CN108187140A - 一种鱼皮源脱细胞真皮基质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下步骤：(1)鱼皮预处理；(2)杀菌消毒处理；(3)脱脂处理；(4)脱色处理；(5)高低渗处理；(6)强碱消蚀处理；(7)反复冻融处理；(8)冻干及定型处理。本发明采用了渗透压交替处理裂解细胞，同时配合强碱消蚀和反复冻融的方法去除细胞成分，达到了较为理想的去除细胞的效果，由本发明制得的鱼皮源脱细胞真皮基质具有双层结构，且处理过程对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保存支架材料的完整性，有利于后期细胞的粘附与生长。

Description

一种鱼皮源脱细胞真皮基质及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料制备技术领域，具体涉及一种鱼皮源脱细胞真皮基质及其制备方法。
背景技术
组织工程是20世纪80年代后期兴起的一门新兴交叉学科，用于组织工程的支架材料主要有天然的生物材料和人工合成的高分子材料。脱细胞真皮基质是一种优良的生物医用材料，在皮肤烧伤科有着十分广泛的应用，后来人们尝试将其应用于口腔修复，覆盖于骨缺损创面，发现数周后其表面能很好地愈合。脱细胞真皮基质是一种通过特定理化处理，脱去供体皮肤中的表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞的天然细胞外基质，生物相容性好，诱导骨再生能力强。脱细胞真皮基质的研究历史可以追溯到20世纪60年代，但其真正发展成熟并成功应用于临床只有十几年历史，随着脱细胞技术的不断发展和应用技术的不断完善，异种脱细胞真皮基质具有更广阔的发展前景。
发明专利CN 102225218 B公开了一种利用超声波制备脱细胞真皮基质的方法，该专利的方法包括对剥离的哺乳动物皮肤进行剔除毛发的处理；用消毒液消毒皮肤，在无菌条件下并用机械法制得网状层真皮；将真皮置于低渗溶液内震荡处理0.5小时-12小时，再置于高渗溶液内震荡处理0.5小时-12小时；重复前步骤1-6次；将真皮置于洗涤剂内用超声波清洗器处理12小时-48小时；用无菌磷酸盐缓冲液洗涤1-6次，环氧乙烷消毒即得脱细胞真皮基质。该专利的制备工艺简单实用，细胞去除较为彻底。但是，该专利的方法超声洗涤操作时间过长，容易使真皮基质的天然结构遭到破坏。
发明专利CN 106310352 A公开了一种抗菌性脱细胞真皮基质敷料的制备方法，该制备方法包括以下步骤：选取健康的哺乳动物、剥离动物皮肤、剔除毛发、制备断层皮片、激光制孔、低温冻融、超声波振荡、脱脂处理、脱细胞处理、浸泡水溶性壳聚糖、冷冻干燥、包装和辐照灭菌后得到抗菌性脱细胞真皮基质敷料。该发明的抗菌性脱细胞真皮基质敷料具有胶原三维完整结构，脱细胞彻底，制作周期短并且具有抗菌功能的特点。但是，该发明的方法制备过程中采用了激光打孔技术，破坏了真皮基质天然的疏松多孔结构，不利于细胞的黏附和增长。
目前，大部分专利制备异种脱细胞真皮基质都是用猪皮和牛皮等哺乳动物，但是在信仰伊斯兰教、回教等人群中，来源于哺乳动物的脱细胞真皮基质的应用受到限制。而且，疯牛病、口蹄疫等传染性疾病的发生和流行，使人们对来源于哺乳动物的脱细胞真皮基质的安全性产生了质疑。因此，用水生生物代替哺乳动物成为研究热点，而鱼类动物的真皮组成上与哺乳动物等门类差异巨大，很难从现有技术中的其他动物门类获得相关的技术启示，关于用鱼皮制备脱细胞真皮基质在医用材料领域还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种鱼皮源脱细胞真皮基质及其制备方法。
本发明通过以下技术方案实现，一种鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼皮预处理：将鱼皮上的残肉刮干净，用无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(2)杀菌消毒处理：清洗并浸泡鱼皮，对鱼皮进行杀菌消毒处理；
(3)脱脂处理：将经杀菌消毒处理的鱼皮浸泡在碱溶液中进行脱脂，然后用无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(4)脱色处理：将经脱脂处理的鱼皮浸泡在脱色剂中进行脱色，然后用无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(5)高低渗处理：将经脱色处理的鱼皮置于低渗溶液内震荡处理，再置于高渗溶液内震荡处理，间歇超声清洗；
(6)强碱消蚀处理：将经高低渗和超声处理的鱼皮置于强碱溶液内消蚀处理，间歇超声清洗，无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(7)反复冻融处理：将经强碱消蚀处理的鱼皮置于冰箱梯度冻融，然后清洗；
(8)冻干及定型处理：将经过步骤(7)处理的鱼皮在冻干机中进行冻干得脱细胞真皮基质，然后裁剪成不同的规格独立真空包装。
优选的，步骤(1)中，用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次；且步骤(1)中用于制备脱细胞真皮基质的所述鱼皮为巴沙鱼皮、罗非鱼皮、鳗鱼皮、鲇鱼皮、鮰鱼皮中的一种，所述鱼皮的厚度为0.3mm～1mm。
优选的，步骤(2)中，杀菌消毒使用溶液为pH为6.5～7.5的电解水，处理方式为在室温条件下浸泡15min～30min；清洗方式为plasma等离子清洗。
优选的，步骤(3)中，所述脱脂方式为二次脱脂方式：其中，第一次脱脂用的碱溶液为质量浓度为1％～3％的碳酸氢钠溶液，鱼皮与碳酸氢钠溶液的体积比为1:3～6，第一次的脱脂时间为18～24h，第二次脱脂用的碱溶液为质量浓度为0.5％～1.5％的氢氧化钾溶液，鱼皮与氢氧化钾溶液的体积比为1:3～6，第二次的脱脂时间为12～18h；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次。
优选的，步骤(4)中，所述脱色剂分别为高锰酸钾和亚硫酸氢钠溶液，其中，先用质量浓度为1％～1.5％的高锰酸钾溶液脱色处理20min～30min，鱼皮与高锰酸钾溶液的体积比为1:4～8，然后，再用质量浓度为2％～3％的亚硫酸氢钠溶液脱色处理1h～2h，鱼皮与亚硫酸氢钠溶液的体积比为1:4～8，重复循环3～6次；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次。
优选的，步骤(5)中，所述低渗溶液为蒸馏水，低渗溶液的处理时间为16～24h，所述高渗溶液为1M NaCl，高渗溶液处理时间为16～24h；超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为30～60min，间歇时间为2～4h。
优选的，步骤(6)中，所述强碱溶液为质量浓度为3％～6％的氢氧化钾溶液，鱼皮与氢氧化钾溶液的体积比为1:4～8，浸泡在氢氧化钾溶液中的时间为16～24h；超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为30～60min，间歇时间为2～4h；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次。
优选的，步骤(7)中，梯度冻融处理中，第一次冻结温度为-20℃，第二次冻结温度为-40℃，第三次冻结温度为-80℃，解冻温度均为常温，冻融间隔时间为3～6h。
优选的，步骤(8)中，经冻干得到的脱细胞真皮基质为双层结构，一层疏松，一层致密，有利于细胞增长和黏附；所述脱细胞真皮基质的裁剪规格为1cm×1cm、1.5cm×2cm、2cm×2.5cm中的一种。
本发明还提供了一种鱼皮源脱细胞真皮基质，所述鱼皮源脱细胞真皮基质在干态条件下的拉伸强度为4～6MPa，断裂伸长率为10％～15％，热收缩温度为60～100℃；所述鱼皮源脱细胞真皮基质在湿态条件下的拉伸强度为2～3MPa，断裂伸长率为25％～50％，热收缩温度为80～120℃。
与现有技术相比，本发明有以下优点：
(1)本发明的产品来源广泛，选用了一种新的原料，打破了原来只能用哺乳动物制备脱细胞真皮基质的限制，打破了因宗教信仰带来的限制，避免了牛、羊等哺乳动物带来的传染性疾病，产品更加安全。
(2)本发明采用了渗透压交替处理裂解细胞，同时配合强碱消蚀和反复冻融的方法去除细胞成分，达到了较为理想的去除细胞的效果。
(3)本发明获得的鱼皮源脱细胞真皮基质不含细胞成分，具有良好的生物相容性和细胞相容性，抗原性低。
(4)本发明获得的鱼皮源脱细胞真皮基质具有致密层和疏松层双层结构，有利于细胞黏附和细胞生长。
(5)本发明在鱼皮源脱细胞真皮基质的制备过程中，采用了简单的方法组合，工艺简单，周期较短，价格适当，适合工业化生产。
(6)本发明获得的鱼皮源脱细胞真皮基质在干、湿状态条件下的拉伸强度、断裂伸长率和热收缩温度等性能十分优异，适合在临床治疗中使用。
由本发明制得的鱼皮源脱细胞真皮基质具有双层结构，且处理过程对真皮的支架结构破坏较小，能很好的保存支架材料的完整性，有利于后期细胞的粘附与生长。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明鱼皮源脱细胞真皮基质的断面图；
图2为本发明鱼皮源脱细胞真皮基质的光滑面图；
图3为本发明鱼皮源脱细胞真皮基质的粗糙面图。
具体实施方式
一种鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼皮预处理：将鱼皮上的残肉刮干净，用无菌磷酸缓冲液清洗干净。
(2)杀菌消毒处理：清洗并浸泡鱼皮，对鱼皮进行杀菌消毒处理。
(3)脱脂处理：将经杀菌消毒处理的鱼皮浸泡在碱溶液中进行脱脂，然后用无菌磷酸缓冲液清洗干净。此过程采用二次脱脂的方式，二次脱脂一方面避免了鱼皮中胶原纤维松散，另一方面进一步加强了脱脂效果。
(4)脱色处理：将经脱脂处理的鱼皮浸泡在脱色剂中进行脱色，然后用无菌磷酸缓冲液清洗干净。所述脱色剂分别为高锰酸钾和亚硫酸氢钠溶液，进行氧化还原脱色，高锰酸钾和亚硫酸氢钠氧化还原脱色可以保留胶原分子的活性，避免胶原蛋白结构的破坏。
(5)高低渗处理：将经脱色处理的鱼皮置于低渗溶液内震荡处理，再置于高渗溶液内震荡处理，间歇超声清洗。高低渗处理可以渗透使细胞裂解，促进细胞成分去除。
(6)强碱消蚀处理：将经高低渗和超声处理的鱼皮置于强碱溶液内消蚀处理，间歇超声清洗，无菌磷酸缓冲液清洗干净。
(7)反复冻融处理：将经强碱消蚀处理的鱼皮置于冰箱梯度冻融，然后清洗。梯度冻融可以避免破坏胶原纤维，同时进一步促进细胞成分的去除。
(8)冻干及定型处理：在冻干机中进行冻干得脱细胞真皮基质，然后裁剪成不同的规格独立真空包装。经冻干得到的脱细胞真皮基质为双层结构，一层疏松，一层致密，有利于细胞增长和黏附。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼皮预处理：将用勺子将巴沙鱼皮上的残肉刮干净，用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。所述鱼皮的厚度为0.3mm～1mm。
(2)杀菌消毒处理：将鱼皮用pH为6.5的电解水在室温条件下浸泡30min，并用plasma去离子清洗机进行清洗。
(3)脱脂处理：将经杀菌消毒处理的鱼皮浸泡在1％(w/v)的碳酸氢钠溶液中24h进行第一次脱脂，此时，鱼皮与碳酸氢钠溶液的料液比为1:6(v/v)；然后将鱼皮浸泡在1％(w/v)的氢氧化钾溶液中12h进行第二次的脱脂，此时，鱼皮与碳酸氢钠溶液的料液比为1:6(v/v)；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。
(4)脱色处理：将经脱脂处理的鱼皮浸泡在1％(w/v)的高锰酸钾溶液脱色处理30min，鱼皮与高锰酸钾溶液的体积比为1:8，然后，将鱼皮浸泡在2％(w/v)的亚硫酸氢钠溶液脱色处理1h～2h，鱼皮与亚硫酸氢钠溶液的体积比为1:8，此为一个脱色处理循环(即高锰酸钾溶液脱色处理，后亚硫酸氢钠溶液脱色处理)，重复循环3次，然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。
(5)高低渗处理：将经脱色处理的鱼皮置于蒸馏水中震荡处理16h，然后再置于1MNaCl中震荡处理16h；然后进行间歇超声清洗，超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为30min，间歇时间为2h。
(6)强碱消蚀处理：将经高低渗和超声处理的鱼皮置于4％(w/v)的氢氧化钾溶液内消蚀处理18h，鱼皮与氢氧化钾溶液的体积比为1:6；然后间歇超声清洗，超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为30min，间歇时间为2h；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。
(7)反复冻融处理：将经强碱消蚀处理的鱼皮置于冰箱梯度冻融，第一次冻结温度为-20℃，第二次冻结温度为-40℃，第三次冻结温度为-80℃，解冻温度均为常温，冻融间隔时间为4h。
(8)冻干及定型处理：在冻干机中进行冻干得脱细胞真皮基质，然后裁剪成规格为1cm×1cm进行独立真空包装。
实施例2
一种鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼皮预处理：将用勺子将罗非鱼皮上的残肉刮干净，用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗6次。
(2)杀菌消毒处理：将鱼皮用pH为7.5的电解水在室温条件下浸泡20min～30min，并用plasma去离子清洗机进行清洗。
(3)脱脂处理：将经杀菌消毒处理的鱼皮浸泡在3％(w/v)的碳酸氢钠溶液中18h进行第一次脱脂，此时，鱼皮与碳酸氢钠溶液的料液比为1:3(v/v)；然后将鱼皮浸泡在0.5％(w/v)的氢氧化钾溶液中18h进行第二次的脱脂，此时，鱼皮与碳酸氢钠溶液的料液比为1:3(v/v)；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗6次。
(4)脱色处理：将经脱脂处理的鱼皮浸泡在1.5％(w/v)的高锰酸钾溶液脱色处理20min，鱼皮与高锰酸钾溶液的体积比为1:4，然后，将鱼皮浸泡在3％(w/v)的亚硫酸氢钠溶液脱色处理2h，鱼皮与亚硫酸氢钠溶液的体积比为1:4，此为一个脱色处理循环(即高锰酸钾溶液脱色处理，后亚硫酸氢钠溶液脱色处理)，重复循环6次，然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗6次。
(5)高低渗处理：将经脱色处理的鱼皮置于蒸馏水中震荡处理20h，然后再置于1MNaCl中震荡处理20h；然后进行间歇超声清洗，超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为1h，间歇时间为4h。
(6)强碱消蚀处理：将经高低渗和超声处理的鱼皮置于3％(w/v)的氢氧化钾溶液内消蚀处理24h，鱼皮与氢氧化钾溶液的体积比为1:4；然后间歇超声清洗，超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为1h，间歇时间为4h；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗6次。
(7)反复冻融处理：将经强碱消蚀处理的鱼皮置于冰箱梯度冻融，第一次冻结温度为-20℃，第二次冻结温度为-40℃，第三次冻结温度为-80℃，解冻温度均为常温，冻融间隔时间为6h。
(8)冻干及定型处理：在冻干机中进行冻干得脱细胞真皮基质，然后裁剪成规格为1.5cm×2cm进行独立真空包装。
实施例3
一种鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，包括以下步骤：
(1)鱼皮预处理：将用勺子将鳗鱼皮上的残肉刮干净，用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。
(2)杀菌消毒处理：将鱼皮用pH为7的电解水在室温条件下浸泡15min，并用plasma去离子清洗机进行清洗。
(3)脱脂处理：将经杀菌消毒处理的鱼皮浸泡在2％(w/v)的碳酸氢钠溶液中20h进行第一次脱脂，此时，鱼皮与碳酸氢钠溶液的料液比为1:4(v/v)；然后将鱼皮浸泡在1.5％(w/v)的氢氧化钾溶液中12h进行第二次的脱脂，此时，鱼皮与碳酸氢钠溶液的料液比为1:4(v/v)；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。
(4)脱色处理：将经脱脂处理的鱼皮浸泡在1％(w/v)的高锰酸钾溶液脱色处理25min，鱼皮与高锰酸钾溶液的体积比为1:5，然后，将鱼皮浸泡在2.5％(w/v)的亚硫酸氢钠溶液脱色处理1.5h，鱼皮与亚硫酸氢钠溶液的体积比为1:5，此为一个脱色处理循环(即高锰酸钾溶液脱色处理，后亚硫酸氢钠溶液脱色处理)，重复循环3次，然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。
(5)高低渗处理：将经脱色处理的鱼皮置于蒸馏水中震荡处理24h，然后再置于1MNaCl中震荡处理24h；然后进行间歇超声清洗，超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为45min，间歇时间为3h。
(6)强碱消蚀处理：将经高低渗和超声处理的鱼皮置于6％(w/v)的氢氧化钾溶液内消蚀处理18h，鱼皮与氢氧化钾溶液的体积比为1:8；然后间歇超声清洗，超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为45min，间歇时间为3h；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3次。
(7)反复冻融处理：将经强碱消蚀处理的鱼皮置于冰箱梯度冻融，第一次冻结温度为-20℃，第二次冻结温度为-40℃，第三次冻结温度为-80℃，解冻温度均为常温，冻融间隔时间为3h。
(8)冻干及定型处理：在冻干机中进行冻干得脱细胞真皮基质，然后裁剪成规格为2cm×2.5cm进行独立真空包装。
由实施例1～3获得的鱼皮源脱细胞真皮基质具有良好的生物相容性和细胞相容性。且所述鱼皮源脱细胞真皮基质在干态条件下的拉伸强度为4～6MPa，断裂伸长率为10％～15％，热收缩温度为60～100℃。所述鱼皮源脱细胞真皮基质在湿态条件下的拉伸强度为2～3MPa，断裂伸长率为25％～50％，热收缩温度为80～120℃。并且由图1～3所示，所述鱼皮源脱细胞真皮基质是一种具有疏松层和致密层的双层多孔结构，且孔隙大小保持在20～100μm，有利于细胞增长和黏附。
以上所述仅为发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)鱼皮预处理：将鱼皮上的残肉刮干净，用无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(2)杀菌消毒处理：清洗并浸泡鱼皮，对鱼皮进行杀菌消毒处理；
(3)脱脂处理：将经杀菌消毒处理的鱼皮浸泡在碱溶液中进行脱脂，然后用无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(4)脱色处理：将经脱脂处理的鱼皮浸泡在脱色剂中进行脱色，然后用无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(5)高低渗处理：将经脱色处理的鱼皮置于低渗溶液内震荡处理，再置于高渗溶液内震荡处理，间歇超声清洗；
(6)强碱消蚀处理：将经高低渗和超声处理的鱼皮置于强碱溶液内消蚀处理，间歇超声清洗，无菌磷酸缓冲液清洗干净；
(7)反复冻融处理：将经强碱消蚀处理的鱼皮置于冰箱梯度冻融，然后清洗；
(8)冻干及定型处理：将经过步骤(7)处理的鱼皮在冻干机中进行冻干得脱细胞真皮基质，然后裁剪成不同的规格独立真空包装。
2.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次；且步骤(1)中用于制备脱细胞真皮基质的所述鱼皮为巴沙鱼皮、罗非鱼皮、鳗鱼皮、鲇鱼皮、鮰鱼皮中的一种，所述鱼皮的厚度为0.3mm～1mm。
3.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，杀菌消毒使用溶液为pH为6.5～7.5的电解水，处理方式为在室温条件下浸泡15min～30min；清洗方式为plasma等离子清洗。
4.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述脱脂方式为二次脱脂方式：其中，第一次脱脂用的碱溶液为质量浓度为1％～3％的碳酸氢钠溶液，鱼皮与碳酸氢钠溶液的体积比为1:3～6，第一次的脱脂时间为18～24h，第二次脱脂用的碱溶液为质量浓度为0.5％～1.5％的氢氧化钾溶液，鱼皮与氢氧化钾溶液的体积比为1:3～6，第二次的脱脂时间为12～18h；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次。
5.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述脱色剂分别为高锰酸钾和亚硫酸氢钠溶液，其中，先用质量浓度为1％～1.5％的高锰酸钾溶液脱色处理20min～30min，鱼皮与高锰酸钾溶液的体积比为1:4～8，然后，再用质量浓度为2％～3％的亚硫酸氢钠溶液脱色处理1h～2h，鱼皮与亚硫酸氢钠溶液的体积比为1:4～8，重复循环3～6次；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次。
6.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述低渗溶液为蒸馏水，低渗溶液的处理时间为16～24h，所述高渗溶液为1M NaCl，高渗溶液处理时间为16～24h；超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为30～60min，间歇时间为2～4h。
7.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述强碱溶液为质量浓度为3％～6％的氢氧化钾溶液，鱼皮与氢氧化钾溶液的体积比为1:4～8，浸泡在氢氧化钾溶液中的时间为16～24h；超声用的超声波清洗器的频率为40kHz，功率为250W，每次超声的清洗时间为30～60min，间歇时间为2～4h；然后用10mM、pH为7.4的无菌磷酸缓冲液清洗3～6次。
8.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，梯度冻融处理中，第一次冻结温度为-20℃，第二次冻结温度为-40℃，第三次冻结温度为-80℃，解冻温度均为常温，冻融间隔时间为3～6h。
9.根据权利要求1所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于：步骤(8)中，经冻干得到的脱细胞真皮基质为双层结构，一层疏松，一层致密，有利于细胞增长和黏附；所述脱细胞真皮基质的裁剪规格为1cm×1cm、1.5cm×2cm、2cm×2.5cm中的一种。
10.根据权利要求1～9任一项所述的鱼皮源脱细胞真皮基质的制备方法制备获得的鱼皮源脱细胞真皮基质，所其特征在于：所述鱼皮源脱细胞真皮基质在干态条件下的拉伸强度为4～6MPa，断裂伸长率为10％～15％，热收缩温度为60～100℃；所述鱼皮源脱细胞真皮基质在湿态条件下的拉伸强度为2～3MPa，断裂伸长率为25％～50％，热收缩温度为80～120℃。
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