KR100907323B1 - 세포의 매크로매스 배양에 의해 생성된, 세포의 조직-유사조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물, 및 매크로매스 배양방법 - Google Patents

Abstract

매크로매스 배양이라는 용어의 높은 세포-씨딩-밀도에 의한 세포의 3차원 조직-유사 조직체가 기술된다. 매크로매스 배양에 의해, 스캐폴드의 도움없이 조직-유사 형태로 그들을 구조화하도록 세포를 만들 수 있고 3차원 거시적 조직-유사 구조물은 세포로부터 전적으로 만들어질 수 있다. 조직-유사 조직체 및 거시적 조직-유사 구조물은 중간엽 기원의 섬유모세포로부터 (적어도) 생성될 수 있고, 이것은 분화된 세포이거나 다중효력의 성인 줄기 세포가 될 수 있다. 이 작업에서, 조직-유사 조직체 및 거시적 조직-유사 구조물은 피부 섬유모세포, 지방 기질 세포-유도 뼈형성 세포, 연골세포, 및 골모세포로부터 생성되었다. 거시적 조직 형성을 초래하는 요인은 단위 면적 또는 3차원 공간 당 높은 세포 씨딩 밀도에서의 대규모 배양 즉, 대규모로 수행된 매크로매스 배양이다. 조직 생성에 어떤 스캐폴드나 외래의 매트릭스가 사용되지 않고, 조직은 완전히 세포 기원의 것이다. 조직-유도 화학물질, 조직-유도 성장 인자, 특별한 성질을 갖는 바닥, 회전 배양 등과 같은 조직 형성을 돕는 어떠한 다른 작용제(높은 세포-씨딩-밀도를 제외하고)도 조직 형성을 위해 채택되지 않는다. 이들 조직-유사 물질은 인체에서 조직 대체물로서 사용하기 위한 잠재력을 갖는다. 높은 세포-씨딩-밀도에 의한 조직-유사 조직체는 또한 미시적 수준에서도 또한 생성될 수 있다.

연골, 뼈, 중간엽, 섬유모세포, 매크로매스 배양, 조직, 거시적, 고-밀도 세 포 씨딩, 3차원, 지방, 피부.

Description

세포의 매크로매스 배양에 의해 생성된, 세포의 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물, 및 매크로매스 배양 방법{TISSUE-LIKE ORGANIZATION OF CELLS AND MACROSCOPIC TISSUE-LIKE CONSTRUCTS, GENERATED BY MACROMASS CULTURE OF CELLS, AND THE METHOD OF MACROMASS CULTURE}

본 발명은 조직 공학에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 세포의 3차원 조직-유사 조직체의 생성에 관한 것이다. 보다 더 구체적으로는, 본 발명은 질병에 걸리거나 손상된 상태를 위한 치료법으로서 인체에서 가능한 이식을 위한 3차원의 거시적인, 조직-유사 구조물의 제작에 관한 것이다.

인체는 다른 장기의 몇가지 질병에 걸리거나 손상된 상태로 인해 고생할 수 있으며, 이를 위한 한가지 치료적 접근법은 외래에서 입수되거나 또는 개발된 조직 등가물에 의한 손상된 부분의 교환이다. 예를 들어, 피부와 화상이나 궤양은 적절한 피부 등가물의 적용으로 치료될 수 있고, 골절된 뼈에서의 결합되지 않는 틈은적절한 뼈 대치물의 이식에 의해 치료될 수 있고, 관절 연골의 손상은 적절한 연골-형성 이식물에 의해 회복될 수 있다.

매년, 외과의사는 장기 기능상실 또는 조직 손실을 경험하는 환자를 치료하기 위해 외과수술 절차를 수행한다. 외과의사/내과의사는 한 개인에서 다른 개인 으로 장기를 이식함으로써, 복원 수술을 수행함으로써, 또는 신장 투석기, 인공 엉덩이 관절, 또는 기계적 심장 판막과 같은 기계적 장치를 사용함으로써 이들 환자를 치료할 수 있었다. 비록 이런 접근법이 많은 생명을 구했지만, 그들은 한계에 직면한다. 심장, 간, 및 신장과 같은 장기의 이식의 한계는 외과적 기술이 아니라, 바로 제공자 장기의 이용가능성이 드물다는 것이다.

자연적으로 이용가능한 이식물의 가능한 종류는 동물로부터 얻은 이종이식, 사람 제공자로부터 얻은 동종이식, 및 환자 그 자체의 건강한 부분으로부터 얻은 자가이식이었다. 이종이식은 면역 부적합성 및 레트로바이러스를 포함하는 인수공통 병원체의 전달의 문제를 갖는다. 동종이식은 제공자의 면역 거부 및 이용불가능성의 문제를 갖는다. 자가이식은 필요한 양의 적절한 조직의 부족과 환자에 대한 외상의 증가의 문제를 갖는다.

외과 재건술을 위해, 조직은 환자의 한 부분으로부터 또다른 부분까지 이동될 수 있다. 이들 자가이식(환자로부터 조직 이식)은 화상을 위한 피부 이식, 심장 우회로 조성술을 위한 혈관 이식, 및 얼굴 및 손 재건술을 위한 신경 이식을 포함한다. 자가이식을 사용하는 것의 단점은 또한 제공자 부위에서 복합 외과수술의 필요성 및 기능의 손실을 포함한다. 게다가, 외과 재건술은 종종 본래 의도되지 않은 목적을 위해 신체 조직을 사용하는 것을 수반하고 장기간 합병증을 초래할 수 있다.

기존의 치료 옵션의 이들 결점의 결과로서, 공학적으로 가공된 조직 등가물에 대한 요구가 존재하고, 새로운 학문 분야로서 떠오른 것은 조직 공학의 과학이 다. 그것의 목표는 기본적인 연구에서 모델 시스템으로서 사용하기 위해서뿐만 아니라, 보다 중요하게는, 손상되거나 병에 걸린 신체 일부를 위한 대체 조직으로서 사용하기 위해 배양에서 조직을 생성하는 것이다. 물론, 사람 치료를 위해 생체인공 조직 및 장기를 발생시키기 위한 노력은 적어도 30년으로 거슬러가고, 그러한 노력이 오직 마지막 10년에서만 임상적 성공에 가까워졌다. 이는 분자 및 세포 생물학, 세포 배양 기술, 및 재료 과학에서의 주된 발전에 의해 가능해졌다.

"조직 공학"이라는 용어는 비교적 최근이고 생체인공 조직 및 장기의 발달을 향한 공학의 원리 및 생명 과학을 적용하는 다른분야간 제휴의 분야를 기술하기 위해 지난 5년에 더욱 널리 사용되었다.

랩-성장 조직의 생성을 위해 채택된 주요 전략 중의 하나는 세포를 잘 다루어 기능 조직으로 발달되도록 할 조건 하에서 3차원 주형 또는 스캐폴드 (매트릭스)위에서 분리된 세포의 성장이다. 이식될 때, 이 생체인공 조직은 구조적으로나 기능적으로 체내로 통합되어야 한다. 매트릭스는 콜라겐과 같은 천연 재료 또는 플라스틱과 같은 합성 폴리머로부터 형성될 수 있다. 궁극적으로, 스캐폴드 재료는 시간에 걸쳐서 생물분해 가능해야 하고 조직 성장을 위한 초기 3차원 주형으로서 작용해야 한다.

세포가 자라고 스캐폴드에서 분화할 때, 그들은 조직을 재생시키는데 필요한 다양한 단백질을 만들어낼 것이다. 스캐폴드의 분해는 오직 천연 조직이 체내에 남아있다는 것을 보증한다. 또한 세포로부터 조직을 만드는 일을 위한 다른 기술을 통합하는 다른 종류의 생물 반응 장치가 존재한다.

사실상 체내의 모든 조직은 생체공학을 위한 잠재적인 타겟이고 과정은 많은 최전선에서 신속하게 일어난다. 장기로서 피부에 대해서, 다른 종류의 공학적 대체물이 개발되었다 - 피부는 변하는 정도의 성공을 갖는 몇가지 다른 접근법을 사용하여 재-엔지니어링되었다.

미국 특허 No. 5489304은 콜라겐-콘드로이틴 황산염-유도된 피부 유사 층에 결합된 합성 바깥층을 갖는 비-세포 이식을 설명한다. 배양된 상피 자가이식이 적용되기 전에, 상처에 초기에 놓이는 이 대체물은 그것이 피부 상처 치유에 중요한 성장 인자들 또는 이들 인자들을 공급할 수 있는 세포가 부족하다는 단점을 갖는다.

미국 특허 No. 5460939는 세포인 또다른 이식을 기술한다. 여기서, 섬유모세포가 생물-재흡수가능 락트산 / 글리콜산 코폴리머 메시에서 성장하여 시트를 형성한다. 이 이식에서, 스캐폴딩 메시가 천연 기원이 아니다.

Eaglstein & Falanga (1997)는 소 콜라겐 매트릭스에서 성장한 섬유모세포를 갖는 피부 층을 포함하는 피부 이식을 기술한다. 이 이식에서, 세포외 매트릭스 는 세포에 대해 외래에서 제공되고, 이것은 비록 사람 콜라겐을 제조하지만, 외래의 성분은 이식 적용 시점에서 남아있다.

미국 특허 No.5613982는 사람 시체 피부는 항원 세포 성분을 제거하도록 가공되어, 면역적으로 불활성 피부 층을 남기는 이식을 기술한다. 이는 무세포이고 사람 시체 피부를 쉽게 이용할 수 없다는 한계를 갖는다.

상기 모든 예에서, 등가물의 제조를 위한 기술 요건은 꽤 복잡하고, 따라서 제품의 비용을 증가시킬 것이다. 아스코르브산염을 사용하는 섬유모세포의 세포 시트가 개발되었지만, 그러한 시트의 형성은 약 35일을 필요로한다(Michel etal, 1999; L'Heureux et al, 1998).

따라서, 개발을 위한 재료를 쉽게 구할 수 있고, 이것은 일부 환자에서 염증 반응을 일으킬 수 있는 합성 또는 천연의 외래의 매트릭스를 갖지 않고, 그것이 성장 인자들 및 다른 단백질을 생산할 수 있도록 하는 세포이고, 이것은 비교적 더 짧은 시간에 제조될 수 있고, 그것의 제조는 기술적으로 간단하여 따라서 제품은 보다 비용-효과적인 피부 등가물의 개발의 필요성이 존재한다.

조직-엔지니어링 생성물의 분야에서 주의를 요구하는 영역은 골절이 치료되지 않고, 결합되지 않는 틈을 남긴 환자를 위한 뼈 대체물이다. 자가조직 뼈 이식은 환자에 대한 외상을 증가시킨다. 다른 접근법이 골 엔지니어링(Service, 2000)에서 시도되고 있다. 골 형성을 유발하는 성장 인자가 주입된 콜라겐 매트릭스와 같은 생체재료가 시도되었지만, 그러한 구조물은 세포 성분이 부족하고 요구되는 실질적인 양의 성장 인자의 합체는 그것을 매우 비싼 대안으로 만든다. 중간엽 줄기 세포가 씨딩된 세라믹 또는 하이드록시아파타이트 매트릭스는 다른 접근법이지만, 그러한 스캐폴드의 사용은 인체를 위해 이상적일 수 없다. 따라서, 뼈의 치유를 초래할 비용-효과적인 세포 이식물에 대한 필요성이 존재한다.

조직-엔지니어링 제품의 분야에서 주의를 요하는 또다른 영역은 연골 회복이다. 관절 연골이 손상후 완전한 회복에 대한 제한된 능력을 가진다는 사실이 알려져있다. 자가조직 연골세포 이식의 세포-기반 치료법은 좋은 임상적 결과를 보여 주었지만(McPherson & Tubo, 2000) 완전한 회복을 위한 시간이 매우 길기 때문에, 개선의 여지가 충분히 남아있다. 가능하게는, 세포부유액보다는 미리형성된 조직 이 이식에 대해 더 우수한 결과를 줄 것이다. 또한, 미리형성된 조직은 외과수술 이식에 대해서 자유 세포보다 유리하다. 따라서, 다양한 접근법은 세포와 스캐폴드를 사용하여 연골-유사 구조물을 만드는데 시도되고 있지만, 이식물에서 세포가 자연 연골 형성 과정을 근접하게 흉내내도록 허용할 이상적인 스캐폴딩 매트릭스 는 도전과제로 남아있다(Kim & Han, 2000). 따라서, 손상 부위에 이식될 때 효과적으로 연골 회복을 일으킬 수 있고, 또한 비용 효과적인, 미리형성된 조직의 개발의 필요성이 존재한다.

요약하면, 치료 목적을 위해 비교적 저가의 살아있는 세포 조직 대체물을 개발하기 위한 요구가 존재한다. 3차원 조직을 개발하기 위해 일찍이 언급한 기술적으로 복잡한 생물 반응 장치는 고가의 방법론이다. 또한, 일반적으로, 새로운 방법에 의해, 테스트했을 때, 기존의 대체품보다 한가지 이상의 관점에서 더 우수한 성능을 갖는 것으로 입증될 수 있는 조직 대체물의 개발에 대한 필요성이 항상 존재한다.

시간의 필요성을 기다리면서, 본 발명의 과학자들은, 인체에서 조직 대체물로 사용될 잠재력을 갖는 신규 3차원 거시적인 조직-유사 구조물을 개발하였다. 이들 조직-유사 구조물의 신규 특성은 어떤 스캐폴드 또는 외래의 매트릭스도 조직 발생에 필요하지 않고, 조직은 완전히 세포 기원으로 형성될 수 있다는 점이다. 또한, 조직-유도 화학물질, 조직-유도 성장 인자, 특별한 성질을 갖는 바닥, 회전 배양과 같이 조직 형성을 돕는 다른 작용제(높은 세포-씨딩-밀도를 제외하고)가 조직 형성을 위해 채택되지 않는다. 조직-유사 구조물 형성을 위한 특정 복합 배지 요구조건은 없다. 거시적인 조직-유사 구조물 형성을 초래하는 인자는 단위 면적 또는 공간 당 높은 세포 씨딩에서 세포의 대규모 배양이다.

조직 공학의 결정적인 관점은 세포를 조립하여 조직 또는 3차원 구조로 만드는 방법이다. 본 발명은 이것을 달성하기 위한 신규 방법을 제공한다.

4. 발명의 목적

상기의 관점에서, 따라서 세포를 모아 3차원 조직-유사 조직체 및 조직-유사 구조물로 만드는 신규 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

또한 상기의 관점에서, 따라서 질병에 걸리거나 손상된 상태를 위한 치료법으로서 인체에서 가능한 이식을 위해 3차원 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

조직학적으로 유능한 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다. "조직학적 유능"이란 이들 조직-유사 구조물이 분열없이 쉽게 섹션될 수 있다는 것을 의미한다.

피부 섬유모세포로 만들어진 엔지니어링 잠정적 피부 등가물, 지방 기질 세포-유도 뼈형성 세포 또는 골모세포로 만들어진 뼈-유사 성질을 갖는 잠정적 대체물 및 연골세포로 만들어진 연골 회복을 위한 잠정적 대체물과 같이, 세포의 3차원 조직-유사 조직체 및 중간엽 기원 (적어도)의 섬유모세포 세포로 만들어진 비용-효과적인 잠정적 조직 등가물을 제공하는 것이 여전히 또다른 본 발명의 목적이다. 다른 조직을 제공하는 가능성을 제시하는 것이 본 발명의 관련 목표이고, 또한, 이것은 이들 다른 세포 타입은 본 발명에서 정의된 바와 같이 매크로매스 배양시에 그들이 조직-유사 물질 형성을 겪을 수 있게 하는 성질을 갖는다면, 본 발명의 방법에 의해 대응하는 세포 타입으로부터 구성되는 것이 가능하다.

스캐폴드 또는 외래의 매트릭스 또는 조직 발생을 위한 복합 생물 반응 장치를 사용하지 않고 세포의 3차원 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 본 발명의 여전히 또다른 목표이다.

조직-유도 화학물질, 조직-유도 성장 인자, 특별한 성질을 갖는 바닥, 회전 배양 등과 같은 조직 형성을 돕는 어떤 작용제도 사용하지 않고, 세포의 3차원 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 본 발명의 여전히 또다른 목적이다.

조직 형성을 돕는 어떠한 다른 작용제에 대한 요구조건 없이, 배양 용기의 단위 면적 또는 공간 당 높은 세포 씨딩 밀도를 사용함으로써 형성된, 세포의 3차원 조직-유사 조직체 및 다른 종류의 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 여전히 또다른 본 발명의 목적이다.

최종 형태로 높은 세포 밀도를 갖는 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 여전히 또다른 본 발명의 목적이다.

특정 복합 배지 성분의 요구조건 없이 형성될 수 있는 세포의 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 본 발명의 여전히 또다른 목적이다.

성장 및/또는 조직-형성 배지에서의 적절한 변화에 의해 그것의 성질이 원하는 성질을 포함하도록 변조될 수 있는, 세포의 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 본 발명의 여전히 또다른 목적이다.

요구조건에 따라 다른 융화성 성장 표면의 매크로매스 배양에 의해 형성될 수 있는, 세포의 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 여전히 또다른 목적이다.

그들의 형성을 위해 사용된 방법의 2차원에서 간단한 정률 증가, 즉, 매크로매스 배양에 의해 더 큰 크기까지 정률 증가될 수 있는 거시적인 조직-유사 구조물을 제공하는 것이 본 발명의 여전히 또다른 목적이다.

또다른 본 발명의 목적은 미시적 수준에서 3차원 조직-유사 조직체를 제공하는 것이다.

5. 발명의 설명

본 발명에서는, 매크로매스 배양에 의해 세포를 3차원 조직-유사 조직체로 모으기 위한 방법과, 매크로매스 배양의 신규 방법이 제공된다. 세포의 매크로매스 배양에 의해 발생된, 조직학적으로 유능한 거시적인 3차원 조직-유사 구조물이 제공된다. 본 발명은 조직 공학에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 질병에 걸리거나 손상된 상태를 위한 치료법으로서 인체에서 가능한 이식을 위한 3차원 조직-유사 구조물의 제작에 관한 것이다. 본 발명은 3차원 조직-유사 형태로의 세포의 구성을 위한 방법을 제공하고 조직-유사 형태 그 자체를 기술한다.

조직의 제작은 인체에서 질병이 난 조직의 대체를 위한 중요한 목표이다. 조직 공학에 대해서 세포의 조직-형성 능력을 탐구하고 보강하기 위한 노력이 이루어지고 있다.

세포 이식의 조직 공학의 과정은 다음의 주요 (2) 단계를 수반한다-

i. 세포를 적절한 공급원으로부터 획득하는 단계. 획득된 세포는 원하는 세포 타입으로의 분화처럼 적절한 제조를 필요로할 수 있다.

ii. 적절하게 제조된 세포를 사용하여 조직을 구조화하여 다른 조직 엔지니어링 제품을 제조하는 단계.

본 발명은 이들 단계 중 두 번째 단계를 역설한다. 본 발명자들은 세포의 3차원 조직-유사 조직체의 발생 및 살아있는, 세포의, 잠정적 조직 대체물의 형성을 위한 간단하고 비용 효과적인 방법을 개발하였다.

본 발명의 조직-유사 구조물은 적절한 지지 및 핸들링 디바이스 또는 기구의 도움으로, 그들을 보유하는 용기로부터 외과수술로 그들을 몸에서 필요한 위치에 위치시키는 과정에 필요하기 때문에, 물리적인 조작 및 핸들링을 견딜 수 있는 응집성 강도를 갖는다.

스캐폴드-기반인 조직 대체물의 발생에서 오늘날까지 실질적인 양의 작업을 수행하였다- 이들은 중요한 구조적 및 종종 기능적 성분으로서 스캐폴드를 포함한다. 이 스캐폴드는 생체적합성, 생물분해성 (결국 오로지 천연 조직만 몸에 남아있도록)의 성질을 가지고 최적 세포 기능에 대한 허용 환경을 제공하도록 요구된다. 가능한 모든 관점에서 이상적인 스캐폴드의 개발은 도전과제로 남아있다. 본 발명에 의해 발생된 3차원 조직-유사 구조물은 스캐폴드의 도움없이 만들어지기 때문에, 본 발명은 그것이 스캐폴드를 통합할 필요성을 회피한다는 잇점을 가진다. 본 발명의 매크로매스 방법에 의한 조직학적으로 유능한 조직-유사 구조물의 형성은 스캐폴드를 필요로하지 않는다. 따라서 본 발명의 조직-유사 구조물 또한 어떤 관점에서 이상적이 못되는 스캐폴드의 사용과 연관될 수 있는 어떠한 부작용 또는 결점도 제거한다. 본 발명에서, 세포외 매트릭스는 세포 그 자체에 의해 합성되고, 사용된 외래의 매트릭스 성분은 없다. 배양 용기의 단위 면적 또는 공간 당 높은 세포 밀도에서 세포를 간단히 씨딩함으로써 조직 형성이 일어난다. 이는 세포의 3차원 조직-유사 형성 또는 구성을 위한 배양 시스템으로서 정의되는, "매크로매스" 배양이라고 명명되었고 이때, 세포는 cm² 당 약 10⁶ 세포의 영역에 걸치는 범위로 배양 용기의 단위 면적 또는 공간당 높은 밀도로 씨딩되고 조직 형성을 돕는 어떤 다른 작용제에 대한 요구가 없다. 매크로매스 배양의 더 넓은 정의는 고-밀도 세포 씨딩에 의해, 세포로부터 거시적인 또는 미시적, 3차원 조직-유사 조직체를 발생시키고, 3차원 공간에서 세포의 높은 밀도의 특정 유리한 범위에서 세포들을 함께 아주 근접하게 가져가고, 이는 3차원 조직-유사 상태로의 세포의 응집성 통합을 촉진하는 방법이고, 조직 형성을 돕는 어떠한 다른 작용제에 대한 요구는 없다. 유리한 범위 내에서의 세포의 특정 높은 씨딩 밀도는 주어진 공간내에서 달성될 것이 요구된다. 유리한 높은 세포 씨딩 밀도의 매크로매스 범위에서, 배양 용기의 바닥에서 세포에 의해 점유되는 3차원 공간 내에서 세포들이 함께 안정될 때, 그들은 조직 형성 모드로 그들을 유발시키거나 신호를 보내는 서로 근접한 상태가 되고 그로인해 응집력있게 통합된다. (매크로매스 범위의 세포 씨딩 밀도가 평편 또는 굴곡의 바닥을 갖는 용기에서 달성될 수 있었다는 것이 주목될 수 있다) 매크로매스 배양을 위해 직경 약 0.75cm 이상의 배양 용기를 사용하는 결과는 거시적인 3차원 조직-유사 구조물의 형성이고, 여기서 "거시적인"이라는 말은 조직의 크기가 적어도 그것이 보통 사람의 육안으로 시각적으로 쉽게 식별할 수 있는 것을 의미한다.

이전에 알려진 조직 배양 시스템, 고-밀도 마이크로매스 배양은 세포의 연골원 분화를 위해 사용되었고, 그러한 배양의 범위는 10 내지 20 μl 스폿의 세포 부유액으로 제한되었다(Yoon et al, 2000). 관행에 따라, 마이크로매스 배양으로서 시험관내 배양될 때, 팔다리 중간엽 세포는 마이크로매스 스폿의 영역을 커버하는 개별적인 결절로서 존재하는 전연골 응축 또는 응집괴의 형성을 겪는다(Ahrens et al, 1977). 이렇게 형성된 세포 결절은 중간에 결절로 형성되지 않은 세포와 서로 분리되고 미시적이다. 모든 세포는 함께 하나의 응집괴를 형성하는 더 큰, 아직 미시적인, 절구 구조가 나중에 명세서에서 언급되는 바와 같이, 성장 인자와 같이 배양 배지에 추가된 특이 성분의 요구와 함께 생성된다. 그러나, 본 발명자들에 의해 생성된 조직-유사 물질은 거시적이고(조직 형성을 돕는 어떠한 특정 작용제의 도움없이 형성되고), 따라서 인체를 위한 조직 대체품으로서 잠재력을 가질 것이 요구되는 양질의 크기를 갖는다. 본 발명의 매크로매스 배양에 의해 조직-유사 조직체에서, 모든 세포는 따라서 전체인 통합된 조직-유사 조직체의 일부가 되고; 개별적인 결절이 없다. 배양에 의해, 다리 전연골 중간엽 세포가 결절 패턴을 만들었다는 것이 일찍 발견되었다(Downie & Newman, 1994). 날개 전연골 중간엽 세포가 마이크로매스 배양에 의해 시트 패턴을 만든 동안; 본 발명의 매크로매스 배양 시스템과는 달리, 이것은 무혈청 배양 시스템 안에 있었다. 또한, 다리 전연골 중간엽 세포는 시트-유사 패턴을 생성할 수 있었지만, 다시 매크로매스 배양과는 달리, 이것은 무혈청 배지에서 TGFβ1로 처리하였고, 이때 조직 형성을 돕는 어떤 특이 작용제도 조직-유사 시트 형성을 위해 요구되지 않고 무혈청 조건에 대한 요구도 없다.

지금까지, 전체 조직-유사 물질 형성을 초래하는 세포-세포 응집이 배지에서 조직 형성을 돕는 어떠한 특정 작용제 없이, 높은 세포-씨딩-밀도 배양에 의해 일어날 것인지의 질문은 조사되지 않았다. 그러나, 본 발명자들의 작업은 이 문제를 역설하였고 본 발명은 긍정적으로 대답한다.

고-밀도 배양은 미시적 개별적인 결절 형성과 함께 연골형성을 유발하는데 사용되었지만, 인체에서 대체품을 위한 거시적인 조직의 발생을 위한 더 큰 거시적인 규모로, 지금까지 평가되지 않았다. 심지어 미시적 규모로도, 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 매크로매스 배양과 달리, 오로지 특정 작용제의 도움으로만 전체 응집괴가 형성된다.

첫번째 개념에서 용어 "매크로매스"는 "마이크로매스"의 단순한 확장을 의미하는 것처럼 보일 수 있으나, 마이크로매스가 세포의 연골원 분화를 위한 방법으로서 발전되었고 또한 심지어 미시적 전체 절구 응집괴 형성을 위한 특정 복합 배지 요구조건을 포함하는 반면, 매크로매스은 세포의 3차원 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물의 발생을 위한 방법이고, 형성을 위한 특정 복합 배지 요구조건이 없다는 중요한 관점에서 실제로 다르다(아래에서 언급한 바와 같이).

현재까지, 세포 응집괴의 발달을 향한 노력이 이루어졌고, 그것의 결과는 절구라는 명칭의 미시적 물질였다. 절구는 비-점착성 접시(Takezawa et al, 1993), 스피너-플라스크 배양 (Abu-Absi et al, 2002), Eudragit와 같은 폴리머 물질 (Yamada et al, 1998), Matrigel (Lang et al, 2001), Primaria 접시 (Hamamoto et al, 1998), 폴리-D-리신 코팅된 접시 (Hamamoto et al, 1998), 프로테오글리칸 코팅 (Shinji et al, 1988), 배양 배지 흐름 (Pollok et al, 1998), 회전 배양 (Furukawa et al, 2001), 액상 오버레이 기술 (Davies et al, 2002), 인슐린, 덱사메타손 & 섬유모세포 성장 인자와 같은 세포-세포 부착을 강화하는 인자들(Furukawa et al, 2001), 응집-촉진 폴리머-펩티드 접합체 (Baldwin & Saltzman, 2001), 회전-벽 생물 반응 장치 (Baldwin & Saltzman, 2001), 등과 같이 조직-유사 형성을 돕는 다양한 작용제의 도움을 받아 간세포와 다른 세포로부터 만들어진 3차원 세포 구조이다. 이들 절구와 달리, 조직-유사 형성을 돕는 어떠한 그러한 작용제의 도움없이, 우리의 작업에서 만들어진 조직 물질가 생성된다. 위에서 언급된 절구가 훨씬 더 작고, 대부분 밀리미터 또는 서브-밀리미터 범위에 있다. 본 발명에서 기술된 바와 같이 매크로매스 배양에 의해 거시적인 조직 물질을 만드는 것이 가능하기 때문에, 이들은 인체에서 필요한 위치에서 위치하기 위해 절구보다 분명한 이점이 있다.

본 발명자들이 공개된 문헌에서 발견한 절구 중 가장 큰 것(직경 약 1 mm)은 고-밀도 펠릿 배양에 의해 형성되었다 (Mackay et al, 1998). 그들의 형성은 TGF-β3, 덱사메타손, 아스코르브산염 2-포스페이트 및 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물을 함유하는 무혈청 한정된 배지의 존재하에서 일어났고 여기서 그러한 것으로서 무혈청 한정된 배지는 매크로매스 배양에 의해 조직 발생에 요구되지 않는다. 골수 유도된 중간엽 원조 세포의 펠릿 배양을 사용하여 선행하는 보고에서, 절구 응집괴 형성은 DMEM + 10% FCS에서 배양된 펠릿에서 일어나지 않았고 (Johnstone et al, 1998), 반면에 매크로매스 배양에 의한 조직-유사 구조물은 DMEM + 10% FCS에서 형성한다는 것이 밝혀졌다. 다각적 잠재적인 중간엽 세포의 마이크로매스 배양에 의한 절구 형성이 보고되었고; 여기서 다시 절구 응집괴 형성은 TGFβl 또는 소 뼈 추출물과 함께 마이크로매스 배양의 처리했을 때만 일어났다(Denker et al, 1995). 미시적 뼈 세포 절구는 TGFβl (Kale et al, 2000; 미국 특허 출원 no. 20020127711)을 함유하는 무혈청 배지의 존재하에서 형성한다고 보고되었고 TGFβl의 존재하에서 그리고 혈청의 존재하에서 세포의 배양은 보고된 바와 같이 이 방법에서 골 세포 절구 형성에 필수적이다. 상기 작업에서, 약 1x10³ 세포/cm² 내지 1x10⁶ 세포/cm²의 세포 배양 밀도가 절구 형성에 유리한 것으로서 기술되었다. 상기 작업으로부터 그것을 구분하는 본 발명의 조직-유사 구조물의 다른 특징들에 더하여, 즉, 거시적이고, 혈청의 부재를 필요로하지 않고 & 형성을 위해 TGFβ1를 필요로하지 않음에 더하여, 유리한 씨딩 밀도 범위 또한 다르다. 본 발명자들의 작업에서, 조직-유사 구조물은 1x10⁵ 세포/cm² 이하에서 일어나지 않은 반면, 상기 작업의 1x10³ 세포/cm²는 100-배 더 낮다. 뼈형성 태아 줄기 세포의 세포-응집괴 또는 결절이 형성되었지만(Buttery et al, 2001), 다시, 본 발명에서 기술된 바와 같이, 이들 결절은 미시적이었고 높은 세포-씨딩-밀도 배양에 의해 형성되지 않았다. 매크로매스 배양에 의해 발생될 수 있는 본 발명의 조직 물질은 대규모로 수행될 때, 거시적이고, 따라서 개발된 어떤 절구보다 훨씬 더 큰 크기는, 형성을 위한 그러한 특정 복합 배지 요구조건이 없다. DMEM + 10% FCS와 같은 간단 배지는 매크로매스 배양에 의한 조직-유사 구조물 형성에 충분하다. 세포의 응집성 플러그는 연골원 세포 미국 No. 5,723,331)로부터 일찍이 형성되었지만, 세포 부착을 방해하고 따라서 고정의 세포를 허용치 않는 표면을 갖는 미리성형된 웰은 이를 위한 결정적인 요구조건이고, 그러나, 본 발명에서, 조직-유사 구조물 형성을 위한 그러한 표면에 대한 요구조건은 없다.

본 발명의 한 구체예에서, 조직-유사 시트는 잠재적인 피부 대체물로서 사람 피부 섬유모세포로부터 형성된다. 사람 피부 섬유모세포가 동종이계 받는이에게 전달될때 비교적 비-면역성이라는 것이 알려져있기 때문에, 피부 섬유모세포는 동종이계 기원이 될 수 있다(미국 특허 no. 5460939). 이 조직-유사 시트는 피부 등가물이 될 잠재력을 갖고, 그것을 위한 재료는 쉽게 이용가능하고, 이것은 일부 환자에서 염증 반응을 일으킬 수 있는 합성 또는 천연 외래의 매트릭스를 갖지 않고, 이것은 그것이 성장 인자와 다른 단백질을 생산할 수 있도록 하는 세포이고, 비교적 더 짧은 시간 후에 제조될 수 있고, 그것의 제조는 기술적으로 간단하여 생성물이 보다 비용-효과적이다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 매크로매스 배양에 의해, 뼈-유사 성질을 갖는 조직-유사 물질은 뼈 골절에서 작은 결합되지 않는 틈의 치유를 야기할 잠재력을 가질 수 있을 잠정적 조직 대체물로서, 지방 기질 세포-유도된 뼈형성 세포로부터 발생된다. 이는 가능한 자가조직 치료법이 될 수 있다. 이 조직-유사 물질은 외래의 스캐폴드가 없이, 비용-효과적인 세포 이식물이 될 잠재력을 가질 수 있고, 이것은 뼈에서 작은 틈의 치유를 초래할 수 있다. 본 발명에서, 조직-유사 구조물은 또한 뼈-유도된 골모세포로 만들어졌다.

본 발명의 여전히 또다른 구체예에서, 조직-유사 시트는 관절 연골 손상을 갖는 환자에서 연골 회복을 유도하는 잠정적 이식물로서, 사람 연골세포로부터 개발되었다. 연골세포는 연골의 작은 생체검사로부터 얻어질 수 있기 때문에, 이 조직-치료법을 위해 자가조직 연골세포가 사용될 수 있다. 이 조직-유사 시트는 손상의 부위에 이식될 때, 효과적으로 연골 회복을 일으킬 수 있고, 또한 비용-효과적일, 미리형성된 조직이 될 잠재력을 가질 수 있다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 미시적 3차원 조직-유사 조직체은 젤라틴 스폰지 내에서 매크로매스 배양에 의해 발생된다.

요약하면, 매크로매스 배양에 의해 발생된 본 발명의 조직-유사 구조물은 스캐폴드와 외래의 세포외 매트릭스가 없는, 살아있는, 세포, 조직 대체물이 될 잠재력을 가질 수 있고, 그것은 기술적으로 만들기 간단하며 따라서 비용-효과적이다. 치료 목적을 위한 조직 대체물로서 상세하게 기술된 본 발명의 조직-유사 구조물은, 또한 시험관내 약물 테스트 등과 같은 다른 용도도 발견할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예는 아래에 기술된 바와 같이, 수반된 도면에서 더욱 도해된다

도 1. (a) 피부 섬유모세포 (b) 지방 기질 세포 (c) 연골세포 (d) 골모세포로부터, 3.5 cm 접시에서, 매크로매스 배양에 의해 형성된 거시적인 조직-유사 구조물을 보여주는 사진.

도 2. 세포-세포 부착 프로세스는 지방 기질 세포의 매크로매스 배양에서 (a) 매크로매스 배양 시작 후 1시간 (b) 매크로매스 배양 시작 후 6시간 일어나는 조직-유사 구조물 형성을 야기한다.

도 3. 피부 섬유모세포의 매크로매스 배양에 의해 형성된 조직-시트의 조직학적 검사 (a) 헤마톡실린 & 에오신 염색은 3차원 조직체를 보여주고 (b) Masson-Trichome 염색은 콜라겐 합성을 보여준다.

도 4. 지방 기질 세포로부터 유도된 뼈형성 세포의 매크로매스 배양에 의해 형성된 조직-유사 구조물의 조직학적 검사 (a) 헤마톡실린 & 에오신 염색은 3차원 조직체를 보여주고 (b) Masson-Trichome 염색.

도 5. 연골세포의 매크로매스 배양에 의해 형성된 조직-유사 구조물의 조직학적 검사 (a) 헤마톡실린 & 에오신 염색은 3차원 조직체를 보여주고 (b) Masson-Trichome 염색.

도 6. 콜라겐 타입 I의 포지티브 검출을 나타내는, 피부 섬유모세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물의 조직학적 섹션의 콜라겐 타입 I 면역염색.

도 7. 생활력을 평가하기 위해 매크로매스 배양에 의해 피부 섬유모세포로부터 만들어진 분리된 조직 시트로부터 재성장된 세포.

도 8. Reverse Transcriptase-PCR에 의해 검정된, 매크로매스 배양에 의해 피부 섬유모세포로부터 형성된 조직 시트의 유전자 발현 분석. 피부의 상처 치유 프로세스에 중요한 것으로 알려진 다양한 유전자에 해당하는 RT-PCR 생성물은 2 % 아가로스 겔 (M) DNA 분자 크기 마커에서 전기이동작용되어 나타난다 (1) 콜라겐 타입 I (2) 신데칸 2 (3) 테나신-C (4) 혈관 내피 성장 인자 (5) 콜라겐 타입 III (6) 섬유결합소 (7) 각질형성세포 성장 인자 (8) 형질전환 성장 인자 1β.

도 9. 지방 기질 세포로부터 유도된 뼈형성 세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물에서의 유전자 발현. RT-PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 (M) DNA 분자 크기 마커에서 전기이동작용되어 나타난다 (1) 콜라겐 타입 I (2) 오스테오폰틴 (3) 부갑상샘 호르몬 리셉터 (4) 뼈 형태형성 단백질 2 (5) 뼈 형태형성 단백질 4 (6) 뼈 형태형성 단백질 리셉터 IA (7) 뼈 형태형성 단백질 리셉터 IB.

도 10. 연골세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물에서의 유전자 발현. RT-PCR 생성물이 2% 아가로스 겔 (M) DNA 분자 크기 마커 (1) 애그레칸 (2) 콜라겐 타입 II (3) 콜라겐 타입 X에서 전기영동된 것을 보여준다.

도 11. (a) 조직-유사 구조물내에서 국소 실제 골 형성(Masson-Trichome) 및 (b) 국소 칼슘 침착 (Von Kossa)을 나타내는, 조절된 뼈형성 배지의 존재하에서 지 방 기질 세포로부터 유도된 뼈형성 세포로 만들어진 조직-유사 구조물의 조직학적 분석, 매크로매스 배양에 의해 만들어진 조직-유사 구조물의 성질이 배지에서 변화에 의해 조절될 수 있다는 것을 증명한다.

도 12. (a) DMEM + 10% FCS (b) 연골원 배지의 존재하에서 연골세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물의 조직학적 섹션 (Toluidine Blue 염색), (b)에서 연골-특이 세포외 매트릭스 형성을 보여주고, 매크로매스 배양에 의해 만들어진 조직-유사 구조물의 성질은 배지의 변화에 의해 조절될 수 있다는 것을 증명한다.

도 13. 피부 섬유모세포로부터 만들어진 조직-유사 시트 및 콜라겐+섬유소 겔로 구성되는 복합체 대상의 조직학적 섹션 (Masson-Trichome 염색), 매크로매스 배양에 의해 만들어진 조직-유사 조직체는 대상의 성분이 될 수 있다는 것을 증명한다.

도 14. 젤라틴 스폰지 내에서 매크로매스 배양의 조직학적 섹션 (헤마톡실린 & 에오신 염색), 형성된 미시적 3차원 조직-유사 조직체의 군집을 보여준다.

본 발명의 다양한 다른 관점이 하기 섹션에서 더욱 상세하게 기술된다.

7. 재료 및 방법 :

본 발명의 발명자에 의해, 전체의 발명의 상세한 설명과 부가된 청구범위 전체에 걸쳐서, 비록 배양 용기의 면적이 원형 배양 용기의 직경의 관점에서 언급되었지만, 관점은 실제로 어떤 형태의 배양 용기도 포함하는 것으로 기술되고, 그것의 면적은 언급된 직경의 원형 용기의 그것과 동일하다고 명백하게 설명된다. 또 한, 본 명세서에서 제시된 작업이 편평한 바닥을 갖는 용기에 관한 것이지만, 매크로매스 배양은 편평하거나 편평하지 않은 바닥을 갖는 배양 용기에서 달성될 수 있었다.

7.1. 세포 분리, 배지 및 배양 -

본 발명에서, 사람 피부 섬유모세포를 사람 피부 생체검사법으로부터 분리시켰다. 디파아제(Sigma, St. Louis, USA)로 처리함으로써 진피를 표피로부터 분리되었다. 진피를 잘께 썰고 DMEM + 10 % FCS중의 0.01 % 콜라게나아제로 밤새 소화시키고 그후 세포를 부착시켰다. 세포를 37℃에서 5% CO₂에서 DMEM + 10 % FCS 에서 배양하였고 트립신-EDTA 용액을 사용하여 2차배양하였다. 지방 기질 세포를 Zuk 등(2001)에 의해 기술된 프로토콜에 따라 사람 지방흡인 재료로부터 분리시켰다. 이들 세포를 DMEM + 10 % FCS에 유지시켰다. 이들 세포는 Zuk et al (2001)에 의해 기술된 프로토콜에 따라 뼈형성 분화로 유도되었다. DMEM + 10 % FCS의 유지 배지에서 배양하기 전에, 연골을 잘게 썰고 콜라게나아제로 처리함으로써 연골세포를 사람 연골 조각으로부터 분리시켰다. 골모세포는 유사한 과정에 의해 사람 뼈로부터 분리시켰고 50μg/ml 아스코르브산을 갖는 DMEM + 10% FCS에서 유지시켰다. 뼈형성 지방 기질 세포가 다음의 2차 배양에서 동일한 세포에 대해 뼈형성 배지의 일부로서 자라고 있었던 배지를 사용함으로써 조절된 뼈형성 배지를 제조하였다. Zuk et al (2001)에 따라서 연골원 배지를 제조하였다.

7.2. 조직-유사 구조물 형성 -

조직-유사 구조물의 형성이 매크로매스 배양에 의해 달성되었고, 이것은 본 발명의 상세한 설명에서 일찍이 정의된 본 발명의 신규 방법이다. 배양된 세포를 트립신-EDTA을 사용하여 수확하였다. 그들은 적절한 부피의 배지에 재현탁되었고 바람직하게는 cm² 당 약 10⁶ 세포의 씨딩 밀도로 또는 매크로매스 유리한 범위의 조직-형성 세포 밀도로 3.5 cm의 웰 직경을 갖는 배양 접시에서 씨딩된다. 따라서, 바람직하게는, 단일 조직의 형성을 위해 약 10⁷ 세포 전체가 6 웰 플레이트 (9.6 cm² 면적)의 단일 웰에서 씨딩되었다. 더 작거나 더 큰 조직-유사 구조물을 위해, 씨딩된 세포의 총 수는 조직-유사 조직체에 유리한 씨딩 밀도를 달성하도록 조절되었다.

7.3. 조직학적 분석 -

형성시, 조직-유사 구조물을 고정시키고 조직학적 검사를 위해 가공하였다. Von Kossa 염색 및 Alcian 블루 염색을 Zuk et al (2001) 및 Bancroft et al (1994)에 의해 기술된 방법에 따라, 본 발명의 적절한 조직 구조물에서 수행하였다. Oil Red O 염색을 Bancroft et al (1994)에 의해 기술된 방법 에 의해 수행하였다. Toluidine Blue 염색을 다음과 같이 수행하였다- 섹션의 탈파라핀화 및 수화후에, 그들을 2% 수성 Toluidine Blue 용액에 1 분동안 염색시키고, 그후 2-3 분동안 물에 세척하였다. 섹션을 그후 100% 아세톤의 2 변화에서 탈수시켰고, 그후 자일렌에서 맑게하고 탑재하였다.

Histopathology Laboratory at Sir Hurkisondas Nurrotamdas Hospital & Research Centre, Mumbai, India에 의해 다른 조직학적 과정을 수행하였다.

7.4. 면역조직화학 -

염소 항 콜라겐 타입 I 항체 및 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA 의 ABC 염색 시스템을 사용하여, 파라핀-침투시킨 조직의 섹션에서 콜라겐 타입 I 면역염색을 수행하였다.

7.5. 형성된 조직-유사 구조물에서 세포의 생활력 -

본 발명의 조직 물질을 잘게 썰었고, 15분동안 무혈청 DMEM 중의 0.5 mg/ml 콜라게나아제로 소화시켰고, 방출된 세포를 성장 배지에 재현탁시켰다. 알리콧을 Trypan Blue으로 염색하였다. 세포를 배양 플라스크에서 씨딩하여 생활력을 평가하였다.

7.6. 유전자 발현 분석 -

피부 섬유모세포, 뼈형성 지방 기질 세포 및 연골세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물에서의 유전자 발현을 Reverse Transcriptase-PCR에 의해 분석하였다. RNA을 트리졸 (Gibco-BRL, Grand Island, USA)을 사용하여 조직-유사 구조물로부터 추출하였다. 각각의 유전자와 Titan One-Tube RT-PCR 시스템 (Roche, Mannheim, Germany)에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.

7.7 콜라겐 + 섬유소 겔 제조 -

콜라겐 + 섬유소 겔의 제조를 위해, 0.1 ISI 아세트산중의 134μl의 3.33 mg/ml 래트 꼬리 콜라겐 타입 I (Sigma, St. Louis, USA), 8μl의 4N NaOH, 1X DMEM중의 165μl의 28.8 mg/ml 섬유소원, 및 1.66X DMEM 중의 210μl의 1.48 mg/ml 트롬빈을 혼합하였다. 혼합물을 2시간동안 37℃에서 겔화시켰다.

7.8 젤라틴 스폰지 내에서 매크로매스 배양에 의한 조직 형성 -

사용된 젤라틴 스폰지는 AbGeI였다(Sri Gopal Krishna Labs. Pvt. Ltd, Mumbai, India).

8. 결과 및 논의:

8.1. 3차원 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물의 형성 -

매크로매스 배양에 의해, DMEM + 10% FCS의 존재하에서 피부 섬유모세포로부터 조직-유사 물질(도 1)가, 자발적으로 또는 무딘 기구로 부드럽게 벗겨냄으로써 성장 표면으로부터 떼어낸 시트의 형상으로 형성되었다. 지방 기질 세포는 또한 Oil Red O 염색에 의해 지질에 대해 네거티브였던 DMEM + 10% FCS 중에서 조직-유사 물질을 형성하였다. 이것이 그 경우이기 때문에, 지방 기질 세포로부터 가능하게 유용한 조직을 만들기 위해서, 그들은 뼈형성 세포로 분화되었고, 이것은 매크로매스 배양시 유사한 시트를 형성하였고 이것은 떼어낸 후에 더욱 배양할 때 빈틈없는 물질로 수축할 수 있다. 사람 연골로부터 분리시킨 연골세포는 또한 DMEM + 10%FCS에서 매크로매스 배양시에 그러한 조직 시트를 형성하였다. 아스코르브산을 함유하는 지속 배지를 씻어버린 후에, 사람 뼈로부터 분리시킨 골모세포는 또한 DMEM + 10% FCS중의 매크로매스 배양에 의해, 조직-유사 구조물을 형성하였다. 도 2에서 보여준, 세포 및 세포 통합으로부터 연장의 광범위한 형성으로부터 보듯이, 세포의 통합은 그러한 조직-유사 구조물 형성에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 8.5 cm 페트리 접시에서 언급된 씨딩 밀도에서 세포를 씨딩함으로써 피부 섬 유모세포 매크로매스 배양의 규모가 확대될 때, 훨씬 더 큰 시트가 형성되었다. 따라서, 매크로매스 배양이 직접적으로 면적방향으로 정률 증가되어 원하는 만큼 큰 조직을 얻을 수 있는 것처럼 보인다. 피부 섬유모세포 또한 무혈청 DMEM에서 매크로매스 배양에 의해 시트를 형성하였지만, 형성의 시간은 밤새 3-4 시간에 혈청-함유 배지 중에서와 비교할 때, 10% FCS를 함유하는 DMEM에서보다 더 컸다. 혈청-함유 배지에서, 피부 섬유모세포로부터, 그들로부터 유도된 지방 기질 세포 & 뼈형성 세포로부터 조직의 형성의 시간은 약 4 시간이었고, 연골세포로부터는 약 18 시간이었다. 세포를 세척하여 아스코르브산을 함유하는 뼈형성 배지를 형성한 후에, 지방 기질 세포로부터 유도된 뼈형성 세포는 DMEM + 10% FCS에서는 물론이고, 뼈형성 배지에서 조직-유사 물질을 형성하였다. 매크로매스 배양에 의한 조직-유사 구조물의 발생은 성공적으로 직경 0.75 cm 내지 8.5 cm의 배양 용기에서 수행되었다. 0.75 cm 직경보다 더 작고 8.5 cm 직경보다 더 큰 배양 용기에서의 매크로매스 배양은 더 작거나 또는 더 큰 조직-유사 구조물의 형성을 각각 야기할 것이라고 외삽될 수 있다. 따라서, 3차원 조직-유사 구조물의 치수는 변할 수 있다.

비록 이들 조직-유사 구조물은 완전히 형성된 조직이 아니지만, 그들은 줄기 세포 또는 부분적으로 분화된 세포의 이식(이것은 완전하게 형성된 조직은 아니지만 조직 형성의 맨 처음에 있는)이 회복 및 재생 (Kaji & Leiden, 2001)을 초래할 수 있다는 발견과 유사한 방식으로, 신체의 치유 과정을 유도하고 참여할 수 있었다.

매크로매스 배양에 의한 3차원 조직-유사 물질 형성의 현상은 세포 씨딩 밀도에 의존했다는 것이 발견되었다. 조직 형성이 모두 높은 밀도에서 일어났는지 아닌지 여부를 조사하기 위해, 피부 섬유모세포는 단위 면적당 다른 세포 밀도의 범위에서 씨딩되었다. 유형의 시트 형성이 cm² 당 약 3.33 x 10⁵ 세포에서 일어난 반면, cm² 당 6.66 x 10⁴ 이하 (5배 미만) 세포의 씨딩 밀도에서는, 조직 시트가 형성되지 않았다는 것을 발견하였다. 또한, cm² 당 3 x 10⁶ 세포의 씨딩 밀도에서 조직 시트 형성이 일어났지만 cm² 당 7 x 10⁶ 세포 이상에서는 일어나지 않았고; 후자의 씨딩 밀도에서 세포는 오로지 함께 느슨하게 응집되었지만 응집성 조직 물질을 형성하지 않았다. 따라서, 조직 시트 형성은 cm² 당 3.33 x 10⁵ 세포와 cm² 당 3 x 10⁶ 세포는 물론이고 시험된 이들 두 값들 사이에 있는 모든 밀도에서 일어났다. 이 범위 위 또는 아래에서 시험된 밀도에서는, 조직 형성은 일어나지 않았다. 천연 지방 기질 세포 및 연골세포를 가지고 유사한 실험을 수행하였고 결과를 표 1로 만들었다. 피부 섬유모세포에서와 같이, 이들 세포 타입에 대한 최소 및 최대 조직-유사 구조물 형성 씨딩 밀도가 존재하였고 또한, 피부 섬유모세포의 그것과 유사하였다. 이들 데이타는 단위 면적당 최소 및 최대 세포 씨딩 밀도는 매크로매스 배양에 의한 조직 형성을 위해 존재한다는 것을 나타낸다. 조직 형성이 매크로매스 배양에 의해 일어나는 높은 세포 밀도의 범위는 시험되지 않은 다른 세포 타입 에 대해서 다를 수 있다.

표 1에서 나타낸 바와 같이 사용된 세포의 더 낮은 씨딩 밀도는 더 얇은 즉, 더 작은 3차원을 갖는 조직-유사 구조물을 야기한 반면, 더 높은 씨딩 밀도를 사용하면 더 두꺼운 즉, 더 큰 3차원을 갖는 조직-유사 구조물을 야기하였다. 따라서, 3차원 조직-유사 구조물의 치수는 변할 수 있다.

8.2. 조직학 (도 3,4,5) -

본 발명의 다른 조직-유사 구조물의 섹션의 헤마톡실린& 에오신 염색은 3차원 구조적 구성 및 세포외 매트릭스 형성을 보여준다. 천연 기질 세포 및 뼈형성 기질 세포는 물론이고 피부 섬유모세포로부터 형성된 조직-유사 구조물의 Masson-Trichome 염색은 콜라겐 합성을 나타냈다. 10일동안 배양된, 피부 섬유모세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물의 콜라겐 타입 I 면역염색은 콜라겐 타입 I에 대해 포지티브 염색을 나타냈다(도 6). 따라서, 세포외 매트릭스 형성은 매크로매스 배양의 방법에 의해 조직-유사 구조물 형성에서 일어날 것처럼 보인다.

8.3. 형성된 조직-유사 구조물에서 세포의 생활력-

피부 섬유모세포 및 연골세포로부터 형성된 조직으로부터 재-분리된 세포는 Trypan Blue 염색에 의해 98 %이상의 생활력을 가졌고; 지방 기질 세포로부터의 조직 물질로부터의 세포는 약 90% 생존가능하였다. 분리된 세포 및 응괴를 플레이팅하여 재성장을 평가하였고, 해리된 피부 섬유모세포 조직 시트의 응괴의 밖으로 자라나는 세포를 보여주는 도 7에서 도시한 바와 같이, 각각의 경우에 생존가능한 것으로 밝혀졌다.

8.4. 조직-유사 구조물의 발현 분석-

피부 섬유모세포로부터 형성된 조직 시트가 진피 대체물로서의 잠재력을 가지는가의 여부를 평가하기 위해, 피부의 상처 치유 프로세스에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 유전자의 발현을 분석하였다(도 8). 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 III, 각질형성세포 성장 인자, TGFβ1, 섬유결합소, 혈관 내피 성장 인자, 테나신-C 및 신데칸-2은 조직 시트에서 발현되는 것으로 나타났고, 따라서 피부 섬유모세포로부터 만들어진 이 조직-유사 시트는 진피 대체물로서의 잠재력을 갖는다는 것을 증명한다. 뼈형성 지방 기질 세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물이 뼈-유사 조직 대체물로서의 잠재력을 갖는지 여부를 평가하기 위해, 뼈-특이적 발현 유전자의 발현을 분석하였다. 조직-유사 구조물은 콜라겐 타입 I, 오스테오폰틴, 부갑상샘 호르몬 리셉터, 뼈 형태형성 단백질 2, 뼈 형태형성 단백질 4, 뼈 형태형성 단백질 리셉터 IA, IB & II을 발현하는 것으로 밝혀졌고, 따라서 아래에서 언급한 국소 석회화 및 실제 뼈 침골 형성에 더하여, 그것의 뼈-유사 성질을 증명한다(도 9). 유사하게는, 연골세포로부터 만들어진 조직-유사 구조물은 연골 조직 대체물로서의 그것의 잠재력에 대해 평가되었다. 연골-특이적 발현 유전자 콜라겐 타입 II, 애그레칸 및 콜라겐 타입 X은 발현되는 것으로 밝혀졌고, 따라서 아래에서 언급한 바와 같이, 연골-특이적 세포외 매트릭스의 형성에 더하여, 그것의 연골-유사 성질 (도 10)을 증명한다.

8.5. 조직-형성 배지의 유연성에 의한 조직-유사 구조물의 성질의 조정

매크로매스 배양에서, 테스트된 한, 매크로매스에 의해 조직-유사 조직체를 저해하는 어떤 것이 배지에 포함되지 않는 한, 조직 형성은 배지 조건에 독립적이기 때문에, 적절한 배지 성분을 포함하거나 배지를 교환함으로써 형성된 조직의 성질을 맞추는 것이 가능하다. 이는 DMEM + FCS와, 덱사메타손 및 β-글리세로포스페이트를 함유하는 뼈형성 배지 둘다에서 지방 기질 세포로부터의 조직 형성은 물론이고, 혈청-함유 및 무혈청 배지 모두에서 피부 섬유모세포에 의한 조직 시트 형성으로부터 명백하다. 따라서, 형성된 조직의 성질은 세포의 조직-형성 배지 및/또는 성장 배지를 변경함으로써, 바람직한 성질을 통합시키도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제시된 바와 같이, 실제 뼈 형성의 형태로 뼈-유사 성질은 세포를 배양하고, 조절된 뼈형성 배지에서 조직-유사 구조물을 형성함으로써, 지방 기질 세포로부터 형성된 조직에서 유도되었고, 뼈형성 배지 단독일때와 비교할 때, 실제 뼈 침골 형성이 전혀 보이지 않았다 (도 11). 조절된 뼈형성 배지의 존재하에서 뼈형성 기질 세포로부터 형성된 조직 물질의 Von Kossa 염색은 석회화의 국소 영역을 나타냈고, 따라서 뼈-유사 성질을 증명하는 반면, 비-조절된 뼈형성 배지에서 뼈형성 기질 세포로부터 만들어진 구조물은 이들 성질을 나타내지 않았다. 그러한 조정의 또다른 예는 DMEM + 10% FCS의 존재하에서 또는 1% FCS 및 인슐린을 함유한 연골원 배지; 및 연골유도제로서 TGFβ1의 존재하에서, 연골세포로부터 조직-유사 구조물의 형성이다. 연골 표현형의 세포외 매트릭스 특성을 갖는 성질은 연골원 배지에서 만들어진 조직-유사 구조물에서 발생되었지만, DMEM + 10% FCS에서 만들어진 것은 그러한 성질을 갖지 않았다. 이것은 도 12에서 Toluidine 블루 염색에 의해 보여진다. 따라서, 매크로매스 배양에 의한 조직 형성은 특정 복합 배지 요구조건을 갖지 않고 남아있기 때문에, 그러한 특이적 성분이 형성된 조직의 성질을 조절하기 위한 배지에서 사용될 수 있다. 그것은 또한 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물이 다른 배양 배지의 존재하에서 형성될 수 있다는 상기 결과로부터 따르고, 여기서 제시된 다른 배지는 예이고 이것에 관하여 본 발명을 이들 예로 제한하지 않는다.

8.6. 매크로매스 배양을 위한 성장 표면 -

플라스틱 표면에 플레이팅된 세포로부터 형성된 조직-유사 시트는 자발적으로 떨어지고 돌돌 말리거나 둥글게 말리는 경향을 가졌고, 시트는 일단 둥글게 말면 곧게 펴지지 않기 때문에 이것은 바람직하지 않다. 가능한 진피 대체물로서 개발되는 조직은 똑바로 남아있도록 요구된다. 이를 위해서, 피부 섬유모세포의 매크로매스 배양은 플라스틱 접시에 높인 Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) 필터에서 수행되었다. 이러한 적응 형태로, 똑바로 남아있도록 형성되고 필터에 부착된 시트는 따라서, 나중에, 그것은 필터를 거꾸로하여 피부 상처에 도포될 수 있다. 이 실험은 매크로매스 배양에 의해 다른 융화성 성장 표면에서 조직 형성을 달성할 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, 이러한 경우에, 매크로매스 배양에 의해 만들어진 시트는 지지 층으로서의 역할을 하는 나일론 필터를 포함하는, 잠정적 이식물의 성분이 되고 그것의 요구조건은 세포의 조직-유사 조직체를 위한 스캐폴드로서가 아니다. 이 지지 층은 진피-유사 시트와 함께 몸 안으로 통합되도록 설계되지 않고, 따라서 그것은 신체의 일부가 될 스캐폴드가 아니라, 진피-유사 시트의 적용을 위한 지지 핸들링 디바이스이다. 이 지지 층은 치유 후에 제거될 것이다.

8.7. 대상의 성분으로서의 조직-유사 구조물 - 조직-유사 구조물이 통합되어 (더 큰) 대상의 성분 또는 일부가 될 수 있다는 것을 증명하기 위해, 피부 섬유모세포는 매크로매스 배양에 의해 씨딩되어 조직-유사 시트를 형성했고, 그후 배양 배지를 제거한 후에, 그것을 콜라겐과 섬유소 겔 믹스로 씌웠다. 겔은 그후 굳어졌다. 이제, 겔은 그것의 한 면에 부착된 조직-유사 시트로 들어올려질 수 있었다. 조직-유사 구조물이 성분인, 이 복합체의 조직학적 섹션은 도 13에 나와있다. 겔과 시트와는 별개로, 스폰지 또는 막과 같은 다른 매트릭스는 또한 그들을 부착함으로써 한 면으로부터 조직-유사-구조물을 지지할 수 있었다. 따라서, 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물은 다른 대상, 예를 들어, 시트 또는 막, 겔, 스폰지, 또는 다른 매트릭스와 조합될 수 있다.

8.8. 매크로매스 배양에 의한 미시적 3차원 조직-유사 조직체-

피부 섬유모세포를 DMEM + 10% FCS에서, 스폰지 영역의 cm² 당 약 2.5 x 10⁶ 세포의 씨딩 밀도에서, 직경 3.5 cm의 젤라틴 스폰지 위로 씨딩하였다. 젤라틴 스폰지에 대해, 높은 세포-씨딩-밀도 매크로매스 배양 방법의 이러한 적용은 도 14에 도시된 스폰지의 조직학적 섹션에서 보이는 바와 같이, 스폰지내에서 3차원 조직-유사 조직체의 미시적 군집의 형성을 초래하였다. 따라서, 매크로매스 배양의 방법은 미시적 수준에서 세포의 3차원 조직-유사 조직체를 생성하는데 사용될 수 있고 또한, 조직-유사 조직체는 전체 집합체의 성분이 된다.

9. 결론:

본 발명의 신규성은 본 명세서에서 상술된 바와 같이, 스캐폴딩 재료가 채택되지 않거나 조직 형성/복합 배지 조제를 돕는 특이적 작용제가 요구되지 않는다는 사실과 같은, 다른 중요한 특징들에서 말고, 높은 세포-씨딩-밀도 배양은 조직 형성을 돕는 어떠한 특정 작용제 없이 전체 세포의 3차원 조직-유사 조직체를 생성하여 그러한 조직체를 유도할 수 있고 면적 방향으로 정률 증가되어 다른 종류의 거시적인 3차원 조직-유사 구조물을 생성할 수 있다는 사실에 존재한다. 본 발명의 발명자들은 세포의 전체 3차원 조직-유사 조직체 및 다른 종류의 거시적인 3차원 조직-유사 구조물이 높은 세포-씨딩-밀도 배양 단독에 의해 생성될 수 있다고 맨 먼저 보고한다.

다른 중배엽 세포 또는 내배엽 또는 외배엽 기원의 세포가 또한 매크로매스 배양에 의해 그러한 조직-유사 조직체를 형성하는 것이 가능할 수 있다. 따라서, 어떤 타입의 포유동물 세포로부터 매크로매스 배양에 의해 만들어진 조직-유사 조직체 및 거시적인 조직-유사 구조물은, 만일 그들이 가능하다면, 본 발명의 범위내에 있고, 한정하는 특징이 매크로매스 배양의 방법에 의해 달성된 조직-유사 조직체이다.

거시적인 조직-유사 구조물이 본 발명의 바람직한 구체예이지만, 더 작은 규모에서 매크로매스 배양, 즉 배양 영역에서 약 0.75 cm 직경보다 더 작은 어떤 것은 더 작은 조직-유사 조직체를 야기할 것이고, 매크로매스 배양의 규모가 감소될 때, 미시적이 되는 쪽으로 크기가 감소할 것이라는 것이 명백하다.

상기 형태 또는 일찍이 기술된 젤라틴 스폰지와 같은 다른 형태의, 높은 세포-씨딩-밀도 매크로매스 배양에 의한 미시적 조직-유사 조직체는 따라서 또한 본 발명의 범위내에 있다. 마찬가지로, 조직-유사 구조물은 8.5 cm 직경보다 더 큰 배양 용기에서 매크로매스 배양에 의해 발생될 수 있다.

따라서, 앞선 설명에서, 본 발명의 특정 구체예가 기술되었다; 예는 다른 세포 타입의 사용, 대안의 성장 표면의 사용, 형성된 조직의 성질을 조정하기 위한 배지의 변화의 사용, 조직 형성의 정률 증가, 배양 용기의 크기, 조직-형성 높은 세포 밀도의 범위, 및 매크로매스 배양에 의해 만들어진 그 조직이 성분이 되는 잠정적 이식물의 생성의 관점에 대해 제시되었다. 비록, 오로지 기술된 구체예만이 제시되었지만, 그들은 단지 예 또는 실례의 목적만을 수행하고, 발명을 제한하지 않는다.

본 발명에 다른 변형 또는 대용이 만들어질 수 있고, 이것은 본 발명의 범위내에 있을 것이라는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명자들은 하나의 그러한 변형은 매크로매스 배양에 의해 만들어진 조직 물질의 적절한 겔 또는 매트릭스 안으로의 포착 또는 캡슐화이거나, 또는 또다른 그러한 변형은 다중 조직-유사 물질 또는 시트가 함께 어떤 수단에 의해 결합되거나 유지되는 구조물이 될 것이라는 것을 계획한다. 그러한 구조물에서, 매크로매스 배양에 의해 만들어진 조직-유사 구조물은 이제 전체 대체물의 성분이 될 것이다. 상기는 결과 부분에서 제시된 것들보다, 다른 방식이고, 그것에 의해 매크로매스 배양에 의해 발생된 조직-유사 조직체 및 구조물은 대상의 성분이 될 수 있다. 결과에서 증명된 바와 같이, 매크로매스 배양에 의한 세포의 조직-유사 조직체는 어떠한 스캐폴드를 요구하지 않고 또한 조직학적으로 유능한 조직-유사 구조물은 스캐폴드의 도움없이 형성되기 때문에, 스캐폴드는 예를 들어, 스캐폴드가 전체 대체물의 일부가 되도록, 대안 성장 표면으로서 매크로매스 배양을 위해 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명의 3차원 조직-유사 조직체와 조직학적으로 유능한 조직-유사 구조물은 스캐폴드-없이 개발될 수 있지만, 조직-유사 구조물 단독일 때보다 유리한 성질 또는 잇점을 제공한다면, 적절한 스캐폴드와 함께 조합될 수 있다. 다른 변형은 매크로매스 배양에 의해 조직-유사 물질을 형성하는 성질을 갖는 다른 세포 타입의 사용, 기술된 것보다 다른 융화성 성장 표면의 사용, 조정을 위한 다른 배지 변화, 및 정율 증가의 다른 크기 등이 될 것이다. 따라서, 발명의 설명은 개시된 정확한 예증 구체예에 의해 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다.

인용된 참고문헌:

미국 특허 문헌

5489304 1996년 2월 Orgill, et al.

5460939 1995년 10월 Hansbrough, et al.

5613982 1997년 3월 Goldstein.

20020127711 2002년 9월 Kale, et al.

5723331 1998년 3월 Tubo, et al.

다른 참고문헌

Abu-Absi SF, Friend JR, Hansen LK, Hu W (2002) Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research 274, 56-67.

Ahrens PB, Solursh M, Reiter RS (1977) Stage-related capacity for limb chondrogenesis in cell culture. Developmental Biology 60, 69-82.

Baldwin SP, Saltzman WM (2001) Aggregation enhances catecholamine secretion in cultured cells. Tissue Engineering 7(2)179-190.

Bancroft JD, Cook HC (1994) Manual of Histological Techniques and their Diagnostic Application, Churchill Livingstone, Edinburgh, UK.

Buttery LDK, Bourne S, Xynos JD, Wood H, Hughes FJ, Hughes SPF, Episkopou V, Polak JM (2001) Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. Tissue Engineering 7(1)89-99.

Davies CdeL, Berk DA, Pluen A5 Jain RK (2002) Comparison of IgG diffusion and extracellular matrix composition in rhabdomyosarcomas grown in mice versus in vitro as spheroids reveals the role of host stromal cells. British Journal of Cancer 86, 1639-1644.

Denker AE, Nicoll SB, Tuan RS (1995) Formation of cartilage-like spheroids by micromass cultures of murine C3H10T1/2 cells upon treatment with transforming growth factor-beta 1. Differentiation 59(1)25-34.

Downie SA, Newman SA (1994) Morphogenetic differences between fore and hind limb precartilage mesenchyme : Relation to mechanisms of skeletal pattern formation. Developmental Biology 162, 195-208.

Eaglstein WH, Falanga V (1997) Tissue engineering and the development of Apligraf®, a human skin equivalent. Clinical Therapeutics 19(5)894-905.

Furukawa KS, Ushida T, Sakai Y, Suzuki M, Tanaka J, Tateishi T (2001) Formation of human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture. Cell Transplantation 10, 441-445.

Hamamoto R, Yamada K, Kamihira M, Iijima S (1998) Differentiation and proliferation of primary rat hepatocytes cultured as spheroids. Journal of Biochemistry 124, 972-979.

Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM3 Yoo JU (1998) In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Experimental Cell Research 238, 265-272.

Kaji EH, Leiden JM (2001) Gene and stem cell therapies. Journal of the American Medical Association 285(5)545-550.

Kale S, Biermann S, Edwards C, Tarnowski C, Morris M, Long MW (2000) Three-dimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone. Nature Biotechnology 18, 954-958.

Kim HW, Han CD (2000) An overview of cartilage tissue engineering. Yonsei Medical Journal 41(6)766-773.

Lang SH, Stark M, Collins A, Paul AB, Stower MJ, Maitland NJ (2001) Experimental prostate epithelial morphogenesis in response to stroma and three-dimensional Matrigel culture. Cell Growth & Differentiation 12, 631-640.

L'Heureux N, Paquet S, Labbe R, Germain L, Auger FA (1998) A completely biological tissue- engineered human blood vessel. FASEB Journal 12, 47-56.

Mackay AM, Beck SC, Murphy JM, Barry FP, Chichester CO, Pittenger MF (1998) Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow. Tissue Engineering 4(4)415-428.

McPherson JM3 Tubo R (2000) Articular cartilage injury. In Principles of Tissue Engineering, 2^nd Edition, Academic Press, San Diego, USA, p.697-709.

Michel M, L'Heureux N, Pouliot R, Xu W, Auger FA, Germain L (1999) Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 35, 318-326.

Pollok JM, Kluth D, Cusick RA, Lee H, Utsunomiya H, Ma PX, Langer R, Broelsch CE, Vacanti JP (1998) Formation of spheroidal aggregates of hepatocytes on biodegradable polymers under continuous flow bioreactor conditions. Journal of Pediatric Surgery 8, 195-199.

Service RF (2000) Tissue engineers build new bone. Science 289, 1498-1500.

Shinji T, Koide N, Tsuji T (1988) Glycosaminoglycans partially substitute for proteoglycans in spheroid formation of adult rat hepatocytes in primary culture. Cell Structure & Function 13, 179-188.

Takezawa T, Mori Y, Yonaha T, Yoshizato K (1993) Characterization of morphology and cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts. Experimental Cell Research 208, 430-441.

Yamada K, Kamihira M, Hamamoto R, Iijima S (1998) Efficient induction of hepatocyte spheroids in a suspension culture using a water-soluble synthetic polymer as an artificial matrix. Journal of Biochemistry 123, 1017-1023.

Yoon Y, Oh C, Kim D, Lee Y, Park J, Huh T, Kang S, Chun J (2000) Epidermal growth factor negatively regulates chondrogenesis of mesenchymal cells by modulating the protein kinase C-α, Erk-1, and p38 MAPK signaling pathways. Journal of Biological Chemistry 275(16)12353- 12359.

Zuk PA, Zhu M5 Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH (2001) Multilineage cells from human adipose tissue : implications for cell-based therapies. Tissue Engineering 7(2)211-228.

Claims (30)

1. 조직(tissue) 형성을 돕는 작용제에 대한 요구없이 중배엽 세포 유래의 3차원 조직-유사 세포 배양물을 생성하는 방법으로서, 피부섬유모세포, 지방기질세포 또는 연골세포를, 배양 용기의 단위면적 cm²당 3.33×10⁵ 내지 3×10⁶개의 세포 밀도로 세포씨딩하여 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 조직-유사 세포 배양물의 생성방법.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 피부섬유모세포는 인간 피부조직에서 유래되고, 지방기질세포는 인간 지방흡인물질에서 유래되고, 연골세포는 인간 연골조직에서 유래되는, 3차원 조직-유사 세포 배양물의 생성방법.
4. 제 1 항에 있어서, 3차원 공간에서 세포들을 서로 접촉시켜 응집을 촉진시키는 단계를 더 포함하는, 3차원 조직-유사 세포 배양물의 생성방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제

Images