CN116492508A - 一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶及其制备方法，包括如下步骤：(1)将小肠粘膜下层进行脱脂处理后，采用碱液处理，再进行脱细胞处理，冷冻干燥后得到小肠粘膜下层基质；(2)将所述小肠粘膜下层基质充分溶解在含胃蛋白酶的乙酸水溶液中形成基质溶液，同时调节所述基质溶液的pH值为6‑8，后续进行冷冻干燥得到小肠粘膜下层基质海绵；(3)将所述小肠粘膜下层基质海绵粉碎，倒入无菌PBS缓冲液中搅拌处理后即得到促进关节软骨修复的可注射水凝胶。本发明的可注射水凝胶具有较好的生物相容性以及较好的表面细胞粘附增殖性能。

Description

一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程支架技术领域，具体涉及一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶及其制备方法。
背景技术
软骨作为骨软骨界面重要组成部分，在关节运动中发挥着重要的作用，可减缓关节摩擦，提供良好的润滑、耐磨性能的同时还对软骨下骨起到应力缓冲作用。然而，关节骨软骨缺损在临床上十分常见，常常导致患者出现关节疼痛、活动受限，诱发骨关节炎，甚至导致肢体功能障碍和残缺，严重影响患者的生活质量，已成为目前肢体残障的主要原因之一。由于软骨内缺乏血管、神经和淋巴组织，其损伤后自我修复能力较差，难以在原位形成足够力学强度的软骨组织。
目前临床上治疗软骨损伤的方法有关节镜清创术，微骨折术、自体软骨移植和异体软骨移植等，但临床应用结果显示，这些方法均存在缺陷。例如，关节镜清创术只能暂时缓解症状，不能有效治疗软骨损伤；微骨折术只能在缺损部位再生纤维软骨，不能到达正常软骨的力学要求，存在后期退化的隐患；自体软骨移植效果较好，但仅适用于软骨缺损面积较小的损伤治疗；异体软骨移植可用于较大缺损修复，但供体来源有限，并有感染传染病、免疫排斥的风险。
发明内容
为了解决现有技术上存在的不足之处，而提供一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶及其制备方法。本发明的可注射水凝胶具有较好的生物相容性，具有较好的表面细胞粘附性能，能够促进软骨修复。
为了达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将小肠粘膜下层进行脱脂处理后，采用碱液处理，再进行脱细胞处理，冷冻干燥后得到小肠粘膜下层基质；
(2)将所述小肠粘膜下层基质充分溶解在含胃蛋白酶的乙酸水溶液中形成基质溶液，同时调节所述基质溶液的pH值为6-8，后续进行冷冻干燥得到小肠粘膜下层基质海绵；
(3)将所述小肠粘膜下层基质海绵粉碎，倒入pH为7.35-7.45的无菌PBS缓冲液中搅拌处理后即得到促进关节软骨修复的可注射水凝胶。
进一步地，所述小肠粘膜下层采用10-30cm的动物小肠，将所述动物小肠剪开，对其清洗干净后用机械刮除法去掉小肠粘膜层、浆膜层和肌层组织即得到小肠粘膜下层。动物小肠可来自猪羊牛等。
进一步地，所述脱脂处理的过程是：将小肠粘膜下层浸泡在脱脂溶液中6-12h，所述脱脂溶液为丙酮、无水乙醇、乙二醇乙醚、异丙醇中的一种。
进一步地，所述碱液处理是将小肠粘膜下层处理成1cm2以下碎片置于碱溶液中室温下摇床震荡20-24h，取出所述碎片后放入无菌PBS缓冲液中摇床震荡2-3h；其中碱溶液为1M碳酸钠水溶液或1wt％氢氧化钠水溶液，所述无菌PBS缓冲液的pH为7.35-7.45。
进一步地，所述脱细胞处理是置于脱细胞溶液中浸泡20-24h，然后放入无菌PBS缓冲液中摇床震荡2-3h；所述脱细胞溶液为0.5wt％Triton X-100溶液或0.1wt％SDS溶液。
进一步地，所述基质溶液中含胃蛋白酶0.1-0.5wt％、含乙酸1-5wt％、含小肠粘膜下层基质0.5-5wt％、余量为水；采用0.1-5mol/L的氢氧化钠溶液调节所述基质溶液的pH。
进一步地，所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占比5-25wt％；优选所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占比10-20wt％。当小肠粘膜下层基质海绵占比超过25wt％时，海绵不能充分溶解，所制得的水凝胶中存在絮状海绵物，影响后续性能。
本发明另一方面提供由上述制备方法制得的促进关节软骨修复的可注射水凝胶。
有益技术效果：由于小肠粘膜下层的结构致密，因此在对小肠粘膜下层进行脱细胞处理时，其内部的细胞难以脱除干净。本发明在对小肠粘膜下层进行脱细胞处理之前，将其处理成1cm2以下的碎片，这样可以增加小肠粘膜下层与处理液的接触反应面积，先使用碱溶液浸泡使小肠粘膜下层发生充分溶胀，在与脱细胞溶液充分反应，可以使碱溶液和脱细胞溶液充分浸润到小肠粘膜下层的内部，从而进一步将其内部的细胞脱除干净。本发明制备的可注射水凝胶是以小肠粘膜下层基质海绵为主要材料，由于疏水和静电作用产生缠绕进而表现出凝胶行为，通过调节小肠粘膜下层基质海绵的浓度来调节水凝胶的微观结构、溶胀性能和细胞相容性等性能。
附图说明
图1为实施例1经过步骤1得到的小肠粘膜下层基质的HE切片图，图中标尺长度表示20μm。
图2为实施例1-3最终得到的可注射水凝胶的微观形貌SEM图，其中A1-A2图为实施例1最终产物10％SIS，B1-B2图为实施例2最终产物15％SIS，C1-C2图为实施例1最终产物20％SIS；其中A1、B1、C1图中标尺长度为100μm，A2、B2、C2图中标尺长度为50μm。
图3为实施例1-3最终得到的可注射水凝胶的溶胀率。
图4为实施例1-3最终得到的可注射水凝胶细胞粘附性能，其中(a)图为培养4h后的DAPI染色荧光图，(b)图为单位面积内的细胞数量，(c)图为培养4h后的CCK-8测试结果。
图5为实施例1-3最终得到的可注射水凝胶细胞增殖性能，其中(a)图为培养24h后的EDU荧光染色图，(b)图为(a)图中EDU荧光染色结果统计，(c)图为分别培养1d、3d、5d后的CCK-8测试结果；(a)图中标尺长度均为300μm。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定；若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、或相关企业提出的标准要求进行。除非另有说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。
实施例1
一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)取长度为10-30cm的猪小肠，将其剪开，对其清洗干净后用机械刮除法去掉小肠粘膜层、浆膜层和肌层组织即得到小肠粘膜下层，备用；
将小肠粘膜下层浸泡在丙酮中10h进行脱脂处理后，取出，然后将小肠粘膜下层处理成1cm2以下碎片，将碎片置于1M碳酸钠水溶液中室温下摇床震荡24h，取出所有碎片后放入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中摇床震荡2h；
然后置于0.5wt％Triton X-100溶液中浸泡20h进行脱细胞处理，之后放入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中摇床震荡2h，-20℃下冷冻干燥12h后得到小肠粘膜下层基质；
(2)将所述小肠粘膜下层基质与含胃蛋白酶的乙酸水溶液进行搅拌48h，充分溶解后形成基质溶液，同时采用1mol/L的氢氧化钠溶液调节所述基质溶液的pH值为7.40，后续在-20℃下冷冻干燥24h得到小肠粘膜下层基质海绵；
其中所述基质溶液中含胃蛋白酶0.25wt％、含乙酸2.5wt％、含小肠粘膜下层基质3wt％、余量为水；
(3)将所述小肠粘膜下层基质海绵磨碎至粒径为20μm的颗粒，倒入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中搅拌处理12h后即得到促进关节软骨修复的可注射水凝胶，所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占10wt％。
本实施例最终得到的可注射水凝胶记为10％SIS。
实施例2
本实施例的促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法与实施例1的方法相同，不同之处在于，最后得到的所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占15wt％。
本实施例最终得到的可注射水凝胶记为15％SIS。
实施例3
本实施例的促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法与实施例1的方法相同，不同之处在于，最后得到的所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占20wt％。
本实施例最终得到的可注射水凝胶记为20％SIS。
实施例4
一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)取长度为10-30cm的猪小肠，将其剪开，对其清洗干净后用机械刮除法去掉小肠粘膜层、浆膜层和肌层组织即得到小肠粘膜下层，备用；
将小肠粘膜下层浸泡在乙二醇乙醚中12h进行脱脂处理后，取出，然后将小肠粘膜下层处理成1cm2以下碎片，将碎片置于1wt％氢氧化钠水溶液中室温下摇床震荡20h，取出所有碎片后放入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中摇床震荡3h；
然后置于0.1wt％SDS溶液中浸泡24h进行脱细胞处理，之后放入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中摇床震荡3h，-30℃下冷冻干燥10h后得到小肠粘膜下层基质；
(2)将所述小肠粘膜下层基质与含胃蛋白酶的乙酸水溶液进行搅拌96h，充分溶解后形成基质溶液，同时采用1mol/L的氢氧化钠溶液调节所述基质溶液的pH值为7.40，后续在-30℃下冷冻干燥20h得到小肠粘膜下层基质海绵；
其中所述基质溶液中含胃蛋白酶0.1wt％、含乙酸5wt％、含小肠粘膜下层基质5wt％、余量为水；
(3)将所述小肠粘膜下层基质海绵磨碎至粒径为20μm的颗粒，倒入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中搅拌处理20h后即得到促进关节软骨修复的可注射水凝胶，所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占10wt％。
实施例5
一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)取长度为10-30cm的猪小肠，将其剪开，对其清洗干净后用机械刮除法去掉小肠粘膜层、浆膜层和肌层组织即得到小肠粘膜下层，备用；
将小肠粘膜下层浸泡在异丙醇中12h进行脱脂处理后，取出，然后将小肠粘膜下层处理成1cm2以下碎片，将碎片置于1M碳酸钠水溶液中室温下摇床震荡20h，取出所有碎片后放入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中摇床震荡3h；
然后置于0.5wt％Triton X-100溶液中浸泡20h进行脱细胞处理，之后放入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中摇床震荡2h，-40℃下冷冻干燥8h后得到小肠粘膜下层基质；
(2)将所述小肠粘膜下层基质与含胃蛋白酶的乙酸水溶液进行搅拌24h，充分溶解后形成基质溶液，同时采用1mol/L的氢氧化钠溶液调节所述基质溶液的pH值为7.40，后续在-40℃下冷冻干燥16h得到小肠粘膜下层基质海绵；
其中所述基质溶液中含胃蛋白酶0.5wt％、含乙酸1wt％、含小肠粘膜下层基质1wt％、余量为水；
(3)将所述小肠粘膜下层基质海绵磨碎至粒径为20μm的颗粒，倒入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中搅拌处理12h后即得到促进关节软骨修复的可注射水凝胶，所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占10wt％。
对比例1
本对比例的水凝胶的制备方法与实施例1方法相同，不同之处在于，未将小肠粘膜下层处理成1cm2以下碎片，而是以20cm×5cm的大小进行后续处理。
对比例2
本对比例的水凝胶的制备方法与实施例1方法相同，不同之处在于，步骤(1)中将小肠粘膜下层浸泡在丙酮中10h进行脱脂处理后，取出，然后将小肠粘膜下层处理成1cm2以下碎片，将碎片先置于0.5％ Triton X-100溶液处理24h，再使用0.1％ SDS溶液处理24h，之后放入pH＝7.40的无菌PBS缓冲液中摇床震荡2h，-20℃下冷冻干燥12h后得到小肠粘膜下层基质。
测试例
Ⅰ、DNA残留量测定以及HE切片观察
对以上实施例经过步骤1得到的小肠粘膜下层基质进行DNA残留量的检测，测试方法按照YY/T 0606.25-2014《动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》进行测试，结果见表1。
表1经过步骤1得到的小肠粘膜下层基质DNA残留量
由表1可知，按照实施例1-5的方法进行处理，可将小肠粘膜下层的DNA残留降低至10ng/mg以下。对比实施例1与对比例1可知，将小肠粘膜下层剪碎之后再进行脱细胞处理，能较好的脱去细胞；同时对比实施例1与对比例2可知，使用碱溶液对小肠粘膜下层进行脱细胞处理，DNA残留有很大程度的降低。
对以上实施例经过步骤1得到的小肠粘膜下层基质进行HE切片观察，其中实施例1的小肠粘膜下层基质的HE切片如图1所示，由图1可见未观察到有完整的细胞核；结合表1数据可知，通过本发明的脱细胞方法，对小肠粘膜下层进行脱细胞处理后能达到很好的脱细胞效果。
Ⅱ、水凝胶形貌观察
对实施例1-3最终得到的可注射水凝胶的微观形貌进行了观察，结果见图2，由图2可知，可注射水凝胶微观上为均匀的多孔结构，并且随着小肠粘膜下层基质海绵浓度的增加，SIS孔径越来越小，其内部结构越来越致密。
Ⅲ、水凝胶溶胀性能
对实施例1-3最终得到的可注射水凝胶进行溶胀性能测试，测试方法如下：用注射器将各组浓度的可注射水凝胶注射到直径为8mm、高为20mm的模具中，并通过冷冻干燥机将各组水凝胶样品干燥，将干燥后的水凝胶从模具中取出并称重，得到初始质量M0。随后，将各组冻干的水凝胶样品浸泡于磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液，pH＝7.4)中，并在气浴控温摇床中进行测试。气浴控温摇床的参数设置为：温度37℃，震荡速度100r/min，在测试的过程中，于特定的时间点将样品取出，用滤纸将样品表面擦干并称重，质量为M1。
水凝胶的溶胀率的计算方式如公式计算：
溶胀性能结果见图3，由图3可知，本发明的水凝胶具有良好的溶胀性能，且小肠粘膜下层基质海绵的浓度越小，水凝胶的溶胀性能越好。
Ⅳ、水凝胶细胞粘附性能
对实施例1-3最终得到的可注射水凝胶进行细胞粘附性能测试，测试方法如下：
1、CCK-8检测
(1)用注射器将各组浓度的可注射水凝胶注射到48孔板中，每组4个样品，静置一段时间后，使水凝胶成形。
(2)将HUVEC以1×105/mL的细胞密度接种到各个样品表面，每个孔加入200μL细胞悬液，置于细胞培养箱中培养4h。
(3)吸走原培养基，并加入20μLCCK-8与200μL细胞培养基的混合溶液，放入培养箱中继续孵育2h。
(4)取出孔板，从每个孔吸取100μL的液体到96孔板中，通过酶标仪进行OD值测试。
2、DAPI染色
(1)按照CCK-8测试中操作，在每个样品上接种细胞，并培养4h。
(2)吸走原培养基，PBS冲洗2次，加入200μL多聚甲醛，室温下固定20min。
(3)吸走固定用的多聚甲醛，PBS冲洗2次，加入200μL DAPI到每个孔内，室温避光孵育5min。
(4)吸走DAPI染液，PBS冲洗2次，在细胞成像系统下观察拍照。
(5)利用Image J软件统计视野下的细胞数量，并计算出单位面积内的细胞数量。单位面积内的细胞数量＝视野下的细胞数量/视野的面积。
细胞粘附性能结果见图4，培养4h后，20％SIS表面的细胞数量最多，并且随着小肠粘膜下层基质海绵浓度的增加，在水凝胶表面粘附的细胞数量逐渐增加，单位面积的细胞数量被统计在图4的(b)图中；同时在图4的(c)图中的CCK-8检测结果也同样说明了小肠粘膜下层基质海绵浓度越大，水凝胶表现出更好的表面细胞粘附性能。
V、水凝胶细胞增殖性能
对实施例1-3最终得到的可注射水凝胶进行细胞增殖性能测试，测试方法如下：
1、CCK-8检测
(1)用注射器将各组浓度的可注射水凝胶注射到48孔板中，每组4个样品，静置一段时间后，使水凝胶成形。
(2)将HUVEC以1×105/mL的细胞密度接种到各个样品表面，每个孔加入200μL细胞悬液，置于细胞培养箱中培养1、3、5天。
(3)吸走原培养基，并加入20μLCCK-8与200μL细胞培养基的混合溶液，放入培养箱中继续孵育2h。
(4)取出孔板，从每个孔吸取100μL的液体到96孔板中，通过酶标仪进行OD值测试。
2、EDU细胞增殖检测
(1)按照CCK-8测试中操作，在每个样品上接种细胞，并培养24h。
(2)在每个孔中加入与原培养基等体积的2×EDU染液，放入细胞培养箱中继续孵育2h。
(3)吸走孔内的液体，PBS冲洗2次，用4％多聚甲醛在室温下固定20min。
(4)吸走4％多聚甲醛，PBS冲洗2次，每孔加入200μL的0.3％TritonX-100溶液，室温通透5min。
(5)吸走0.3％TritonX-100溶液，PBS冲洗2次，加入100μLAppolle染色反应液在室温避光的环境下孵育30min。
(6)吸走Appollo染色反应液，PBS冲洗2次，加入Hoechst 33342染液在室温避光的条件下孵育10min。
(7)吸走Hoechst 33342染液，PBS冲洗2次，在细胞成像系统下观察拍照。
(8)利用Image J软件分别统计出视野下的EDU染色的细胞数量和Hoechst 33342染液染色的细胞数量，并计算出EDU染色的细胞数量和Hoechst33342染液染色的细胞数量之间的比例。
细胞增殖性能结果见图5，图5的(a)图中EDU结果显示，在各组浓度可注射水凝胶表面的细胞大多数都处于细胞分裂期，表现出较好的细胞增殖性能；同时，对图5的(a)图中的各组浓度水凝胶中的被Hoechst 33342标记和被EDU标记的细胞数量进行统计，统计结果如图5的(b)图所示，可以看出在20％SIS表面上处于增殖期的细胞数量比例最高。同时图5的(c)图中CCK-8检测结果也表明小肠粘膜下层基质海绵浓度的越大，水凝胶表现出更好的表面细胞增殖行为。
本发明中制备的以小肠粘膜下层基质海绵为材料的可注射水凝胶主要包括胶原蛋白，其具有良好的生物相容性，同时还包括TGF-β、bFGF等多种生长因子和透明质酸，其中，TGF-β可以促进软骨组织生长和分化，bFGF可以刺激软骨细胞增殖，促进糖胺聚糖产生，从而保护软骨和促进软骨修复；透明质酸作为软骨细胞外基质的重要组成成分，可以减少软骨细胞的凋亡，同时促进软骨细胞增殖。本发明的水凝胶可以使用注射器将此水凝胶注射到软骨层缺损的部位，从而达到治疗软骨缺损的作用并降低手术的难度与风险，同时，水凝胶可以减缓关节摩擦，提供良好的润滑作用。还可以包覆软骨细胞和促软骨组织生长因子一起注射到软骨缺损部分，从而解决软骨组织中软骨细胞较少而无法自我修复的问题，到达促进软骨组织生长的作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将小肠粘膜下层进行脱脂处理后，采用碱液处理，再进行脱细胞处理，冷冻干燥后得到小肠粘膜下层基质；
(2)将所述小肠粘膜下层基质充分溶解在含胃蛋白酶的乙酸水溶液中形成基质溶液，同时调节所述基质溶液的pH值为6-8，后续进行冷冻干燥得到小肠粘膜下层基质海绵；
(3)将所述小肠粘膜下层基质海绵粉碎，倒入无菌PBS缓冲液中搅拌处理后即得到促进关节软骨修复的可注射水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述小肠粘膜下层采用10-30cm的动物小肠，将所述动物小肠剪开，对其清洗干净后用机械刮除法去掉小肠粘膜层、浆膜层和肌层组织即得到小肠粘膜下层。
3.根据权利要求1所述的一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述脱脂处理的过程是：将小肠粘膜下层浸泡在脱脂溶液中6-12h；所述脱脂溶液为丙酮、无水乙醇、乙二醇乙醚、异丙醇中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述碱液处理是将小肠粘膜下层处理成1cm2以下碎片置于碱溶液中室温下摇床震荡20-24h，取出所述碎片后放入无菌PBS缓冲液中摇床震荡2-3h；其中碱溶液为1M碳酸钠水溶液或1wt％氢氧化钠水溶液，所述无菌PBS缓冲液的pH为7.35-7.45。
5.根据权利要求1所述的一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理是置于脱细胞溶液中浸泡20-24h，然后放入无菌PBS缓冲液中摇床震荡2-3h；所述脱细胞溶液为0.5wt％Triton X-100溶液或0.1wt％SDS溶液。
6.根据权利要求1所述的一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述基质溶液中含胃蛋白酶0.1-0.5wt％、含乙酸1-5wt％、含小肠粘膜下层基质0.5-5wt％、余量为水；采用0.1-5mol/L的氢氧化钠溶液调节所述基质溶液的pH。
7.根据权利要求1所述的一种促进关节软骨修复的可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，所述可注射水凝胶中所述小肠粘膜下层基质海绵占比5-25wt％。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法获得的促进关节软骨修复的可注射水凝胶。
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