CN103990179B - 一种制备异种脱细胞基质的方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到一种制备脱细胞真皮基质敷料的方法，将动物皮通过制备断层皮片﹑分离表皮和真皮﹑交联﹑脱细胞﹑冷冻干燥﹑病毒灭活后最终得到脱细胞真皮基质。本发明的优点：本方法用N,N‑二环己基碳化二亚胺进行交联时间短﹑效率高，另交联前提，极大简化了后面交联剂残留处理程序，节省了成本；脱细胞过程中利用酶﹑SDS和碱联合，对脱细胞基质进行微观调控，利用冷冻干燥对脱细胞基质进行宏观调控，脱细胞彻底，细胞更容易在其上生长。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种备异种脱细胞基质的方法。
背景技术
脱细胞真皮基质制备的目的是尽可能的去除皮肤组织中免疫原性很强的细胞成分（表皮细胞﹑毛囊﹑皮脂腺﹑汗腺及真皮中血管内皮细胞﹑成纤维细胞等），保留免疫原性相对较弱的细胞基质外成分以及真皮组织完整的三维空间结构。这样既能避免移植后的排斥反应和过强的免疫炎症反应，从而影响移植效果，又能提供引导组织再生的生物“模板”或支架，达到最大限度地修复组织缺损的目的。
目前脱细胞真皮基质的制备方法主要有以下几种：1) DispaseII- Triton 法:皮肤标本先经DispaseII处理( 2.5 U/ ml溶液, 4e下作用48 h),再经TritonX-100 处理(0.5%溶液,室温下作用48 h)。DispaseII 主要分解IV 型胶原和纤维粘蛋白, 能裂解基底膜中的致密层，是一种快速有效的分离表皮与真皮的酶。标本经DispaseII处理后, 表皮真皮间的基底膜及皮肤附属器于周围结缔组织成分均被破坏。同时也破坏了纤维细胞和结缔组织基质间的连结, 更有利于TritonX-100 的浸透。TritonX-100 属于非离子型表面活性剂，在溶液中稳定性高,不易受强电解质无机盐存在的影响, 能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成复合物, 溶解于溶液中。同时, TritonX-100中的疏水端也能和膜蛋白破坏生物膜，从而使细胞溶解破坏。
2)高渗盐-SDS法:皮肤标本先经高渗盐作用(1mol/LNaCl溶液,37e下作用24h)使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离开米,从而完整地去除表皮。然后在未改变胶原结构的情况下, 再用破膜剂十二烷基硫酸钠(0.5%SDS溶液,室温下作用1h)将皮肤标本中的细胞脱除。该法细胞脱除也比较彻底,基底膜完整保留, 但真皮中Ⅳ胶原,纤维结合素,弹力素,HLA-DR 等含量较多,因此具有相对高的抗原性。
3)高渗盐-NaOH消蚀法,该法利用高渗盐(1mol/LNaCl溶液, 37e下作用24h)去除表皮,同时再利用NaOH(低浓度溶液,室温下作用18h)中碱离子的吸水作用, 夺取组织细胞的水分,使细胞脱水而死亡。最后使用超声清洗仪清洗除去细胞。该法细胞彻底脱除, 胶原纤维结构完整, 排列较正常松散。但要注意控制NaOH 的作用时间,过长(如36h) 则会使胶原变性,蛋白裂解,得到的是真皮皮浆。
4)其它:Lee Y等用胰蛋白酶(0.25%溶,4e下作用24h),接着TritonX-100( 0.1%溶液,室温下作用8h) ,最后用Dispase (560 units/L,4e下作用24h)。Ray等使用胰蛋白酶(0.25%溶液,室温下作用18h)和SDS(0.1%溶液,室温下作用12h),然后用胰蛋白酶再作用12h,最后用Dispase (560 units/L, 25e下作用12h)。
其它辅助制备措施：
1)戊二醛交联:一般用2ml/L的戊二醛溶液交联皮肤标本510min。该措施是利用醛基封闭抗原位点作用, 降低异种/异体ADM 的免疫炎症反应,减缓组织降解。更有利于ADM的创面黏附和移植成活。但同时醛基又有细胞毒性作用,导致滞后的炎症细胞浸润和异物巨细胞反映。对于戊二醛醛基矛盾性的作用,有待进一步的深入研究。
2) 网状打孔:选择孔径500-800um,间距为35mm。孔径的选择十分重要,经大量的理论和实验证明,孔径过大或过密,会增加抗原位点的暴露和抗原提呈细胞等接触ADM 的机会。该措施是利用毛细现象, 使创面基底血浆等渗液渗透到无细胞真皮替代物表面, 维持皮片早期的营养供应, 并防止皮下积液、积气及血肿形成。
检索近年来有关脱细胞真皮基质制备的相关文章，考虑到脱细胞效果以及对细胞外基质的损伤程度，脱细胞真皮基质的制备顺序一般是制备断层皮片，然后预处理，再经过脱细胞处理后，进行交联处理，最终病毒灭活。此种制备技术存在以下不足：1.细胞真皮制备过程中酶消化或高渗盐处理过度将破坏胶原三维结构,反之则可能残留细胞成分,引起排斥反应;2.缺乏血管网结构, 导致其缺血时间,再灌注时间和无营养支持的时间较长;3.脱细胞基质制备中孔隙率和通孔率不理想，使成纤维细胞不易于黏附迁移；4.常用交联剂戊二醛交联后易发生钙化，变硬﹑变脆现象。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种步骤简单、成本低廉、效果好的制备异种脱细胞基质的方法。本发明同时提供了上述方法制备的异种脱细胞基质。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一种制备异种脱细胞基质的方法，其具体包括如下步骤：
(1) 制备断层皮片
用取皮机将动物皮肤制成0.1-2.0mm厚的断层皮片，经洗涤，去脂，再用磷酸盐缓冲液（PBS液）洗涤1-3次；
(2) 分离表皮和真皮
将步骤(1)得到的断层皮片用0.1%-0.5%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶-PBS液在4℃-20℃下，浸泡6-24h；
(3) 交联
将步骤(2)处理后的材料用含有N,N-二环己基碳化二亚胺（DCC）、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和一水吗啉乙磺酸（MES）的乙醇水溶液浸泡3-12h；
(4) 脱细胞
将步骤(3)处理后的材料用1-2%的氢氧化钠溶液处理8-24h，然后用0.1%-0.5%（质量体积比g/100ml）的胰蛋白酶-PBS液在4℃-20℃处理20-36h，PBS冲洗，以0.2%-0.5% （质量体积比g/100ml）SDS对基质进行震荡洗涤，100-200转/分钟，温度20℃-30℃，每隔1小时更换SDS液，3-5h取出，PBS冲洗；
(5) 冷冻干燥
-100--60℃预冷冻3-5小时，在冷冻干燥机做8-15小时真空冷冻干燥。
(6)病毒灭活
经经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品 。
进一步的，所述的PBS液的配制方法如下：
NaCl 8.00g/L；
KCl 0.20 g/L；
Na2HPO4 1.56g/L；
KH2PO4 0.20 g/L；
将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。
进一步的，所述步骤(2)中胰蛋白酶-PBS液的浓度为0.13%，温度为7℃。
进一步的，所述含有N,N-二环己基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和一水吗啉乙磺酸（MES）的乙醇水溶液的配制方法如下：用向乙醇水溶液(乙醇的体积比为40%),加入一水吗啉乙磺酸（MES）使其浓度达到0.06mol/L，再向上述溶液中加入N,N-二环己基碳化二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),按质量比为每克步骤(2)处理后的材料1.8-5.4克N,N-二环己基碳化二亚胺和0.415-1.245克NHS。
进一步的，所述步骤(4)中氢氧化钠溶液的浓度为1%，所述胰蛋白酶-PBS液的浓度为0.13%，温度为7℃。
本发明另一方面提供了一种上述方法制备的异种脱细胞基质。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
本发明用N,N-二环己基碳化二亚胺进行交联时间短﹑效率高，另交联前提，极大简化了后面交联剂残留处理程序，节省了成本；脱细胞过程中利用酶﹑SDS和碱联合，对脱细胞基质进行微观调控，利用冷冻干燥对脱细胞基质进行宏观调控，脱细胞彻底，细胞更容易在其上生长。
附图说明
图1 为本发明实施例1制备的基质的HE染色效果图；
图2 未脱细胞前猪中厚皮的HE染色效果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步详细的说明。
本实施例和对比例中的磷酸盐缓冲液（PBS液）的制备方法如下：
NaCl 8.00g/L；
KCl 0.20 g/L；
Na2HPO4 1.56g/L；
KH2PO4 0.20 g/L；
将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。
实施例1
1.0 制备断层皮片：用取皮机将动物皮肤制成长6cm，宽4cm，0.6mm厚的断层皮片，纯净水洗涤，用0.15%新洁尔灭消毒去脂30分钟，每次100mlPBS洗涤，洗涤3次，处理得到的猪中厚皮的HE染色效果图见图2。
2.0 分离表皮和真皮：用0.15%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在7℃作用24小时终止。
3.0 交联：用100ml乙醇溶液(乙醇的体积比为40%),加入一水吗啉乙磺酸（MES）使其浓度达到0.06mol/L，再向溶液中加入N,N-二环己基碳化二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),按质量比为每克步骤2.0处理后的材料对应1.8克N,N-二环己基碳化二亚胺和0.415克NHS,浸泡4小时。
4.0 脱细胞：用1%的氢氧化钠溶液100ml处理18小时，然后用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7℃处理24小时。PBS反复冲洗3次，间隔约10分钟，每次100ml。以0.4% SDS 100ml对基质进行震荡洗涤，150转/分钟，温度26℃。每隔1小时更换SDS液，3小时取出，PBS反复冲洗7次，每次100ml，间隔10min。
5.0 冷冻干燥：-80℃预冷冻4小时，在冷冻干燥机做10小时真空冷冻干燥。处理后的基质的HE染色效果图见图1。
6.0 病毒灭活：经Co-60所产生的Y射线辐照消毒灭菌。
实施例2
1.0 制备断层皮片：用取皮机将动物皮肤制成长6cm，宽4cm，0.6mm厚的断层皮片，纯净水洗涤，用0.1%新洁尔灭消毒去脂30分钟，每次100mlPBS洗涤，洗涤3次。
2.0 分离表皮和真皮：用0.1%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在4℃作用6小时终止。
3.0 交联：用100ml乙醇溶液(乙醇的体积比为40%),加入一水吗啉乙磺酸（MES）使其浓度达到0.06mol/L。再向溶液中加入N,N-二环己基碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),按质量比为每克步骤2.0处理后的材料对应5.4克N,N-二环己基碳化二亚胺和1.245克NHS,浸泡4小时。
4.0 脱细胞：用2%的氢氧化钠溶液100ml处理24小时，然后用0.1%的胰蛋白酶-PBS液在4℃处理36小时。PBS反复冲洗3次，间隔约10分钟，每次100ml。以0.2% SDS 100ml对基质进行震荡洗涤，150转/分钟，温度20℃。每隔1小时更换SDS液，3小时取出，PBS反复冲洗7次，每次100ml，间隔10min。
5.0 冷冻干燥：-100℃预冷冻3小时，在冷冻干燥机做8小时真空冷冻干燥。
6.0 病毒灭活：经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌。
实施例3
1.0 制备断层皮片：用取皮机将动物皮肤制成长6cm，宽4cm，0.6mm厚的断层皮片，纯净水洗涤，用0.15新洁尔灭消毒去脂30分钟，每次100mlPBS洗涤，洗涤3次。
2.0 分离表皮和真皮：用0.5%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在20℃作用4小时终止。
3.0 交联：用100ml乙醇溶液(乙醇的体积比为40%),加入一水吗啉乙磺酸（MES）使其浓度达到0.06mol/L。再向溶液中加入N,N-二环己基碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),按质量比为每克步骤2.0处理后的材料对应3.6克N,N-二环己基碳化二亚胺和0.930克NHS,浸泡4小时。
4.0 脱细胞：用1.5%的氢氧化钠溶液100ml处理24小时，然后用0.5%的胰蛋白酶-PBS液在20℃处理20小时。PBS反复冲洗3次，间隔约10分钟，每次100ml。以0.5% SDS 100ml对基质进行震荡洗涤，200转/分钟，温度26℃。每隔1小时更换SDS液，3小时取出，PBS反复冲洗7次，每次100ml，间隔10min。
5.0 冷冻干燥：-60℃预冷冻5小时，在冷冻干燥机做10小时真空冷冻干燥。
6.0 病毒灭活：经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌。
对比例1
1.0 制备断层皮片：用取皮机将动物皮肤制成长6cm，宽4cm，0.6mm厚的断层皮片，纯净水洗涤，用0.15新洁尔灭消毒去脂30分钟，每次100mlPBS洗涤，洗涤3次。
2.0 脱细胞：用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7℃处理24小时。PBS反复冲洗3次，间隔约10分钟，每次100ml。以0.4% SDS 100ml对基质进行震荡洗涤，150转/分钟，温度26℃。每隔1小时更换SDS液，3小时取出，PBS反复冲洗7次，每次100ml，间隔10min。
3.0 交联：用100ml乙醇溶液(乙醇的体积比为40%),加入一水吗啉乙磺酸（MES）使其浓度达到0.06mol/L。再向溶液中加入N,N-二环己基碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),按质量比为每克步骤2.0处理后的材料对应1.8克N,N-二环己基碳化二亚胺和0.415克NHS,浸泡4小时。
5.0 冷冻干燥：-80℃预冷冻4小时，在冷冻干燥机做10小时真空冷冻干燥。
6.0 病毒灭活：经Co-60所产生的Y射线辐照消毒灭菌。
对比例2
1.0 制备断层皮片：用取皮机将动物皮肤制成长6cm，宽4cm，0.6mm厚的断层皮片，纯净水洗涤，用0.15新洁尔灭消毒去脂30分钟，每次100mlPBS洗涤，洗涤3次。
2.0 分离表皮和真皮：用0.15%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在7℃作用24小时终止。
3.0 交联：用100mlPBS溶液(pH7.4),加入40%的戊二醛1.25g,使其浓度达到0.625g/L,浸泡24小时。
4.0 脱细胞：用1%的氢氧化钠溶液100ml处理18小时，然后用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7℃处理24小时。PBS反复冲洗3次，间隔约10分钟，每次100ml。以0.4% SDS 100ml对基质进行震荡洗涤，150转/分钟，温度26℃。每隔1小时更换SDS液，3小时取出，PBS反复冲洗7次，每次100ml，间隔10min。
5.0 冷冻干燥：-80℃预冷冻4小时，在冷冻干燥机做10小时真空冷冻干燥。
6.0 病毒灭活：经Co-60所产生的Y射线辐照消毒灭菌。
对比例3
1.0 制备断层皮片：用取皮机将动物皮肤制成长6cm，宽4cm，0.6mm厚的断层皮片，纯净水洗涤，用0.15新洁尔灭消毒去脂30分钟，每次100mlPBS洗涤，洗涤3次。
2.0 分离表皮和真皮：用0.15%的胰蛋白酶-PBS液100ml，在7℃作用24小时终止。
3.0 交联：用100ml乙醇溶液(乙醇的体积比为40%),加入一水吗啉乙磺酸（MES）使其浓度达到0.06mol/L，再向溶液中加入N,N-二环己基碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),按质量比为每克步骤2.0处理后的材料对应1.8克N,N-二环己基碳化二亚胺和0.415克NHS,浸泡4小时。
4.0 脱细胞：用0.15%的胰蛋白酶-PBS液在7℃处理24小时。PBS反复冲洗3次，间隔约10分钟，每次100ml。以0.4% SDS 100ml对基质进行震荡洗涤，150转/分钟，温度26℃。每隔1小时更换SDS液，3小时取出，PBS反复冲洗7次，每次100ml，间隔10min。
5.0 病毒灭活：经Co-60所产生的Y射线辐照消毒灭菌。
对比例4-13
表1
| 项目 | MES（mol/L） | 每克脱细胞组织对应DCC（g） | 每克脱细胞组织对应NHS（g） | 交联时间 | 交联效果 |
| 实施例1 | 0.06 | 1.8 | 0.415 | 4 | 交联前后质量损失15% |
| 对比例4 | 0.06 | 1.8 | - | 4 | 很差 |
| 对比例5 | 0.06 | 0.6 | 0.415 | 4 | 交联前后质量损失70% |
| 对比例6 | 0.06 | 1.0 | 0.415 | 4 | 交联前后质量损失41% |
| 对比例7 | 0.06 | 5.5 | 0.415 | 4 | 交联前后质量损失12% |
| 对比例8 | 0.06 | 7.0 | 0.415 | 4 | 交联前后质量损失11% |
| 对比例9 | 0.06 | 1.8 | 0.310 | 4 | 交联不完全 |
| 对比例10 | 0.06 | 1.8 | 0.200 | 4 | 交联不完全 |
| 对比例11 | 0.06 | 1.8 | 1.250 | 4 | 干扰交联反应 |
| 对比例12 | 0.06 | 1.8 | 1.800 | 4 | 干扰交联反应 |
| 对比例13 | - | 1.8 | 0.415 | 4 | 很差 |
效果例1
对实施例1和对比例1-3进行效果对比，具体见表2：
表2
| 指标 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| 后处理时间 | 2天 | 5天 | 7天 | 5天 |
| 交联时间 | 4小时 | 4小时 | 24小时 | 4小时 |
| 孔径大小 | 150μM | 70μM | 140μM | 30μM |
| 性状 | 疏松 | 较疏松 | 疏松 | 致密 |
| 脱细胞效果 | 完全 | 完全 | 完全 | 不完全 |
上述后处理时间是指脱细胞步骤完毕后，用纯化水浸泡时间。
由此可见，本发明用N,N-二环己基碳化二亚胺进行交联时间短﹑效率高，另交联前提，极大简化了后面交联剂残留处理程序，节省了成本；脱细胞过程中利用酶﹑SDS和碱联合，对脱细胞基质进行微观调控，利用冷冻干燥对脱细胞基质进行宏观调控，脱细胞彻底，细胞更容易在其上生长。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (5)
1.一种制备异种脱细胞基质的方法，其特征在于：其具体包括如下步骤：
(1) 制备断层皮片
用取皮机将动物皮肤制成0.1-2.0mm厚的断层皮片，经洗涤，去脂，再用磷酸盐缓冲液（PBS液）洗涤；
(2) 分离表皮和真皮
将步骤(1)得到的断层皮片用0.1%-0.5%的胰蛋白酶-PBS液在4℃-20℃下，浸泡6-24h；
(3) 交联
将步骤(2)处理后的材料用含有N,N-二环己基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和一水吗啉乙磺酸（MES）的乙醇水溶液浸泡3-12h；
(4) 脱细胞
将步骤(3)处理后的材料用1-2%的氢氧化钠溶液处理8-24h，然后用0.1%-0.5%的胰蛋白酶-PBS液在4℃-20℃处理20-36h，PBS冲洗，以0.2%-0.5% 十二烷基磺酸钠(SDS)对基质进行震荡洗涤，100-200转/分钟，温度20℃-30℃，每隔1小时更换SDS液，3-5h取出，PBS冲洗；
(5) 冷冻干燥
-100--60℃预冷冻3-5小时，在冷冻干燥机做8-15小时真空冷冻干燥；
(6) 病毒灭活
经Co-60所产生的射线辐照消毒灭菌，即得成品；
所述含有N,N-二环己基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和一水吗啉乙磺酸（MES）的乙醇水溶液的配制方法如下：向乙醇水溶液,加入一水吗啉乙磺酸（MES）使其浓度达到0.06mol/L，再向上述溶液中加入N,N-二环己基碳化二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺(NHS),按质量比为每克步骤(2)处理后的材料对应1.8-5.4克N,N-二环己基碳化二亚胺和0.415-1.245克NHS。
2.根据权利要求1所述的一种制备异种脱细胞基质的方法，其特征在于：所述的PBS液的配制方法如下：
NaCl 8.00g/L；
KCl 0.20 g/L；
Na2HPO4 1.56g/L；
KH2PO4 0.20 g/L；
将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。
3.根据权利要求1所述的一种制备异种脱细胞基质的方法，其特征在于：所述步骤(2)中胰蛋白酶-PBS液的浓度为0.13%，温度为7℃。
4.根据权利要求1所述的一种制备异种脱细胞基质的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，氢氧化钠溶液的浓度为1%，所述胰蛋白酶-PBS液的浓度为0.13%，温度为7℃。
5.一种异种脱细胞基质，其特征在于：所述异种脱细胞基质是采用权利要求1-4任一项所述的方法制得。
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