JP5277479B2 - 多孔質コラーゲン基質を調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、多孔質コラーゲン基質の調製方法に関する。

コラーゲン基質は、他にもあるが、人工組織、人工臓器、及び薬剤送達手段を作るために使用されることが出来る。コラーゲン基質は、通常、コラーゲンが豊富な結合組織から抽出したコラーゲン繊維を再構成することで調製される。コラーゲン繊維を抽出するための従来の方法は、コラーゲン繊維網構造を破壊する酷烈な物理的又は化学的処理、例えば粉砕、均質化、又は酸性／塩基性分解を必要とする。

本発明は、ほぼ無塩で穏やかな酸性溶液で結合組織を処理することで、結合組織はかなりの程度膨張しコラーゲン網構造を壊すことがないという予期せぬ発見に基づいている。

従って、本発明の１つの態様は、結合組織から直接、多孔質コラーゲン基質を調製するための方法を提供する。この方法は（i）２０ｍｍ²〜２ｍ²（例えば、２５ｍｍ²〜９００ｃｍ²）の範囲の表面を有する結合組織を準備すること、（ii）酸性溶液を用いて該結合組織の体積を５０％以上（例えば１００％〜５００％）膨張させ、膨張した結合組織を作ること、及び（iii）該膨張した結合組織を洗浄して非コラーゲン物質を取り除くことで、多孔質コラーゲン基質を作製することを含む。該結合組織は真皮または腱に由来してよい。結合組織を膨張させるために使用する該酸性溶液はｐＨが１〜６（例えば、２〜４）でほぼ無塩、即ち、塩を含まないか又は非常に低い濃度で塩を含むので、この溶液のイオン強度は０．００５Ｍ以下である。この酸性溶液の例は、他にもあるが、蟻酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、又はこれらの混合物から調製できる。好ましくは、この酸性溶液は０．１〜６Ｍ酢酸溶液である。

前記膨張させるステップの前に、前記結合組織を有機溶剤と随意に水とを含む溶剤ですすぐことが出来る。該溶剤が有機溶剤と水の両方を含む場合、有機溶剤と水との体積比は１：４〜９：１の範囲であってよい。該有機溶剤の例は、これらに限定されないがアルコール、ケトン、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、Ｎ,Ｎ‐ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びこれらの混合物を含む。該結合組織が皮膚に由来し毛又は毛根を含む場合、該結合組織をタンパク質分解酵素（例えば、ディスパーゼ、トリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、ブロメライン、フィシン、及びこれらの混合物）で前処理し該毛又は毛根を除去するのが好ましい。

前記膨張させるステップは、前記結合組織を前記酸性溶液に浸漬することで実行される。随意に、この浸漬処理は、該結合組織に液体を噴射すること、又は超音波処理と同時に実行される。

前記膨張させるステップ後、該膨張した結合組織を洗浄して非コラーゲン物質を取り除くことで、多孔質コラーゲン基質を作製する。該洗浄するステップは、該膨張した結合組織を洗剤、タンパク質分解酵素、又はこれらの混合物を含む洗浄液に浸漬することで実行されてもよい。随意に、この浸漬処理は、該膨張した結合組織に液体を噴射すること、又は結合組織を超音波で処理することと共に実行される。
上記の方法により調製された多孔質コラーゲン基質も本発明の範囲内である。

本発明の１つ以上の実施形態を下記に詳細に説明する。本発明の他の特徴及び利点は、下記の実施例の詳細な説明と図面と添付の請求項から明らかとなるであろう。

実施例１で説明するプロセスにより調製された多孔質コラーゲン基質の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（倍率：×１００）である。 実施例１で説明するプロセスにより調製された多孔質コラーゲン基質のＳＥＭ画像（倍率：×４００）である。

コラーゲンが主なタンパク質である結合組織から多孔質コラーゲン基質を直接調製する方法を説明する。コラーゲンは、約３００ｎｍの長さと約１．５ｎｍの直径を有する３重らせん棒状分子である。複数のコラーゲン分子がコラーゲン原繊維を形成し、コラーゲン原繊維の束がコラーゲン繊維を形成する。共有結合架橋がコラーゲン分子間及び分子内に存在し、結合組織内で繊維網を形成する。

本発明の方法では、出発物質、即ち、結合組織は、牛、豚、馬、羊、鶏、鴨、七面鳥、雁、鯨、鮫などの動物に由来してもよい。本方法で使用するのに適した結合組織は、これらに限定されないが真皮、皮下組織、靭帯、腱、腱膜、軟骨、及び骨組織を含む。必要であれば、結合組織を先ず手作業（例えば、肉眼解剖）、又は機械で清掃し、脂肪、脂質等の望ましくない物質を取り除く。１つの実施例では、新鮮な動物の皮膚から脂質を取り除き、その皮膚を生理食塩水で数回洗浄し、その動物の皮膚の表面層を皮膚切断器で取り除くことで真皮が得られる。この真皮をリン酸緩衝生理食塩水で更に洗浄してもよい。

もし望むなら、結合組織を先ず適切な有機溶剤又は有機溶剤と水との混合物で処理し、有機溶剤を結合組織に浸透させてもよい。有機溶剤の例は、これらに限定されないがアルコール、ケトン、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、Ｎ,Ｎ‐ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、又はこれらの混合物を含む。有機溶剤と水との混合物を使用する場合、有機溶剤と水との比率は１：５超（例えば、１：４、１：１、又は４：１）である。

結合組織は、毛又は毛根を含む場合、毛又は毛根を分解するタンパク質分解酵素（例えば、ディスパーゼ、トリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、ブロメライン、フィシン、又はこれらの混合物）で処理してもよい。

次に、上記の結合組織のいずれかを有効量の酸性溶液に十分な時間浸清し、結合組織を所望の程度、即ち、元の厚みより約５０％以上大きな厚み（例えば、元の厚みの２〜１０倍）になるまで膨張させる。この酸性溶液は有機酸、例えば蟻酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、又はこれらの混合物から調製できる。１つの実施例では、酸性溶液は濃度０．１〜６Ｍ（例えば、０．１〜２Ｍ又は０．５〜１．２５Ｍ）の酢酸溶液である。より良好な膨張効果を得るために、本発明で使用される酸性溶液はほぼ無塩である。

上記膨張ステップでは、結合組織は上記の酸性溶液中に浮遊する。もし望むなら、１つ又は複数の液体流を結合組織に当てて酸性溶液の結合組織への浸透を容易にし、結合組織を所望の程度に膨張させるのに必要な時間を低減してもよい。液体流は結合組織と酸性溶液が入った容器に設けられたノズル又は孔から噴出してもよい。

或いは又は加えて、超音波振動装置で生成された超音波、又は電磁場又はカムで生成された高周波数水波を酸性溶液に浸清された結合組織に当てて、酸性溶液の結合組織への浸透を助けてもよい。

上記の膨張ステップから得られた膨張した結合組織を、洗浄液を用いて洗浄し非コラーゲン物質を膨張した結合組織からほぼ取り除き、これにより多孔質コラーゲン基質を作製する。洗浄液は洗剤、キレート試薬、タンパク質分解酵素、又はこれらの混合物を含んでよい。

洗浄液を調製するための典型的な洗剤は、これらに限定されないがドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、テゴ化合物（例えば、Tween 80、Triton W. R. 1339、ｐ‐イソオクチルポリオキシ‐エチレンフェノール重合体、及びTriton A20）、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、エマゾール４１３０（ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン）、ルブロールＷ、ノニデットＰ４０を含む。１つの実施例では、０．０１〜１０％のＳＤＳを含む洗浄液を使用して、膨張した結合組織を４〜４５℃で１〜１５０時間処理する。

洗浄液に含まれるキレート試薬は、これらに限定されないがエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１,４,７,１０‐テトラアザシクロドデカン‐１,４,７,１０‐四酢酸（ＤＯＴＡ）、１,４,７,１０‐テトラアザシクロドデカン‐１,４,７,１０‐テトラキス（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、トランス‐１,２‐ジアミノシクロヘキサン‐四酢酸（ＣＤＴＡ）、４,５‐ジヒドロキシベンゼン‐１,３‐ジスルホン酸（タイロン）、チオ尿素、８‐ヒドロキシキノリン‐５‐スルホン酸、３,６‐ジスルホ‐１,８‐ジヒドロキシ‐ナフタレン、Eriochromeschwarz T（１‐（１‐ヒドロキシ‐２‐ナフチルアゾ）‐２‐ヒドロキシ‐５‐ニトロ‐４‐ナフタレンスルホン酸）、プルプル酸アンモニウムなどを含む。好ましくは、キレート試薬は濃度０．０１〜１００ｍＭのＥＤＴＡである。

或いは又は加えて、洗浄液は、細胞外基質関連タンパク質、他の非コラーゲンタンパク質、及びコラーゲン分子のテロペプチドを取り除くための１つ以上のタンパク質分解酵素、例えばフィシン、ペプシン、トリプシン、ディスパーゼ、及びハーモライシン（hermolysin）を含んでもよい。制限酵素消化、即ち、コラーゲン繊維の完全性を維持しながら非コラーゲンタンパク質を分解する時の条件は当分野において周知である。

洗浄ステップでは、上記の洗浄液のいずれにおいても膨張した結合組織を十分な時間浮遊させることが出来る。１つの実施例では、膨張した結合組織に向けて１つ又は複数の液体流をノズル又は孔から噴出させて、非コラーゲン物質の除去を容易にする。この液体流は水、洗剤含有溶液、又は酵素含有溶液の流れであってよい。別の実施例では、膨張した結合組織は洗浄液に浸漬され、超音波で処理して洗浄効率を向上させる。

洗浄ステップから得られた多孔質コラーゲン基質をゆっくり冷凍して所望のサイズの液晶を含む基質を形成させることが出来る。次に保存のため凍結乾燥することができる。或いは、リン酸緩衝生理食塩水に浸漬し、４℃で保存することが出来る。必要であれば、多孔質コラーゲン基質は標準の化学的又は物理的方法で架橋結合されてもよい。コラーゲン分子を架橋結合するための薬品は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド、及びポリエポキシ化合物（例えば、グリコール・ジグリシジル・エーテル、ポリオール・ポリグリシジル・エーテル、及びジカルボン酸ジグリシジルエステル）を含む。

コラーゲン基質を調製するための上記の方法は、従来の方法と少なくとも２つ点で異なる。第１に、結合組織の繊維状コラーゲン網を壊す酷烈な物理的又は化学的処理（例えば、粉砕、均質化、又は強い酸性／塩基性処理）を必要としない。第２に、従来の方法はコラーゲン繊維を安定させるために塩を使用するが、上記の方法はほぼ無塩の酸性溶液を使用して結合組織を膨張させる。

上記の方法のいずれかで調製された多孔質コラーゲン基質も本明細書に開示する。この多孔質コラーゲン基質を、人工組織、人工臓器、インプラント、及び薬剤送達手段を調製するために、又は細胞成長のためのスカフォルドとして使用することができる。

更なる説明を省略しても上記の説明に基づいて当業者は本発明を完全に利用することが出来るであろう。従って、下記の具体例は単に例示であり、本開示をどのようにも限定しないと解釈されるべきである。引用した全ての公報を本明細書に援用する。

実施例１：豚の皮膚から多孔質コラーゲン基質を調製
豚の皮膚を採取した。脂質除去後、この皮膚を生理食塩水で数回洗浄した。皮膚の表面層を皮膚切断器で取り除いて厚さ０．３ｍｍの真皮を得た。この真皮をリン酸緩衝生理食塩水で更に洗浄した。洗浄後、真皮表面から全ての生理食塩水残留物を完全に除去した。

真皮を０．５Ｍ酢酸で満たされた容器内に入れ、３７℃で様々な時間培養して真皮を膨張させた。培養中、真皮を浮遊させるために容器をシェーカーに載せた。様々な時点における膨張した真皮の厚みを下記の表１に示す。

次に、膨張した真皮をＳＤＳ（０．５％）及びＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を含む溶液に室温で２時間浸漬して、非コラーゲン物質を除去し多孔質コラーゲン基質を作製した。

得られた多孔質コラーゲン基質を無菌リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し残留ＳＤＳ及びＥＤＴＡを除去し、次に−２０℃で冷凍し保存のため凍結乾燥した。凍結乾燥された多孔質コラーゲン基質に真空中で金をスパッターし、ＳＥＭ写真を撮影した。図１及び図２に示すように、多孔質コラーゲン基質は細胞及び細胞屑がなく、コラーゲン繊維によって形成された基質構造を有している。

実施例２：液体噴射を使用して多孔質コラーゲン基質を調製
上記の実施例１で説明した方法に従って、豚の真皮を調整し０．５Ｍ酢酸に浸漬した。より具体的には、複数のノズルを有する容器内の酢酸に真皮を浸漬し、各ノズルから真皮に向って酢酸流を噴出させた。下記の表２に示すように、この噴射ステップは膨張処理を加速した。

次に、膨張した真皮を上記の実施例１で説明したＳＤＳ／ＥＤＴＡ溶液で、浸漬及び噴射により洗浄し、多孔質コラーゲン基質を作製した。

実施例３：超音波処理を使用して多孔質コラーゲン基質を調製
液体噴射を超音波振動装置を使用する超音波処理に替えた以外は上記の実施例２で説明した方法に従って、多孔質コラーゲン基質を調製した。

得られた結果は、液体噴射と同様、超音波処理も適切な程度に真皮を膨張させるための時間をかなり短縮したことを示した。

実施例４：アルコールで前処理された豚の真皮から多孔質コラーゲン基質を調製
上記の実施例１の方法に従って調整した豚の真皮を３０％エタノール（アルコール／水＝３０：７０（ｖ／ｖ））で満たされた容器内に入れた。真皮をエタノール溶液中に浮遊させるために容器をシェーカーに載せた。真皮を３０％エタノール溶液中で約１４時間培養した。

３０％エタノール溶液を注ぎ出した後、容器を０．５Ｍ酢酸で満たしシェーカーに載せて酢酸に浸漬された真皮を膨張させた。１日後に膨張した真皮は０．４５ｍｍの厚み（元の真皮の１．５倍）に達した。これはエタノール前処理も０．４５ｍｍ厚の膨張した真皮を得るための膨張時間を短縮したことを示す。

０．５Ｍ酢酸を取り除いた後、膨張した真皮を２０％エタノール（アルコール／水＝２０：８０（ｖ／ｖ））を用いて室温で１２時間培養した。作製された多孔質コラーゲン基質を脱イオン水で洗浄し、−２０℃で冷凍し保存のため凍結乾燥した。

実施例５：タンパク質分解酵素処理を使用して多孔質コラーゲン基質を調製
豚の皮膚組織を洗浄し、次にディスパーゼを含む溶液（１５Ｕ／ｍｌ）で１日培養した。次に上記の実施例２の方法に従って皮膚組織を膨張させた後、洗浄し多孔質コラーゲン基質を作製した。結果は、ディスパーゼ処理された皮膚組織が０．４５ｍｍの厚みに達するのに６時間しかかからなかったことを示した。

比較例１：多孔質コラーゲン基質の従来の調製方法
上記の実施例１の方法に従って、豚の真皮を得て、０．５Ｍ酢酸に３７℃で１２時間回転させながら浸漬した。次に、この真皮を０．２Ｍ酢酸と０．５ＭのＮａＣｌとを含む溶液に移し７２時間培養した。処理後の真皮は０．３６ｍｍの厚み（元の真皮の１．２倍）であった。次に、この真皮を１％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含む溶液に移し２４時間培養した後、ＳＤＳ及びＥＤＴＡを含む溶液に移し３７℃で２４時間更に培養した。最後に、この真皮を無菌リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、−２０℃で冷凍し凍結乾燥した。

上記のように、酢酸と塩（即ち、塩化ナトリウム）の両方を含む溶液中で膨張させた場合、０．３ｍｍ厚の真皮は７２時間超で０．３６ｍｍの厚みに達した。一方、実施例１に示したように、酢酸だけを含む溶液中で膨張させた場合、０．３ｍｍ厚の真皮は３日で０．９ｍｍの厚みに達した（表１参照）。これは無塩の酸性溶液は、酸と塩（この場合、ＮａＣｌ）の両方を含む溶液よりずっと大きく真皮を膨張させることを示す。これは塩の安定化効果のためである可能性がある。より具体的には、塩はコラーゲン繊維を安定にするので、膨張しないでぎっしり詰まる可能性がある。

他の実施形態
本明細書に開示した特徴の全ては任意に組み合わせることが出来る。本明細書に開示した各特徴は、同じか、又は等価な、又は類似の目的を果す別の特徴で置き換えてもよい。従って、特にことわらない限り、開示した各特徴は等価な、又は類似の特徴群の一例でしかない。

上記の説明から、当業者は本発明の重要な特徴を容易に理解し、本発明の思想と範囲を逸脱することなく、様々な用途と条件に合わせて本発明の様々な変更と変形を想到する可能性がある。従って、他の実施形態も請求の範囲に入る。

Claims (16)

1. 結合組織から多孔質コラーゲン基質を調製するためのプロセスであって、
   ２０ｍｍ²〜２ｍ²の範囲の表面を有する結合組織を準備することと、
   塩を含まず、又はイオン強度が０．００５Ｍ以下となるように、非常に低い濃度で塩を含み、ｐＨが１〜６の酸性溶液を用いて該結合組織の体積を５０％以上膨張させ、膨張した結合組織を作ることと、
   該膨張した結合組織を洗浄して非コラーゲン物質を取り除くことで、多孔質コラーゲン基質を作製することとを含み、
   前記膨張させるステップは、前記結合組織を前記酸性溶液に浸漬しながら、該結合組織に液体を噴射すること、または該結合組織を超音波で処理することで実行されるプロセス。
2. 前記結合組織は２５ｍｍ²〜９００ｃｍ²のサイズを有する請求項１に記載のプロセス。
3. 前記酸性溶液は、蟻酸、カルボン酸、シュウ酸、酢酸、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、ホウ酸、リン酸、及びこれらの混合物からなるグループから選択された酸を含む請求項１に記載のプロセス。
4. 前記酸性溶液は、２〜４のｐＨ値を有する請求項３に記載のプロセス。
5. 前記酸性溶液は、酢酸を０．１〜６Ｍの濃度で含む請求項４に記載のプロセス。
6. 前記膨張させるステップは、前記結合組織の体積を１００％〜５００％膨張させる請求項１に記載のプロセス。
7. 前記洗浄するステップは、前記膨張した結合組織を洗剤、タンパク質分解酵素、又はこれらの混合物を含む洗浄液に浸漬することで実行される請求項１に記載のプロセス。
8. 前記洗浄するステップは、前記膨張した結合組織を前記洗浄液に浸漬しながら、該膨張した結合組織に液体を噴射することで実行される請求項７に記載のプロセス。
9. 前記洗浄するステップは、前記膨張した結合組織を前記洗浄液に浸漬しながら、該膨張した結合組織を超音波で処理することで実行される請求項７に記載のプロセス。
10. 前記膨張させるステップの前に、前記結合組織を有機溶剤と水とを含む溶剤で処理することを更に含み、
    該有機溶剤は、アルコール、ケトン、アセトン、アセトニトリル、クロロホルム、Ｎ,Ｎ‐ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びこれらの混合物からなるグループから選択される請求項１に記載のプロセス。
11. 前記溶剤は、前記有機溶剤と水の両方を体積比１：４〜９：１で含む請求項１０に記載のプロセス。
12. 前記結合組織は複数の毛又は毛根を含み、該プロセスは前記膨張させるステップの前に、該結合組織をタンパク質分解酵素で処理し該毛又は毛根をほぐすことを更に含む請求項１に記載のプロセス。
13. 前記タンパク質分解酵素はディスパーゼ、トリプシン、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、ブロメライン、フィシン、及びこれらの混合物からなるグループから選択される請求項１２に記載のプロセス。
14. 前記結合組織は真皮または腱に由来する請求項１に記載のプロセス。
15. 前記洗浄するステップ後、前記多孔質コラーゲン基質を乾燥させることを更に含む請求項１に記載のプロセス。
16. 前記洗浄するステップは、前記膨張した結合組織を洗剤、キレート試薬、又はこれらの混合物を含む第１洗浄液と、タンパク質分解酵素を含む第２洗浄液とで処理することで実行される請求項１に記載のプロセス。

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