多个颗粒可组装到具有明显的空隙空间的组织中。这些颗粒或组织可以作为其他的细胞类型的基质。这些颗粒或组织可以进一步进行体外培养，以实现良好的细胞或细胞外基质生长、组织或其他所需特征。这些颗粒或组织可以失活或去细胞化。这些颗粒或组织可以注射或植入人体，以修复、增强或创建一分泌、机械或美学功能。

Description

细胞合成颗粒

优先权声明

本申请基于35U.S.C.§119(e)要求美国临时申请61/478,033的优先权，该临时申请的申请日为2011年4月21日，其全文以引用的方式并入本文中。

技术领域

本技术涉及组织工程领域。更具体地说，本技术涉及的领域为包含由细胞在培养基中产生的天然细胞外基质的颗粒、这些颗粒的制备方法以及它们的后续用途。

背景技术

多细胞生物体是由组织，即具有相似形态和功能的细胞群构成。不同的组织相互集合在一起并行使其功能，形成器官。虽然一些组织似乎专由细胞构成，但是大多数组织具有第二种关键成分-细胞外基质（ECM）。ECM由细胞合成的各种蛋白组成，并建立了细胞的生理环境。ECM在以下方面具有重要作用：提供机械结构、为合适的细胞行为提供粘附点、储存生长因子和细胞因子以及正在进行的研究主题的其他作用。在ECM的许多蛋白质中，胶原蛋白通常是最丰富的，并因其机械作用而广为人知。到目前为止，已经得到描述的胶原蛋白有大约20种。弹性蛋白也是一个众所周知的已知蛋白质，其在一些组织中发挥了重要的机械作用。ECM还包含了许多其他蛋白，这些蛋白具有各种功能并建立一不容易被人为复制的复杂微环境。(这些蛋白质包括：纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、核心蛋白聚糖、腓骨蛋白、原纤蛋白、微纤维相关的糖蛋白（MFAP）、界面蛋白（emilins）、骨桥蛋白、腱生蛋白、巢蛋白（entactin/nidogen）、血小板反应蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、母系蛋白、多功能蛋白聚糖、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、二聚糖、基底膜聚糖、多配体聚糖、基膜聚醣、磷脂酰肌醇聚糖以及其他许多种）。现已被广泛接受的是，构成恰当的ECM在维持正常的细胞形态和功能方面是至关重要的。

但是，组织缺陷可由一些医疗条件引起，包括，例如，先天性畸形、外伤、感染、和肿瘤切除。数百年来，外科医生已经解决了在活体生物体内修复受伤组织的问题。组织和器官移植可以为许多病变情况提供解决方案。然而，数目有限的器官捐赠者以及机体的有限的再生能力，使许多病人得不到治疗，往往导致其遭受很多的苦难，甚至死亡。

成功修复有缺陷或受损组织部分取决于提供的条件，允许合适的细胞再生以及最大限度减小在修复过程中发生感染和炎症的可能性。因为很多组织和器官不能自发的再生，或者运用现有的外科和药理技术无法将其修复，所以仍需要能够促进组织再生或提供体外产生新组织的治疗策略。

组织工程学是从细胞生物学和工程学领域的集合中产生的。组织工程包括一些在人体外，如在试管内生产组织的技术和方法。传统上，组织工程一直试图解决的问题涉及使用细胞生物学原理结合材料科学的技术生产复杂的医疗设备，从而进行组织修复。一般来说，组织工程是指由细胞组件通过自组装来构建一片片组织。

然而，人工材料通常被机体识别为异物，并引起免疫反应，称为“异物反应”，其特征是慢性炎症和疤痕（例如，见Anderson,J.M.,et al,Semin.Immunol.20(2),86(2008)）。这种反应的结果往往是人工植入体部分或全部封装入疤痕组织中，将其与人体循环系统进行有效隔离。虽然这并不妨碍植入体的许多机械功能（例如，整形外科的和牙科的植入物），它确实会影响位于植入体中的细胞的生存（例如，肝脏、肾脏、胰腺更换产生的问题）。这种类型的困难对于较厚的并包含大量细胞的植入体尤为严重，其需要有效的血液供应来输送氧气和排除代谢废物。此外，合成材料很容易引起感染，因为它们可在微环境中给致病性微生物躲藏，这使机体的免疫细胞很难进入。由于这些原因，现在更多方法聚焦于期望完全生物化的材料的使用能在发展治疗策略中获得更大的成功，这些治疗策略旨在修复、更换、保持和加强组织功能。但是，发展纯生物材料并不是没有自己的障碍。

制造全生物化的组织工程构建体的一种方法是使用从动物或人体源提取的蛋白（例如胶原蛋白、弹性蛋白和纤维蛋白)。也可以使用通过生物技术方法获得的重组蛋白。这些蛋白可通过物理化学方法组装成不同的形状（薄膜状、海绵状、纤维状、管道状等等）。然后可将特定的细胞添加到蛋白结构中，以模拟特定组织的生理组织或者功能。这种方法的一个主要限制是在提取工艺中，蛋白质往往会变性或进行化学修饰，开展该提取工艺是为了在组装到工程化构建体之前，获得或多或少纯化的蛋白。当在体外重组进组织时，这些修饰过的蛋白缺乏原始蛋白的微观结构，或者缺乏一种或多种所需的关联蛋白，而这些在重建细胞外基质（ECM）的微组织结构是需要的。在大多数情况下，自然界中看到没有活体细胞的干预，即使完好无损的蛋白也无法自发的重新装配到复杂的组织中。

然后，这种提取蛋白的不正常微观结构被宿主的非特异性免疫系统识别为“损坏”组织。这将导致这类植入体迅速降解、功能和机械强度的丧失（例如，见Patino,M.G.,et ai,J.Orallmplantol.28(5),220,(2002)）。如果动物来源的蛋白质用于人体，也会引发特异性免疫系统的识别并导致上述方式的排斥。化学处理，可以用于增加构建体的机械强度或者使蛋白质更耐受酶降解，但是这类处理进一步使蛋白变性，并能引发异物反应炎症过程，这在使用天然蛋白时是首先需要避免的（例如，见Cheung,D.T.,et al.,Connect.Tissue Res.,25(1),27(1990)）。

据观察，在抗败血酸化合物存在时进行长期培养，粘附细胞如成纤维细胞，能够在培养盘的内部表面上沉积大量的ECM蛋白。因此，在一延长的培养期后，由活细胞以及活细胞产生的ECM蛋白组成的活组织能够从培养盘上以平面块状分离。这些活细胞合成的组织块（在此称为“组织片”）已形成一种方法的基础，该方法被称为基于片的组织工程（SBTE），其能够产生活的完全生物化的构建体，这些构建体具有高机械强度而不需要任何人工的或外源骨架。

SBTE已经成功用于制造人类皮肤和血管，后者目前正在临床试验中测试（例如，见Michelet al.,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Anim.,35(6),318(1999)；L'Heureux et al.,FASEBJ.,12(1),47(1998)；L'Heureux et al.,Nat.Med.,12(3),361(2006)；L'Heureux,et al.,N.Engl.J.Med.,(2007)357(14),1451；美国专利7,112,218和7,504,258，上述内容全部通过引用方式并入本文中)。一些SBTE方法涉及在培养基中堆叠或滚动层叠片（sheet layers），然后等它们粘附并强有力的融合在一起，从而制造更厚的组织。层叠片必须在一延长的时期内（称为成熟期）保持紧密并置，以实现不同层的融合。

虽然SBTE和TBTE都能制造纯天然的、没有修饰的、机械性能非常强的组织，但是产生的构建体非常密集，这不利于制造厚的组织，所述厚的组织需要布满血管网络以提供足够的气体、营养成分和废物的交换。因此有必要开发一种天然材料，其包括与天然组织相似的组织的微结构和微组织，并提供多孔结构以建立可遍布的厚组织如肝脏、肾脏、胰腺、大脑和脂肪组织。此外，基于组织片和基于线（thread）的结构创建具有宽范围组分梯度的复杂三维结构的能力有限。最后，SBTE和TBTE并不容易制造可注射的产品。

已提供了可注射形式的其他基于组织的材料，但是这些材料具有一些缺点。例如，Fascian^TM是由尸体组织制成的填充剂，其具有美容方面的应用（见Shore,Ophth.Plastic andReconst.Surg.,16(1),Jan.2000）。这种物质利用具有许多ECM的组织，但是相对来说细胞较少，因此不使用组织工程原理来构建。此外，Fascian不利用活细胞，因此通常以冻干的形式或者以被研磨或粉碎的颗粒提供。Fascian^TM也与组织工程材料不同，因而没有组织工程材料的优点，因为它不需要纯物质，其来源意味着它能包括所有种类的碾碎细胞，如来自血管、神经和免疫系统的细胞。这种缺乏同质性意味着不适合很多敏感的应用，特别是在可能发生排斥反应的应用中。

在此讨论的背景技术也用于解释本技术内容。在此并不承认所有涉及的材料在所附权利要求的优先权日是已经公开的，已知的或者是公知常识的一部分。

发明内容

本公开内容重点涉及细胞合成颗粒的制造和使用。特别是，本公开内容包括一包含一种或多种组织工程颗粒的组合物，所述颗粒包含一种或多种生物细胞和由细胞合成的一细胞外基质。

本公开内容进一步包括一制造组织工程颗粒组合物的方法，该方法包括：(a)在培养容器中种植细胞群；

(b)在允许组织片接触培养容器内表面来形成的培养条件下培养，其中所述组织片由细胞和细胞合成的胞外基质组成；以及（c）将组织片切成多个块，从而形成颗粒组合物。

本公开内容进一步包括一制造组织工程构建体的方法，该方法包括：（a）将一种或多种类型的细胞合成颗粒组合物放入容器中；（b）在允许颗粒融合的条件下培养颗粒，从而形成组织；以及（c）将组织切成构建体。

颗粒或组织包括具有机械和生物性能的颗粒，这些性能在医疗行业证明是有利的，并能在组织片制造中通过改变气候条件、改变组织上的压力和张力，或者通过调节培养环境的化学成分来实现。该细胞合成颗粒因此为细胞合成片（cell-synthesized sheets）和线提供一互补性的技术；它们提供一不同形式的用于制造组织工程构建物的构件，就像布、珠和绳子可以被用在纺织制造中一样。

本文所述的工艺能获得由未经修饰的天然ECM构成的生物颗粒。这会获得一在移植后不会引起明显免疫反应的产品。这些颗粒或组织可以部分或大体上失活或去细胞化。这些颗粒或组织可以结合其他组件，如生物材料、化学品、药品或生物制品来制造新的产品。

本公开内容提供在此描述的细胞合成颗粒的活体应用和使用。

此处的技术具有美学应用，以及用于外科手术。例如，在此描述的细胞合成颗粒可作为填充剂注射，用于纠正外形损伤、抬头纹等。在这个意义上，细胞合成的颗粒代表了现存形式的美容手术的替代物，以及这些形式的补充。例如，细胞合成颗粒可以与其他由塑料、陶瓷或尸体组织制成的填充物结合使用。

本公开内容另外还包括一以适合制造细胞合成颗粒的方式来培养组织的装置，以及一从组织片，如细胞合成组织片切割颗粒的装置。

附图说明

附图提供了示例性公开内容，结合本发明的详细说明、实施例以及所附的权利要求说明了本技术的各方面。

图1A和1B显示了在此进行进一步描述的示例性颗粒的显微图。比例尺显示在每个图中。在每种情况下，通过用镊子聚集最初从组织片切割的组织片段来机械调节颗粒。图1A是各种尺寸的干燥颗粒的明视野显微图，其直径大约为75μm、150μm、250μm和350μm。图1B是图1A中相同的三种最小颗粒水合（hydration）后的相衬显微图。现在大致的尺寸是165μm、260μm和600μm，表明水合后该颗粒的体积显著增加。虽然颗粒可以干燥储存，它们通常以“湿的”或水合的形式利用。发生水合相对比较容易，例如，将颗粒浸入水溶性介质中。水合时，典型的颗粒在水中将保持约50%的干重；

图2显示了水合颗粒的相衬显微图，经过切割产生的颗粒比图1A和图1B中的形状更加有棱角。这些颗粒没有通过机械调节来产生更圆的颗粒。图2的颗粒从180微米厚的组织片产生，其比图1A和图1B中用于生成颗粒的组织片更厚；

图3显示了颗粒在形成后如何取决于它们是否包括活细胞或死细胞来重塑。通过组织收缩证明了所述的重塑，在此通过二维表面面积（第一天约减少50%）的变化来测量活细胞的活性（每个时间点的左侧（深色）的柱）。如果细胞在形成颗粒之前被杀死，颗粒的投影面积保持恒定在约1.4mm²（在每个时间点的右侧（浅色））；

图4显示了一杆形组织片段，其通过基于颗粒的组织工程形成，本文对此进行进一步的说明。颗粒由人类成纤维细胞合成组织片产生，进一步与人类内皮细胞一起种植，并将其组装在具有多孔底部的管状模具内。在去模之前，将组织在离心式生物反应器中培养5天来灌注培养基。杆状组织约5mm厚，即使在其成熟期的早期，也能用镊子处理；

图5显示了在离心灌注条件下在培养基中培养5天后，通过基于颗粒的组织工程获得的组织的组织切片。苏木精和伊红染色（A板）显示了融合的颗粒和各种尺寸的复杂的管道网络。活的成纤维细胞分布在整个组织中。Masson的三色染色（B板）突出了组织的高胶原蛋白含量；

图6显示了种植失活（A）和活的（B）颗粒和内皮细胞，该颗粒是由基于颗粒的组织工程制造。两种染色都突出了具有第二细胞类型（这里是内皮细胞）的成纤维合成颗粒的覆盖区。A板显示了种植在先前灭活的颗粒的表面并培养5天的内皮细胞的免疫标记。使用的抗体是针对血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin），这是对内皮细胞具有特异性的分子，并位于细胞-细胞界面。此外，细胞核使用Hoechst33342染色。板B显示了种植在活性颗粒的表面并培养5天的内皮细胞的免疫标记。使用的抗体是针对血管假性血友病因子，这是对内皮细胞具有特异性的分子，并位于细胞质中。在板B中，因为颗粒包含活性成纤维细胞，培养5天形成的组织可由可视的管道来证实。与此形成对照的是，在板A中的失活的颗粒不形成粘性组织，并且在处理时会分散；

图7A和7B显示了用于从组织片制造细胞合成的颗粒的切割装置示例，7A为概述图，7B为切割部分的近视图。

具体实施方式

本发明公开的是细胞合成的生物颗粒，用于修复损伤的或有缺陷的器官或组织，还公开了与颗粒及其组合物制造和使用相关的设备、材料以及方法。该细胞合成颗粒可以使用组织工程技术制造。该细胞合成颗粒也可以用作研究目的的体外模型。该细胞合成颗粒可以组装成复杂的三维构建体，用作细胞培养的骨架，或组织或器官的替代物；它们可用作填充剂，例如作为可注射组合物的一部分，作为药物输送系统或作为伤口愈合设备。

制造细胞合成颗粒

在本文描述的技术的一个实施例中，细胞合成颗粒是通过切割组织片获得的。组织片优选是由在别处描述的或引用自别处的其他方法构建，并包括活细胞和由细胞产生的细胞外基质。其具有高机械强度，不需要人工的或其他外源骨架。适当组织片可以是50至300μm厚，并且通常大约为50-100μm厚。用于制造这种组织片的示例性方法和装置是基于片的组织工程的方法，在以下文本中有所描述：Michel et al.,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Anim.,35(6)，318(1999)；L'Heureux et al.,FASEBJ.,12(1),47(1998)；L'Heureux et al.,Nat.Med.,12(3)，361(2006)；L'Heureux,et al.,N.Engl.J.Med.,(2007)357(14)，1451；美国专利7,112,218和7,504,258，上述内容全部通过引用方式并入本文中。

组织片通过将成纤维细胞种植在无菌基质上，该基质有助于细胞增殖到密度为约1×10⁶细胞/cm²或更少，优选是约100细胞/cm²到1×10⁵细胞/cm²，更优选的为约1×10³细胞/cm²至5×10⁴细胞/cm²，最优选的为约1×10⁴细胞/cm²。细胞优选生长在无菌培养基中，其有助于细胞增殖和ECM生产。这种培养基的一个实例是将Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（高葡萄糖配方，无L-谷氨酰胺）和补充有4mM L-谷氨酰胺或等同物、20%牛胎儿血清（优选去除免疫球蛋白）和50μg/ml的抗坏血酸钠或其他胶原蛋白合成促进剂的Hams F-12培养基以3:1的比例混合。其他添加剂可用于促进胶原蛋白或其它ECM组分的（例如，弹性蛋白)生成。另外，可使用不含血清的培养基；这种培养基可化学限定。生长培养基每隔2-5天完全或部分用新鲜培养基替换。细胞保持在约含10%CO₂、20%O₂，温度为约37℃的环境中。组织片也可在低氧气浓度或不需要二氧化碳的培养基中生长。支持细胞增殖和ECM生产的其他细胞相容的试剂和培养条件可由哺乳动物细胞培养领域的技术人员确定。通常，组织片的培养期是约24周或少于24周，优选是约1-16周，更优选是约4-12周，最优选是约8周。

可通过将组织工程的片切割成很小的具有各种形状但通常是矩形的块来形成细胞合成颗粒。这些矩形可具有不同的尺寸范围（例如，面积为0.01mm²-400mm²，对应尺寸为0.1×0.1mm至20×20mm），以制造多种颗粒集合组合物。在这个实施例中，颗粒具有与组织片厚度相对应的尺寸。除了矩形，从组织片切割成的颗粒还可为其它形状（正方形、圆形、椭圆形、三角形等），以产生更复杂的构建体，以改善制造容易度，或者改善治疗用途或治疗效果。多种切割方式可以在同一组织片上产生不同的形状和尺寸。

在一个实施例中，组织片被切割成相同形状和尺寸的颗粒。在另一个实施例中，组织片被切割成不同形状和/或尺寸的颗粒。需要了解的是，当描述颗粒的宽度或直径时，并不意味着颗粒的一个横截面是圆形的，或甚至横截面是统一的。一宽度或直径因此可指的是颗粒的平均尺寸，或者颗粒外周的两点之间的最大距离的测量值。

可通过一种或多种机械设备如刀片、冲栽模、切割轮、冲压机或切割针来切割组织片。可用光（包括激光）、声、热或其他形式的能量将组织片破碎成颗粒。也可用液体或粒子喷射来实现切割。为了实现更高的精确度，可用模板（mask）、导板或者由计算机控制或协助切割。切割过程可部分或完全自动化。

在另一个实施例中，从组织片切割颗粒可通过使用空心针或空心针阵列来实现，每一个针都使颗粒从组织片中冲出。一般来说，这种方法需将一个很强的力应用到针上。描述的这种针能够制造尺寸为50μm×50μm的颗粒，但是其他尺寸也是可能的，如10-100μm×10-100μm。通常也需要将颗粒从空心针的开口推出，如通过向针下部射出或喷出气流。

在另一个实施例中，可使用自定义的破碎机1来从组织片制造颗粒，如图7A所示。显示在图7A和7B的这种破碎机的具体外形是纯示例性的形式。该撕碎机1的中央部分3包括一组织片（未显示）。可教导将该组织片置于上板7和下板5之间。组织片的张力可通过一个或多个螺栓9进行调节。一切割单元15包括杆11的阵列。在实施例中，这些杆平行排列成两排，其中杆在两排中的位置相互补偿（offset）。每个杆包含一开孔器（cut-out）13（如放大视图7B所示），其配置成用作刀片，以用于切割组织片。在该实施例中，切割单元朝箭头方向推进，向下切割组织片形成多个颗粒，因为每一行杆与组织片的前缘相交。当这些杆与组织片边缘接触时，这些杆可通过额外的垂直移动（与组织片平面垂直）来促进切割。一液流或刷子可用于从切割器上撞出颗粒，使得它们落入一位于组织片下方的容器（未显示）中。可使用各种尺寸的杆，以获得不同尺寸的颗粒，这与本文其他说明一致。

可在组织片形成的任何阶段或者在组织片与基质（组织片生长在其上）分离之前、之中或之后进行切割。如果切割了组织片，同时仍粘附在基质上，可通过机械分离、酶分离、化学分离或者通过热动力学改变（如温度或压力变化）或其他本领域已知的方法进行细胞合成颗粒分离。该组织片可在形成颗粒之前进行脱水或失活。在一个实施例中，切割方式可造成穿孔的线条，允许颗粒在稍后的时间进行分离。该切割方式可留下小部分组织使颗粒与其他颗粒相连，或者与组织片的剩余部分相连。这是一种形成颗粒串或者颗粒组以及具有颗粒边缘的组织片的方法。

如果组织群（cluster）生长在非常小的离散培养基表面以直接产生颗粒，则可不通过切割便生产出颗粒。离散表面可通过选择性处理培养基基质区域以促进细胞粘附到其他的非许可的基质上，或者通过处理限定的区域来抑制细胞粘附到通常许可的基质上来形成。这两种方式都可以结合使用。这些表面可以有多种形状，可以共享同一种培养基，并可以通过较薄的区域连接，以允许在后续阶段分离颗粒或使颗粒分裂开。可以使用别处描述的方法使这些颗粒从基质分离。

在此描述的细胞合成颗粒与先前科技文献中描述的细胞外聚集物明显不同（如Kelm,J.M.,et al.,J.Biotechnol.,17(2010)；以及Napolitano,A.P.,et al.,Tissue Eng.,13(8),2087(2007)）。通常被称为“自组装”，这些细胞聚集物由单细胞悬浮物或者小团体形成，其防止粘附到基质上。这些聚集物主要由细胞组成并不包括大量的ECM。这种差异对后续的用聚集物进行组织装配以及可能的治疗用途具有重要影响。ECM的存在对细胞行为和存活产生积极影响，并提供了机械结构。此外，在悬浮中形成的细胞聚集物可具有超高的、非生理需要的细胞密度，其通常会导致细胞在培养或移植过程中死亡。ECM的缺乏和过高的细胞密度将需要在移植过程中对由这种聚集物制成的构建体进行大量的重塑。此外，过量的死细胞和细胞碎屑可能会导致过度发炎。因此，由细胞聚集物制成的移植体的几何形状可根据时间以不利的方式改变。

与此相反，由于本文描述的细胞合成颗粒复杂但天然的ECM，以及由于它们的细胞密度是更典型的正常组织，一旦移植后，其可允许人造组织和器官更好地保持其结构。

组织片和初始颗粒

这些颗粒可以从自同源或非同源(同种异体的)人类细胞、动物（异种的)细胞产生或从基因修饰的细胞（人类或动物细胞）或其任意组合中产生。颗粒可完全由人类细胞甚至自体细胞产生，以避免免疫反应。

尽管成纤维细胞作为生产颗粒的首选细胞类型，颗粒可使用任何其他产ECM的细胞类型，例如但不限于：多种所谓的基质细胞、肌成纤维细胞、肌细胞或其前体、平滑肌肉细胞或其前体，巨噬细胞、成骨细胞或其前体、间充质干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞（包括附属物），胚胎干细胞、诱导多能干细胞或其任意组合。这些细胞可以在组织片生产期间同时或按顺序种植。某些细胞在免疫性方面可具有重要优势，但是本文描述的基于颗粒的组织工程的方法和应用并不限于特定细胞类型。在一些实施例中，细胞不是成纤维细胞，并且细胞培养基中也不包括成纤维细胞。

此外，不产生ECM的细胞可与产生ECM的细胞合并以实现其他生物功能，以便于制造或在移植中起到治疗作用。这些细胞可以在组织（例如组织片）产生的开始或中间过程中加入。替代地，可在组织片生产工艺结束时（在颗粒形成前）将不产生ECM的细胞种植到组织片的表面和/或底部。能使用这种方法的不产生ECM的细胞类型包括但不限于，神经元或其前体，神经胶质细胞或其前体，岛细胞或其前体，肝细胞或其前体，内皮细胞或其前体、间皮细胞、角化细胞或来自肾单位的细胞。

用于生产组织片的基质可以是薄膜或薄层生物相容性材料，例如但不限于，永久（例如非生物降解的）合成聚合物（如ePTFE)，可吸收或可生物降解的合成聚合物(如聚乙醇酸)，生物材料(如胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白质、多肽)。在一个实施例中，基质可与组织片一起切割，变成颗粒的一部分，因而产生复合颗粒。这种复合产品提供了一种更简单的方法来制造颗粒，避免了从基质中分离生物材料的步骤。在一些情况下，在其被注射到病人体内后，基质本身有利于细胞合成颗粒的治愈，或者根据本文进一步描述的是可塑形的。基质也可作为填充物，其减少了每个体积单位的产品的成本。

在组织片生长过程中，外源性成分可加入到培养基中并被嵌入或以其他方式并入组织片，最终成为由组织片生产的颗粒的一部分。这些组件包括，但不限于，天然或合成多肽、蛋白质、糖蛋白、蛋白多糖、抗体、多聚糖、DNA或RNA、转染试剂、抗生素、药物、金属颗粒、不溶性矿物晶体或颗粒、聚合物颗粒、放射性试剂、药物输送系统，或射频识别(RFID)芯片或其他磁性或电子设备。除了识别目的，这些添加物可以促进或加强进一步的处理、存储、诊断、外科使用或修复。

生产后颗粒的处理

当被引入到对象中时，存活的细胞合成颗粒能提供满足需要的生物效应或有利的治疗。然而，用于生产细胞合成颗粒的组织片或颗粒本身也可被杀死或被去细胞化（decellularized）（两种过程在本文其他地方用术语“灭活”指代）。可以全部灭活或部分灭活。这可以通过以下本领域所知的任意方法或方法的组来实现，包括但不限于，干燥、加热、冷却、冷冻、加入化学品如酸、碱、酶、盐、毒素或溶剂，或应用多种形式的能量，包括但不限于，超声、辐射、机械力和渗透压。灭活过程可能有次级效应并且可能是为了隐藏的目的，如增加机械强度、减低而进行的免疫原性或形成血栓、便于生产或提高种植成功率而进行的。这通过，例如，在同种异体或异种异体种植中降低不利免疫反应的危险来提高颗粒的治疗效果。这也可简化颗粒的工序、存储以及运输。对于更复杂的基于颗粒的产物的组装，灭活也是必需的或实用的。

从培养基分离后，细胞合成的颗粒可直接用于移植或组织组装，或可使它们存活在培养基中，让组织发生收缩或其他生物变化。可将颗粒处于机械调节的应力下，例如，与搅拌、压缩或滚动相关的那些力。图4显示了颗粒表面的面积在培养基中随时间如何变化，这取决于细胞是活的还是死的。

在一个实施例中，颗粒保持在搅拌生物反应器的悬浮液中。在保持细胞生存能力中，在颗粒上引起流体切应力是尤其重要的，从而产出有用且有利的产物。应该理解的是，这可能是因为搅拌液体介质加速O₂转移进入细胞中的结果。

同样众所周知的是，液体的切变会改变细胞的蛋白表达形式。这个动作还会引起细胞产出或降解胶原质或其他蛋白。活的（非灭活的）细胞合成颗粒可以保存在生物反应器中，或任何其他本领域所知的储存系统中，以应用物理性压力和应力（机械调节），或建立其他环境条件（例如，适当的O₂浓度和温度）来保持颗粒的生存能力。也可以低温保藏细胞合成的颗粒，并采用本领域已知的方法以冷冻的形式储存来保持生存能力。应该理解的是，几乎不可能实现所有细胞完全的（全部的）生存能力，总有一些细胞会死去。

也可以机械地加工颗粒以将它们塑造得更为球状的或卵形的颗粒，例如，通过在平面上滚动颗粒。这可以连同一个或多个干燥或再水化的步骤来完成。除了其他方面，这能给制备颗粒提供更好的注入性能。

此外或替换地，能用不同强度的强烈交联试剂，包括用于实现全部灭活或部分灭活的醛类来处理细胞合成的颗粒或组织片，从而降低免疫原性的影响、阻止生物降解、改变机械性能或简化化学或生物化合物直接依附到颗粒或组织片。

如本文其他地方描述的颗粒，也能被杀死和/或在如前述的条件下交联。可以在本文描述的任意生产步骤中杀死活的颗粒。灭活时或灭活后，可以通过压缩力、磁力、静力（isometric）、等渗力、调制力或其他形式的力或大量的力（regiments of forces）包括液体的剪切应力在任意一个方向或多个方向来机械调节活的颗粒。灭活的颗粒可以保存在不同的液体中，如水溶液、酒精或交联剂溶液中，以及干燥或冷冻保存。

在生产细胞合成的颗粒、活的或灭活的颗粒或用于制造颗粒的组织片的任何时候，产物都可涂抹不同的试剂来改善愈合、机械性能或治疗效果，来标记产物，或来便于进一步的加工。这些试剂包括，但不限于，外源蛋白或多肽、蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖、天然的脱氧核糖核酸（“DNA”）、重组DNA、天然的核糖核酸（“RNA”）、重组RNA、病毒试剂、转染试剂、生长因子、抗增殖试剂、抗体、抗生素或防腐剂或这些化合物的任意片段或组合。

在制造颗粒、活的或灭活的颗粒或用于制造细胞合成颗粒的组织片前、后或期间的任意时间点，都可种植新的或额外的细胞。额外的细胞可以与用于颗粒生产的细胞类型相同或不同，或者是细胞群的组合。这些额外的细胞可以是自体的或非自体的人类（同种异体的）细胞、动物细胞、转基因的细胞（人类或动物的）或它们的任意组合。这些额外的细胞可以是产生ECM的或不产生ECM的细胞。这些额外的细胞可用于改善愈合、机械性能或治疗效果，用于标记产物，或用于方便进一步的加工。实际上，使用额外的细胞的结果是形成复合颗粒，这可以以前面描述的任意或全部方式改变。

向颗粒中加入高度分化的新细胞可以成为修复或替换目标组织或器官的工具。例如，为了生产新的肾组织，在注射前，可以在颗粒的表面种植原代肾细胞群。一旦肾细胞附到了颗粒上并充分地繁殖开，这能在合适的生物反应器中实现，种植了细胞的颗粒就能注射到合适的位置来建立新的组织。替代地，高度分化的细胞可在切割颗粒之前加入到组织片中，或者简单地，与颗粒一起注射。如果成纤维细胞的存在对结果具有负面影响的话，可以用灭活的颗粒代替。

在另一个添加额外细胞的实施例中，可以向颗粒中加入心肌细胞、肌细胞或它们的前体，以及可能的话，加入内皮细胞并注射到衰竭的心脏的壁中。虽然基于细胞的心脏衰竭治疗显示很有前途，但是一个令人烦恼的问题是注射到心脏壁中的细胞保留率和存活率很低。注射附在颗粒上的细胞能增加保留率，这是由于简单的机械阻碍，并且能增加存活率，这是因为细胞事实上附在天然的ECM上，而不是在悬浮液中。

本文描述的细胞合成颗粒的主要用途是作为可注射组合物的部分。这种组合物可以直接注射到需要修复的位置。用于注射的针的大小根据颗粒的平均粒径而不同。因而，本文包含颗粒的组合物可用作皮肤填充剂，例如，在整容手术中。这种组合物与本领域使用的非生命的和无机材料（例如，塑料和陶瓷）不同，至少是因为它提供了变成真正融入周围组织的可能性。如本文其他地方所描述的，本技术的组织工程化颗粒也与由尸体的组织制成的、具有美容用途的皮肤填充剂Fascian不同，它们提供更好的质量控制，因为例如，它们能从单一的细胞系/供体生产。

将细胞合成颗粒组装成复合结构

可从活的细胞合成颗粒制成具有多孔结构及复杂几何形状的紧密结合的并完全生物化的活体组织。因为组织中存在大量的孔隙空间，这些组织的机械强度不如由SBTE或TBTE创建的组织。强度在很大程度上依赖于组织的融合，而由于存在孔隙，仅有部分的颗粒是联系的。由SBTE制成的组织片具有固有的强度，而由TBTE制成的线具有产生强度而没有融合的排列方式。

然而，通过本文描述的方法创建的颗粒在组织片和线上还具有其他重要的优势。最突出的是，PBTE产出具有很大孔隙空间的组织，这允许复杂通道网络的发育。这些通道能用作创建血管、淋巴管、分泌管、呼吸道或其他类似的结构。为了这一目的，可在孔隙空间中种植高度分化的细胞。这些结构可以模仿不同的器官和组织，如肝脏、肾脏、大脑、胰腺、肺、脂肪组织、骨骼、软骨或其他。这些结构中的孔隙空间也能用其他材料填充，例如外源ECM（来源于其他地方，并包含例如，纤维蛋白或弹性蛋白的ECM），从而获得所需的结构或治疗效果。此外，PBTE能方便复杂几何形状的形成，因为其能实现几何的、多孔性和细胞内含物的广泛及精细分布。例如，通过组装不同大小和不同形状的颗粒，可以创建广泛的组织孔隙度。合在一起，这些特征意味着PBTE为生成血管化的大体积器官提供了明显的优势。利用多种可用的组装技术，可将大体积的器官与孔隙或通道的网络组合在一起，其中孔隙或通道的网络可以连接身体的脉管系统。

可以使用细胞合成颗粒来产出多种二维（即，平面的），但优选三维的构建体。本发明最简单的实施例中，使在生物反应器的培养基悬浮液中的活的颗粒沉到容器的底部，并保持在有助于细胞存活的环境条件中。经过多个小时，甚至多天、多周甚至多个月的成熟期后，由于细胞的活动（例如，细胞间粘附、细胞-ECM粘附和ECM的合成），颗粒将融合在一起。成熟的时间通常由开发者控制，并且基于对具体的细胞类型和特定应用目的（由参数如组织硬度来界定）的经验来决定的。

诱导颗粒融合的方法可以包括多种物理方法（离心、压缩、浓缩，通过例如在颗粒中包含磁性物质，然后采用磁场在颗粒上施加力、静电力等来磁力加入颗粒）。在一个实施例中，将颗粒放置在灭菌的管中，管的一端打开，而另一端用滤纸封闭。装有颗粒的管放置到装有培养基的生物反应器中，并且能同心地旋转来引起离心力和培养基流过颗粒团。也可以使用诱导颗粒融合的药理学方法：一个方式是通过向培养基中加入添加剂来促进细胞运动。也可以使用粘附剂，例如生物胶或化学胶。可以使用分子粘附剂，例如采用多肽、蛋白、抗体等的配体-受体组合。也可以使用来自外源的酶活性。在另一个实施例中，颗粒包被在水凝胶或其他化合物中，从而创建包含多种颗粒的粘性组织。在另一个实施例中，颗粒封闭在生物相容的膜中，或其他设备形成的外壳中。在另一个实施例中，使用灭活的颗粒，并且使用化学交联剂来建立颗粒间的连接。

这种构建体可以通过颗粒的连续组装形成具有相同或不同性质的多个层来产生。这种构建体可以通过组合相同或不同细胞类型（可以使用任何颗粒组合物）的活颗粒和灭活颗粒来产生。可以使用不用大小的颗粒。可以改变沉降表面的几何形状来控制构建体的几何形状。颗粒可以集合到模子或圆柱体（cast）中。通过使用特殊的灌装（tinning）和特别订制分布的颗粒大小，可以得到广泛的复杂结构。

组织构建体中的额外的孔隙空间可以这样构建：通过在颗粒组装期间完全或部分地包埋外源的物体，然后一旦颗粒融合则移除这个物体。替代地，外源的物体可留在该组装体中，用于促进颗粒融合、机械性能、治愈或治疗效果，用于标记产物，或用于方便进一步的加工。该物体可采用天然的或合成的材料制成，并且性质上永久的或可吸收的。该物体是本文提及的任意外源组分，可能嵌入或包含在切割出颗粒的组织片中。此外，该物体可以比那些嵌入片中的更大，因为组装好的基于颗粒的构建体比组织片的厚度要大得多。额外的物体可包括管或套管（cannulas）以及多种类型的连接器、柄、线、环、磁体以及连接、缝合或固定装置，以便于组织操作、移植或进一步的加工。这些物体也可包括例如心血管支架或血管移植物的装置。

出于相同的理由，如前对单种颗粒所述，这些构建体可以经历相同的处理和过程。例如，这些构建体可保持存活以允许进一步的细胞活性和重塑。它们可以干燥或冷冻保存在多种液体中。活的构建体可以使用本领域已知的方法来冷冻，从而保持部分的生存能力。如本文其他地方所描述的，可将该构建体暴露在机械力下、与不同的试剂交联或涂抹不同的试剂来部分或完全地灭活。

在该构建体建立后，或建立期间的任意时候，可向该构建体中加入新的细胞。该细胞可以与用于颗粒生产的细胞的类型相同或不同，或者是细胞群的组合。这些细胞可以是自体的或非自体的人类（同种异体的）细胞、动物细胞、转基因的细胞（人类或动物的）或它们的任意组合。这些细胞可以是产生ECM的或不产生ECM的细胞。这些额外的细胞可用于促进颗粒融合、改善机械性能、治愈或治疗效果，用于标记产物，或用于方便进一步的加工。构建体中的通道可以种植合适的高度分化的细胞来模仿待替换的组织或器官。

可将本文描述的细胞合成的颗粒和细胞合成的组织片（例如，参见美国专利US7,112,218和US7,504,258），以及细胞合成的线（美国专利申请公开号为2010-0189712的文献）来生产更复杂的构建体，上述内容全部通过引用方式并入本文中。

如本文描述的颗粒可为器官修复以及几乎任何身体组织替换提供支撑结构，并且用于包括，但不限于，肝脏、肾脏、大脑、胰腺、肺、脂肪组织、骨骼和软骨的修复或替换。此外，颗粒可用于整形手术和重建手术，充当再生剂、填充剂或疏松剂。在一个实施例中，颗粒可使用类似注射器的设备来注射。

组织构建体可以通过在体外培养细胞合成的颗粒来组装。例如，颗粒可以沉到模子中，如通过将一种或多种细胞合成的颗粒放入容器中，并与其他培养基（media）结合。可以加入其他细胞来帮助颗粒融合在一起并形成组织。然后，该模塑的组织可以形成所需的构建体，例如通过使用不同的成形切刀。

本文描述的颗粒可以制成一系列尺寸。例如，当颗粒是从细胞的片切割出来时，颗粒的宽可从100微米到2厘米。颗粒宽的其他范围包括10-150微米、1mm到10cm、0.5cm到5cm以及1到2cm。

还有其他范围，包括10-25微米；25-50微米；50-75微米；75-100微米；100-150微米；150-200微米；200-250微米；250-300微米；300-500微米；500-750微米；750-1000微米；1000-1250微米；1250-1500微米；1500-2000微米；2000-2500微米；以及2500-5000微米。应当理解的是，选自前面范围的清单的各自不同的范围，上限值和下限值组成的其他范围也可用于描述颗粒宽的有用范围。进一步应当理解的是，以准确值（例如，250微米）表达的范围可替代地以具有不准确的表达（例如，大约250微米），因此，包含了略超出准确规定的范围的值。通常，使用“大约”表示±5%的不精确度。另外的宽度例子是0.4、0.6和0.8厘米。优选的颗粒大小落入0.1到1mm的范围内。大小可以以总体平均值来表示。所以，例如，从组织片上切割的颗粒总体的大小落入具体的范围内，如长和宽0.3到0.5mm，即总体平均值是从0.3到0.5mm。如本文其他地方所述，颗粒的厚度来源于切割出颗粒的组织片的厚度，并且通常为0.05到0.3mm。由线性参数表示颗粒大小并不排除量化大小的其他方式，例如，通过说明对应的体积。

实施例

实施例1可注射的细胞合成的颗粒

培养24周后，将细胞合成的组织片（由本文其他地方描述的方法生产的）切割得到颗粒。对于这种应用，优选面积大约1mm²的颗粒，其近似直径大约250微米的球状的体积，但可使用任意能得到可注射颗粒的颗粒大小。该组织片是从培养基上机械分离出来，并转移到切割板上的。使用多个刀刃的仪器，在一个方向上切割组织片，然后在垂直的方向上切割，从而制成分离的颗粒。将颗粒放入亲和细胞的悬浮液中，制成细胞合成的颗粒。可以马上注射该颗粒，或经过一段从几分钟到多个月的时间，使其缩回到更球状的形状，或者重塑。这可在提供特定培养条件，例如搅拌或培养基的生物反应器中实现，这可促进颗粒的重塑以及存活，从而改善治疗效果。

移植之前，用特定的缓冲液冲洗颗粒几分钟到几天来移除培养基中不需要的成分，如牛血清，它会对成功移植产生不利的影响。它们可以与能够提升植入物的愈合、增加制备量或具有其他有利效果的试剂一起孵育，或简单地，一起注射。例如，试剂在注射部位能促进血管形成，从而提高颗粒的存活和新生组织（neo-tissure）的生成以及稳定性。在另一个实施例中，如果注射的颗粒是用于骨骼修复处理，该试剂有助于钙化。在另一个实施例中，颗粒与纤维蛋白胶、或其他骨架胶一起注射，从而在注射后形成更有粘着力的团。

实施例2用于组织修复的多孔骨架

在这个实施例中，在37℃及10%CO₂下，活的颗粒在培养基处于搅拌状态（40RPM）的生物反应器中生产（截面积1mm²）和保持3天。然后，将颗粒浇到具有多孔底部的模子中。例如，该模子可以是一个末端由具有100μm的孔的聚酯网封闭的硅树脂圆筒（内部直径为1cm）。一旦将颗粒倒入管中，则用中央内径1mm开孔的塞子封闭另一端。然后，将该模子安装到旋转轴上，使得网背对轴，塞子面对轴（管是水平放置的，而轴是垂直的）。随着轴绕其纵向轴线旋转，管对于轴呈放射状。得到的离心力使组织保持靠在网上，并确保培养基在组织中的交换。3周后，颗粒融入到组织中，可以从模子中移出。这个组织可以移植到病人体内来填补缺陷。组织中的空隙空间将有助于移植物的血管形成，并保持其整体的几何形状。

一个替代的方法中，将组织灭活，并且整个重新注入病人自己的细胞。从制造的立场看，这种方法具有明显的优势，因为灭活的移植物比活的组织更容易保存和运输。此外，如果组织片用同种异体的细胞产生，通过避免一些免疫反应，灭活的组织可引起增强的愈合效果。如果成纤维细胞抑制组织的血管生成或其他有利的重塑，甚至灭活的自体组织可引起更好的效果。也可通过加入例如，肝素覆盖层来结合到构建体的空隙空间的腔表面来实现更好的愈合。肝素能进一步与能加快基质血管生成的血管内皮生长因子一起加入。

一个美容的应用是轮廓缺陷造型或替换肿瘤缺陷（oncologic defects）。为了临床上可转移策略（translatable strategy）的发展，存在许多重建的、美容的和矫正的发展可能，从而使用病人自己血管化的组织来修复移除的大块癌组织。

实施例3包含高度分化的细胞的多孔骨架

如本文其他地方所述，可使用活的或灭活的细胞合成颗粒来建立多孔骨架。在移植前，可以用细胞群来种植骨架。种植了的骨架具有基于细胞群来模仿或补充任何器官的正常功能的能力。这种细胞的模仿可用于起生化作用，例如，生产胰岛素，或结构作用。在一个实施例中，可以种植内皮细胞或它们的前体细胞来构建血管的功能性网络，比自发重构要更快，其中内皮细胞从受体周围的组织迁移。通过具备功能性的脉管系统，植入物更可能保持它原来的形状，并为美容手术和重建手术提供更好的产品。在组织形成期间，可将一个或多个管状结构部分地整合到组织中，这样，剩下的自由端可以嫁接到受体的血管，而另一端嵌入组织中并与组织中的通道相连，因此允许组织的灌流。也可以在体外进行灌流来促进组织的形成，并为移植做准备。

此外，高度分化的细胞可以与内皮细胞一起使用来增加额外的功能。例如，如果与脂肪细胞或它们的祖细胞（progenitors）一起种植，该颗粒构建体就能在乳房再造中，为外科医生提供预定体积的特定病人的脂肪组织源。如果与胰细胞一起种植，当用葡萄糖激发时，这个构建体将产出胰岛素。如果与原代肾细胞一起种植，这个构建体将重组成一功能性血液过滤单元。如果与肝细胞一起种植，这个构建体可种植到有缺陷的肝脏中来增强解毒功能。

实施例4研究模型

颗粒可用于构建复杂的细胞培养模型，这重新创造了体内肿瘤微环境的观点来研究肿瘤发育、进展及在多方位上治疗的动力学。颗粒可用于构建复杂的细胞培养模型来研究在灌流下血管网络的发展。

实施例5PBTE、TBTE和SBTE的组合

当涉及到组织和器官设计时，细胞合成的组织片、线和颗粒的每个都具有明显的和不同的优势。在这个实施例中，可将组织自身卷绕来形成一外壳（enclosure）。该外壳通过使用线，作为缝合材料并将组织片的边缘缝合起来，从而完全或部分地封闭。然后，外壳可用高度分化的细胞（如，肝细胞）种植的颗粒来填充。该外壳能与组织片形成的管连接，如美国专利US7,112,218中所述，从而形成灌流系统。可用内皮细胞种植这个组织片的空隙空间。通过一段适当的培养时期后，这个组装体就可通过将管与病人的循环系统连接来移植到病人体内。一些管可以连接到肝管、胆管或直接连接到十二指肠。这些构建体能提供完全的类似肝脏的生物结构。这些组织片和线可采用生物可相容的材料来代替。本领域技术人员可以看出，通过改变使用的高度分化的细胞、改变构建体的几何形状和改变移植的位置，可以造出任意数目的器官。这种方法甚至可以通过在内层表面移植内皮细胞和气道上皮细胞，并且将一些管道连接到支气管来造出肺。

应该理解的是，虽然本文描述的方法和装置是通常应用于制造人类使用的组织颗粒，但是，该方法和装置也可用于兽用和农业用途，如宠物和家畜使用的组织颗粒。一般地，本文的方法和装置应用于哺乳动物，但这些方法也可用于制造鸟类、爬行类、两栖类和水生动物如鱼的组织。

以上描述旨在举例说明本技术的多个方面。而不旨在以本文记载的实施例来限制后附的权利要求。本发明现已完整公开了，本领域技术人员应当明白，在没有背离后附权利要求的精神或范围下，可以做出多种改变和修改。

为了所有的目的，所有本文引用的参考文献的全文以引用的方式并入本文。

Claims (22)

1.一种包含一种或多种组织工程颗粒的组合物，所述颗粒包含一种或多种生物细胞和由所述细胞合成的一细胞外基质。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物细胞包括两种或更多种细胞类型。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞大体上被灭活。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞经基因方法改造过。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒的直径从大约50微米到大约5毫米。

6.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括一外源成分。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述外源成分是一天然的或合成的组分，选自：多肽、蛋白质、糖蛋白、蛋白多糖、抗体、多聚糖、DNA或RNA、转染试剂、抗生素、药物、金属颗粒、不溶性矿物晶体或颗粒、聚合物颗粒、放射性试剂、药物输送系统，或射频识别芯片或其他磁性或电子设备。

8.一种制造组织工程颗粒组合物的方法，该方法包括：

(a)在培养容器中种植细胞群；

(b)在允许组织片接触培养容器内表面来形成的培养条件下培养，其中所述组织片由细胞和细胞合成的胞外基质组成；以及

(c)将组织片切成多个块，从而形成颗粒组合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞包括一种或多种类型的选自以下细胞的细胞：成纤维细胞、基质细胞、肌成纤维细胞、肌细胞或其前体、平滑肌肉细胞或其前体、巨噬细胞、成骨细胞或其前体、间充质干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞（包括附属物），胚胎干细胞、诱导多能干细胞或其任意组合。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，细胞群经基因方法改造过。

11.根据权利要求8所述的方法，进一步包括将多个块从底物分离。

12.根据权利要求8所述的方法，进一步包括在切割之前，将组织片从底物移出。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，每个所述块的面积是从大约0.01mm²到大约400mm²。

14.根据权利要求8所述的方法，进一步包括大体上将组织片或生物相容的颗粒组合物灭活。

15.根据权利要求8所述方法，进一步包括：

（i）在外源组分存在下培养粘附细胞；或

（ii）将外源组分和组织片或形成的颗粒组合物结合。

16.根据权利要求8所述的方法，进一步包括用交联剂处理组织片或颗粒组合物。

17.根据权利要求8所述的方法，进一步包括在切割前干燥组织片。

18.一种制造组织工程化构建体的方法，所述方法包括：

（a）将一种或多种类型的细胞合成颗粒组合物放入容器中；

（b）在允许颗粒融合的条件下培养颗粒，从而形成组织；以及

（c）将组织切成构建体。

19.根据权利要求18所述的方法，进一步包括部分地灭活所述构建体。

20.根据权利要求18所述的方法，进一步包括在所述组织中或所述组织上种植一种或多种细胞。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞合成的颗粒由权利要求8所述的方法制成。

22.权利要求1所述的组合物是适合于注射的形式。

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