CN113368313B - 一种生物膜的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种生物膜的制备方法及其产品和应用。所述生物膜的制备方法包括以下步骤：(1)采用胶原酶抑制剂处理动物腔道组织；(2)去除占动物腔道组织总脂肪含量40％以上的膜层；(3)采用第一酶溶液处理步骤(2)得到的产物；(4)采用碱溶液处理步骤(3)得到的产物；(5)采用脱细胞溶液处理步骤(4)得到的产物；(6)采用脱脂液溶液处理步骤(5)得到的产物；(7)采用第二酶溶液处理步骤(6)得到的产物；(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜。本发明可极大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性，机械强度高，能去除产品中有机物和试剂的残留，使其诱导组织再生效果更好。

Description

一种生物膜的制备方法及其产品和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物膜的制备方法及其产品和应用，尤其涉及一种基于动物腔道组织的多层结构天然生物膜的制备及其在引导组织再生中的应用。
背景技术
组织工程技术的进步和发展为泌尿系统重建、消化系统重建、女性生殖道重建等重要组织器官的修复提供了希望。组织工程技术包含支架材料、种子细胞和生长因子等领域。细胞外基质是较好的支架材料，细胞外基质含有的胶原网状结构和弹性纤维等利于细胞黏附生长，具有良好的临床应用前景。近年来，许多研究利用生物酶和试剂除去膀胱、真皮组织中的细胞和细胞碎片，留下细胞外基质，成为无细胞和富含胶原蛋白、弹性蛋白、弹性纤维、血管框架的基质结构。这种材料具有良好的生物相容性和机械稳定性，免疫原性相对较低，从而为细胞再生提供了一个良好的支架，营造了细胞再生所需的优良微环境。
CN107397978A公开了一种动物腔道组织脱细胞基质的制备方法，取动物腔道组织的粘膜下层，经过病毒灭活步骤、脱脂步骤以及脱细胞步骤制得，其中，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤。该方法存在脱细胞和脱脂处理的方式存在用药量过大、脱细胞不彻底、用药毒性大残留多、制备材料机械性能低的问题。
CN106256382A公开了一种制备膀胱膜生物支架的方法，包括：(1)用NaOH处理膀胱组织；(2)用TritonX-100和SDS以任意顺序处理所得物，并重复一遍该步骤；(3)用NaOH处理所得物；(4)将所得物低温干燥。该方法同样存在脱细胞和脱脂处理的方式存在用药量过大、脱细胞不彻底、用药毒性大残留多、制备材料机械性能低的问题；而且由于部分保留肌肉层，但是受脂肪影响，制备时间极长(完成流程需45天才能制备得到)。
CN107164298A公开了一种软组织去细胞基质的制备方法，涉及临床医学、生物医学与再生医学技术领域，本发明提供的一种软组织去细胞基质的制备方法，使用超临界流体技术制备天然软组织去细胞基质。本发明提供的软组织去细胞基质的制备方法，对软组织基质成分的破坏更小，获得的软组织去细胞基质的免疫原性低，生物相容性好。
因此，开发一种能最大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性的生物酶制备方法是本领域研究的重点。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种生物膜的制备方法及其产品和应用，特别是提供一种富含多层结构的生物膜的制备方法及其产品和应用。本发明所述制备方法可极大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性，机械强度高，并能去除产品中有机物和试剂的残留，使其诱导组织再生效果更好；且制备富含多层结构的生物膜的整体耗时极短，仅需7天以内。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种生物膜的制备方法，所述生物膜的制备方法包括以下步骤：
(1)采用胶原酶抑制剂处理动物腔道组织；
(2)去除占动物腔道组织总脂肪含量40％以上的膜层；
(3)采用第一酶溶液处理步骤(2)得到的产物；
(4)采用碱溶液处理步骤(3)得到的产物；
(5)采用脱细胞溶液处理步骤(4)得到的产物；
(6)采用脱脂液溶液处理步骤(5)得到的产物；
(7)采用第二酶溶液处理步骤(6)得到的产物；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜。
本发明使用胶原酶抑制剂处理以保护腔道组织材料的胶原纤维，然后通过物理方法(机械切除法)去除腔道组织结构中高比例的脂肪，该步骤可去除占动物腔道组织总脂肪含量40％以上的(优选为40-60％，该含量为质量百分含量)的脂肪，此外，由于大部分动物腔道组织具有致密的浆膜层结构，物理去除致密的浆膜层后可提高脱细胞和进一步化学脱脂的效率，大大节省生物膜制备时间。本发明选用温和、毒性低的试剂按顺序进行脱细胞和脱脂步骤，减小试剂对生物膜的破坏，采用酶法去除杂蛋白、核酸和多糖等能引起免疫反应的物质，并引入超临界CO2流体萃取技术，去除产品中有机物和所用试剂的残留，一方面极大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性，机械强度高，另一方面通过引入无毒环保的临界CO2流体萃取技术，去除产品中有机物和试剂的残留，使其诱导组织再生效果更好。
其中，步骤(1)中使用胶原酶抑制剂处理，胶原酶依赖一些金属离子如钙、锌、镁维持正常结构与功能，当这些离子被胶原酶抑制剂络合后，就可抑制胶原酶的活性，使胶原蛋白不受损，从而对动物腔道组织材料中的胶原纤维起到保护作用，避免后续机械、化学过程中机械升温和化学试剂对胶原纤维的结构产生影响。研究发现，动物腔道组织中大部分脂肪聚集在浆膜及浆膜下层，因此步骤(2)中采用机械切除方式除去动物腔道的浆膜及浆膜下层，可去除占比为40％以上的(优选为40-60％，该含量为质量百分含量)的脂肪，这可以为进一步化学脱脂提供一定的基础，且去除致密的浆膜层，有利于酶溶液、脱细胞试剂和清洗剂等进入组织内壁，大大提高了肌肉细胞、杂蛋白、杂质和其他免疫原性成分的脱除效率，从而显著降低生物膜制备时间(由现有技术的50天作用直接减少至7天以内)。
其中，步骤(3)～(7)按照采用第一酶溶液处理、碱溶液处理、脱细胞溶液处理、脱脂液溶液处理、第二酶溶液处理的顺序。其原因是：使用第一酶溶液可起到消化肌肉细胞间连接的作用，有助于肌肉细胞裂解，并通过碱溶液作用疏松动物腔道组织壁中的胶原纤维，使脱细胞溶液能够有效进入组织壁中与细胞膜上的磷脂结合，使细胞破裂，达到彻底脱除肌肉细胞和细胞碎片的目的。将细胞脱除后，材料孔径变得疏松，使得脱脂液能有效进入组织孔隙中，高效去除组织内壁残留的脂肪。最后，使用第二酶溶液能够去除支架材料中残留的杂蛋白、多糖及核酸，有利于降低材料的免疫原性。以上方法能够尽量减少药量，进一步避免用药毒性大残留多，制备的材料机械性能低的问题，并且最大程度地保留了生物膜的多层空间结构、弹性纤维及胶原网状结构的完整性。
其中，步骤(8)采用采用超临界二氧化碳清洗，超临界流体萃取技术(Supercritical Fluid Extraction，SFE)是一种发展快，运用广的新型分离技术，具有操作简单、能耗少、无污染、分离效果好、成本低、无溶剂残留等优点。基于目前超临界CO2流体萃取技术这些优点，本发明将超临界CO2流体萃取技术应用于动物腔道组织多层结构天然生物膜制备过程中的清洗，以达到去除有机溶剂和试剂的残留，同时进一步去除一些多糖等具有免疫原性的物质，能够提高多层结构天然生物膜诱导组织再生的诱导活性。
优选地，步骤(1)中，所述动物腔道组织包括依次层叠的浆膜层、浆膜下层、肌肉层、粘膜下层和粘膜层。
优选地，步骤(1)中，所述动物腔道组织选自动物食道组织、动物胃组织、动物肠道组织、动物尿道组织或动物膀胱组织中的任意一种。
在本发明中，所述动物腔道组织可选择但不限于猪、牛、羊中的任意一种动物的腔道组织。
优选地，步骤(1)中，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)中，所述处理具体为：将动物腔道组织浸泡于胶原酶抑制剂的水溶液中进行处理。
优选地，所述胶原酶抑制剂的水溶液的质量浓度为1-20wt％，例如可以是1wt％、2wt％、5wt％、10wt％、15wt％、20wt％等。
优选地，所述动物腔道组织和胶原酶抑制剂的水溶液的质量比为1:(5-15)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15等。
优选地，所述浸泡的温度为20-30℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃、30℃等，所述浸泡的时间为1-6h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h等。
优选地，步骤(2)中，所述去除采用机械切割设备切除、剪刀修剪、手工剥离或物理打磨中的任意一种，优选为机械切割设备切除。
其中，选择机械切割设备切除的优点：精确控制去除或保留需要的膜层；能够有效达到物理去脂的效果；能够进一步缩短生物膜的制备时间；且相比于其他现有的去除方式，机械切割设备切除方式能更精确控制加工膜层厚度及膜层的表面均匀度。
优选地，所述机械切割设备切除的方法具体工艺参数包括：电压160-265V(例如可以是160V、180V、200V、220V、240V、260V、265V等)，功率1200-4000W(例如可以是1200W、2000W、2500W、3000W、3500W、4000W等，切割速率5-40mm/s(例如可以是5mm/s、10mm/s、15mm/s、20mm/s、25mm/s、30mm/s、35mm/s、40mm/s等)，切割后材料表面粗糙度<100μm(例如可以是99μm、95μm、90μm、98μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、40μm、30μm、20μm、10μm等)。
其中，在此操作参数下机械设备切割后粗糙度小，生物膜表面更加均匀。
优选地，步骤(2)去除占动物腔道组织总脂肪含量40-60％(例如可以是40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％等)的膜层，优选为44-52％。
优选地，步骤(2)中，所述去除的膜层包括浆膜层和浆膜下层。
优选地，步骤(2)中，所述去除的膜层还包括部分肌肉层。
优选地，步骤(2)中，所述去除的膜层为浆膜层和浆膜下层，得到的产物为肌肉层、粘膜下层和粘膜层；所述去除的膜层为浆膜层、浆膜下层和部分肌肉层，得到的产物为剩余的肌肉层、粘膜下层和粘膜层。
其中，“部分肌肉层”指的是脂肪含量占总脂肪含量10-20％(例如可以是10％、12％、14％、16％、18％、20％等)的肌肉层，厚度约为0.5-1.5mm(例如可以是0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm等)，选择性地去除一部分肌肉层可得到厚度不同的生物膜，用于不同的适应症。
优选地，步骤(2)去除的膜层的总厚度为1-3mm，例如可以是1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm等。
在本发明中，采用机械去脂的方式仅除去动物腔道组织的浆膜层和浆膜下层，而保留部分肌肉层，其目的是：肌肉层的细胞外基质成分，能够较好的模拟细胞外基质微环境，为细胞再生提供了一个良好的支架，此外，肌肉层和结缔组织在整个膀胱壁中占比较大，将肌肉层中的肌肉细胞去除后，使得肌肉细胞外基质孔径大，胶原纤维和弹性蛋白排列疏松，利于多种组织细胞更好的生长，使得其可以广泛应用于不同组织的修复和再生。
优选地，步骤(3)中，所述第一酶溶液包括胰蛋白酶溶液和/或1398蛋白酶溶液。
优选地，步骤(3)中，所述第一酶溶液的浓度为0.1-5wt％，例如可以是0.1wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％等。
优选地，步骤(3)中，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为20-30℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等，所述浸泡的时间为1-8h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h等。
优选地，步骤(4)中，所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钙溶液中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(4)中，所述碱溶液的浓度为0.1-5mol/L，例如可以是0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、4mol/L、4.5mol/L、5mol/L等。
优选地，步骤(4)中，所述碱溶液中还包括1-5wt％(例如可以是1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％等)的胶原酶抑制剂。
优选地，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(4)中，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为4-25℃，例如可以是4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃等，所述浸泡的时间为1-4h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h等。
优选地，步骤(5)中，所述脱细胞溶液包括表面活性剂的水溶液。
优选地，所述表面活性剂包括吐温(Tween)、十二烷基氨基丙酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)或烷基酚聚氧乙烯醚中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述吐温包括Tween-20、Tween-40、Tween-60或Tween-80中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述表面活性剂的水溶液的浓度为0.1-5wt％，例如可以是0.1wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％等。
优选地，所述脱细胞溶液中还包括1-5wt％(例如可以是1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％等)的胶原酶抑制剂。
优选地，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(5)中，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为15-25℃，例如可以是15℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、25℃等，所述浸泡的时间为5-24h，例如可以是5h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。
优选地，步骤(6)中，所述脱脂液溶液包括有机溶剂和/或去污剂的水溶液。
优选地，所述有机溶剂包括蔗糖酯、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、异丙醇、三氯甲烷或丙酮中的任意一种或至少两种的组合，优选为乙二醇和异丙醇混合液。
优选地，所述去污剂的水溶液的浓度为0.1-5wt％，例如可以是0.1wt％、0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％等。
优选地，步骤(6)中，所述脱脂液溶液还包括1-5wt％(例如可以是1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％等)的胶原酶抑制剂。
优选地，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(6)中，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为10-25℃，例如可以是10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、25℃等，所述浸泡的时间为1-24h，例如可以是1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。
优选地，步骤(7)中，所述第二酶溶液包括多糖酶溶液、核酸酶溶液和蛋白酶溶液的混合水溶液。
优选地，所述多糖酶溶液包括非淀粉多糖酶、昆布多糖酶、聚蛋白多糖酶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述核酸酶溶液包括DNA酶溶液和/或RNA酶溶液。
优选地，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶溶液、中性蛋白酶溶液、1398蛋白酶溶液或组织蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(7)中，所述第二酶溶液的浓度为0.1-10wt％，例如可以是0.1w％、0.5w％、1w％、1.5w％、2w％、2.5w％、3w％、3.5w％、4w％、4.5w％、5w％、6w％、7w％、8w％、9w％、10w％等。
优选地，步骤(7)中，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为20-30℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等，所述浸泡的时间为1-24h，例如可以是1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。
优选地，步骤(8)中，所述超临界二氧化碳清洗的压力为10-50MPa，例如可以是10MPa、15MPa、20MPa、25MPa、30MPa、35MPa、40MPa、45MPa、50MPa等。
优选地，步骤(8)中，所述超临界二氧化碳清洗的温度为31-50℃，例如可以是31℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃等。
优选地，步骤(8)中，所述超临界二氧化碳清洗中CO2流量为1-10L/min，例如可以是1L/min、2L/min、3L/min、4L/min、5L/min、6L/min、7L/min、8L/min、9L/min、10L/min等。
优选地，步骤(8)后还需进行步骤(9)：将步骤(8)得到生物膜进行干燥和灭菌。
优选地，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥前的预冷冻温度为-80～-20℃，例如可以是-80℃、-75℃、-70℃、-65℃、-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-30℃、-20℃等，所述冷冻干燥的温度为-50～0℃，例如可以是-50℃、-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃等，所述冷冻干燥的时间为24-72h，例如可以是24h、30h、36h、40h、48h、50h、60h、70h、72h等，所述冷冻干燥的真空度为1-10Pa，例如可以是1Pa、2Pa、3Pa、4Pa、5Pa、6Pa、7Pa、8Pa、9Pa、10Pa等。
优选地，所述灭菌为辐照灭菌。
优选地，所述辐照灭菌具体为钴-60辐射灭菌。
优选地，所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量为15-30KGy，例如可以是15KGy、16KGy、18KGy、20KGy、22KGy、24KGy、26KGy、28KGy、30KGy等。
第二方面，本发明提供一种多层结构天然生物膜，所述多层结构天然生物膜是由如第一方面所述的制备方法制备得到的。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的多层结构天然生物膜在制备引导组织再生材料中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)通过本发明提供的方法制备的天然生物膜材料，保留了腔道组织中肌层的细胞外基质骨架，并可以通过精密控制切去浆膜及浆膜下层或肌肉层的厚度来做出不同厚度的多层结构生物膜；
(2)本发明选择性地切去不同厚度的肌肉层，所制得的生物膜涵盖的基质骨架不同，使其能够用于不同适应症，引导不同组织再生；
(3)本发明提供的方法做出的生物膜具有明显的致密层和疏松层，疏松层能够更好地引导组织细胞生长，起到修复和再生的作用；
(4)本发明提供的方法，首先物理去除一部分的脂肪，使得脱脂效果显著，从而显著缩短含肌层生物膜的制备时间，提高制备效率。
附图说明
图1为动物腔道组织材料横截面结构示意图；
其中，1为浆膜层、2为浆膜下层、3为肌肉层、4为粘膜下层、5为粘膜层。
图2为本发明提提供的动物膀胱壁组织纵切面每层脂肪含量柱状图；
其中，1为浆膜层及浆膜下层的脂肪含量，2-6为肌肉层脂肪含量，7为粘膜及粘膜下层脂肪含量，1-7每层厚度均为1mm。
图3A为实施例1制备得到的生物膜致密面的电子显微镜图。
图3B为实施例1制备得到的生物膜粗糙面的电子显微镜图。
图4A为实施例1制备得到的生物膜的横截面组织学染色图。
图4B为图4A方框处的局部放大图；
其中，1为粘膜及粘膜下层细胞外基质，2为肌肉层细胞外基质。
图5A为实施例2制备得到的生物膜致密面的电子显微镜图。
图5B为实施例2制备得到的生物膜粗糙面的电子显微镜图。
图6A为实施例3制备得到的生物膜致密面的电子显微镜图。
图6B为实施例3制备得到的生物膜粗糙面的电子显微镜图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
图1为动物腔道组织材料横截面结构示意图，如图1所示，动物腔道组织可分为浆膜层、肌肉层和粘膜层。浆膜层和粘膜层表面非常致密，浆膜下层、肌肉层和粘膜下层分布有血管、结缔组织和脂肪。
图2为本发明提供的动物腔道组织(膀胱壁)纵切面每层脂肪含量柱状图。如图2所示，腔道组织的脂肪含量由浆膜层向粘膜层逐层降低，即大部分脂肪存在于组织的浆膜及浆膜下层和靠近浆膜的肌肉层中。因此，去掉浆膜层、浆膜下层和部分肌肉层，可以去除组织中占总脂肪含量的40％-60％的脂肪，这可以为进一步化学脱脂提供一定的基础，而且去除浆膜层大大提高了肌肉细胞脱除的效率。
实施例1
本实施例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法包括以下步骤：
(1)将100g新鲜猪膀胱组织材料在1L的10wt％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于25℃下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为1mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
其中，图3A为实施例1制备得到的生物膜致密面的电子显微镜图；如图3A所示，以膀胱组织材料为原料，生物膜致密面呈现光滑无孔隙状态。图3B为实施例1制备得到的生物膜粗糙面的电子显微镜图；如图3B所示，以膀胱组织材料为原料，生物膜粗糙面呈现疏松多孔状态。
实施例2
本实施例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜猪胃组织材料在1L的5wt％的枸橼酸钠溶液中浸泡4h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从胃浆膜层面切除厚度为1mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的1wt％1398蛋白酶溶液中浸泡5h；
(4)将步骤(3)得到的产物于10℃下，在1L的2mol/L的碳酸钠和质量百分含量为2％的枸橼酸钠混合水溶液中浸泡4h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡15h，所述脱细胞溶液为1wt％的十二烷基氨基丙酸钠和2wt％的枸橼酸钠的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡15h，所述脱脂溶液为脂肪醇聚氧乙烯醚和乙二醇体积比为1:1的混合液和3wt％的枸橼酸钠的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于20-25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：1％的昆布多糖酶、0.1％的DNA酶、0.1％的RNA酶和1％的1398蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为30MPa，温度为35℃，CO2流量为6L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-40℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-20℃，时间为48h，真空度为1Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为30KGy。
其中，图5A为实施例2制备得到的生物膜致密面的电子显微镜图；如图5A所示，以胃组织材料为原料，生物膜致密面呈现光滑无孔隙状态。图5B为实施例2制备得到的生物膜粗糙面的电子显微镜图；如图5B所示，以胃组织材料为原料，生物膜粗糙面呈现疏松多孔状态。
实施例3
本实施例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜牛大肠组织材料在1L的质量百分含量为15％的依地酸二钠溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从大肠组织浆膜层面切除厚度为3mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的3wt％胰蛋白酶溶液中浸泡3h；
(4)将步骤(3)得到的产物于15℃下，在1L的3mol/L的氢氧化钙和质量百分含量为2％的依地酸二钠混合水溶液中浸泡1h；
(5)将步骤(4)得到的产物于15℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡22h，所述脱细胞溶液为0.5wt％的Triton X-100和2wt％依地酸二钠的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于20℃下，在1L的脱脂液中浸泡20h，所述脱脂液为4wt％的十二烷基硫酸钠水溶液和2wt％的依地酸二钠的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡10-12h；其中，所述第二酶溶液包括：1％的非淀粉多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和1％的中性蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为20MPa，温度为40℃，CO2流量为3L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻2h，冻干机冷冻温度为-10℃，时间为72h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为20KGy。
其中，图6A为实施例3制备得到的生物膜致密面的电子显微镜图；如图6A所示，以大肠组织材料为原料，生物膜致密面呈现光滑无孔隙状态。图6B为实施例3制备得到的生物膜粗糙面的电子显微镜图；如图6B所示，以大肠组织材料为原料，生物膜粗糙面呈现疏松多孔状态。
实施例4
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的第一酶溶液为2wt％的木瓜蛋白酶和3wt％的乙酰半胱胺酸混合水溶液；
步骤(7)的第二酶溶液为2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶、2％的胰蛋白酶，5wt％的乙酰半胱胺酸，余量为水。
实施例5
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中胶原酶抑制剂为质量百分含量为15％的四环素溶液。
实施例6
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中的碱溶液为1mol/L的氢氧化钾溶液和5wt％的青霉胺的混合水溶液。
实施例7
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中所述碱溶液中不再添加乙酰半胱胺酸，缺失部分以水补至100％。
实施例8
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(6)中所述第二酶溶液中不再添加多糖酶，缺失部分以水补至100％。
实施例9
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(8)进行超临界二氧化碳清洗步骤时，压力为5Mpa，温度为55℃，二氧化碳流量为15L/min。
实施例10
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(8)进行超临界二氧化碳清洗步骤时，压力为55Mpa，温度为20℃，二氧化碳流量为0.5L/min。
实施例11
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)采用片皮机除去动物膀胱的2mm厚的浆膜层和浆膜下层、1mm厚的肌肉层。
实施例12
本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)采用片皮机除去动物膀胱的1mm厚的浆膜层和浆膜下层、3mm厚的肌肉层。
实施例13
本实施例提供本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例2的区别仅在于，步骤(2)中采用片皮机除去猪胃的2mm厚的浆膜层及浆膜下层。
实施例14
本实施例提供本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例2的区别仅在于，步骤(4)中的碱溶液为1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为5％的乙酰半胱胺酸混合水溶液。
实施例15
本实施例提供本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例2的区别仅在于，步骤(6)中的脱脂液为：脂肪醇聚氧乙烯醚和乙二醇体积比为1:1的混合液。
实施例16
本实施例提供本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例3的区别仅在于，所述动物组织材料选取动物小肠。
实施例17
本实施例提供本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例3的区别仅在于，步骤(4)中的碱溶液为3mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为2％的依地酸二钠混合水溶液。
实施例18
本实施例提供本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例3的区别仅在于，步骤(6)中的脱脂液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和5wt％的依地酸二钠的混合溶液。
实施例19
本实施例提供本实施例提供一种生物膜的制备方法，与实施例3的区别仅在于，步骤(7)中所述第二酶溶液包括：2％的昆布多糖酶、1％的DNA酶、1％的RNA酶和3％的胰蛋白酶混合溶液。
对比例1
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料使用纯化水清洗备用；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠水溶液中浸泡2h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的2wt％的Tween-20水溶液中浸泡16h；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例2
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(4)将步骤(3)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例3
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于15℃下，在1L的碱性脱细胞溶液中浸泡6h，所述碱性脱细胞溶液为：含1mol/L的氢氧化钠、2wt％Tween-20和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(7)采用超临界二氧化碳清洗步骤(6)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(8)将步骤(7)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例4
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞-脱脂复合溶液中浸泡16h，所述复合溶液为2wt％Tween-20、蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液、2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(7)采用超临界二氧化碳清洗步骤(6)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(8)将步骤(7)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例5
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)采用片皮机除去动物膀胱浆膜层、浆膜下层和肌肉层，仅保留粘膜及粘膜下层，保留材料的总厚度为1mm；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例6
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(4)将步骤(3)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(7)采用超临界二氧化碳清洗步骤(6)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(8)将步骤(7)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例7
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(7)采用超临界二氧化碳清洗步骤(6)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(8)将步骤(7)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例8
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(7)采用超临界二氧化碳清洗步骤(6)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(8)将步骤(7)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例9
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(8)采用纯化水清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例10
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜膀胱组织材料在1L的质量百分含量为10％的乙酰半胱胺酸溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从膀胱材料浆膜层面切除厚度为2mm的膜层；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的2wt％胰蛋白酶溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的产物于5℃下，在1L的含1mol/L的氢氧化钠和质量百分含量为3％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液中浸泡2h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡16h，所述脱脂溶液为蔗糖酯和异丙醇体积比为1:1的混合液和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡16h，所述脱细胞溶液为2wt％Tween-20和2wt％的乙酰半胱胺酸的混合水溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：2％的聚蛋白多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和2％的木瓜蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为25MPa，温度为40℃，CO2流量为5L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-40℃，时间为24h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为15KGy。
对比例11
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜猪胃组织材料在纯化中清洗备用；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从胃浆膜层面切除厚度为1mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的1wt％1398蛋白酶溶液中浸泡5h；
(4)将步骤(3)得到的产物于10℃下，在1L的2mol/L的碳酸钠溶液中浸泡4h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡15h，所述脱细胞溶液为1wt％的十二烷基氨基丙酸钠溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡15h，所述脱脂溶液为脂肪醇聚氧乙烯醚和乙二醇体积比为1:1的混合液；
(7)将步骤(6)得到的产物于20-25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：1％的昆布多糖酶、0.1％的DNA酶、0.1％的RNA酶和1％的1398蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为30MPa，温度为35℃，CO2流量为6L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-40℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-20℃，时间为48h，真空度为1Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为30KGy。
对比例12
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜猪胃组织材料在1L的5wt％的枸橼酸钠溶液中浸泡4h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从胃浆膜层面切除厚度为1mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的产物于10℃下，在1L的2mol/L的碳酸钠和质量百分含量为2％的枸橼酸钠混合水溶液中浸泡4h；
(4)将步骤(3)得到的100g的产物于25℃下，在1L的1wt％1398蛋白酶溶液中浸泡5h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡15h，所述脱脂溶液为脂肪醇聚氧乙烯醚和乙二醇体积比为1:1的混合液和3wt％的枸橼酸钠的混合溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡15h，所述脱细胞溶液为1wt％的十二烷基氨基丙酸钠和2wt％的枸橼酸钠的混合水溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于20-25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：1％的昆布多糖酶、0.1％的DNA酶、0.1％的RNA酶和1％的1398蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为30MPa，温度为35℃，CO2流量为6L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-40℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-20℃，时间为48h，真空度为1Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为30KGy。
对比例13
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜猪胃组织材料在1L的5wt％的枸橼酸钠溶液中浸泡4h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从胃浆膜层面切除厚度为1mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的1wt％1398蛋白酶溶液中浸泡5h；
(4)将步骤(3)得到的产物于10℃下，在1L的2mol/L的碳酸钠和质量百分含量为2％的枸橼酸钠混合水溶液中浸泡4h；
(5)将步骤(4)得到的产物于25℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡15h，所述脱细胞溶液为1wt％的十二烷基氨基丙酸钠和2wt％的枸橼酸钠的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的脱脂溶液中浸泡15h，所述脱脂溶液为脂肪醇聚氧乙烯醚和乙二醇体积比为1:1的混合液和3wt％的枸橼酸钠的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于20-25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡12h；其中，所述第二酶溶液包括：1％的昆布多糖酶、0.1％的DNA酶、0.1％的RNA酶和1％的1398蛋白酶，余量为水；
(8)采用纯化水清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-40℃，预冷冻1h，冻干机冷冻温度为-20℃，时间为48h，真空度为1Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为30KGy。
对比例14
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜牛大肠组织材料使用纯化水清洗备用；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从大肠组织浆膜层面切除厚度为3mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的3wt％胰蛋白酶溶液中浸泡3h；
(4)将步骤(3)得到的产物于15℃下，在1L的3mol/L的氢氧化钙水溶液；
(5)将步骤(4)得到的产物于15℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡22h，所述脱细胞溶液为0.5wt％的Triton X-100水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于20℃下，在1L的脱脂液中浸泡20h，所述脱脂液为4wt％的十二烷基硫酸钠水溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡10-12h；其中，所述第二酶溶液包括：1％的非淀粉多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和1％的中性蛋白酶，余量为水；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为20MPa，温度为40℃，CO2流量为3L/min；
(9)将步骤(8)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻2h，冻干机冷冻温度为-10℃，时间为72h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为20KGy。
对比例15
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜牛大肠组织材料在1L的质量百分含量为15％的依地酸二钠溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从大肠组织浆膜层面切除厚度为3mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的3wt％胰蛋白酶溶液中浸泡3h；
(4)将步骤(3)得到的产物于15℃下，在1L的3mol/L的氢氧化钙和质量百分含量为2％的依地酸二钠混合水溶液中浸泡1h；
(5)将步骤(4)得到的产物于15℃下，在1L的脱细胞-脱脂混合溶液中浸泡22h，所述脱细胞-脱脂混合溶液为0.5wt％的Triton X-100、4wt％的十二烷基硫酸钠水溶液和2wt％的依地酸二钠的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于25℃下，在1L的第二酶溶液中浸泡10-12h；其中，所述第二酶溶液包括：1％的非淀粉多糖酶、0.5％的DNA酶、0.5％的RNA酶和1％的中性蛋白酶，余量为水；
(7)采用超临界二氧化碳清洗步骤(6)得到的产物，得到生物膜；其中，清洗的压力为20MPa，温度为40℃，CO2流量为3L/min；
(8)将步骤(7)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻2h，冻干机冷冻温度为-10℃，时间为72h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为20KGy。
对比例16
本对比例提供一种生物膜，所述生物膜的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将100g新鲜牛大肠组织材料在1L的质量百分含量为15％的依地酸二钠溶液中浸泡2h；
(2)将步骤(1)得到的产物于常温下采用切片设备从大肠组织浆膜层面切除厚度为3mm的膜层，其中，机械切割设备切除的具体工艺参数为：电压220V，功率3600W，切割速率15mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm；
(3)将步骤(2)得到的100g的产物于25℃下，在1L的3wt％胰蛋白酶溶液中浸泡3h；
(4)将步骤(3)得到的产物于15℃下，在1L的3mol/L的氢氧化钙和质量百分含量为2％的依地酸二钠混合水溶液中浸泡1h；
(5)将步骤(4)得到的产物于15℃下，在1L的脱细胞溶液中浸泡22h，所述脱细胞溶液为0.5wt％的Triton X-100和2wt％依地酸二钠的混合水溶液；
(6)将步骤(5)得到的产物于20℃下，在1L的脱脂液中浸泡20h，所述脱脂液为4wt％的十二烷基硫酸钠水溶液和2wt％的依地酸二钠的混合溶液；
(7)将步骤(6)得到的产物采用超临界二氧化碳清洗，得到生物膜；其中，清洗的压力为20MPa，温度为40℃，CO2流量为3L/min；
(8)将步骤(7)得到的生物膜进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到成品；其中，冷冻干燥预冷冻的温度为-80℃，预冷冻2h，冻干机冷冻温度为-10℃，时间为72h，真空度为5Pa；辐照灭菌为钴-60辐射灭菌，辐照剂量为20KGy。
性能测试
分别测试上述实施例1-19和对比例1-16提供的成品的各项性能，具体测试方法和标准如下所示：
(1)核酸含量按YY/T0606.25-2014规定的方法进行试验；
(2)脂肪含量：按GB/T 5009.6-2010第一法的规定方法进行；
(3)拉伸强度：按照GB/T 1040.3-2006中2型试样规定的方法进行实验；
(4)标准胶原含量：按照YY/T 1511-2017中附录B羟脯氨酸的测定方法进行试验；
(5)缝合线撕裂力：按照YY/T 1794-2021中的缝合线撕裂力的检测方法进行检测；
(6)有机物和试剂残留：根据有机物和试剂的性质，使用液相和气相方法检测；
(7)细胞毒性：按照GB/T16886.5-2017规定的方法进行检测；
具体测试结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003110325990000251
Figure BDA0003110325990000261
由表1测试数据可知，由本发明制备方法制备得到的生物膜核酸含量在10ng/mg以下，脂肪含量在0.5wt％以下，拉伸强度在8MPa以上，标准胶原含量在95wt％以上，缝合线撕裂力在10N以上，有机物和试剂残留在1ppm以下，无细胞毒性。由此充分说明通过本发明提供的方法做出来的天然生物膜材料，保留了腔道组织中肌肉层的细胞外基质骨架，并可以通过精密控制切去腔道组织浆膜层、浆膜下层和/或肌肉层的厚度来做出不同厚度的多层结构生物膜，选择性地切去不同厚度的膜层，所制得的生物膜涵盖的基质骨架不同，使其能够用于不同适应症，引导不同组织再生。此外，本发明提供的方法做出的生物膜具有明显的致密层和疏松层，疏松层能够更好地引导组织细胞生长，起到修复和再生的作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明所述生物膜的制备方法及其产品和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (25)

1.一种生物膜的制备方法，其特征在于，所述生物膜的制备方法包括以下步骤：
(1)采用胶原酶抑制剂处理动物腔道组织；所述处理具体为：将动物腔道组织浸泡于质量浓度为1-20wt％胶原酶抑制剂的水溶液中进行处理，所述动物腔道组织和胶原酶抑制剂的水溶液的质量比为1:(5-15)，所述浸泡的温度为20-30℃，所述浸泡的时间为1-6h；
(2)去除占动物腔道组织总脂肪含量40-60％的膜层；所述去除采用机械切割设备切除，去除的膜层的总厚度为1-3mm；
步骤(2)中，所述去除的膜层为浆膜层和浆膜下层，得到的产物为肌肉层、粘膜下层和粘膜层；所述去除的膜层为浆膜层、浆膜下层和部分肌肉层，得到的产物为剩余的肌肉层、粘膜下层和粘膜层；
(3)采用第一酶溶液处理步骤(2)得到的产物；所述第一酶溶液包括胰蛋白酶溶液和/或1398蛋白酶溶液，所述第一酶溶液的浓度为0.1-5wt％，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为20-30℃，所述浸泡的时间为1-8h；
(4)采用碱溶液处理步骤(3)得到的产物；所述碱溶液的浓度为0.1-5mol/L，所述碱溶液中还包括1-5wt％的胶原酶抑制剂，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为4-25℃，所述浸泡的时间为1-4h；
(5)采用脱细胞溶液处理步骤(4)得到的产物；所述脱细胞溶液包括表面活性剂的水溶液，所述表面活性剂的水溶液的浓度为0.1-5wt％，所述脱细胞溶液中还包括1-5wt％的胶原酶抑制剂，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为15-25℃，所述浸泡的时间为5-24h；
(6)采用脱脂液溶液处理步骤(5)得到的产物；所述脱脂液溶液包括有机溶剂和/或去污剂的水溶液，所述去污剂的水溶液的浓度为0.1-5wt％，所述脱脂液溶液还包括1-5wt％的胶原酶抑制剂，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为10-25℃，所述浸泡的时间为1-24h；
(7)采用第二酶溶液处理步骤(6)得到的产物；所述第二酶溶液包括多糖酶溶液、核酸酶溶液和蛋白酶溶液的混合水溶液，所述第二酶溶液的浓度为0.1-10wt％，所述处理采用浸泡的方式进行，所述浸泡的温度为20-30℃，所述浸泡的时间为1-24h；
(8)采用超临界二氧化碳清洗步骤(7)得到的产物；所述超临界二氧化碳清洗的压力为10-50MPa，所述超临界二氧化碳清洗的温度为31-50℃，所述超临界二氧化碳清洗中CO2流量为1-10L/min，得到生物膜。
2.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述动物腔道组织包括依次层叠的浆膜层、浆膜下层、肌肉层、粘膜下层和粘膜层。
3.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述动物腔道组织选自动物食道组织、动物胃组织、动物肠道组织、动物尿道组织或动物膀胱组织中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，所述机械切割设备切除的方法具体工艺参数包括：电压160-265V，功率1200-4000W，切割速率5-40mm/s，切割后材料表面粗糙度<100μm。
6.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述去除为去除占动物腔道组织总脂肪含量44-52％的膜层。
7.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钙溶液中的任意一种或至少两种的组合。
8.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
9.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述表面活性剂包括吐温、十二烷基氨基丙酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚或烷基酚聚氧乙烯醚中的任意一种或至少两种的组合。
10.据权利要求9所述的生物膜的制备方法，其特征在于，所述吐温包括Tween-20、Tween-40、Tween-60或Tween-80中的任意一种或至少两种的组合。
11.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
12.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述有机溶剂包括蔗糖酯、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、异丙醇、三氯甲烷或丙酮中的任意一种或至少两种的组合。
13.据权利要求12所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述有机溶剂为乙二醇和异丙醇混合液。
14.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述去污剂包括聚乙二醇辛基苯基醚和/或十二烷基硫酸钠。
15.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述胶原酶抑制剂包括乙酰半胱胺酸、依地酸二钠、青霉胺、甲孕酮、枸橼酸钠、四环素或强力霉素中的任意一种或至少两种的组合。
16.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述多糖酶包括非淀粉多糖酶、昆布多糖酶或聚蛋白多糖酶中的任意一种或至少两种的组合。
17.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述核酸酶包括DNA酶和/或RNA酶。
18.据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述蛋白酶包括木瓜蛋白、中性蛋白酶、1398蛋白酶或组织蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合。
19.根据权利要求1所述的生物膜的制备方法，其特征在于，步骤(8)后还需进行步骤(9)：将步骤(8)得到生物膜进行干燥和灭菌。
20.根据权利要求19所述的生物膜的制备方法，其特征在于，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥前的预冷冻温度为-80～-20℃，所述冷冻干燥的温度为-50～0℃，所述冷冻干燥的时间为24-72h，所述冷冻干燥的真空度为1-10Pa。
21.根据权利要求19所述的生物膜的制备方法，其特征在于，所述灭菌为辐照灭菌。
22.根据权利要求21所述的生物膜的制备方法，其特征在于，所述辐照灭菌具体为钴-60辐射灭菌。
23.根据权利要求22所述的生物膜的制备方法，其特征在于，所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量为15-30KGy。
24.一种多层结构天然生物膜，其特征在于，所述多层结构天然生物膜是由如权利要求1-23中任一项所述的制备方法制备得到的。
25.根据权利要求24所述的多层结构天然生物膜在制备引导组织再生材料中的应用。
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