CN104771784B - 一种组织脱细胞液 - Google Patents

Abstract

公开了一种组织脱细胞液。该脱细胞液包含溶于缓冲液中的十二烷基硫酸钠和抗坏血酸。还公开了经该组织脱细胞液处理的大网膜组织。利用抗坏血酸(维生素C)的抗氧化作用，减少脱细胞基质在脱细胞过程中的氧化损伤，保护脱细胞基质中的细胞外基质蛋白，进而增加了脱细胞支架的生物相容性。本方法还具有操作简单、成本低廉、可实施性强的优势。

Description

一种组织脱细胞液

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种制备脱细胞基质的组织脱细胞液。

背景技术

脱细胞技术主要是指利用脱细胞技术(物理、化学、酶解等方法)去除组织中各种细胞成分以及遗传物质从而获得天然生物支架材料。由于保留了细胞外基质的三维结构和天然成分，有利于细胞粘附、增殖、分化及其生物学功能的发挥，因此，其在组织修复与再生中具有其他支架材料无法比拟的优势。目前，人们已经能够从多种组织中得到脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、血管、角膜以及更为复杂的心、肺、肝、肾等。

细胞外基质是结构蛋白和功能蛋白的复杂复合物，包含多种纤维蛋白，如胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖等组分。细胞外基质作为细胞生长支架，在细胞粘附、增殖和分化方面发挥着重要作用。然而，由于当组织受到外界各种因素刺激时会促进活性氧的产生，如物理因素、化学因素(氧化还原反应、电子传递、金属离子催化、药物)、生物因素(酶的催化)。活性氧会对蛋白质进行氨基酸残基修饰，从而引起其结构和构象的改变，造成肽链断裂、聚合、交联等损伤。因此，常规的脱细胞处理会产生大量的活性氧，进而一定程度破坏大网膜脱细胞基质中的蛋白成分，影响其生物学功能。因此，亟需在对大网膜进行脱细胞处理的同时，减少体系中的活性氧，保护细胞外基质蛋白免受活性氧的损伤。

大网膜是腹膜的一种，是存在于高等动物腹腔中的一层黏膜，是由结缔组织形成的膜状组织。大网膜富有极强的弹性以及高度血管化的结构，这些优点使其在组织工程与再生医学领域中具有广泛的应用前景。目前，大网膜脱细胞相关研究刚刚起步，还存在诸多问题亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织脱细胞液。该脱细胞液是在常规的组织脱细胞体系中引入了一种抗氧化物成分而制备成的新型脱细胞液。该脱细胞液的配制方法简单，成本低廉，可实施性强。

根据本发明的一个方面，提供了组织脱细胞液，其包含溶于缓冲液中的十二烷基硫酸钠和抗坏血酸。

本发明的组织脱细胞液利用了抗坏血酸(维生素C)的抗氧化作用，减少大网膜脱细胞基质在脱细胞过程中的氧化损伤，保护大网膜脱细胞基质中的细胞外基质蛋白，进而增加了脱细胞大网膜支架的生物相容性，更有利于接种细胞的存活。

根据本发明的另一方面，提供了经上述组织脱细胞液处理的大网膜组织。

附图说明

图1脱细胞生物网膜I型胶原免疫组织化学染色×200。

图2脱细胞生物网膜IV型胶原免疫组织化学染色×200。

图3大网膜脱细胞基质的扫描电镜观察。

图4不同脱细胞液处理后大网膜脱细胞基质中的生物相容性检测×200。

具体实施方式

在本申请中，缩写词的含义如下：

DMEM：Dulbecco′s modified eagle medium培养液，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基；

PBS：磷酸盐缓冲液；

SDS：十二烷基硫酸钠；

EthD-III：溴化乙锭同型二聚体-III；

calcein AM：二乙酰甲酯

DNA酶：脱氧核糖核酸酶；

min：分钟。

根据本发明的一个方面，提供了组织脱细胞液，其包含溶于缓冲液中的十二烷基硫酸钠和抗坏血酸。

在某些实施方案中，所用的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

在某些实施方案中，十二烷基硫酸钠的浓度为1％至2％重量体积比。在具体的实施方案中，十二烷基硫酸钠的浓度可以为1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2.0％重量体积比。

在某些实施方案中，抗坏血酸的浓度为0.1％至0.5％重量体积比。在具体的实施方案中，抗坏血酸的浓度可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％重量体积比。

在某些实施方案中，组织脱细胞液由溶于缓冲液中的十二烷基硫酸钠和抗坏血酸组成。

根据本发明的另一方面，提供了经上述组织脱细胞液处理的大网膜组织。

在本申请中，大网膜是可商购的，可以购自例如屠宰场。

通过以下实施例对本发明做详细描述，然而以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。

实施例1大网膜脱细胞液的配制

配制含有SDS与抗坏血酸的大网膜组织脱细胞液，其中，SDS浓度为1.5％重量体积比，抗坏血酸(维生素C)浓度为0.2％重量体积比，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)配制。

实施例2小型猪来源大网膜的脱细胞处理

取新鲜的小型猪腹膜大网膜组织(购自屠宰场)，于PBS中清洗3遍。脱脂处理后，将其浸泡于1L大网膜脱细胞液中处理18h，并于PBS中清洗3遍，将经脱细胞液处理后的大网膜组织经冷冻干燥后辐照灭菌，常温保存。

实施例3大网膜脱细胞基质的免疫组织化学染色

使用4％的多聚甲醛溶液固定实施例2中制备的大网膜脱细胞基质，浓度梯度酒精脱水，石蜡包埋，制备厚度为4μm的切片。切片置于病理组织漂烘仪上烘干2h。随后，组织切片经过梯度酒精(浓度由高到低)的水化，蒸馏水冲洗切片。加3％双氧水作用10min，去除内源性过氧化物酶；PBS漂洗三次，每次5min；利用抗原修复液进行微波修复，修复后冷却室温，PBS漂洗三次，每次5min；1％牛血清白蛋白37℃封闭30min；分别滴加抗Collagen I(1∶200)、抗Collagen IV(1∶200)一抗，4℃过夜。用0.01M PBS清洗3次，滴加山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30min，PBS清洗3次，每次5min；避光下DAB显色10min，蒸馏水冲洗切片；梯度酒精脱水(浓度由低到高)，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察染色结果并拍照。

结果可见，通过本发明制备的脱细胞生物网膜具有典型的网状结构，且呈现CollagenI、CollagenIV大量表达，表明本发明制备的脱细胞大网膜基质完好保留了天然细胞外基质的主要蛋白组分。此外，各类组织学染色切片均未见明显的细胞成分，表明本发明的脱细胞液具有很好的脱细胞效果(图1-2)。

实施例4大网膜脱细胞基质的扫描电镜观察

利用2％戊二醛将制备的大网膜脱细胞基质固定24h，常规脱水、真空干燥、喷金，利用扫描电子显微镜观察并摄像。结果未见细胞组分残留，且大网膜脱细胞基质交织成网状立体三维支架，孔隙均一(图3)。

实施例5不同脱细胞液处理后大网膜脱细胞基质中的生物相容性检测

利用不添加抗坏血酸的脱细胞液，即1.5％的SDS溶液以同样的步骤对大网膜组织进行脱细胞处理，得到大网膜脱细胞基质支架材料。

将5×10⁶mL的皮肤成纤维细胞悬液2mL分别接种于上述制备的大网膜脱细胞基质材料以及实施例2制备的大网膜脱细胞基质材料上，得到复合构建物。将复合构建物培养于37℃、5％CO₂孵箱中1.5h，然后添加DMEM培养液10mL，继续培养至第7天，随后进行细胞活性检测。

用移液枪吸取20μl 2mM EthD-III溶液加到10mL PBS中，得到4μM EthD-III工作液，再将5μl 4mM calcein AM溶液转移到EthD-III工作液中，配制成混合液(2μM calceinAM和4μM EthD-III)。随后添加足量的Live/Dead混合液以覆盖上述构建物，然后于室温孵育30-45min，PBS溶液清洗三次。在荧光显微镜下观察荧光标记的细胞。

经染色，由于活细胞具有酯酶活性，可以把非荧光calcein AM转化成能发绿色荧光的calcein，而由于死细胞的细胞膜失去选择性，EthD-1进入细胞结合到细胞核上，使死细胞呈现红色荧光。live/dead染色而结果可见，实施例2中，经添加抗坏血酸的脱细胞液处理获得的大网膜脱细胞基质中的活性细胞(绿色)比例明显多于经未添加抗坏血酸的脱细胞处理获得的大网膜脱细胞基质中的活性细胞，表明本发明的脱细胞增加了脱细胞大网膜支架的生物相容性，更有利于接种细胞的存活(图4)。

Claims (7)

1.一种组织脱细胞液，其包含溶于缓冲液中的十二烷基硫酸钠和抗坏血酸。

2.如权利要求1所述的组织脱细胞液，其中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

3.如权利要求1所述的组织脱细胞液，其中十二烷基硫酸钠的浓度为1％至2％重量体积比。

4.如权利要求1所述的组织脱细胞液，其中抗坏血酸的浓度为0.1％至0.5％重量体积比。

5.如权利要求3所述的组织脱细胞液，其中抗坏血酸的浓度为0.1％至0.5％重量体积比。

6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的组织脱细胞液，其由溶于缓冲液中的十二烷基硫酸钠和抗坏血酸组成。

7.经权利要求1-6中任一权利要求所述的组织脱细胞液处理的大网膜组织。