KR20180131721A - 피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 조직의 탈세포화 방법은 탈세포화 대상이 되는 피부 조직을 준비하는 단계, 상기 피부 조직을 트립신이 포함된 제1 용액을 이용해 처리하는 박리 준비 단계 및 상기 박리 준비 단계 이후에 상기 피부 조직으로부터 피하 지방을 제거하는 박리 단계를 포함한다.

Description

피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크{Method for decellularizaion of dermis, producing of artificial skin and producing of D-dECM hydrogel, Lyophilized D-dECM hydrogel and Bio-ink}
본 발명은 피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 실제 피부와 보다 유사한 인공 피부를 제조하기 위한 피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크에 관한 것이다.
현재 인공 피부는 주로 콜라겐(Collagen) 하이드로젤(Hydrogel)에 세포를 봉입하는 방법으로 제작된다.
그러나 콜라겐 하이드로젤을 이용하여 만든 인공 피부는 그 물성이 약하여 잘 부서지기 때문에 실질적으로 사람이 다루기 어렵다. 또한, 인공 피부를 오랜 기간 배양하면 그 부피가 상당히 줄어드는 동시에 세포들도 죽게 되기 때문에 일정 시간이 지나면 사용할 수 없다.
그리고 피부 진피층이 콜라겐만으로 이루어져 있는 것이 아니기 때문에 콜라겐 하이드로젤을 이용하여 만들어진 인공 피부는 아직까지는 실제 피부와 유사한 환경을 만들어내는데 한계가 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 실제 피부와 보다 유사한 인공 피부를 제조하는데 필요한 피부 조직의 탈세포화 방법, 인공 피부 제작 방법, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 동결 건조한 탈세화된 피부 조직 및 바이오 잉크를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 조직의 탈세포화 방법은 탈세포화 대상이 되는 피부 조직을 준비하는 단계, 상기 피부 조직을 트립신이 포함된 제1 용액을 이용해 처리하는 박리 준비 단계 및 상기 박리 준비 단계 이후에 상기 피부 조직으로부터 피하 지방을 제거하는 박리 단계를 포함한다.
상기 제1 용액은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 더 포함할 수 있다.
상기 제1 용액은 상기 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 1mM 이내, 상기 트립신이 0.25% 이내로 용해된 것일 수 있다.
상기 박리 준비 단계 및 상기 박리 단계 중 적어도 한 단계에서 상기 피부 조직의 표피가 제거될 수 있다.
상기 박리 단계를 거친 이후의 상기 피부 조직을 마그네슘 이온과 DNA 분해 효소가 포함된 제2 용액을 이용해 처리하는 DNA 처리 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제2 용액은 완충 용액에 10mM 이하의 염화마그네슘(MgCl2)과 30 U/ml 이하의 DNase를 포함할 수 있다.
상기 완충 용액은 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 포함하고, 상기 DNA 처리 단계는 섭씨 30도 이상 섭씨 40도 이하의 온도에서 20시간 이상 수행될 수 있다.
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 비이온 계면활성제가 포함된 완충 용액을 이용해 상기 박리 단계를 거친 이후의 상기 피부 조직을 처리하는 세포 제거 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 완충 용액은 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)에 상기 에틸렌디아민테트라아세트산이 25mM 이하, 상기 비이온 계면활성제가 1% 이하로 용해된 것일 수 있다.
상기 세포 제거 단계는 섭씨 30도 이상 섭씨 40도 이하의 온도에서 20시간 이상 수행될 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 동결 건조한 탈세포화된 피부 조직은 탈세포화된 피부 조직을 40시간 이상 동결 건조한 것일 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오 잉크는 탈세포화된 피부 조직에 인간의 진피 섬유아세포(normal human dermal fibroblasts; NHDF)를 혼합한 것일 수 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 인공 피부 제작 방법은 바이오 잉크에 인간의 표피 케라틴 형성세포(normal human epithelial keratinocytes; NHEK)를 뿌린 후 배양하는 단계를 포함한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법은 탈세포화된 피부 조직을 펩신과 함께 아세트산 용액에 용해시켜 프리젤(pre-gel)을 제작하는 단계 및 상기 프리젤을 중화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 기타 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.
본 발명의 실시예들에 의하면 적어도 다음과 같은 효과가 있다.
실제 피부와 더욱 유사한 인공 피부를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 조직의 탈세포화 방법을 도시한 순서도이다.
도 2는 생화학적 분석방법을 이용해 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 방법을 통해 제조된 탈세포화된 피부 조직(D-dECM)과 원래 피부 조직(Native)안에 포함된 콜라겐, 글라이코사미노글리칸, 엘라스틴, 히알루론산, DNA의 함유량을 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 도시한 순서도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤과 콜라겐 하이드로젤의 물성치와 SEM 이미지를 비교한 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤과 콜라겐 하이드로젤에서 배양된 NHDF와 NHEK의 성장 상태를 비교한 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤과 콜라겐 하이드로젤에서 배양된 NHDF의 qRT-PCR 데이터를 도시한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤로 만들어진 인공 피부와 콜라겐 하이드로젤로 만들어진 인공 피부의 단면을 비교 도시한 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤로 만들어진 인공 피부와 콜라겐 하이드로젤로 만들어진 인공 피부의 두께와 넓이를 비교 도시한 그래프이다.
도 9는 콜라겐 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only COL), 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C), 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only D-dECM) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)의 피부 접촉각 측정 결과를 비교 도시한 것이다.
도 10은 콜라겐 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only COL), 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C), 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only D-dECM) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)의 표피간 전기저항 측정 결과를 비교 도시한 것이다.
도 11은 콜라겐 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only COL), 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C), 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only D-dECM) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)은 피부장벽 투과도 검사 결과를 비교 도시한 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 조직의 탈세포화 방법, 이를 이용한 탈세포화된 피부 조직, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법, 이를 이용한 인공 피부 제작 방법 등을 설명하기 위한 도면들을 참고하여 본 발명에 대하여 설명하도록 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 조직의 탈세포화 방법을 도시한 순서도이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 조직의 탈세포화 방법은, 피부 조직 준비 단계(S11), 박리 준비 단계(S12), 박리 단계(S13), 세포 제거 단계(S14), 1차 세척 단계(S15), DNA 처리 단계(S16), 2차 세척 단계(S17), 소독 단계(S18) 및 3차 세척 단계(S19)를 포함한다.
피부 조직 준비 단계(S11)에서는 탈세포화가 진행될 피부 조직을 준비한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 방법에서는 탈세포화를 진행할 피부 조직으로서 돼지의 피부 조직을 사용한다. 돼지의 피부 조직은 진피층을 포함하도록 준비하는 것이 바람직하다.
박리 준비 단계(S12)에서는 약 1mM 농도의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액에 트립신이 약 0.25% 농도로 첨가된 용액(제1 용액)이 사용될 수 있다. 실시예에 따라 에틸렌디아민테트라아세트산과 트립신의 농도는 다양하게 선택될 수 있다.
박리 준비 단계(S12)에서 S11 단계에서 준비된 돼지의 피부 조직은 제1 용액을 이용해 대략 6시간 동안 처리될 수 있다. 돼지의 피부 조직은 제1 용액에 6시간 동안 침지되거나, 제1 용액과 함께 교반될 수 있다. 돼지의 피부 조직이 제1 용액에 의해 6시간 동안 처리되는 중에 피부 조직의 표피층의 적어도 일부는 제1 용액에 의해 분해될 수 있다.
박리 단계(S13)에서는 S12를 거친 돼지의 피부 조직에서 피하 지방을 제거한다. 또한, S12단계에서 제거되지 않고 잔존하는 표피층도 함께 제거한다.
S12를 거치면서 피부 조직의 피하 지방과 표피는 제1 용액에 의해 흐물흐물하게 물러진다. 박리 단계(S13)에서는 칼 등의 공구를 이용해 자르거나 긁어내는 중의 물리적 방법으로 피하 지방과 표피를 제거할 수 있다. 박리 단계(S13)에서는 피부 조직의 진피층을 제외한 나머지를 제거할 수 있다.
세포 제거 단계(S14)에서는 완충 용액에 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 계면 활성제가 용해된 용액(세포 제거 용액)으로 S13를 거친 돼지의 피부 조직을 처리할 수 있다.
본 실시예에서는 완충 용액으로서 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 사용하였으며, 계면 활성제로서 비이온 계면 활성제인 Triton X-100을 사용하였다. 인산완충식염수(PBS)는 약 25mM, Triton X-100은 약 1%의 농도로 포함되었으며, 섭씨 30도 이상 섭씨 40도 이하의 온도에서 20 시간 내지 30 시간 동안 진행하였다. 바람직하게는 약 섭씨 37도의 분위기에서 약 24시간 동안 진행할 수 있다.
세포 제거 단계(S14)에서 피부 조직은 세포 제거 용액에 침지된 상태로 처리되거나, 세포 제거 용액과 함께 교반되어 처리될 수 있다. 세포 제거 단계(S14)가 진행되는 동안 계면 활성제의 활성 작용 등으로 피부 조직 내의 세포 물질이 제거 또는 분해된다.
1차 세척 단계(S15)에서는 완충 용액으로 S14 단계를 거친 피부 조직을 세척한다. 본 실시예에서는 인산완충식염수(PBS)와 함께 피부 조직을 약 14시간 동안 교반하여 세척하였다. 1차 세척 단계(S15)를 통해 S14 단계에서 분해되어 조직에 잔존하는 세포 물질들의 대부분이 씻겨서 조직으로부터 제거된다.
DNA 처리 단계(S16)에서는 S15 단계를 거친 피부 조직에서 DNA를 분해한다. 본 실시예에서는 인산완충식염수(PBS)에 약 10mM의 염화마그네슘(MgCl2)과 약 30 U/ml의 DNase가 포함된 용액(제2 용액)을 사용하여 피부 조직의 DNA를 분해하였다.
DNA 처리 단계(S16)는 섭씨 30도 이상 섭씨 40도 이하의 온도에서 20 시간 내지 30 시간 동안 진행하였다. 바람직하게는 약 섭씨 37도의 분위기에서 약 24시간 동안 진행할 수 있다. DNA 처리 단계(S16)에서 피부 조직은 제2 용액에 침지된 상태로 처리되거나, 제2 용액과 함께 교반되어 처리될 수 있다.
DNA 처리 단계(S16)가 진행되는 동안 DNase에 의해 피부 조직 내에 포함된 DNA가 분해된다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 제2 용액에는 약 10mM의 염화마그네슘(MgCl2)이 포함되어, DNA의 분해가 보다 효과적으로 진행된다. 이는 제2 용액 내에 포함된 마그네슘 이온이 DNA를 잘게 잘라내어 DNase가 DNA를 분해하기에 용이한 상태를 조성하기 때문이다.
2차 세척 단계(S17)에서는 완충 용액으로 S16 단계를 거친 피부 조직을 세척한다. 본 실시예에서는 인산완충식염수(PBS)와 함께 피부 조직을 약 48시간 동안 교반하여 세척하였다. 2차 세척 단계(S17)를 통해 S16 단계에서 분해되어 조직에 잔존하는 물질들의 대부분이 씻겨서 조직으로부터 제거된다.
또한, 2차 세척 단계(S17)에서는 인산완충식염수(PBS)로 약 48시간 동안 세척된 피부 조직을 다시 증류수(distilled water)로 세척할 수 있다. 본 실시예에서는 인산완충식염수(PBS)로 약 48시간 동안 세척된 피부 조직을 증류수를 이용해 15분씩 3회에 걸쳐 세척하였다. 증류수에 의한 세척 시간 및 횟수는 실시예에 따라 달라질 수 있다.
소독 단계(S18)에서는 소독 용액으로 S17 단계를 거친 피부 조직을 살균한다. 소독 용액으로는 미생물의 세포막을 파괴할 수 있는 과초산(peracetic acid)과 에탄올(ethanol)이 포함된 용액이 사용될 수 있다. 본 실시예에서는 증류수에 약 4%의 에탄올(ethanol) 및 약 0.1%의 과초산(peracetic acid)이 용해된 용액을 소독 용액으로 사용하였다. 소독 단계(S18)는 약 2시간 이상 수행될 수 있다.
3차 세척 단계(S19)에서는 완충 용액으로 S18 단계를 거친 피부 조직을 세척한다. 본 실시예에서는 3차 세척 단계(S19)에서 인산완충식염수(PBS)와 함께 피부 조직을 약 15분씩 2회 교반하여 세척한 후, 초순수(deionized water)와 함께 피부 조직을 약 15분씩 2회 교반하여 세척하였다.
상술한 단계들(S11 ~ S19)을 거쳐 탈세포화된 피부 조직, 보다 구체적으로은 탈세포화된 진피층(D-dECM, dermis decellularized extracellular matrix)을 획득할 수 있다.
탈세포화된 피부 조직(D-dECM)은 40시간 이상 동결 건조되어 보관/사용될 수 있다.
도 2는 생화학적 분석방법을 이용해 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 방법을 통해 제조된 탈세포화된 피부 조직(D-dECM)과 원래 피부 조직(Native)안에 포함된 콜라겐, 글라이코사미노글리칸, 엘라스틴, 히알루론산, DNA의 함유율을 비교한 그래프이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 방법을 통해 제조된 탈세포화된 피부 조직(D-dECM)은 원래 피부 조직(Native)- 돼지의 피부 조직- 대비 콜라겐(Collagen)이 약 125%, 글라이코사미노글리칸(GAGs)이 약 74%, 엘라스틴(Elastin)이 약 9.8%, DNA가 약 2.3% 함유되어 있으며, 히알루론산(HA)은 약 100% 가까운 함량을 보이고 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 방법은 세포를 효과적으로 제거함과 동시에 글라이코사미노글리칸(GAGs), 콜라겐(Collagen), 히알루론산(HA)은 보존시키는 것을 확인할 수 있다.
한편, 히알루론산은 다양한 세포외기질에 부착되여 세포외기질을 안정화시키고, 상처치유과정에서 세포이동을 촉진시키며, 저분자량의 히알루론산은 혈관 생성을 유발하기도 하므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 방법을 통해 제조된 탈세포화된 피부 조직(D-dECM)은 상처이유를 위한 치료제를 만드는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 도시한 순서도이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법은 전술한 탈세포화 방법에 프리젤 제작 단계(S21) 및 중화 단계(S22)를 더 포함한다.
프리젤 제작 단계(S21)에서는 탈세포화된 피부 조직(D-dECM)을 펩신(pepsin)과 함께 아세트산(acetic acid) 용액에 녹여 D-dECM 프리젤(pre-gel)을 제작한다.
프리젤 제작 단계(S21)에서 탈세포화된 피부 조직(D-dECM)은 40시간 이상 동결 건조된 것이 사용될 수 있으며, 본 실시예에서는 동결 건조된 D-dECM을 동결 건조된 D-dECM의 무게의 약 10%의 펩신(pepsin)이 약 0.5M의 아세트산아세트산(acetic acid) 용액에 용해된 용액에 녹여 D-dECM 프리젤을 제작하였다.
중화 단계(S22)에서는 산성의 D-dECM 프리젤을 중화시킨다. 중화 단계(S22)에서는 염기성 용액을 이용해 D-dECM 프리젤의 pH를 중성으로 적정할 수 있다.
본 실시예에서는 대표적 염기성 용액인 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하였으며, 보다 구체적으로 10M의 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 산성의 D-dECM 프리젤을 중성으로 적정하였다.
중화 단계(S22)는 실시예에 따라 다른 염기성 용액을 사용하여 진행할 수도 있다.
S22 단계까지 진행되면 D-dECM은 하이드로젤 상태가 된다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤과 콜라겐 하이드로젤의 물성치와 동결 건조된 SEM 이미지를 비교한 도시한 것이다.
도 4(A)에 도시된 그래프는 D-dECM 하이드로젤(D-dECM)과 콜라겐 하이드로젤(COL)의 shear rate과 viscosity의 상관 관계를 비교 도시한 것이다. 도 4(A)에 도시된 바와 같이, D-dECM 하이드로젤(D-dECM)은 shear thining behavior를 보이며 열에 의해 가교가 일어나게 된다. 따라서 압력에 의한 사출이 가능하므로 3D 프린팅으로 프린팅될 수 있다.
또한 D-dECM 하이드로젤은 세포와 섞일 수 있고, pH가 중성이므로 세포와 D-dECM 하이드로젤이 섞이더라도 세포가 파괴되지 않으며, 다른 화학적 처리 없이 열만으로 가교가 되므로 경화과정에서 화학물질에 의해 세포활성에 악영향을 초래되는 것을 방지할 수 있다.
도 4(B)에 도시된 그래프는 D-dECM 하이드로젤(D-dECM)과 콜라겐 하이드로젤(COL)의 시간 경과에 따른 복소탄성계수(complex modulus)를 비교 도시한 것이다. 도 4(B)에 도시된 바와 같이, D-dECM 하이드로젤(D-dECM)의 복소탄성계수는 콜라겐 하이드로젤(COL)에 비해 약 10배임을 확인할 수 있으며, 이는 D-dECM 하이드로젤(D-dECM)의 강도가 콜라겐 하이드로젤(COL) 보다 약 10배 정도 높다는 것을 의미한다.
도 4(E)에 도시된 이미지는 동결 건조된 D-dECM 하이드로젤(D-dECM)과 콜라겐 하이드로젤(COL)의 SEM(주사전자현미경) 이미지이다.
D-dECM 하이드로젤(D-dECM)의 강도가 콜라겐 하이드로젤(COL) 보다 높은 것은 도 4(E)에 도시된 바와 같이, D-dECM 하이드로젤(D-dECM)의 콜라겐 다발이 콜라겐 하이드로젤(COL) 보다 두껍고, 히알루론산이나 글라이코사미노글리칸(GAGs)이 수분을 함유할 수 있는 능력을 높여줘 외부 압력에 저항하는 능력이 강해졌지 때문으로 예상된다.
한편, [표 1]은 LC-MS/MS mass spectrometry를 이용하여 D-dECM 하이드로젤과 콜라겐 하이드로젤 내에 포함된 다양한 종류의 성장인자의 함량을 분석한 결과이다.
Figure pat00001
표 1에 나타난 바와 같이, 세포의 성장 분화능력을 촉진시키는 대부분의 성장인자가 콜라젠 하이드로젤에 비해 D-dECM 하이드로젤에서 더 많이 존재하는 것을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 D-dECM 하이드로젤은 인간 세포와 혼합되어 바이오 잉크로 사용될 수 있다. 바이오 잉크는 조직/기관의 모사체의 배양 재료로 사용될 수 있으며, 3D 세포 프린팅의 잉크로 사용될 수도 있다.
특히, 본 발명의 일 실시예에 따른 D-dECM 하이드로젤에 인간의 진피 섬유아세포(normal human dermal fibroblasts; NHDF) 및 또는 인간의 표피 케라틴 형성세포(normal human epithelial keratinocytes; NHEK)를 혼합한 바이오 잉크를 배양하여 인공 피부를 제작할 수 있다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤과 콜라겐 하이드로젤에서 배양된 NHDF와 NHEK의 성장 상태를 비교한 이미지이다.
도 5에 도시된 이미지들은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤(D-dECM)과 콜라겐 하이드로젤(Collagen)에 각각 NHDF을 봉입하여 2주간 배양한 후 촬영한 이미지와, NHEK를 표면에 뿌린 후 2주간 배양한 상태를 촬영한 이미지들이다.
도 5에 도시된 바와 같이, D-dECM에 봉입되거나 뿌려진 NHDF와 NHEK가 콜라겐 하이드로젤(Collagen)에 봉입되거나 뿌려진 NHDF와 NHEK에 비해 더 빨리 성장하고 서로 접합하고 있는 세포의 비율도 더 높은 것을 확인할 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤과 콜라겐 하이드로젤에서 배양된 NHDF의 qRT-PCR 데이터를 도시한 그래프이다.
도 6에 도시된 바와 같이, D-dECM안에 봉입되어있는 NHDF에서 collagen type1(COL1), fibronectin(FN), decorin(DCN), collagen type3(COL3), vimentin(VIM), KGF의 RNA발현량이 더 많은 것이 확인된다. 따라서, D-dECM 하이드로젤이 콜라겐 하이드로젤보다 NHDF의 활성에 더 도움이 되는 것을 확인할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤로 만들어진 인공 피부(Skin-D)와 콜라겐 하이드로젤로 만들어진 인공 피부(Skin-C)의 단면을 비교 도시한 이미지이다.
도 7에 도시된 바와 같이, D-dECM 하이드로젤을 이용한 인공 피부(Skin-D)는 3일만에 각질층이 형성되었고 1주일 만에 표피층의 두께가 80um까지 자라나 실제 피부의 표피층과 비슷한 수준의 두께(약 0.06mm~0.2mm)가 된 것을 확인할 수 있었다. 이는 콜라겐 하이드로젤을 사용하는 것에 비해, D-dECM 하이드로젤을 사용하는 경우에 조직공학적 인공 피부 제작기간이 훨씬 단축될 수 있음을 의미한다
그리고 진피층을 비교하면 D-dECM 하이드로젤을 이용한 인공 피부(Skin-D)에서 NHDF가 스스로 생산한 collagen type 1의 양이 더 많은 것을 확인할 수 있다. 이는 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C)에 비해 D-dECM 하이드로젤을 이용한 인공 피부(Skin-D)가 실제 사람의 피부와 유사함을 의미한다. 따라서, D-dECM 하이드로젤은 피부 이식용 제제 또는 상처치료제로 사용될 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법을 통해 제조된 하이드로젤로 만들어진 인공 피부(Skin-D)와 콜라겐 하이드로젤로 만들어진 인공 피부(Skin-C)의 두께와 넓이를 비교 도시한 그래프이다.
도 8에 도시된 바와 같이, 콜라겐 하이드로젤로 만들어진 인공 피부(Skin-C)는 7일차에 면적(whole area)과 두께(whole thickness)과 모두 급격히 감소하였지만, D-dECM 하이드로젤로 만들어진 인공 피부(Skin-D)는 7일째까지 면적은 거의 유지되었고 두께는 다소 감소하였지만, 콜라겐 하이드로젤로 만들어진 인공 피부(Skin-C)에 비해 감소폭이 월등히 적은 것을 확인할 수 있다.
따라서, 오랜 기간 인공 피부를 배양하면서 실험을 해야하는 경우에는 콜라겐 하이드로젤을 사용하는 것보다 D-dECM 하이드로젤을 사용하여 인공 피부를 배양하는 것이 유리하다.
한편, 콜라겐 하이드로젤로 인공 피부를 제작하는 경우에는 콜라겐 하이드로젤 내에 NHDF를 봉입한 후, 콜라겐 하이드로젤이 수축되는 것을 기다린 후에 NHEK를 안정화된 콜라겐 하이드로젤의 표면에 파종하였다.
그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 D-dECM 하이드로젤은 세포들에 의해 수축되는 정도가 작기 때문에 인공 피부를 제작하는 과정에서 D-dECM 하이드로젤에 NHDF를 봉입한 후 D-dECM 하이드로젤이 수축되는 것을 기다리지 않고 NHEK를 바로 파종하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 D-dECM 하이드로젤을 사용하여 인공 피부를 제작하는 경우 NHDF를 봉입한 후 D-dECM 하이드로젤이 수축되는 것을 기다리지 않아도 되므로 종래 콜라겐 하이드로젤로 인공 피부를 제작하는 것에 비해 제작시간을 단축시킬 수 있다.
이하에서는 본 발명의 일 실시예에 따른 D-dECM 하이드로젤을 사용하여 제작된 인공 피부와 실제 피부의 유사정도를 측정한 결과에 대해 설명한다.
도 9는 콜라겐 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only COL), 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C), 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only D-dECM) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)의 피부 접촉각 측정 결과를 비교 도시한 것이다.
실제 피부의 접촉각은 70 ~ 80도로 알려져 있다.
콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C)의 접촉각은 35.6도임에 반해, D-dECM 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)의 접촉각은 66.3도로 측정되었다.
따라서, 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C)에 비해 D-dECM 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)의 표면 소수성이 실제 피부에 더 유사하다고 할 수 있다.
도 10은 콜라겐 하이드로젤만으로 제작된 인공 피부(Only COL), 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C), 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤만으로 제작된 인공 피부(Only D-dECM) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)의 표피간 전기저항 측정 결과를 비교 도시한 것이다.
실제 피부의 상피세포층 표피간 전기저항은 약 5500Ω으로 알려져 있다.
도 10에 도시된 바와 같이, D-dECM 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)의 표피간 전기저항은 4616.7 Ω으로 측정된 반면, 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C)의 표피간 전기저항은 D-dECM 하이드로젤만으로 제작된 인공 피부(Only D-dECM)보다도 전기저항이 낮게 측정되었다.
따라서, 표피간 전기저항의 특성 역시, 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C)에 비해 D-dECM 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)가 실제 피부에 더 유사하다.
도 11은 콜라겐 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only COL), 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C), 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤만으로 제작한 인공 피부(Only D-dECM) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)은 피부장벽 투과도 검사 결과를 비교 도시한 것이다.
도 11에 도시된 바와 같이, 덱스트란(dextran) 투과도 검사에서도 D-dECM 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-D)가 콜라겐 하이드로젤을 기초로 제작한 인공 피부(Skin-C)보다 덱스트란의 투과를 약 1.5배 정도 많이 막아 피부장벽의 기능을 더 잘 수행하는 것으로 확인되었다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 탈세포화 대상이 되는 피부 조직을 준비하는 단계;
    상기 피부 조직을 트립신이 포함된 제1 용액을 이용해 처리하는 박리 준비 단계; 및
    상기 박리 준비 단계 이후에 상기 피부 조직으로부터 피하 지방을 제거하는 박리 단계를 포함하는 피부 조직의 탈세포화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 용액은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 더 포함하는, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 용액은 상기 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 1mM 이내, 상기 트립신이 0.25% 이내로 용해된, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 박리 준비 단계 및 상기 박리 단계 중 적어도 한 단계에서 상기 피부 조직의 표피가 제거되는, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 박리 단계를 거친 이후의 상기 피부 조직을 마그네슘 이온과 DNA 분해 효소가 포함된 제2 용액을 이용해 처리하는 DNA 처리 단계를 더 포함하는, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2 용액은 완충 용액에 10mM 이하의 염화마그네슘(MgCl2)과 30 U/ml 이하의 DNase를 포함하는, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 완충 용액은 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 포함하고,
    상기 DNA 처리 단계는 섭씨 30도 이상 섭씨 40도 이하의 온도에서 20시간 이상 수행되는, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 비이온 계면활성제가 포함된 완충 용액을 이용해 상기 박리 단계를 거친 이후의 상기 피부 조직을 처리하는 세포 제거 단계를 더 포함하는, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 완충 용액은 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)에 상기 에틸렌디아민테트라아세트산이 25mM 이하, 상기 비이온 계면활성제가 1% 이하로 용해된, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 세포 제거 단계는 섭씨 30도 이상 섭씨 40도 이하의 온도에서 20시간 이상 수행되는, 피부 조직의 탈세포화 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 탈세포화된 피부 조직을 40시간 이상 동결 건조한 탈세포화된 피부 조직.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 탈세포화된 피부 조직에 인간의 진피 섬유아세포(normal human dermal fibroblasts; NHDF)를 혼합한 바이오 잉크.
  13. 제12항의 바이오 잉크에 인간의 표피 케라틴 형성세포(normal human epithelial keratinocytes; NHEK)를 뿌린 후 배양하는 단계를 포함하는 인공 피부 제작 방법.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 탈세포화된 피부 조직을 펩신과 함께 아세트산 용액에 용해시켜 프리젤(pre-gel)을 제작하는 단계 및
    상기 프리젤을 중화시키는 단계를 포함하는, 탈세포화된 피부 조직의 하이드로젤 제조 방법.
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