KR20080065606A

KR20080065606A - 세포 이식 방법

Info

Publication number: KR20080065606A
Application number: KR1020087008037A
Authority: KR
Inventors: 한네 에베르란드; 크리스티안 크라우센; 컬트 오스터
Original assignee: 인터페이스 바이오텍 에이/에스
Priority date: 2005-09-02
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2008-07-14
Also published as: WO2007028169A2; EP1924146A2; US20090214614A1; EP1924146A4; CN101291586A; WO2007028169A3

Abstract

본 발명은 결손 위치에 인 시투(in situ) 스캐폴드의 사용이 관련된 세포 이식에 의한 조직 공학을 위한 방법을 제공하는 것으로, 스캐폴드가 조직 결손 위치에 삽입되면, 상기 치료적 세포들은 오직 스캐폴드 내로 고정되고, 이것에 의해 스캐폴드에 세포들 뿐만 아니라, 조직 결손에 스캐폴드가 고정된다. 본 발명은 또한, 본 발명의 방법을 수행하는데 적절한 부분들의 키트를 제공한다.

세포, 이식, 임플란트

Description

세포 이식 방법 {A METHOD FOR CELL IMPLANTATION}

본 발명은 조직 결손의 복구를 촉진시키기 위한 살아있는 포유류 내 조직 결손에 살아있는 세포의 이식에 관한 것이다.

세포 이식을 이용한 조직 공학(tissue engineering) 방법은 알려져 있고, 예컨대, 개방(open) 관절 수술(open joint surgery), 예를 들어, 개방 무릅 수술과 관절 수술의 경우에, 환자가 최적의 결과를 달성하도록 보장하기 위해 회복하기 위해 광범위한 기간의 상대적인 장애가 포함된다. 그러한 절차는 값비싸고, 재활 및 물리요법과 같은 광범위한 의료 절차가 필요하다.

다양한 형태의 스캐폴드(scaffold) 기술을 이용한 방법은, 여기서 스캐폴드는 (스캐폴드 내에서 성장된 세포들이 함께 있거나, 없거나) 결손 내에 삽입되는 것으로, 상기 방법은 관절경 검사(arthroscop)에 의해 오직 안내되는 세포 이식 절차를 수행하는데 어려움들을 겪어왔다.

관절경(arthroscopic) 자가(autologous) 세포 이식은 (마이너(minor) 수술적 중재(intervention)를 이용한 AACI 또는 ACI라고 불린다) 연골 또는 뼈 결손을 치료하기 위한 수술적 절차이고, 이것에 의해 스캐폴드는, 전구체(precursor) 고정제와 세포 혼합물 또는 세포 현택액을, 예컨대, "끝이 무른(blunt)" 바늘 또는 카테 터(catheter)와 같은 바늘을 이용하여 상기 결손에 주입함과 동시에, 결손에 삽입된다. 이러한 이식 절차는 관절경 검사에 의해 시각화되고, 안내된다.

WO2004/110512는 포유류 내 연골 또는 뼈 결손을 치료하는데 유용한, 결손 부위를 확인하고, 연골세포(condrocyte), 연골아세포(condroblast), 골세포(osteocyte) 및 골아세포(osteoblast)를 연골 또는 뼈 결손에 주입하는 것을 포함하는 내시경적(endoscopic) 방법을 개시한다. 이 세포들은 용해가능한 트롬빈 및 피브리노겐 또는 콜라겐 혼합물과 같은 고화될 수 있는(solidafiable) 지지 물질과 함께 적용된다. 볼록 또는 오목 관절 내에 수술에 있어서, 다공성 막은 결손 부위에 위치될 수 있지만, 제거된 피브린/세포 혼합은 적절한 위치에서 응고되는 것이 상상된다. WO 2004/110512에 개시된 방법은 즉, open joint surgery (예를 들어, open knee surgery) 의 도움없이, 조직이 관절경적으로(arthroscopically) 복구되는 것을 허용한다.

그러나, WO 2004/110512에 개시된 방법은 특히, 충분한 복구/재생 전에 환자에게 수술 부위의 과도한 스트레스가 일어나는 경우와 같이, 완전하거나 충분하게 확고한 복구를 제공하지 못한다.

스캐폴드(scaffold)는 세포들이 조합될 수 있는 다공성 구조이다. 그것들은 보통 생체적합하고, 생분해가능한 재료로 만들어지고, 기능적인 조직을 형성하기 위한 공정에서 세포들의 조직, 성장 및 분화를 안내하기 위해 조직에 추가된다. 사용되는 재료들은 천연이거나 합성적인 기원을 가질 수 있다.

이전에 출원된 덴마트 우선권 출원 PA200600337 (명칭은 Coloplast)은 본 발 명의 키트 및 방법에서 사용되는 바람직한 스캐폴드 재료를 제공한다. 스캐폴드 생산을 위한 스캐폴드 재료들 및 방법은 본 발명의 일부는 아니다.

본 발명은 세포 이식에 의한 조직 공학을 수행하고, 결손 부위에 고체 스캐폴드를 추가하고, 동시에 세포 및 고정제 전구체(WO2004/110512에 개시된 '고체화가능한 지지체(support)'와 같은)를 적용하기 위한 개선된 방법을 제공한다.

고정제 전구체의 고정제로의 전환은 세포와 스캐폴드 및 스캐폴드와 결손 부위의 효과적인 결합을 가져온다. 우리는 놀랍게도, 본 발명이 주목할만한 비율의 조직 치료, 및 주변의 손상되지 않은 조직과 닮을 수 있는 넓이의 회복을 제공하는 방법을 밝혔다. 스캐폴드의 효과는 세포 이동 (예컨대, 크론도제닉(chrondogenic) 효과)과 생존력을 증가시킬 뿐만 아니라, 구조적으로 강건한 조직의 재생을 허용하는 세포의 강한 지지를 제공하고, 주변 조직에 공정된 또는 대체된 조직과 주변 조직의 더 일정한 통합을 허용한다.

발명의 요약

본 발명에서 겔 또는 히드로겔에 고정된 스캐폴드 및 세포들과 같은 스캐폴드 및 고정된 세포들의 이용은 결손 부위에 새로운 건강한 조직을 생성하는 매우 효율적이고 강한 (robust) 방법을 제공하고, 이것은 뛰어난 높은 품질의 복구, 즉, 두껍거나 더 일정한 그리고, 때때로는 거의 원래 상처입지 않았던 인접 조직과 같이 거의 한결같은 것으로 실현될 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 본 방법은 관절 연골과 같은 높은 수준의 '히알인(hyalin)', 일반적으로 수술 후 재생하는데 많은 시간이 걸리는 조직 종류, 자주 약하거나 열등한 복구로 결과가 나타나는 이것을 효과적으로 제조하는데 이용될 수 있다. 본 발명에 의해 수행되는 복구의 몇몇 면에 있어서, 천연 연골과 거의 동등하거나, 거의 그 형태에 접근했다고 생각될 수 있다.

본 발명의 제1 면은 인간과 같은 살아있는 개개의 포유류의 조직에서 결손을 살아있는 포유류 세포의 이식에 의해 복구하는 방법에 관한 것으로,

상기 방법은,

i) a) 필수적으로(essentially) 무세포(cell-free)이고, 생체적합성 스캐폴드를 포함하는 제1 요소; b) 필수적으로 무혈청(serum free) 포유류 세포와 생물학적으로 수용가능한 고정제 전구체 (또는 전구체들의 혼합물)의 혼합물을 포함하는 제2 성분,를 고정제 전구체가 고정제로 전환되기 전에 그 결손부위에 동시에 적용하는 단계, 및

ii) 상기 스캐폴드에 상기 포유류 세포들을 고정하고, 상기 스캐폴드는 상기 살아있는 포유류 조직에 고정제 전구체가 고정제로 전환되는 것에 의해 고정하는 단계

를 포함한다.

본 발명의 제2 면은 상기 방법에 이용하기 위한 부분들의 키트를 제공하는 것으로,

상기 키트는,

a) 필수적으로 무세포이고, 생체 친화적인 스캐폴드를 포함하는 제1 성분;

b) 필수적으로 무혈청 포유류 세포 및 생물학적으로 수용가능한 고정제 전구체 (또는 전구체의 혼합물)의 혼합물을 포함하는 제2 성분;

c) 및 상기 고정제 전구체를 위한 임의적으로 가교제

를 포함하고, 상기 제1성분 및 제2 성분는 서로 분리되어 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 요소들을 언급하는, 여기에서 기술된 구체예들은 동일하게 본 발명에 따른 키트에도 적용된다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명의 목적은 어떠한 내성있는 (tolerated) 형태의 스캐폴드, 이것에 제한되지는 않으나, 콜라겐 스캐폴드, 알긴산, 폴리락틱산 (PLA), 폴리글리콜릭 산 (PGA) 조성물 및 상기 기재된 스캐폴드 또는 막-유사 스캐폴드를 포함하는 스캐폴드를, 목적하는(target) 곳에, 예컨대, 연골 결손, 뼈 결손, 피부 및 장기 결손 또는 장기 내에 국부화된(localized) 세포 결손에 적용하는 수단 및 방법이다.

스캐폴드, 세포 또는 고정제 (접착제/풀과 같은) 없이는 바람직하게, 결손부위에 위치되는 제1 단계로써, 일반적으로, 결손부위에 맞게 잘라지거나, "크기에 맞게 맞춰진" 후에, 적절하게 스캐폴드는 결손부위 및/또는 소망하는 새로운 조직의 모양/형태에 맞도록 특정한 형태로 형성될 수 있다.

제1 면에서, 배양배지 및 피브리노겐과 혼합된 세포들은 먼저 결손부위에 위치된 무세포 스캐폴드의 표면에 위치된다- 세포들 및 피브리노겐은 목적하는 부위에 놓여진 무세포 스캐폴드의 표면상에 적용된다, 그리고 트롬빈과 같은 겔화하는 촉매/작용제를 포함하는 성분은 동시적으로 또는 조금 후에 스캐폴드의 상부에 추가된다. 겔화 또는 응고 과정은 스캐폴드내에 5 분 미만 또는 심지어 2분 미만으로 수초 또는 수분 내에 일어나고, 그리하여 스캐폴드 (및 다른 세포들)는 결손부위에 고착되는 것과 동시에 스캐폴드에 세포들이 고착된다.

본 발명의 바람직한 면은 무세포 또는 본질적으로 무세포 스캐폴드와 같은 스캐폴드가 세포의 첨가에 앞서 결손부위에 위치되는 것에 있다. 적절하게, 스캐폴드는 처리될 결손 부위의 영역을 따라 연속적으로 타이트하게 맞도록 형성한다. 상기 스캐폴드는 바람직하게 친수성 능력이 있어야만 한다.

다른 면에 있어서, 하나의 고정제 전구체에서 세포들은 (예컨대, 피브리노겐은 다른 고정제 전구체 (트롬빈)과 혼합된다) 동시에 스캐폴드에 삽입된다.

또 다른 면에 있어서, 스캐폴드는 사용에 앞서, 하나의 고정제 전구체에 "포화시키는(impregnated)" 방식으로 제작될 수 있고, 이것은 그 활성 (예를 들어, HumaGene Inc.,Chicago, Illinois에 의해 개발된 트롬빈 유사체)을 유지할 수 있다. 스캐폴드는 일반적으로 결손부위 크게 이 맞게 잘라지거나, 형태에 맞게 맞춰지고, 스캐폴드는 결손 부위에 위치되고 (예를 들어, 관절경 안내), 세포들은 고정제 전구체 또는 전구체들과 혼합되고 이것은 스캐폴드에 위치되며, 세포/고정제 전구체들은 그리고나서 용액을 함유할 것이고, 이것이 스캐폴드에 추가될 때, 다른 고정제 전구체 (예컨대, 트롬빈 유사체)에 포화되어, 스캐폴드 활성에 고정제 전구체를 공급하고, 이것에 의해 세포에 함께 추가된 고정제 전구체와 반응하는 것이 가능해지고, 겔화, 응고(clotting) 및 부착이 실현된다.

설명된 방법은 스캐폴드 친수(hydrophillic) 세포 흡수 시스템 (SCAS 시스템)이라 불리운다. SCAS 시스템은 어떠한 세포들을 이용하여, 연골 결손, 골관절염성(osteoarthritic) 결손, 뼈 결손, 치주의(periodontal) 결손, 피부 결손, 뿐만 아니라 세포들이 장기내에 질환을 복구하기 위해 환자에게 유익할 다양한 "타겟(target)" 장기들에 이르는, 적절한 타겟에 적용할 수 있다. 예를 들어, 자가 피부 이식을 필요로 하는 손상된 피부의 영역을 포함하는 스캐폴드는 이식을 필요로하는 영역에 놓여질 수 있고, 하나의 겔화 또는 응고 요소 (예컨대, 피브리노겐)를 포함하는 배지내 세포들은 겔화 또는 응고 요소들과 함께 가져와서 흡수될 수 있고, 친수성 막에 스프레이 될 때 예를 들어 막이 빨리 피브리노겐을 포함하는 배지 내에 세포를 흡수하고 동시에 겔화요소를 흡수한다는 사실 때문에, 트롬빈의 경우, 그리하여 손상된 피부 영역에 상기 막을 고정하여 유지한다- 전체 절차는 일반적으로, 살균(sterile) 또는 무균(aseptic) 힙-필터된(heap-filtered) 텐트(tent) (LAF-bench) 또는 방에서 일어난다. 케라티노사이트 또는 바람직하게는 자가 기원을 가지는 다른 피부 관련 세포들과 같은 피부 세포 및/또는 섬유아세포(fibroblast)와 같은 세포들은 스캐폴드 또는 막에 고정될 것이고, 동시에 스캐폴드 또는 막은, 무세포 스캐폴드 또는 막이 그 타겟 (예컨대, 연골 결손)에 놓일때, 상기 무세포 스캐폴드 또는 막에 적용되는 용액을 포함한 인 시투(in situ) 겔화 또는 응고 세포 때문에 타겟에 고착될 것이다.

본 발명에 있어서, 스캐폴드가 위치한 다음에, 세포 현탁액, 예를 들어 피브리노겐을 포함하는 배양 배지에 현탁된 현탁액과, 응고제, 예컨대, 트롬빈과 같은, 가능하게는 다른 응고제들과 함께 포함하는 다른 용액은, 예를들어 여기서 개시하는 키트를 이용하여 놓여지고, 이 키트는 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 이러한 혼합된 요소들 또는 세포 현탁액 및 응고제 혼합물 (예컨대, 피브리노겐 및 트롬빈)과 같은 것들을 스캐폴드로 방출하기 위해, 적어도 두개의 시린지(syringe)를 포함하고, 이것은 기능적으로 또는 구조적으로 연결되어 있다. 친수성 스캐폴드는 그리고나서 스캐폴드 내로 혼합된 세포 유체 및 응고제(clotting agent)의 "흡입(suction)"을 용이하게 하고, 이것에 의해 스캐폴드에 고정 및 고착하여, 세포로 채워지게 되고, 예를 들어 연골 결손과 같은 타겟 부위 (결손)에, 스캐폴드 내에 퍼진 피브린에 포함된다. 그러므로, 스캐폴드는 세포로 채워지고, 동시에 응고제는 스캐폴드 내에서 상호작용하고, 그러므로, 이것은 즉석에서 지속되게 된다 (스캐폴드 내로 혼합된 세포 유체 및 응고제의 단 몇초 또는 몇분의 적용과 같이).

K.Osther 및 다른 것 (미국특허 5,759,190; 5,989,269; 6,120,514; 6,283,980; 6,379,367; 6,592,598; 6,592,599; 6,599,300; 6,599,301)에 의한 이전 개시내용에서, 세포들은 스캐폴드 내로 적용되고, 타겟 (예컨대, 연골 결손)에 스캐폴드를 함유하는 세포를 놓기 전에 한동안 스캐폴드에서 배양한다. 본 발명은 개선된 결과와, 여기에 개시된 바와 같은 좀 더 편리한 절차를 나타낸다.

본 발명의 방법에 있어서, 스캐폴드는 동일한 수술 절차의 일부로써 결손 부위로부터 제거되지 아니한다. 바람직하게, 스캐폴드는 제거되지않고 결손 부위에서 생분해되거나 용해될 수도 있음에도 불구하고, 일반적으로 수술 후 최소한 1-6 개월 이상 지속된다. 그러므로, 그 동안 및 본 발명에 따른 방법 후에, 스캐폴드는 결손 부위에 남아있고, 결손 부위에서 생분해되거나 용해될 수도 있음에도 불구하고, 일반적으로 수술 후 최소한 1-6 개월 이상 지속된다.

WO02/061052에 개시된 것과 같이, 세포들은 제조될 수 있고, 이것은 참고로 여기에 포함된다. WO02/061052에 개시된 세포들은 그러므로, 그 타겟에 놓여진 무세포 스캐폴드내로 직접 주입될 수 있다.

일 구체예에서, 세포들은, 세포 유체 및 갤화 재료가 타겟 부위에 미리 놓여진 무세포 스캐폴드 또는 막에 동시적으로 또는 필수적으로 수반하여 첨가되기 때문에, 스캐폴드 내에 고정된다. 무세포 스캐폴드 (또는 막)에 적용된 겔화 물질을 포함하는 세포는 그러므로, 동시적으로 또는 필수적으로 수반하여, 무세포 막에 유체로써 적용되는 겔화 물질과 함께 퍼진다. 일 구체예에서, 세포들은 피브린 겔(히드로겔)의 형성에 의해, 겔화 재료 피브리노겐과 트롬빈의 상호작용에 의해, 스캐폴드내로 고정된다. 스캐폴드는 그리고나서, 자발적으로, 타겟 영역 (예컨대, 연골 결손)에 부착된다.

본 발명의 구체예

제1성분은, 상기 제2 성분의 적용 이전에, 상기 결손 부위에 적용되는 것이 바람직하다. 그러한 구체예에서, 제1성분은 제2성분의 수반하는 적용보다는, 분리된 수술 절차로 적용될 수 있는 것이 가능하다, 예를 들어, 제1성분은 개방 수술 절차를 이용하여 적용가능하고, 반면에, 제2 수술 절차는 내시경적으로(endoscopically) 적용가능하다. 그러나, 제1성분 및 제2성분들은 동일한 수술 절차동안 적용되는 것이 바람직하다.

제1성분 및 제2성분들이 적용되고 고정되면, 포유류 세포들이, 새로운 살아있는 조직을 재생하기 위해, 스캐폴드를 통해 이동 및/성장하는 것이 허용되고, 이것은 연골 복구의 경우에는, 콘드로제닉(chondrogenic) 효과로 언급된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 고정제 전구체 전환제는 상기 결손 위치에 동시적(concomitant)으로 적용된다.

본 발명의 구체예에서, 전환제는 제1성분의 일부로써 적용된다. 이 점에서, 전환제는 입자의 형태 또는 화학적으로 연결된, 또는 비화학적으로 연결된 형태로, 스캐폴드내로 통합될 수 있다. 전환제는 용매로써 적용가능하고, 예컨대 이것은 스캐폴드 내에서 건조되도록 하고, 및/또는 예를 들어, 이것은 스캐폴드 중합체(polymer)와 공유적으로 연결되거나, 또는 대신에 또는 화학적으로 또는 중합체로 방사(radiation) 가교되거나 이온 결합 (예컨대, 수소 결합 또는 반데르발스 힘)에 의해 연결될 수 있다.

일 구체예에서, 전환제는 가교제 및/또는 폴리머화제일 수 있다.

일 구체예에서, 전환제는 단백질 또는 다당류이다.

일 구체예에서, 전환제는 상기 생물학적으로 수용가능한 스캐폴드에 동결건조(lyophilize)된다.

일 바람직한 구체예에서, 고정제는 히드로겔 형태이고, 즉, 물과 결합할 수 있는 겔화 물질이고, 예를 들어, 상기 고정제 전구체 피브리노겐 및 전환제 트롬빈의 조합에 의해 형성되는 피브린 일 수 있다.

고정제 전구체는 제2성분의 일부인 것이 바람직하고, 전환제는 분리되어, 제1성분의 일부로써 또는 동시에 스캐폴드 상에 적용되는 세포들과 혼합되어, 공급되는 반면에, 하나의 구체예에서, 전환제는 세포들 (예컨대, 트롬빈)과 함께 혼합되고, 피브리노겐과 같은 전환제는 동시에 또는 제1성분의 일부로써, 예컨대, 스캐폴드의 동결건조된 요소로써 공급되는 것이 가능한 것으로, 인식된다. 일 특정예에서, 본 발명의 목적을 위해, 전환제 및 고정제 전구체는 상호교환가능한 용어들이고, 중요한 것은, 본 발명 이전에, 그것들은 분리된 채로 지속되고, 그러므로, 본 발명의 방법동안에, 수반하여 일어나는(concomitant), 또는 필수적으로 동시에 일어나는 적용을 허용한다.

바람직한 구체예에서, 포유류 세포들은 상기 살아있는 포유류 조직/개체들과 면역-친화적이다. 비면역-친화적인 세포들의 사용은 그러나, 예를 들어, 면역 억제 약들과 함께 사용가능하다.

환자

살아있는 개개의 포유류는 바람직하게는, 인간, 일반적으로 환자이다. 그러나, 본 발명의 방법은 말이나 염소와 같은 다른 포유류에도 또한 적용가능하다.

세포

상기 포유류 세포는 개개의 포유류로부터 수득되거나 유래되는 것이 바람직하다. 개개의 포유류로부터 세포를 수득하고 배양하는 그러한 방법들은 WO02/061052에 개시되어 있다.

포유류 세포들은 바람직하게는 세포 현탁액 또는 조직 외식편(explant)의 형태로 공급된다. 조직 외식편은 개개의 포유류의 다른 일부로부터 직접 얻어질 수 있고, 그러므로, 피부 이식(graft)과 같은 조직 이식의 형태일 수 있다.

포유류 세포들은 기원에 있어서 자가(autologous), 상동(동종) 또는 이종(xenogenic)이다.

포유류 세포들은 다분화능(multipotent) 또는 만능(pluripotent) 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.

포유류 세포들은 섬유아세포(fibroblast), 케라티노사이트(keratinocytes), 연골세포(chondrocyte), 골아세포(osteoblast), 신경 및 치주의 세포들로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 중간엽(mesenchymal) 기원의 세포들.

섬유아세포 및 케라티노사이트들은 두 가지 세포 종류의 피부 세포들이다.

연골세포는 연골 복구와 같은데에 특히 바람직하다.

줄기 세포 또는 결손 부위에 인 시투(in situ) 연골 세포가 되거나 생산할 수 있는 적절한 다른 전구체 세포들이 또한 사용가능한 것으로 파악된다.

일반적으로, 제2성분에 사용되는 세포들은 결손 또는 타겟 조직의 복구 또는 재생을 가져오는 충분한 양, 예컨대, 약 0.1×10⁴내지 10×10⁶ 세포/ml, 또는 0.1×10⁶ 세포/ml 내지 약 10×10⁶ 세포/ml 와 같은 양으로 존재한다.

조직 결손

본 발명의 방법이 포유 동물의 신체에 많은 수의 고형 조직에 넓게 적용가능할 것이라는 것이 인지되어 있는데 반해, 조직 결손은 연골 결손, 뼈 결손, 피부 결손, 치주 결손으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

수술 방법

수술방법은 내시경적(endoscopic), 아트로스코피적(atheroscopic), 또는 최소 인베이시브(invasive) 수술(surgery), 또는 통상의 또는 또는 개방(open) 수술로 수행될 수 있다.

스캐폴드

스캐폴드는 친수성이고/거나, 히드로겔과 같은 생체적합성 습윤제의 적용에 의해 결손부위상에 삽입되기에 앞서 제조되는 것이 가장 바람직하다. 스캐폴드는 또한 물 및/또는 등장액에 삼투성인 것이 가장 바람직하다.

일 구체예에서, 스캐폴드는 25kDa 및 75kDa 사이와 같은, 약 1 kDa에서 백만kDa 사이와 같은, 약 1kDa 보다 큰, 평균 분자량과 같은, 분자량의 다수의, 중합체, 중합체들을 포함하는 것과 같이, 필수적으로 구성되거나 또는 포함한다.

스캐폴드는 막, 직조된(woven) 또는 비직조된(unwoven) 파이버들, 동결 건조된 중합체 시트, 로드(rod) 또는 튜브로 구성된 군에서 선택된 형태일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 스캐폴드는 합성이다.

스캐폴드는 시트, 막, 몰드된 형태, 플러그(plug), 튜브, 스피어(sphere), 결손 부위에 삽입을 위해 제조된 3차원 형태, 또는 이식편(implant)로 구성된 군에서 선택된 형태일 수 있다.

본 발명의 방법은 성형 재건(cosmetic reconstruction)에 사용될 수 있다 - 예를 들어, 스캐폴드는 재건 수술에 필요한 형태로 제조/몰드되고, 세포들은 일단(once) 인 시투(in situ)로 스캐폴드에 적용되거나 고정된다.

스캐폴드는 마운드(mound)로써 결손부위를 이용하거나, 결손부위를 주형(template)으로 이용하여 제작되는 몰드 내 결손부위를 창조하는 것에 의해, 결손 부위의 정확한 형태에 맞기 위해 전-몰드(pre-mold)될 수 있다.

제1성분은, 처음, 스캐폴드와 같이, 또는 예컨대 동결 건조동안 스캐폴드에 추가될 수 있는 조성물/화합물,은 추가적인 화합물을 포함하고, 이것은 예를 들어, 세포 부착, 세포 이동 및/또는 조직 재생을 향상할 수 있고, 이것은, 예컨대, 히알루론산(HA), 히드록실 아파타이트(예컨데, 미립(granule) 형태로), IGF-1과 같은 성장 인자, 콜라겐으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

스캐폴드의 실제 구멍들은 콘드로이틴 황산염(sulfate), 히알루로난, 헤파린 설페이트, 황산 헤파란, 더마탄 설페이트, 성장 인자, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐, 젤라틴, 및 아그리칸(aggeecan)으로 구성된 군에서 선택되는 요소와 같은, 조직 재생을 위한 내부 성장(in-growth) 및/또는 세포 부착을 용이하게 하는 요소에 의해 부분적으로 채워질 수 있다.

일 구체예에서, 제2성분은, 예컨대, 세포 이동 및/또는 조직 재생을 증진할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다.

일 흥미로운 구체예에서, 히알루론산과 같은 세포이동 및/또는 조직 재생을 증진하는 상당한 양의 화합물을 0.1 및 10wt% 사이와 같은, 0.1 및 10wt% 사이와 같은, 약 0.1 및 약 15wt% 사이와 같은 비율로 스캐폴드 내에 포함된다. 일 구체예에서, 상기 수준은 10wt% 이하 또는 5wt% 이하와 같은, 15wt% 이하이다. 일 구체예에서, 상기 수준은 0.01wt% 이상, 예컨대 0.1wt% 이상 또는 1wt% 이상이다.

스캐폴드는 임의의 적합한 생물학적으로 허용가능한 물질로 이루어지거나 이를 포함할 수 있지만, 바람직한 구체예에서 스캐폴드는 일반적으로 폴리락티드 (PLA), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (PLGA), MPEG-PLGA (메톡시폴리에틸렌글리콜) - 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드), 폴리 히드록시산으로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물을 포함한다. 이와 관련하여, 구멍(pore)의 공간 및 임의의 추가적 성분 (예컨대, 세포 부착(adhesion) 및/또는 조직의 재생을 위한 내부 성장을 촉진시키는 것)을 제외한, 스캐폴드는 본 명세서에서 제공되는 1종 이상의 중합체 (중합체의 혼합물을 포함함)를 50% 이상, 예컨대 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 포함할 수 있다.

PLGA 및 MPEG-PLGA가 특히 바람직하다.

스캐폴드는 용액 내에 전술한 것과 같은 화합물을 포함하는 용액의 동결건조에 의하여 제조될 수 있다.

스캐폴드는 다공도(porosity)가 20% 내지 99%, 예컨대, 50% 내지 95% 또는 75% 내지 95%의 범위인 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 스캐폴드는 생물학적 중합체, 예컨대 단백질 또는 다당류를 포함할 수 있다. 적합한 생물학적 중합체는 젤라틴, 콜라겐, 알지네이트, 키틴, 키토산, 케라틴, 실크, 셀룰로오스 및 이들의 유도체 및 아가로스로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

생물학적으로 허용가능한 고정제 전구체

일 구체예에서, 생물학적으로 허용가능한 고정액 전구체는 생물학적으로 얻어지거나 유도된 피브리노겐과 같은 화합물이다.

피브리노겐은 재조합 피브리노겐 (예컨대, HumaGene Inc. (Chicago, Illinois, USA)로부터의 재조합 인간 피브리노겐)의 형태일 수 있다.

피브리노겐은 포유류 숙주 세포, 예컨대 포유류 개체와 동일한 종으로부터 얻어지거나 유래된 숙주 세포, 또는 트랜스제닉 숙주로부터 분리될 수 있다.

사용되는 피브리노겐의 적합한 농도는 1∼100 mg/ml을 포함한다. O

일 구체예에서, 특히 고정액 전구체가 피브리노겐인 경우, 전환제(conversion agent)는 트론빈, 트롬빈 유사체, 재조합 트롬빈 도는 재조합 트롬빈 유사체로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

사용되는 트롬빈의 적합한 농도는 0.1NIH 유닛 내지 150NIH 유닛, 및/또는 1∼100 mg/ml 피브리노겐을 중합시키기 위한 트롬빈의 적합한 수준이다.

표준 NIH 유닛은 트롬빈 측정을 위하여 관례적으로 사용되는 국립보건원 표준 유닛(National Institute of Health standard unit)을 말하며, 이는 가프니 피제이, 에드겔(Gaffney PJ, Edgell)의 문헌 [Thromb Haemost. 1995 Sep;74(3):900-3]에 따라, 트롬빈 1.1 내지 1.3 IU, 바람직하게는 1.15IU와 등가이다.

살아있는 포유류 조직은 예컨대 결합조직, 피부, 연골, 뼈, 인대 및 치주조직으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 재건 수술(reconstruction surgery) 또는 성형(cosmetic) 수술 도중이 수행된다.

부분들의 키트(Kit of parts)

전술한 방법에서의 사용을 위해 적합한 키트는 본 발명의 방법 또는 본 명세서의 다른 부분에 따라 정의된 제1 성분 및 제2 성분을 포함하고, 여기서 상기 제1 성분 및 상기 제2 성분은 서로 분리되어 있다. 따라서, 외과적 시술을 수행하기 전에 제1 및 제2 성분은 결합되지 않아야 한다.

적합하게는, 본 명세서에서 정의된 전환제가 또한 제공되고, 여기서 전환제는 상기 제1 성분 및 상기 제2 성분과 분리되어 있는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 정의된 것과 같은 전환제는 상기 제1 성분의 일부일 수 있다.

키트의 구조적 형태는 제1 및 제2 성분과, 필요에 따라, 전환제를 외과적 시술을 수행하기 전에 분리시켜 둘 수 있게 하지만, 외과적 시술 도중에 결합되게 하여, 본 발명의 방법과 관련하여 본 명세서에 기재된 바와 같이, 제2 성분의 첨가와 동시에 또는 그 전에, 일 구체예에서는 제2 성분의 첨가에 이어서, 스캐폴드가 결손 속으로 삽입되게 할 수 있는 임의의 형태를 취할 수 있다.

바람직하게는 키트는 다음의 기능적으로(functionally) 연결된 장치를 포함하는 통합 공급 장치(integrated supply device)를 포함한다: (i) 사용 전에 상기 제2 성분을 함유하는 1개 이상의 용기, (ii) 상기 제2 성분이 상기 용기 밖으로 나오게 하여 (iii)으로 들어가게 압력을 가하기 위한 강제 도포기(force applicator), (iii) (iv)에 대한 (혼합) 커넥터, (iv) 전달 장치 (상기 전달 장치는 살아있는 포유류 조직 중의 결솔 위치에 삽입된 제1 성분에 제2 성분의 직접적인 적용(application)에 적합함).

일 구체예에서, 상기 통합 공급 장치는 2개의 용기, 즉 상기 세포 현탁액을 함유하는 제1 용기 및 상기 고정제 전구체를 함유하는 제2 용기를 포함하는데, 상기 제1 및 제2 용기는, 상기 세포 현탁액과 상기 고정제 전구체를 혼합시키고, 동시에 상기 운반 수단에 의한 운반 전에 제2 성분을 준비하는 공통의 커넥터에 의하여 연결된다.

본 명세서에서 설명되는 것처럼, 세포 현탁액 및 고정제 전구체가 사용전에 혼합되는 것이 또한 실시되고, 따라서 통합 공급 장치에서 각각을 위한 2개의 분리된 용기를 가지는 것이 항상 필요한 것은 아니다.

그러나, 상기 통합 공급 장치는 상기 전환제를 함유하는 추가적인 용기를 포함할 수 있고, 여기서 상기 추가적인 용기는 공통 커넥터(common connector)에 의하여 상기 제1 용기 및 필요에 따라 상기 제2 용기에 연결되고, 상기 공통 커넥터에 의하여, 상기 전달 수단에 의하여 상기 조직 중의 결손 자리에 삽입되는 상기 제1 성분에 전달되기 바로 전에, 상기 제1 성분과 상기 전환제의 혼합을 가능하게 한다. 그러한 통합 공급 장치는 또한 세포 현탁액 및 고정제 전구체를 위한 분리된 용기를 언급한 전술한 구체예를 포함할 수 있다.

상기 용기들은, 공통(common) 강제 도포기 장치 또는 분리 독립된(separate independent) 강제 도포기일 수 있는 강제 도포기에 기능적으로 연결될 수 있다. 상기 강제 도포기는 예컨대 주사기 플런저(syringe plungers)의 기부(proximal) 말단을 결합 또는 연결시킴으로써 구조적으로 연결될 수 있거나, 또는 이들은 예컨대 컴퓨터 협동 연동 펌프(computer coordinated peristaltic pumps)에 의하여 연결될 수 있다.

비록 상기 용기가 예컨대 튜브, 실린더, 백(bags), 단지(jars), 비이커 등의 임의의 적합한 형태를 취할 수 있지만, 일 구체예에서 1개 이상의 용기 (예컨대, 제1 용기, 제2 용기 및/또는 상기 제3 용기)는 주사기 몸체의 형태이고, 상기 강제 도포기(들)은 결합될 수 있거나 결합될 수 없는 각각의 주사기 플런저의 형태이다.

커넥터는 일반적으로, 전술한 바와 같은 상기 1개 이상의 용기에 연결되는 기부 말단 또는 말단들 및 상기 전달 장치에 연결되는 단일의 원위부(distal) 말단을 가지는 1개 이상의 튜브이거나 또는 이를 포함한다.

커넥터는 상기 전달 장치로 들어가기 전에 제2 성분 및 필요에 따라 상기 전환제의 완전한 혼합을 가능하게 하는 혼합 장치(mixing device)를 더 포함할 수 있다. 상기 혼합 장치는 예컨대 균등한 혼합을 보장하는 액체의 흐름 중에 혼합하는 소용돌이를 만드는 단순한 프로펠러와 유사한 형태와 같은 형태일 수 있다. 혼합 장치는 예컨대 전기 모터 또는 그 프로펠러의 표면을 지나가는 액체의 흐름을 이용하여 회전하는 수동적(passive) 장치에 의하여 외부적으로 작동될 수 있다. 그 대신에, 상기 커넥터는 정적 혼합기(static mixer)로서 작동할 수 있다.

전달 장치는 본 명세서에서 언급된 것과 같은 선택된 수술 기법을 위한 임의의 적합한 의료 장치의 형태일 수 있고, 예를 들어, 전달 장치는 카테터, 바늘, 주사기, 튜브, 압력총(pressure gun) 및 스프레이 장치로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

전술한 일체화된(unified) 커넥터 및 운반 장치가 바람직하지만, 키트는, 예컨대 제2 성분을 위한 하나, 및 전환제를 위한 하나와 같이, 병렬의(parallel) 통합된 공급 장치를 포함할 수 있다는 것이 인식된다.

본 발명의 또 다른 측면

제1 성분은 고체 스캐폴드로 이루어지거나 이를 포함한다.

제2 성분은 세포 (포유류 세포) 및 생물학적으로 허용가능한 고정제 전구체(fixative precursor)를 포함한다. 일반적으로, 제2 성분은 세포 현탁액의 형태이다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 제1 조성은 건조 또는 가습 조건에서 보관되지만, 사용 전에, 예컨대 식염수 또는 등장 버퍼, 또는 적절한 버퍼 시스템 중에서 적셔진다.

본 명세서에서 사용되는 "동시 적용(concomitant application)"이라는 용어는 제1 성분 및 제2 성분의 혼합물과, 고정제 전구체를 고정제로 전환시키는 적합한 전환제(conversion agent)를 형성시켜, 상기 혼합물이 고정 단계 (공정) 앞서 결손 자리에 존재하게 하는 적용을 의미한다. 본 발명에 따른 방법에서, 상기 스캐폴드 (즉, 제1 성분)이 제2 성분의 첨가 전에 결손 자리에 첨가되는 것이 매우 바람직하다. 제1 성분 전에 제2 성분의 첨가는, 그 결손에 대한 스캐폴드의 나쁜 고정 및 스캐폴드와 그 안에 포함되는 세포의 결손에 대한 효과적 고정의 더 높은 실패 가능성을 이끄는, 스캐폴드와 결손 사이의 액상 갭(liquid gap)을 가져올 수 있다.

그러나, 일 구체예에서, 제1 성분 (스캐폴드)는 제2 성분의 적용 다음에 결손 자리에 위치된다. 그러한 구체예에서, 그 스캐폴드는 고정 단계(fixation step) 전에 위치된다. 따라서, 전환제가 예컨대 제2 성분의 일부로서 (아주 최근에) 적용되어 질 수 있었고, 또는 전환제가 제1 성분의 일부로서 또는 제1 성분의 적용 바로 후에 적용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 제2 성분의 적용이 제1 성분의 적용에 앞서는지 여부와 무관하게, 제2 및 제1 성분의 적용 사이의 시간은 바람직하게는 30분을 이하, 예컨대 10분 이하, 5분 이하, 2분 이하, 예컨대 1분 이하이다.

전환제는 예컨대 스캐폴드와 함께 제조되는 제1 성분의 일부로서 제공될 수 있거나, 또는 제1 성분에 대한 제2 성분의 적용의 바로 전, 적용 도중 또는 적용 후에 제2 성분에 첨가될 수 있다.

"생체적합성(biocompatible)"이라는 용어는 포유 동물의 신체, 예컨대 환자의 신체로 삽입될 때, 특히 결손 자리에 삽입될 때, 개체로부터 중요한 독성 또는 유해한 면역 반응을 가져오지 않는 조성물 또는 화합물을 의미한다.

스캐폴드

"생체적합성 스캐폴드"는 포유류의 신체 내, 예컨대 환자의 신체 내로 삽입될 때, 특히 결손 자리에 삽입되는 경우, 허용되는(tolerated) 고체 스캐폴드를 의미한다. 스캐폴드는 본 발명의 방법/외과적 시술의 일부로서 제거되지 않지만, 예컨대 수술 후 1-6 개월, 예컨대 결손이 스캐폴드를 통하여 및 적절하게 주변 조직과 함께 세포의 이동 및 성장에 의하여 적절하게 회복되는 때, 시간에 따라 생체분해 (bio-degrade) (또는 재흡수) 될 수 있다. 생체분해를 위한 시간은 상이한 적용에 따라 상당히 변할 수 있다.

일 구체예에서, (생체적합성) 스캐폴드는 콜라겐, 알지네이트, 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), MPEG-PLGA 또는 PLGA로 이루어지는 군에서 선택될 수 있는 중합체를 포함하는 것이 바람직하다.

스캐폴드는 다공성 막(porous membrane), 다공성 시트(sheet), 삽입물(implant), 섬유(fibre), 3차원형, 예컨대, 버섯형, 거품, 튜브, 직조된(woven) 또는 비직조된(non woven) 시트, 로드(rod) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 형태와 같은 다양한 상이한 형태일 수 있다.

적절하게는, 스캐폴드는 임의의 종류 및 크기뿐만 아니라 예컨대 얇은 막 내지 수 밀리미터의 두꺼운 스캐폴드까지의 범위의 임의의 두께의 스캐폴드일 수 있다. 일 구체예에서, 액상 스캐폴드 매트릭스, 즉 세포의 첨가 전이 아니라, 결손이 있는 그 자리에(in situ) 위치될 때 고체 스캐폴드를 형성하는 세포가 없는(cell free) 또는 필수적으로 세포가 없는 스캐폴드를 사용할 수 있다는 것 또한 고려된다. 그러나, 스캐폴드가 결손에 첨가되기 전에 고체인 것이 바람직하다.

스캐폴드, 또는 제1 성분은 본 발명의 방법에서 사용되기 전에 세포가 없는, 또는 필수적으로 세포가 없는 것이 바람직하다.

본 발명과 관련하여 사용되는 필수적인(required) 종류의 스캐폴드는 포유류 (인간을 포함함) 내의 외래 물질(foreign bodies)로서 행동하지 않는 스캐폴드이어서 면역(immunity)이 없거나 또는 최소한의 면역이 관찰될 수 있고, 본 발명과 관련하여 사용되는 스캐폴드는 그것이 위치되는 생물에 대하여 독성(toxic)이 없거나 유의미한 유해성이 없을 것이다. 스캐폴드는 어떠한 미생물 세포 또는 어떠한 유해한 감염물(contaminants)도 함유하지 않는 것이 바람직하다. 스캐폴드에 사용되는 세포 (예컨대 히드로겔 내에 있는(embedded) 인간 세포)는 상기 스캐폴드가 그의 표적 영역에 위치한 후에 스캐폴드 위로 위치될 수 있을 것이다. 스캐폴드는 바람직하게는 친수성이어서, 세포 물질(cell material)이 상대적으로 빨리 스캐폴드 내로 흡수되어야 한다. 그러나, 몇몇 경우, 스캐폴드는 세포 및 히드로겔로의 주입(injection)에 의하여 접근될 수 있다. 세포는 독성이 없거나 또는 단지 최소한의 독성인 또는 유의미한 독성이 없는 스캐폴드에 대한 내성이 있어야 하고(tolerate), 그렇지 않으면 유해한 결과를 이끌 수 있다.

바람직한 구체예에서, 스캐폴드는 시트의 형태이고, 손상에 적합하게 미리 잘려지거나 적합한 크기일 수 있다. 그러한 스캐폴드는 예컨대 0.2 mm 내지 6 mm 두께일 수 있다.

매우 바람직한 구체예에서, 스캐폴드는 친수성, 즉 적어도 소량의 물 또는 수용액 (예컨대 세포 현탁 조성물, 예컨대 히드로겔 용액)을 흡수하는, 예를 들어, 수용액 (예컨대 생리학적 배지, 버퍼 또는 물) 중에 위치될 때, 물 (또는 등가의 수용액) 중의 스캐폴드 부피가, 예컨대, 적어도 1%, 예컨대 적어도 2%, 예컨대 적어도 5%, 예컨대 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예컨대 적어도 50%로 흡수하는 능력을 가진다. 상기 스캐폴드가 그의 다공성 구조 내로 전술한 양의 세포 현탁액을 흡수할 수 있고 그에 따라 결손 자리로 삽입되고 고정된 스캐폴드 전체에 걸쳐 상대적으로 동질의 세포 분포를 제공하는 것이 특히 유리하다.

친수성이라는 용어는 '극성(polar)'이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.

비극성 스캐폴드가 사용되는 경우, 스캐폴드는 세포의 갱신(update)를 촉진하는 제제, 예컨대 습윤제(wetting agent)로 전처리되는 것이 바람직하다. 습윤제는 또한 친수성 스캐폴드와 함께 사용되어 그 다공성 구조 속으로의 세포 침투를 더욱 향상시킬 수 있다.

본 발명의 생체적합성 스캐폴드는 폴리에스테르를 포함하거나 그로 구성될 수 있다. 중합체 중의 친수성 블록(block)의 혼입에 의하여, 그것이 그 물질의 습윤 특성을 개선시키는 것처럼 그 중합체의 생체적합성이 향상될 수 있고, 비극성 물질 상에서 최초 세포 접착(adhesion)이 약화된다.

바람직한 구체예에서, 스캐폴드는 생물분해성(biodegradable), 즉 포유류의 체내에서 시간에 걸쳐 (예컨대, 1∼6 개월) 분해되는 것이다.

스캐폴드가 다공성(porous)인 것, 예컨대 적어도 25%, 50%, 예컨대 50∼99.5%의 범위의 다공도(porosity)를 가지는 것이 매우 바람직하다. 다공도는, 예컨대 고체 스캐폴드의 부피와 구멍의 부피를 비교하는 것과 같은, 당해 기술 분야에 알려진 임의의 방법에 의하여 측정될 수 있다. 이것은 스캐폴드의 밀도를 스캐폴드로서 동일한 조성의 비다공성 시료와 비교하여 측정함으로써 수행될 수 있다. 그 대신에, 수은 압입 다공도측정법(Mercury Intrusion Porosimetry)이 사용될 수 있다.

본 발명의 매우 흥미있는 구체예에서, 본 발명에 따른 생체적합성 스캐폴드는, 폴리(L-락트산) (PLLA), 폴리(D/L-락트산) (PDLLA), 폴리(카프로락톤) (PCL) 및 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA) 및 이들의 유도체, 특히, 그 중합체의 친수 특성을 향상시키키는 치환기 또는 조성의 첨가를 가지는 각각의 중합체 골격을 포함하는 유도체 (예컨대, MPEG 또는 PEG)를 포함하는 군에서 선택되는 중합체 중의 1종 이상으로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 그 예들이 본 명세서에서 제공되고, 중합체들의 매우 바람직한 군, MPEG-PLGA를 포함한다.

제1 성분과 관련하여 사용될 때, "필수적으로 세포가 없는(essentially cell free)"이라는 용어는 스캐폴드가 본 발명에 따른 방법에서 사용되기 전에 살아있는 포유류 세포를 포함하지 않는 것을 의미한다. 일 구체예에서, "필수적으로 세포가 없는"이라는 용어는 "세포가 없는(cell free)"과 동일하고, 그 스캐폴드가 멸균되고(sterile), 환자에게 도입되면 생존 및/또는 복제할 수 있는 살아있는 미생물 또는 포유류 세포를 포함하지 않는 것, 특히 살아있는 세포는 어떠한 것도 없는 것을 의미한다.

일 구체예에서, 스캐폴드는 합성 중합체로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.

"결손( defect )"

본 명세서에서 사용되는 "결손"이라는 용어는 현재 또는 미래의 기능의 상실(loss of function) 또는 기능 장애(hindered function), 결함(disablility), 불편(discomfort) 또는 고통(pain)과 관련된 조직의 유해한 또는 손상된 상태를 의미한다. 결손은 바람직하게는 정상 조직의 소실(loss), 예컨대 정상조직의 현저한(pronounced) 소실과 관련된다. 본 발명의 방법이 예방적으로, 즉 결손의 발생의 예방 또는 존재하는 결손의 악화의 예방을 위하여 사용될 수 있다는 것이 예견된다. 결손은, 예컨대 조직에서의 강(cavity), 조직에서의 열상(tear) 또는 창상(wound), 조직 밀도의 손실, 비정상 세포 형태의 발생 또는 건강하지 않거나 손상된 조직의 외과적 제거에 의하여 기인하는 것 등일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결손은 손상된 관절 연골, 뼈까지 내려간 및/또는 뼈를 포함하는 관절 연골 결손 (골관절염, osteoarthritis), 연골 및 뼈 결손의 조합, 정상 연골 또는 뼈에 의하여 둘러싸인 뼈의 결손, 또는 뼈 구조 자체의 결손 또는 SCAS 시스템에서와 같이 스캐폴드와 함께 뼈 세포의 첨가에 의한 강화가 필요한 뼈 구조 중의 하나일 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 결손은 연골, 예컨대 관절 연골에 있거나 피부 결손이다.

"조직( tissue )"

본 명세서에서 사용되는 "조직"이라는 용어는 살아있는 포유류 개체 (예컨대, 인간)의 일부인 고형의(solid) 살아있는 조직을 의미한다. 조직은 연질(soft) 조직 (예컨대, 내부 기관 및 피부) 또는 경질(hard) 조직 (예컨대, 뼈, 관절 및 연골)일 수 있다. 조직은 연골, 예컨대, 관절 연골, 뼈, 피부, 치아, 인대 및 힘줄 또는 기타의 임의의 중배엽성(mesenchymal) 조직으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

"세포"

"살아있는 포유류 세포"라는 용어 (본 명세서에서 "포유류 세포" 또는 "세포"로서 언급될 수도 있음)는 본 발명에 따른 방법에서의 사용 전에 시험관 내에서, 바람직하게는 적합한 배양 배지 내에서 유지되고 배양된 포유류 조직으로부터 얻어진 세포로부터 얻어지거나 그 세포에서 유래된 세포를 말한다. 바람직한 구체예에서, "살아있는 포유류 세포"라는 용어는 연골세포, 연골모세포, 골세포 및 골모세포, 치주세포, 또는 피부 유래 세포 및/또는 이들의 조합을 말한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 살아있는 그 포유류 개체로부터 얻어지거나 또는 그로부터 유래되는데, 즉 자가유래(autologous)이다. 세포는 또한 동종유래(homologous), 즉 그들이 사용되는 조직과 적합(compatible)할 수 있거나, 또는 다능(multipotent) 또는 다능성(pluripotent) 줄기 세포로부터 유래될 수 있다 (예컨대, 동종(allogenic) 세포의 형태임). 일 구체예에서, 세포는 또 다른 유사한 개체로부터의 동종성이거나, 또는 이종성, 즉 처리될 생물과 다른 생물로부터 유래된 것일 수 있다. 동종 세포는 분화된 세포, 기원세포(progenitor cells), 또는 다능 세포 (예컨대, 배아 또는 배아 및 성체 전문 세포 또는 세포들의 조합, 다능성 줄기세포 (제대혈, 성체 줄기세포 등으로부터 유래됨) 등)로부터 생긴 세포, 다른 세포 또는 유전자 구조물로부터의 유전자의 교환, 삽입 또는 부가에 의하여 또는 배아 줄기세포 또는 다능 줄기 세포, 예컨대 제대혈 유래의 줄기 세포로의 분화된 세포의 핵의 전달의 이용에 의하여 조작된 세포일 수 있다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 처리된 포유류 개체와 동일한 종으로부터 얻어질 수 있는 줄기 세포 및 줄기 세포로부터 유래한 세포 (예컨대 인간 줄기 세포 또는 그로부터 유래된 세포)의 용도를 또한 포함한다.

바람직한 구체예에서, 특히, 연골, 뼈 및/또는 피부의 복구(repair)에 있어서, 상기 세포는 중배엽성 세포, 연골발생성(chondrogenic) 세포 또는 피부로부터 유래된 세포이다.

고정제/고정제 전구체( Fixative / Fixative precursor )

본 발명에서 사용되는 고정제 전구체는, 다공성 스캐폴드에 의하여 흡수되는 것이 가능하고, 고정제로 전환될 때, 스캐폴드를 결손에 및 세포를 스캐폴드에, 및 필요에 따라 세포를 결손에 고정시키는(anchoring) 것이 가능한 겔형성제(gelation agents)을 포함하는 생체적합성 아교(glue) 또는 접착제의 임의의 형태일 수 있다.

WO 2004/110512에서는 '지지 물질(support materials)'로서 지칭되는 몇몇 고정제 전구체 - 즉, 결손에 적용시킴에 따라 응집(coagulating) 또는 고화(solidifying)가 가능한 물질을 제공한다.

적합한 고정제 전구체는 피브리노겐, 젤라틴, 콜라겐, 콜라겐 펩티드 (I형, II형 및 III형)로 구성되는 군에서 선택되는 단백질과 같은 단백질일 수 있다.

고정제 전구체는 아가로스 또는 알지네이즈와 같은 다당류일 수 있다.

적절하게는, 고정제는 생체적합성 의료용 접착제(medical adhesive)이다.

고정제 전구체가 생체적합성이고, 예컨대 인간으로부터 얻어지거나, 재조합적으로 발현된 인간 단백질인 것이 바람직하다. 인간 피브리노겐은 예컨대 트롬빈에 노출되는 경우 중합하는 바람직한 고정제 전구체이다

바람직한 고정제는 피브린이다.

고정제 전구체는 고정제로 적절하게 전환될 때 스캐폴드 주위 및 전체에 겔 구조를 형성시키고, 그에 따라 스캐폴드 및 세포를 고정시키는 겔형성제일 수 있다.

본 명세서에 참조 통합되는 WO2004/110512에서 고정제 전구체 및 전환제(conversion agents)의 적합한 조합의 구체적인 예가 제공된다. 적절하게는, 고정제 전구체 대 전환제의 비율이 고정이 일어나는 속도 및 고정된 조성물이 세포에 제공하는 지지의 수준 양쪽을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 고정제 전구체의 고정제로의 전환은 전환제의 사용을 통하여 일어난다. 스캐폴드가 결손의 제자리에(in situ) 있는 경우 전환제의 첨가가 일어나는 것이 바람직하다. 스캐폴드에 제2 성분의 첨가 바로 전, 동시 또는 바로 후에, 제2 성분에 전환제의 첨가가 일어나는 것이 바람직하다 - 즉, 고정제 전구체의 고정제 (예컨대, 겔/히드로겔 또는 고체)로의 전환에 있어서 전환제의 효과는 스캐폴드 및 세포가 결손 자리의 원위치에 있고, 일반적으로 그 세포가 스캐폴드틀 전체에 분포된 경우에 일어난다.

일 구체예에서, 예컨대 고정제 전구체가 피브리노겐인 경우, 전환제는 트롬빈 또는 트롬빈 유사체이다. 인자 XIII, 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘 이온이 전환을 촉진시키기 위하여 전환제 또는 제1 또는 제2 성분에 첨가될 수 있다. 특정 구체예에서, 중합이 되도록 하는 피브리노겐에 대한 트롬빈 절단 효과를 촉진시킬 수 있는 이온 또는 염, 예컨대, 나트륨, 칼슘, 마그네슘 등이 첨가될 수 있다. 생물학적으로 적합한 형태가 사용되는 것이 바람직하기는 하지만, 어떠한 출처의 트롬빈이라도 사용될 수 있고, 예컨대 재조합 트롬빈이 인간 조직 결손의 치료에 사용될 수 있다. 그 대신, 예컨대 소(bovine) 트롬빈 (그러나 소 트롬빈은 예컨대 인간에게서 면역 반응을 유발시킬 수 있다)과 같은 다른 출처의 트롬빈이 사용될 수 있다.

제1 및 제2 성분이 결손 위치의 제자리(in situ)에 있는 경우, 그 성분들은 고정제 전구체(들)의 고정제로의 전환에 의하여 그 위치에서 고정된다. 비록, 일부 구체예에서 전환제를 필요로 하지 않는 것이 예상되지만, 전환제가 스캐폴드 및 세포 양쪽의 균일성과 효과적인 고정을 보장하는 잘 제어될 수 있고 편리한 방법을 제공한다는 것이 인식된다.

전환제 트롬빈은 스캐폴드 속으로 혼입될 수 있고, 히드로겔이 스캐폴드에 피브리노겐/세포 현탁액을 첨가할 때 형성될 것이다.

고정은, 세포 이동 및 성장을 위한 적합한 배지를 통과시키는 반면, 스캐폴드 속으로 세포를 가두고, 그 스캐폴드를 결손 속으로 가두는 겔 (즉, 젤라틴), 예컨대 히드로겔을 형성하는 형태를 취할 수 있고, 그에 따라 스캐폴드를 통한 새로운 조직의 성장을 촉진하고, 결손을 복구할 수 있다.

세포의 준비( preparation of the cells )

본 명세서에 참조 통합되는 WO02/061052에서는 본 발명에서의 사용을 위한 세포를 준비하기 위한 적합한 방법이 제공된다.

사용에 앞서, 살아있는 포유류 세포를 성장 호르몬, 성장인자, 접착촉진제(adhesion-promoting agents) 및/또는 생리학적으로 허용되는 이온 (예컨대, 칼슘 및/또는 마그네슘 이온)을 필요에 따라 포함할 수 있는 배양 배지를 가진 적합한 현탁액 중에 일반적으로 위치시킨다 (WO 2004/110512 참조). 세포 현탁액이 유의미한 수준의 혈청을 포함하지 않는 것이, 즉, 필수적으로 혈청이 없는, 예컨대 자가성 또는 동종성 혈청이 없는 것이, 특히 혈청이 결손 자리의 제자리에서 고정제의 형성을 방해할 수 있는 성분을 함유하는 경우 매우 바람직하다. 피브리노겐을 포함하는 제1 성분에 첨가되는 경우, 결손 자리에 위치하기 전에 고정제의 형성을 촉진시킬 수 있는 트롬빈을 포함하는 혈청의 사용이 한가지 예이다. 따라서, 일 구체예에서, 소량의 혈청 또는 불활성 안정화 혈청 단백질(inert stabilizing serum proteins)의 첨가가, 이들이 본 발명에 따른 방법을 방해하지 않는 경우, 허용될 수 있다.

사용 전에 세포 현탁액이 배지 단독과 함께 유지될 수 있고, 그 후에 고정제 전구체와 혼합되어 제2 성분을 형성할 수 있다. 일 구체예에서, 세포 현탁액은, 고정제 전구체의 스캐폴드에 대한 적용 전에, 적용과 동시에 또는 적용 바로 후에, 고정제 전구체와 혼합될 수 있다 - 즉, 제2 성분이 제자리에서 형성될 수 있다. 그러나, 포유류 세포 및 고정제 전구체 양쪽을 모두 포함하는 제2 성분이 결손 위치 및/또는 상기 제1 성분에 대한 적용 전에 결합되는 것이 바람직하다.

부분들의 키트( Kit of Parts )

도 12∼15에서 본 발명의 적합한 키트, 본 발명의 방법에서의 이들의 사용 (도 12) 및 나타낸 장치의 일부를 형성하는 커넥터 장치의 도해가 제공된다.

본 발명에 따른 키트에서, 포유류 세포를 포함하는 제2 성분은 고정제 전구체와 함께 용기 내 (예컨대, 전달 장치의 1개의 챔버(chamber))에 적절하게 위치된다. 그러나, 고정제 전구체는 동일하거나 또는 제2 용기 (예컨대 챔버 또는 전달 장치)와 기능적으로 관련된 분리된 챔버 (즉, 상기 제1 챔버에 기능적으로 연결되어 제2 성분의 결손 자리에 대한 적용 바로 전 또는 적용 도중에 제2 성분의 형성을 가능하게 하는 것)에 존재할 수 있다는 것이 또한 예견된다. 그러나, 세포 및 고정제 전구체는 본 발명의 방법에 앞서 일체화된 제2 성분으로서 결합되는 것이 바람직하다.

고정제 전구체가 챔버 그 자체 내에서 고정제를 형성 (예컨대, 겔 형성 및 세포의 응김)하지 않고, 결손 자리에서 스캐폴드 속으로 위치된 후에만 형성한다는 것이 중요하다. 따라서, 전환제가 사용될 때, 전환제는 결손 자리에서 제2 성분이 스캐폴드에 적용되기 바로 전, 적용 도중 또는 적용 후까지, 제2 전환제에 첨가되지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 키트는, 결손 자리에서 제2 성분이 스캐폴드에 적용되기 바로 전 또는 적용 도중에, 상기 제1 챔버 (필요에 따라 상기 제2 챔버)에 기능적으로 연결되어, 상기 제2 성분 및 상기 전환제의 혼합물의 형성을 가능하게 할 수 있는, 상기 전환제를 포함하는 추가적인 용기를 포함할 수 있다. 전환제가 상기 제1 및 제2 성분의 결손 자리에 대한 동시 적용에 이어서 적용될 수 있다는 것이 또한 예견된다 (그러나 이것은 일부 경우에 있어서 동일하지 않은(un-uniform) 고정일 이끌어 더 낮은 수준의 결과를 가져올 수 있다).

일 구체예에서, 본 발명의 키트는 제1 성분 (스캐폴드)과, 2중(twin) 또는 3중(triple) 챔버를 가진 운반 장치 (예컨대, 주사기)를 포함하고, 여기서 상기 챔버는 적용 도중에 2/3개 챔버의 함유물의 혼합이 가능하도록 기능적으로 연결된다. 제2 성분 (세포 및 고정제 전구체를 포함함)은 1개의 챔버 내에 또는 세포 현탁액 중에 존재하고, 고정제 전구체는 2개의 분리된 챔버 내에 존재하며, 전환제는 제3 챔버 내에 존재한다. 상기 챔버들은 예컨대 1개의 단일 연결에 대한 "Y" 연결을 통하여 기능적으로 연결될 수 있어서, 예컨대 주사기의 경우, 주사기 플런저에 압력을 가함으로써 (예컨대 플런저 말단에서 함께 융합됨으로써 구조적으로 또는 기능적으로 또한 관련될 수 있다), 챔버의 함유물이 방출되는 경우, 제1 성분 및 전환제가 결합된다. 적절하게는, 2/3개 챔버의 함유물의 혼합의 작용은 결손 자리에서 제1 성분/전환제 혼합물의 스캐폴더 위로의 동시 적용을 가져온다 - 일례로서 결손 자리에서 스캐폴드로 주사 바늘 도는 카테터를 통하여 통과될 때, 제1 성분/전환제 혼합물이 형성된다.

전환제가 제1 성분 중에 포함되는 구체예에서, 적용 전에 전환제와 제2 성분을 혼합하는 것은 불필요하다 (비록 그것이 이러한 구체예와 필요에 따라 결합될 수도 있지만). 그러나, 일반적으로, 이러한 구체예와 관련된 키트는 제1 성분 (스캐폴드) 및 용기, 예컨대 상기 제2 성분을 함유하는 운반 장치를 포함한다. 그러나, 전술한 바와 같이, 제2 성분은 하나는 세포 (현탁액)를 함유하고, 나머지 하나는 고정제 전구체 (용액)을 함유하는 2개의 분리된 챔버에 의하여 형성될 수 있다.

스캐폴드에 제조에서 사용되는 바람직한 중합체

덴마크 출원 PA200600337은 본 발명에서 스캐폴드로서의 사용을 위한 그러한 바람직한 중합체의 제조 방법을 개시하고 있다. 덴마크 출원 PA200600337에서 이미 개시된바 있는 그러함 중합체의 제조 방법을 포함하는 스캐폴드의 제조에서의 사용을 위한 바람직한 중합체와 관한 것을 아래에 개시한다.

본 발명의 방법에서의 사용을 위한 바람직한 생물분해성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 잔기 및 1 또는 2개의 폴리(락트산-코-글리콜산) 잔기(들)로 구성된다.

따라서, 본 발명의 방법에서의 사용을 위한 한 가지 측면에서, 스캐폴드는 다음의 일반식의 중합체로부터 제조되거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다:

A-O-(CHR¹CHR²O)_n-B

식 중,

A는 분자량이 4000 g/mol 이상이고, 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기 중의 (i) 락티드 유닛과 (ii) 글리콜리드 유닛의 몰 비가 80:20 내지 10:90의 범위, 특히 70:30 내지 10:90의 범위인 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기이고,

B는 A에서 정의된 것과 같은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기이거나, 수소, C_1-6-알킬 및 히드록시 보호기로 구성되는 군에서 선택되는 것이며,

각각의 -(CHR¹CHR²O)- 유닛 내의 R¹ 및 R² 중 하나는 수소 및 메틸 중에서 선택되고, 동일한 -(CHR¹CHR²O)- 유닛 내의 R¹ 및 R² 중의 나머지 하나는 수소이고,

n은 중합체 사슬 내의 -(CHR¹CHR²O)- 유닛의 평균 개수로서, 10∼1000의 범위, 특히 16∼250의 범위의 정수이며,

(iii) 폴리알킬렌 글리콜 유닛 -(CHR¹CHR²O)-의 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들) 중의 (i) 락티드 유닛 및 (ii) 글리콜리드 유닛에 대한 몰 비는 최대 20:80이고,

상기 공중합체의 분자량은 10,000 g/mol 이상, 바람직하게는 15,000 g/mol 이상, 또는 심지어 20,000 g/mol 이상이다.

따라서, 본 발명의 방법에서 사용을 위한 중합체는 2 블록형(diblock-type) 또는 3 블록형(triblock-type)일 수 있다.

상기 중합체의 다공도는 바람직하게는 50% 이상, 예컨대 50∼99.5%의 범위이다.

본 발명의 방법에서의 사용을 위한 중합체가 1개 또는 2개의 잔기 A, 즉 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들)를 포함하는 것이 이해될 것이다. 그러한 잔기는 분자량이 4000 g/mol이상, 특히 5000 g/mol 이상 또는 심지어 8000 g/mol 이상이어야 한다는 것이 발견된다.

그 중합체의 폴리(락티드-코-글리콜리드)는 생리학적 조건하에서 (예컨대, 체액(bodily fluid) 중에서 및 조직 중에서) 분해될 수 있다. 그러나, 이들 잔기의 분자량 (및 본 명세서에 열거된 나머지 요건) 때문에, 그 분해는 충분히 느릴 것이고, 그에 따라 그 중합체로부터 만들어진 물질(materials) 및 물건(objects)이 중합체가 완전히 분해되기 전에 그들의 목적을 완수할 수 있을 것으로 믿어진다.

"폴리(락티드-코-글리콜리드)"라는 표현은, 예컨대 폴리(랜덤-락티드-코-글리콜리드), 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드), 폴리(메소락티드-코-글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드)와 같은 다수의 중합체 변이체를 포함하며, PLGA 중의 락티드/글리콜리드의 서열은 랜덤(random), 첨형(tapered) 또는 블록형(as blocks)일 수 있고, 락티드는 L-락티드, DL-락티드 또는 D-락티드일 수 있다.

바람직하게는, 상기 폴리(락티드-코-글리콜리드)는 폴리(랜덤-락티드-코-글리콜리드) 또는 폴리(첨형-락티드-코-글리콜리드)이다.

또 다른 중요한 특징은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들) 내의 (i) 락티드 유닛과 (ii) 글리콜리드 유닛의 몰 비(molar ratio)가 80:20 내지 10:90, 특히 70:30 내지 10:90의 범위이어야 한다는 사실이다.

폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들) 내의 (i) 락티드 유닛과 (ii) 글리콜리드 유닛의 몰 비가 70:20 또는 그 미만인 중합체에 대해서 최상의 결과가 얻어진다는 것이 일반적으로 관찰되었지만, (iii) 폴리알킬렌 글리콜 유닛 -(CHR¹CHR²O)-의 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들) 내의 (i) 락티드 유닛과 (ii) 글리콜리드 유닛의 합친 양에 대한 몰 비가 8:92 이하인 한, 각각 몰 비가 80:20 이하인 중합체의 경우에도 상당히 좋은 결과가 또한 관찰되었다.

전술한 바와 같이, B는 A에서 정의된 것과 같은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기이거나, 수소, C₁ _-6-알킬 및 히드록시 보호기로 구성되는 군에서 선택되는 것이다.

일 구체예에서, B는 A에서 정의된 것과 같은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기이고, 즉, 그 중합체는 3블록형(triblock-type)이다.

또 다른 구체예에서, B는 수소, C₁ _-6-알킬 및 히드록시 보호기로 구성되는 군에서 선택되는 것이고, 즉, 그 중합체는 2블록형(diblock-type)이다.

(이들 구체예 내에서) 가장 일반적으로는, B는 C₁ _-6-알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸, tert-부틸, 1-펜틸 등이고, 가장 바람직하게는 메틸이다. B가 수소인 경우 (즉, 말단 OH기에 상응함), 그 중합체는 B로서 히드록시 보호기를 사용하여 일반적으로 제조된다. "히드록시 보호기(hydroxy protecting groups)"는 예컨대 수소화분해, 가수분해 또는 기타의 적합한 수단에 의하여 중합체의 분해 없이 중합체의 합성 후에 제거되어, 자유(free) 히드록실기를 PEG-부분(PEG-part)에 남겨둘 수 있는 기(group)이다 (예컨대, 그린, T.W.(Greene, T.W.) 및 우츠, P.G.M.(Wuts, P.G.M.)의 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis, third or later editions]과 같은 당해 분야의 기술 수준의 절차를 기재한 문헌을 참조). 이들 중의 특히 유용한 예로는 벤질, 테트라히드로피라닐, 메톡시메틸 및 벤질옥시카르보닐이 있다. 그러한 히드록시 보호기는 B가 수소인 중합체를 얻기 위하여 제거될 수 있다.

각각의 -(CHR¹CHR²O)- 유닛 내의 R¹ 및 R² 중 하나는 수소 및 메틸 중에서 선택되고, 동일한 -(CHR¹CHR²O)- 유닛 내의 R¹ 및 R² 중의 나머지 하나는 수소이다. 따라서, -(CHR¹CHR²O)- 잔기는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜) 중 하나 일 수 있다. 바람직하게는, -(CHR¹CHR²O)- 잔기는 폴리에틸렌 글리콜, 즉, 각 유닛 내의 R¹ 및 R² 양쪽 모두가 수소이다.

n은 중합체 사슬 내의 -(CHR¹CHR²O)- 유닛의 평균 개수로서, 10∼1000의 범위, 특히 16∼250의 범위의 정수이다. n이 중합체 분자의 풀(pool) 내의 -(CHR¹CHR²O)- 유닛의 평균을 나타낸다는 것이 이해될 것이다. 이것은 당해 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 폴리알킬렌 글리콜 잔기 (-(CHR¹CHR²O)_n-)의 분자량은 일반적으로 750∼10,000 g/mol, 예컨대 750∼5,000 g/mol의 범위이다.

-(CHR¹CHR²O)_n- 잔기는 (반면, 생체 내에서, 예컨대 인간 신체로부터 분비될 수 있는 것에 의한) 생리학적 조건하에서 일반적으로 분해되지 않는다.

(iii) 폴리알킬렌 글리콜 유닛 -(CHR¹CHR²O)-의 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들) 내의 (i) 락티드 유닛과 (ii) 글리콜리드 유닛의 합친 양에 대한 몰 비가 또한 특정 역할을 하고, 20:80 이하이어야 한다. 더욱 일반적으로, 그 비율은 18:82 이하, 예컨대 16:84 이하, 바람직하게는 14:86 이하 또는 12:88 이하, 특히 10:90 이하 또는 심지어 8:92 이하이다. 흔히, 그 비율은 0.5:99.5 내지 18:82의 범위, 예컨대 1:99 내지 16:84, 바람직하게는 1:99 내지 14:86 또는 1:99 내지 12:88, 특히 2:98 내지 10:90 또는 심지어 2:98 내지 8:92의 범위이다.

공중합체의 분자량은 그것이 10,000 g/mol 이상인 한 특별히 관련되지 않는다고 믿어진다. 그러나, 바람직하게는 분자량이 15,000 g/mol 이상이다. "분자량"은 중합체의 수평균 분자량으로서 추론될 수 있는데, 이는 숙련자라면 중합체 분자들의 풀(pool) 내의 중합체 분자의 분자량이 평균값 주위에 분포된 값에 의하여 표현될 것 (예컨대, 정규 분포에 의하여 표현되는 것)이라는 점을 이해할 것이기 때문이다. 더욱 일반적으로, 분자량은 10,000∼1,000,000 g/mol, 예컨대 15,000∼250,000 g/mol 또는 20,000∼200,000 g/mol의 범위이다. 특히 주목되는 중합체는 분자량이 20,000 g/mol 이상, 예컨대 30,000 g/mol 이상인 것으로 나타났다.

중합체의 구조는 다음과 같이 나타낼 수 있다 (식 중, R은 수소, C₁ _-6-알킬 및 히드록시 보호기 중에서 선택되는 것이고; n은 전술한 바와 같으며; m, p 및 ran은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들)에 대한 전술한 조건이 만족되도록 선택되는 것이다):

2블록형 중합체

3블록형 중합체

전술한 중합체 구조 (I) 및 (II) 각각에 있어서, p 및 m에 의하여 표현되는 락티드 및 글리콜리드 유닛이 출발 물질 및 반응 조건에 따라서 랜덤하게 분포될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

또한, 락티드 유닛은 D/L 또는 L 또는 D, 일반적으로 D/L 또는 L일 수 있다는 것이 이해된다.

전술한 바와 같이, 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기(들), 즉 폴리에스테르 잔기(들)은 생리학적 환경에서 가수분해적으로 분해되고, 폴리알킬렌 글리콜 잔기가 예컨대 표유동물 신체로부터 분비된다.

생물분해성은 실시예 부분에 개괄된 바와 같이 평가될 수 있다.

중합체의 제조 (덴마크 출원 PA200600337 에 이미 개시되어 있음).

중합체는 당해 기술분야의 숙련자에게 알려져 있는 원리에 따라 원칙적으로 제조될 수 있다.

원칙적으로, B가 잔기 A가 아닌 중합체 (2블록형 중합체)는 다음과 같이 제조될 수 있다:

원칙적으로, B가 잔기 A인 중합체 (3블록형 중합체)는 다음과 같이 제조될 수 있다.

특별한 조건이 적용되지 않으면, 락티드 유닛 및 글리콜리드 유닛의 분포는 각각의 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기 내에서 무작위적으로 분포되거나 점감(漸減, tapered)될 것이다.

바람직하게는, 스캐폴드에서 사용되는 중합체 내에 존재하는 글리콜리드 유닛 및 락티드 유닛의 비율은 약 80:20의 상한 내지 약 10:90의 하한 사이이고, 더욱 바람직하게는 약 60:40 내지 40:60의 범위이다.

바람직하게는, PEG-함량(PEG-content)의 상한은 최대 약 20 몰%, 예컨대 최대 약 15 몰%, 예컨대 1∼15 몰%, 바람직하게는 4∼9 몰%, 예컨대 약 6 몰%이다.

본 발명에 따른 중합체의 합성은 실시예 부분에서 더욱 상세히 설명된다.

스캐폴드의 추가적인 측면 (덴마크 출원 PA200600337에 개시된 바와 같음, 그러나 이는 다른 스캐폴드에도 또한 적용될 수 있음)

예컨대, 스캐폴드는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 중합체를 포함하고 그 다공도가 50% 이상, 예컨대 50∼99%의 범위인 생물분해성, 다공성 물질일 수 있다. 동결 건조에 의하여 높은 수준의 다공도가 얻어질 수 있다.

중합체 물질의 빈 공간은 채워져 있지 않을 수 있어서 그 결과 조직의 재생을 위한 세포 부착 및/또는 내부 성장(in-growth)을 가능하게 하거나 촉진할 수 있다. 그러나, 일 구체예에서, 그 물질의 구멍은 세포외 매트릭스로부터의 성분에 의하여 적어도 부분적으로 채워진다. 그러한 성분들은 조직의 재생을 위한 새포 부착 및/또는 내부 성장을 촉진시킬 수 있다. 세포외 기질로부터의 성분의 예로는 콘드로이틴 설페이트, 히알루로난, 히알루론산, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 더마탄 설페이트, 성장인자, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐, 젤라틴 및 아그레칸이 있다.

또한, 스캐폴드는 전환 성분 트롬빈을 단독으로 또는 전술한 것들 중 하나와 조합으로 함유할 수 있다.

세포외 기질로부터의 성분들은 불균질하게 분산된 입자로서 또는 표면 코팅(surface coating)으로서 첨가될 수 있다. 합성 중합체에 대한 세포외 매트릭스로부터의 성분의 농도는 일반적으로 0.5∼15% (w/w), 바람직하게는 10% (w/w) 미만이다. 더욱이, 세포외 매트릭스의 성분의 농도는 그 물질의 부피에 대하여 바람직하게는 최대 0.3% (w/v), 예컨대 최대 0.2% (w/v)이다.

다공성 물질은, 예컨대 문헌 [Antonios G. Mikos, Amy J. Thorsen, Lisa A Cherwonka, Yuan Bao & Robert Langer. Preparation and characterization of poly(L-lactide) foams foams. Polymer 35, 1068-1077 (1994)]에 개시된 바와 같은 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러나, 다공성 물질의 제조를 위한 매우 유용한 한가지 기술은 동결 건조이다.

일 구체예에서, 스캐폴드는 덴마크 출원 PA200600337에 이미 개시되어 있는 다음의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 그 방법은 PLGA 및 MPEG-PLGA 중합체로부터 스캐폴드를 제조하는데 특히 적합하다.

(a) 본 명세서에서 정의된 것과 같은 중합체를 비수성(non-aqueous) 용매 중에서 용해시켜 중합체 용액을 얻는 단계;

(b) 단계 (a)에서 얻어진 용액을 냉동시켜 동결된 중합체 용액을 얻는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 얻어진 동결된 중합체 용액을 동결 건조시켜 생물분해성, 다공성 물질을 얻는 단계.

상기 방법에서 사용된 비수성 용매는 용융점(melting point)과 관련하여 선택되어 적합하게 동결될 수 있어야 한다. 그 구체적인 예로 다이옥신 (mp. 12℃) 및 디메틸카르보네이트 (mp. 4℃)가 있다.

한 가지 변형으로서, 단계 (a) 후에 중합체 용액은 적절한 주형에 부어져 성형된다. 이러한 방식으로, 구체적인 적용을 위하여 특이적으로 고안되는 그 물질의 3차원적 형태를 얻는 것이 가능하다.

세포외 기질로부터의 성분의 입자는 그 용액 (분산)이 단계 (b)에서 설명한 바와 같이 동결되기 전에 단계 (a)에서 얻어진 용액 중에 분산될 수 있다.

세포외 기질로부터의 성분은 예컨대 적합한 용매 중에 용해될 수 있고, 그 후 단계 (a)에서 얻어진 용액에 첨가될 수 있다. 단계 (a)의 용매 (즉, 본 명세서에서 정의된 중합체를 위한 용매)와의 혼합에 의하여, 세포외 매트릭스로부터의 성분이 거의 대부분 침전되어 분산을 형성할 수 있을 것이다. 한 가지 측면에서, 단계 (c)에서 얻어진 생물분해성, 다공성 물질은 그 다음 단계에서, 글루코사미노글리칸 (예컨대, 히알루로난)의 용액 중에 넣어지고, 이어서 다시 동결 건조된다.

일부 또 다른 구체예에서, 상기 물질은, 필요에 따라 세포외 매트릭스로부터의 성분과 조합으로, 본 명세서에서 정의된 중합체로부터 제조된 섬유 또는 섬유상 구조의 형태로 존재한다. 섬유 또는 섬유상 물질은 당해 기술 분야에 알려진 기술, 예컨대 방사(spinning), 전기방사(electrospinning), 압출(extrusion) 등에 의하여 제조될 수 있다.

도 1은 조직학을 나타낸 것으로, (A)는 10μm 크라이오섹션(cryosection) 상에 톨루이딘 블루 스테이닝 결과, (B)는 10μm 크라이오섹션 상에 사프라닌(safranin O) 스테이닝 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 면역조직화학을 나타낸 것으로, (A)는 갈색으로 어두운 점으로 표시된 콜라겐 타입 II를 나타낸 것이고, (B)는 갈색으로 어두운 점으로 나타낸 애그리칸(aggrecan)을 나타낸 것이다.

도 3은 유전자 발현을 나타낸 것으로, SOX9 및 콜라겐 타입 II은 히드로겔-폴리그래프트 시스템 내에서 증가된 발현을 나타내고, 이것은 hACs를 우리 히드로겔 (SACS 원리) 에 적용할 때 측정되어왔다 (피브리노겐/트롬빈과 예컨대, 연골세포, 그외에 본 발명에 포함되는 다른 종류의 스캐폴드들과의, 조성물).

도 4는 스캐폴드를 12 웰 NUNC 트레이의 바닥에 위치하고, 세포/피브린을 3배(triplcate)로 5번 및 18번 표지된 줄에 스캐폴드에 첨가하였다. 마지막 두개(2) 의 3배(triplicate) 셋업(set-up)들은 인산 완충 식염수(PBS)를 오직 포함한다.

도 5는 연골 결손의 바닥에 연골세포/히드로겔을 적용한 것을 나타낸 것이다.

도 6은 MPEG-PLGA가 스캐폴드내에 위치된 것을 나타낸 것이다.

도 7은 거시(macroscopic) ICRS 점수를 나타낸 것이다. SCAS 시스템 (히스토그램 상에 PLGA) 점수는 세 개의 다른 군보다 훨씬 높은 점수를 나타낸다.

도 8은 결손부위를 처리하지않거나, 미세골절(microfracture)로 처리하는 경우, 조직 복구의 대표적인 조직학적 외형을 나타낸 것이다. 입증한 것처럼, 조직 복구가 거의 안되는 것으로 나타난다. 사프라닌 스테이닝 및 톨루이딘 블루 스테이닝을 나타낸 것이다.

도 9는 결손부위를 FIB50으로 처리하거나 또는 SCAS 시스템으로 처리하는 경우, 조직 복구의 대표적인 조직학적 외형을 나타낸 것이다. 입증한 것처럼, 높은 수준의 복구가 SCAS 시스템으로 처리한 경우에 나타난다 (SCAS 원리). 사프라닌 스테이닝 및 톨루이닝 스테이닝이 사용되었다.

도 10은 MPEG-PLGA/히드로겔 내에 위치한 뒤 2주후, 연골 외식편(explant)이 없는 연골세포의 이동을 나타낸 것이다.

도 11은 MPEG-PLGA/히드로겔 내에 위치한 뒤 4주후, 연골 외식편(explant)이 없는 연골세포의 이동을 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명의 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 조직 (T) 내 결손부위(D)의 개체가 먼저 확인되고 (1), 스캐폴드 (S)가 제조되고, 결손부위로 삽입되 며 (2), 동시에 세포 현탁액 및 고정제 전구체 (CF), 및 고정제 전구체의 고정제 (T)로의 전환을 위한 적절한 전환제를 결손부위에 인 시투(in situ) 스캐폴드로 적용이 수행되는 것을 나타낸 것이다.

도 13은 본 발명의 방법에서 이용되는 2 개의 적절한 키트의 예를 나타낸 것이다. 제1 키트 (1) 에서, 제1 성분 스캐폴드 (S)는 전환제 (T)에 포화되고 (즉, (ST)), 고정제 전구체 (F) 를 포함하는 세포 현탁액 (C) (즉, (CF))는 전달 수단 (X)과 연결되어 있는 분리된 용기(container)에 공급되어 조직 (T)내에 결손 부위 (D)에 공급된다. (CF) 요소는 두개의 분리된 용기에 저장될 수 있고, 전달 수단 (X)과 연결된 일반적인 연결/혼합 장치 (Y)에 의해 연결될 수도 있다 (이에 대한 예시는 나타나 있지 않음). 전달 장치에 압력 (P) 의 적용은 (CF) 를 전달장치를 통해 용기 밖으로 나오게 하고, 결손 부위에 스캐폴드로 직접 전달되게 한다. 제2 키트의 경우 (2), 제1 성분 스캐폴드 (S) 는 전환제 (T)에 포화되지 않지만, (T) 는 가해진 압력 (P)에 의해 (CF) 와 동시적으로 혼합되게 되고, 이것은 일반적인 연결/혼합 장치 (Y) 안에서, 그들 각각의 용기 밖으로 (CF) 와 (T) 가 나오게 하고, 전달 장치 (X) 를 통해 그 (CF) 및 (T)의 혼합물이 동시적으로, 조직 내 (T) 결손부위 (D)에 이전에 이식(implant)된 스캐폴드로 적용된다.

도 14는 본 발명에 따른 방법에서 이용되는 3 개의 적절한 키트의 예를 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 제1 성분 스캐폴드 (S) 는 전환제 (T), 세포 현탁액 (C) 및 고정제 전구체 (F)에 포화되어 있지 않고, 전환제 (X) 는 일반적인 전달 수단 (X) 에 연결된 분리된 용기에 공급되어 조직 (T) 내에 결손 부위에 공급된다. 전달 장치로의 압력의 적용 (P) 은, 일반적인 연결/혼합 장치 (Y)를 통해 각각의 용기 밖으로 나오게 되고, 그리고나서 (C), (F), (X)의 혼합물은 동시에 전달 장치 (X)를 통해, 조직 내 (T)의 결손 부위 (D)에 이식(implant)된 스캐폴드로 적용된다.

도 15는 본 발명에 따른 키트 내에 사용가능한 적절한 연결 장치의 예를 나타낸 것이다. (F) 는 연결 장치 및 고정제 전구체 소스/용기 사이에 결합을 나타낸 것이고, (C) 는 연결 장치 및 세포 현탁액 소스/용기 사이에 결합을 나타낸 것이고 ( (F) 와 (C) 는 단일 소스일 수 있다), (T) 는 연결 장치와 전환제 사이에 결합을 나타낸 것이다. (Y) 는 연결 장치 본체(body)를 나타낸 것이고, (X) 는 전달 장치와, 전달 장치 및 연결 장치 사이에 임의의 유연성있는 튜브를 나타낸 것이며, (M)은 (F, C 및 T)를 형성하기 위한 (F), (C) 및 (T) 요소의 혼합을 용이하게 하는 연결 장치 요소들의 임의적인 혼합을 나타낸 것이다.

실시예 1.

본 발명에 따른 히드로겔 중에 내포되어 있는(embedded) 인간 세포를 함유하는 친수성 스캐폴드를 다음의 방법으로 제조하였다.

MPEG-PLGA 스캐폴드 (아래에 참조로서 제공되는 덴마크 출원 PA2006 00337의 예에 따라 제조됨)를 멸균 메스(scalpel)로 직경 10 mm의 원형으로 잘랐다.

본 발명에서의 예에서 사용되는 트롬빈의 종과 관련하여, 소 트롬빈이 실시 예를 위한 "일반적(in general)" 트롬빈으로서 사용되었지만, 그 최종 겔형성은 인간 트롬빈과 동일할 것이다. 비록, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 소 트롬빈의 사용이 본 발명에 따른 조성물 또는 키트에서 회피되어야 하지만, 실시예에서 사용된 트롬빈은 그 트롬빈의 출처와 무관하게 겔형성 효과 트롬빈을 단지 예증하기 위한 것이다. 이러한 트롬빈을 0.1% BSA를 함유하는 멸균 H₂O 중에 그 트롬빈을 용해시켜 제조하였다.

본 발명의 실시예에서 사용된 피브리노겐의 종과 관련하여, 소 피브리노겐이 실시예를 위한 "일반적(in general)" 피브리노겐으로서 사용되었지만, 그 최종 겔형성은 인간 트롬빈과 동일할 것이다. 비록, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 소 피브리노겐의 사용이 본 발명에 따른 조성물 또는 키트에서 회피되어야 하지만, 실시예에서 사용된 피브리노겐은 그 피브리노겐의 출처와 무관하게 단지 90% 이상 순도의 피브리노겐인 그의 순도에 대한 겔형성 효과 피브리노겐을 단지 예증하기 위한 것이다. 이러한 피브리노겐을 37℃에서 최종 농도 59 μg/ml 배지의 겐타마이신 설페이트 (Invitrogen) 및 최종 농도 2.4 μg/ml의 펀지존(fungizone) (Invitrogen)을 함유하는 DMEM/F12 (Life Technologies) 중에 피브리노겐을 용해시켜 제조하였다.

4℃로 유지된 상기 트롬빈 용액 6 μl를 494 μL 멸균 40 mM CaCl₂에 첨가하였다. 이렇게 활성화된 트롬빈 용액 (500 μL)를 투베르쿨린 (1 ml) 주사기에 부어 사용시까지 4℃로 유지시켰다.

37℃(일반적으로 4℃ 내지 37℃의 범위 내)로 유지시킨 상기 피브리노겐 용액 500 μl를 투베르쿨린 (1 ml) 주사기에 붇고, 연골 결손 속으로 최종 수의 세포를 제공하기 위하여 임의의 수의 연골세포를 첨가 (예컨대 0.1 x 10⁴ 내지 10 x 10⁶ 인간 연골세포/cm²가 첨가됨)할 수 있었고, 그 세포 함유 용액을 사용시까지 4℃∼37℃의 온도로 유지하였고, 허용가능한 상한 온도는 38℃이었다.

MPEG-PLGA 스캐폴드를 멸균 페트리디쉬 (Nunc)에 위치시켜 연골세포 및 피브리노겐/트롬빈으로 구성된 히드로겔로 담겨지기를 준비하였다. 2개의 주사기를 Y-커넥터(connecter)로 결합시켰다. 투베르쿨린 주사기의 2개의 피스톤을 정압(steady pressure)을 사용하여 활성화시켰다. 페트리디쉬 중에 위치한 MPEG-PLGA 스캐폴드 위로 250 μL를 담았다. 30∼60초 후에, 그 히드로겔이 MPEG-PLGA 스캐폴드의 친수성 특성에 기인하여 흡수되었다. 흡수 후에, MPEG-PLGA 스캐폴드 내에서 응집 단계(coagulation process)가 개시되어, 그 스캐폴드 내에 상기 연골세포가 보유되게 되었다.

응집에 이어서, 그 스캐폴드 내에서 3주에 걸친 연골세포의 행동을 연구하기 위하여 20% 소태아 혈청, 겐타마이신 59 μg/ml 및 펀지존(fungizone) 2.5 μg/ml 뿐만 아니라 P-아스코르베이트 함유 25 ml DMEM/F12를 첨가하였다. 그 스캐폴드를 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 중에 위치시켰다.

실시예 2

본 발명에 따른 히드로겔 중에 내포된 인간 세포를 함유하는 친수성 스캐폴 드를 다음의 방식으로 제조하였다. 전임상(pre-clinical) 연구만을 위해 사용될 PolyGraft® BGS, Lot # X41053로 불리는 전임상 연구를 위하여 Osteobiologics, Inc.로부터의 Trufit®을 5.3 x 3 mm로 치수를 맞추고, 알루미늄 호일로 이루어진 멸균 포장 중에 포장하였다.

전술한 실시예 1에서와 유사하게, 이번 실시예 및 본 문맥에서 사용되는 트롬빈의 종과 관련하여, 소 트롬빈이 실시예를 위한 "일반적" 트롬빈으로서 사용되었지만, 그 최종 겔형성은 인간 트롬빈과 동일할 것이다. 비록, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 소 트롬빈의 사용이 본 발명에 따른 조성물 또는 키트에서 회피되어야 하지만, 실시예에서 사용된 트롬빈은 그 트롬빈의 출처와 무관하게 겔형성 효과 트롬빈을 단지 예증하기 위한 것이다. 이러한 트롬빈을 0.1% BSA를 함유하는 멸균 H₂O 중에 그 트롬빈을 용해시켜 제조하였다.

이 실시예 및 본 문맥에서 사용되는 피브리노겐의 종과 관련하여, 소 피브리노겐이 실시예를 위한 "일반적(in general)" 피브리노겐으로서 사용되었지만, 그 최종 겔형성은 인간 트롬빈과 동일할 것이다. 비록, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 소 피브리노겐의 사용이 본 발명에 따른 조성물 또는 키트에서 회피되어야 하지만, 실시예에서 사용된 피브리노겐은 그 피브리노겐의 출처와 무관하게 단지 90% 이상 순도의 피브리노겐인 그의 순도에 대한 겔형성 효과 피브리노겐을 단지 예증하기 위한 것이다. 이러한 피브리노겐을 37℃에서 최종 농도 59 μg/ml 배지의 겐타마이신 설페이트 (Invitrogen) 및 최종 농도 2.4 μg/ml의 펀지존(fungizone) (Invitrogen)을 함유하는 DMEM/F12 (Life Technologies) 중에 피브리노겐을 용해시켜 제조하였다.

37℃(일반적으로 4℃ 내지 37℃의 범위 내)로 유지시킨 상기 피브리노겐 용액 500 μl를 투베르쿨린 (1 ml) 주사기에 붇고, 연골 결손 속으로 최종 수의 세포를 제공하기 위하여 임의의 수의 연골세포를 첨가 (예컨대 0.1 내지 10 x 10⁶ 인간 연골세포/cm²가 첨가됨)할 수 있었고, 그 세포 함유 용액을 사용시까지 4℃∼37℃의 온도로 유지하였고, 허용가능한 상한 온도는 38℃이었다.

Trufit®를 멸균 페트리디쉬 (Nunc)에 위치시켜 연골세포 및 피브리노겐/트롬빈으로 구성된 히드로겔로 담겨지기를 준비하였다. 2개의 주사기를 Y-커넥터로 결합시켰다. 투베르쿨린 주사기의 2개의 피스톤을 정압(steady pressure)을 사용하여 활성화시켰다. 페트리디쉬 중에 위치한 Trufit® 위로 250 μL를 담았다. 30∼60초 후에, 그 히드로겔이 Trufit®의 친수성 특성에 기인하여 흡수되었다. 흡수 후에, Trufit® 내에서 응집 단계(coagulation process)가 개시되어, Trufit® 내에 상기 연골세포가 보유되게 되었다.

응집에 이어서, Trufit® 내에서 3주에 걸친 연골세포의 행동을 연구하기 위하여 20% 소태아 혈청, 겐타마이신 59 μg/ml 및 펀지존(fungizone) 2.5 μg/ml 뿐 만 아니라 P-아스코르베이트 함유 25 ml DMEM/F12를 첨가하였다. 그 Trufit®를 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터 중에 위치시켰다.

실시예 3

인간 관절 연골 세포 (hACs)를 단층 세포 배양으로 배양하고 난 후, 트립신-EDTA를 사용하여 세포 배양 플라스크로부터 방출시켰다. 0.5 x 10⁶개의 세포를 연골 세포와 피브리노겐/트롬빈으로 구성된 히드로겔과 한 데 모으고, 이어서 페트리 접시에 있는 특별한 트루핏 (골생물학 (Osteobiologics)에서 폴리-그래프트 탑 페이스 (Poly-Graft Top Phase)으로 부름, San Antonio, Texas)에 적용하였다. 5분 후, "히드로겔-폴리그래프트 시스템"을 24 웰 플레이트 안에 넣고, 상기 웰에 성장 배지를 적용하였다. 6개의 시료를 37℃ CO₂ 배양기 안에서 배양하고, 성장 배지는 대략 주 2회 갈아주었다. 2개의 시료는 "14일" 시점 분석(time point analysis)을 위하여 14일간 유지시켰고, 2개의 시료는 2달간의 분석을 위하여 유지시켰으며, 2개의 시료는 4달간의 분석을 위하여 유지시켰다.

각 시점 이후, 다음과 같은 분석을 행하였다.

극저온 단편(Cryo-section) 이후 조직학 (툴루이딘 블루 염색 및 사프라닌 오 (Safranin O) 염색) 및 면역 세포 화학 (아그레칸 (Aggrecan)과 콜라겐 Ⅱ형에 대한 모노클로날 항체).

뒤이은 RT-PCR 분석을 위한 RNA 정제. 콜라겐 Ⅱ형 및 연골 형성 전사 인자 Sox9의 발현을 분석하였다. 이들 실험을 위한 대조군은 히드로겔-폴리그래프트 시스템에서의 배양에 사용된 것과 동일한 성장 배지에서 단층으로 배양된 hAC이었다.

이동 분석. 각 시점 이후에, 각 히드로겔-폴리그래프트 시스템을 이식체 (explant) 안으로 진행시키고, hAC의 이동을 광학 현미경 (light microscopy; LM)하에 관찰하였다.

후술하는 결과는 "14일 시점"이다. 조직학은 도 1에 나타낸다. 면역 화학 세포 화학은 도 2에 나타내고, 유전자 발현은 도 3에 나타낸다.

이동 분석

처리 후, 신속하고 훌륭한 세포 이동이 관찰되었다. 이 이동 속도는 정상인의 관절 연골 조직에서의 정상적인 이동에 필적한다.

14일 시점 이후 이미 이러한 결과를 얻었지만, 이러한 히드로겔-폴리그래프트 시스템 내에서 배양된 hAC는, 툴루이딘 블루- 및 사프라닌 오 염색에 의하여 증명된 것처럼 프로테오글리칸이 풍부한 소량의 연골 매트릭스를 합성할 수 있었다. 면역 세포 화학에 의하여, 이러한 시스템에서 배양된 hAC가 관절 히알린 연골에 대한 2개의 공지 마커인 콜라겐 Ⅱ형 및 아그레칸 양자 모두를 합성하였다는 것이 더 증명되었다.

또한, RT-PCR에 의하여 콜라겐 Ⅱ형 및 연골 형성 전사 마커 Sox9의 유전자 증명하였다. 콜라겐 Ⅱ형의 발현은 면역 세포 화학에 의하여 증명된 것과 같은 수준으로 단백질에서의 발현을 뒷받침하였다.

또한, 유전자 발현 분석을 통하여, 히드로겔-폴리그래프트 (폴리그래프트는 또한 폴리그래프트 탑 페이스로도 부른다)에 있는 마커의 mRNA 수준의 비교적 높은 발현과 비교할 때, 연골 세포 단층 대조 배양에 있는 이들 2가지 마커의 mRNA 수준이 훨씬 더 낮다는 것이 증명되었다.

본 발명자들은 전술한 방법에 의하여 측정된 신호들이 배양 시간의 증가에 따라 급속도로 증가할 것이라고 기대하고 있다.

실시예 4

또 다른 실험에서, 본 발명자들은 SCAS 시스템으로서 MPEG-PLGA 스캐폴드를 사용하였다. 상기 스캐폴드는 다시 1 내지 10% 범위의 다양한 농도의 2가지 상이한 히알루론산 (HA 및 NZHA)으로 제조되거나, 이들로 코팅되거나 CS (chodroritin sulfate)로 제조되었다. 각 스캐폴드를 무균 절단하여 1 x 1 cm 3개(triplicates) 단편으로 만들고, 무균의 12 웰 바닥이 평평한 트레이에 이 3개 단편을 넣었다. 각 3개 단편에 스캐폴드를 특정하는 코드 번호를 지정하였다. 상기 코드 번호는 다음의 MPEG-PLGA의 코팅을 함유한다.

사용된 막에 대한 다음의 코드 번호는 다음과 같다.

HA = 히알루론산

MPEG-PLGA = (메톡시폴리에틸렌글리콜-블록-코-폴리(락티드-코-글리콜리드).

이 연구에서, MPEG-PLGA의 조성물은 본 명세서에 기재된 것과 동일하다.

상기 스캐폴드는 동결 건조에 의하여 제조된다. 상기 스캐폴드는 두께 1 내지 3 mm, 다공도 약 90%의 시트이다.

코드 1: PLGA 4%, 다량의 1% HA

4 w/w % 디옥산 용액으로부터 "배제된 (Casted)" MPEG-PLGA (Mw 2.000-30.000 Da; PLA/PGA 비율 50:50). 상기 스캐폴드는 입자로서 1 w/w % HA (Mw 1 1 mill Da 이상)를 함유한다. 동결 건조에 의하여 제조된 스캐폴드. 상기 스캐폴드는 두께 1 내지 3 mm, 다공도 약 90%의 시트이다.

코드 2: PLGA 4%, 코팅된 다량의 1.5% HA

4 w/w% 디옥신 용액으로부터 배제된 MPEG-PLGA 스캐폴드. 상기 스캐폴드는 동결 건조된다. 그리고 나서, 1.5 w/w% HA 용액으로 코팅하고 건조한다. (Mw HA > 1 mill)

코드 3: PLGA 4%, 다량의(bulk) 2% HA

번호 1을 참조. 유일한 차이는 이것이 입자로서 2 w/w% HA를 함유한다는 것이다.

코드 4: PLGA 4%, 다량의 5% HA

번호 1을 참조. 유일한 차이는 이것이 입자로서 5 w/w% HA를 함유한다는 것이다.

코드 5: PLGA 4%, 다량의 10% HA

번호 1을 참조. 유일한 차이는 이것이 입자로서 10 w/w% HA를 함유한다는 것이다.

코드 6: PLGA 4%, 1% NZHA

번호 1을 참조. 유일한 차이는 이것이 입자로서 1 w/w% HA (Mw 약 700.000 Da)를 함유한다는 것이다.

코드 7: PLGA 4%, 2% NZHA

번호 1을 참조. 유일한 차이는 이것이 입자로서 2 w/w% HA (Mw 약 700.000 Da)를 함유한다는 것이다.

코드 8: PLGA 4%, 5% NZHA

번호 1을 참조. 유일한 차이는 이것이 입자로서 5 w/w% HA (Mw 약 700.000 Da)를 함유한다는 것이다.

코드 9: PLGA 4%, 10% NZHA

번호 1을 참조. 유일한 차이는 이것이 입자로서 10 w/w% HA (Mw 약 700.000 Da)를 함유한다는 것이다.

코드 10: PLGA 4%

다른 첨가제 없이 4 w/w % 디옥산 용액으로부터 "배제된 (Casted)" MPEG-PLGA (Mw 2.000-30.000 Da; PLA/PGA 비율 50:50).

젤라틴 1%, 과량의 1 내지 10% HA 등의 젤라틴 기재 스캐폴드를 제조할 수 있다. 이것은 관례대로 1 w/w% HA (Mw 1 mill)를 함유하는 1 w/w% 젤라틴 용액을 사용하여 제조된다. 이 스캐폴드는 EDC와 교차 결합(cross linked)된다.

체외이식 배양법(explant method) (WO 02/061052호로 공개된 특허 출원 PCT/DK02/00065호에 기재되어 있음)을 사용하여 생성된 인간 연골 세포 배양은 16% FCS (foetal calf serum)와 젠타마이신 및 펀지존 (fungizone)을 함유하는 DMEM/F12를 사용하여, 세포 배양 플라스크에 있는 인간 연골 세포 16 x 10⁶개까지 계속되었다. 제품 기재 CAS 번호 9001-32-5인 소 피브리노겐 F 8630 50 ㎎/㎖를 함유하는 무혈청 DMEM/F12 (피브리노겐은 사용 전에 5 내지 60분 내에 37℃ 배지에 용해되었다) 중에 ㎖당 4 x 10⁶개의 세포 농도 (50 ㎕당 2 x 10⁵세포)로 상기 연골 세포를 재현탁시켰다. 세포/피브리노겐 용액 50 ㎕를 각 스캐폴드에 첨가하였다 (코드 1과 2를 운반하는 플레이트 상의 2개 열의 웰과 코드 3의 상부 웰을 제외, 이는 우연히 197 ㎕ 세포/피브리노겐을 받았고, 과량의 세포/피브리노센 용액은 즉시 제거하였다).

상기 세포/피브리노겐 용액이 시험된 다양한 스캐폴드로 흡수되도록 하였다. 일부 스캐폴드는 용액을 적용하자, 용액이 수초 내에 쉽게 흡수되었다. 다른 스캐폴드는 단지 미세한 정도의 흡수를 보이고, 50 ㎕는 심지어 2 내지 3분 후에, 이들 스캐폴드 최상부 위에 방울을 형성하였다.

기타의 구성 성분으로서, 트롬빈 용액 50 ㎕를 각 1 x 1 cm 스캐폴드에 첨가하였다. 상기 트롬빈은 제품 번호 T6634, 제품 기재 9002-04-4인 소 혈장으로부터 취한 것이고, 100 유닛/㎖의 농도 (㎕당 0.1 유닛에 상응)로 제조되었다. 트롬빈 5 ㎕ (0.1 유닛 x 5 = 0.5 유닛에 상응)를 40 mM CaCl₂ 용액 495 ㎕에 첨가하였다. 이 희석 용액 중에서 트롬빈 50 ㎕를 각 스캐폴드에 첨가하였다. 후술하는 결과는 도 4 내지 7중 각각에 설명된 실험 도중에 관찰된 것이다.

배지 중에 이미 용해되어 있는 소 피브리노겐 50 ㎎/㎖를 제외하고 무혈청, 200,000 인간 연골 세포/50 ㎕ DMEM/F12로 이루어진 50 ㎕를 각 스캐폴드 최상부에 놓았다. 4℃에서, 40 Mm 염화칼슘 용액에 미리 희석시킨 소 트롬빈 50 ㎕를 첨가하였다. 설정 (set up)은 각 유형의 스캐폴드 3개(triplicate) 단편으로 이루어졌다. 이 설정에서, 다양한 스캐폴드의 코드 번호와 적용 결과를 표 1에 제시한다. 실온에서 5분간 응고시키고 스캐폴드에 적용된 총 100 ㎕에 대한 흡수 시간을 측정하였다. 5분 후, 16% vol/vol FCS와 젠타마이신 및 펀지존 등의 항생제를 함유하는 DMEM/F12 배양 배지 2 ㎖를 각 웰에 첨가하고, 각 스캐폴드의 형태와 점착성을 기입하였다. 플레이트를 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 3일 후, 상기 배지를 제거하고, 새로운 배지를 첨가하였다. 이들은 소위 "SCAS" 시스템 또는 막이라고 부르며, 코드 3 최상부 웰 뿐만 아니라 코드 1 내지 2도 실수로 최초 192 ㎕ 세포/피브리노겐 혼합을 얻었다. 이들 웰에서 막으로 흡수되지 않은 나머지 및 여분을 즉시 가능한 한 철저하게 제거하였다. 세포/피브리노겐 혼합물 50 ㎕를 전체 실험에 있어서 나머지 웰에 있는 나머지 막에 첨가하였다. 전술한 바와 같이 희석된 트롬빈 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 트롬빈 첨가 후, 총용액의 일부는 코드 3의 상부 웰뿐만 아니라 1과 2로 코드된 웰 안으로 흡수되지 않았으나, 웰 안으로 분산되는 것 같다 (또한, 웰의 바닥에 부착하는 것 같다).

SCAS 원리 (웰에 있는 세포/피부린/스캐폴드)의 시험 실시예를 도 4에 나타낸다.

실시예 5

포울럼(Foulum)의 연구 센터 수술실에서 10 마리의 성체 염소의 대퇴부 관절 돌기 중에서 상기 SCAS계를 시험하였다. 피브린/"자가 조직의" 연골 세포를 혼합하여 골격에 주입하였다.

상기 SCAS 시스템을 세 개의 군과 비교하였다. 1. 빈 결손 (대조군), 2. 피브린 겔 (FIB50)과 혼합한 연골 세포 및 3. 미세 골절 (관절 연골 결함을 치료하기 위한 이미 발표된 방법).

연구에 사용된 성체 염소 중에서 모든 중막 대퇴부 관절 돌기에 6 ㎜의 원형 결함을 형성하였다. 연골 세포를 배양하기 위하여 연골 조직을 채취하였다. 제2 개방 수술에서 상기 결함을 4개의 치료군으로 무작위 배분하였다 (각 군에 10개의 무릎 관절).

SCAS 시스템를 사용한 치료는 다음 단계로 구성되었다.

의사에게 수술 2 시간 전에 다음의 3개의 바이알을 제공하였다; (1) 16%의 우태아혈청 및 항생제를 함유하는 DMEM/F12 중에 현탁된 연골 세포, (2) 피브리노겐 용액 (100 ㎎/㎖ DMEM/F12 + 항생제) 및 (3) 트롬빈 용액 (100 U/㎖ CaCl₂). 그 밖에 의사에게 MPEG-PLGA 스캐폴드 (1 ㎝x 1 ㎝)을 제공하였다.

수술 직전에 상기 연골 세포 현탁액을 피브린노겐 용액과 무균 혼합하였고 (1:1 v/v), 이 연골 세포/피브리노겐 용액을 투베르쿨린 주사기에 주입하였다 (1 ㎖). 상기 트롬빈 용액을 또 다른 투베르쿨린 주사기에 주입하여 (1 ㎖) 이들 2개의 주사기를 한 데 모았고, 이제 2중 주사기(double-syringe)를 제조하였다.

이어서, 2중 주사기의 2개의 챔버 중의 부피 절반을 염소 무릎 관절 중의 결함 바닥에 주입하였다 (도 5). 그 다음, 상기 MPEG-PLGA 스캐폴드를 스캐폴드에 배치하였고 마지막으로 2중 주사기의 2개의 챔버 중의 남은 용액을 MPEG-PLGA 스캐폴드에 주입하였다. 이어서, MPEG-PLGA 스캐폴드가 연골 세포/수화 겔을 흡수하도록 하기 위하여 상기 무릎 관절을 손대지 않고 5분 방치하였다. 5분 후에 관절을 폐쇄하였다.

상기 동물들을 4 개월간 지켜보았다. 분석: 육안 점수 (1~12). 재생 조직의 경직도를 평가하기 위하여 기계적 시험을 수행하였다. 오드리스콜(O,Driscoll)에 의하여 조직학적 연구를 수행하였고, 피나다(Pinada) 연골 점수 및 결함 충전 퍼센트를 측정하였다.

상기 ICRS 육안 점수 및 조직학 외관은 그룹 사이에 매우 현저한 차이를 나타내었다 (도 7 내지 도 9). SCAS 시스템를 사용한 연골 재생은 빈 결함 중에서 어떠한 히알린 재생 조직도 보이지 않았던 반면에, 높은 결함 충전 및 히알린 연골에 근접한 조직 특성을 나타내었다. 기계적 시험은 치료 그룹 간에 어떠한 차이도 나타내지 않았다.

상기 SCAS 시스템은 좋은 표현형 특성과 함께 광범위한 연골 재생 반응을 나타내었다. 예상한 바와 같이 빈 결함 중에서는 어떠한 재생도 보이지 않았다. 이 방법은 생체내에서의 연골 조직 공학을 위한, 결손들 중에서 히알린과 유사한 관절 연골을 생성하는 매우 좋은 기술인 듯 하다.

실시예 6

측정하기 위하여 MPEG-PLGA에 피브리노겐/트롬빈으로 구성된 수화겔이 적재되는 경우, 연골 세포를 손상되지 않은 연골 조직으로부터 다음 실험이 행하여진 MPEG-PLGA/수화겔 스캐폴드로 이동시킬 것이다. 연골 생검을 하여 보통의 관절 연골로부터 작은 연골 체외이식편(3-5)들을 제조하였고, MPEG-PLGA 관절 내부에 배치하였다 (1 ㎝ x 1 ㎝). 상기 연골 체외이식편을 함유하는 관절을 웰 (12개의 웰 플레이트) 중에 두었다. 50 ㎎/㎖의 우형(牛型) 피브리노겐 F8630을 함유하는 50 ㎕의 무혈청 DMEM/F12, 혈청, 제품 설명 CAS 번호: 9001-32-5 (사용하기 전 5 내지 60분 이내에 피브리노겐을 37℃에서 배지 중에 용해하였다)을 MPEG-PLGA 스캐폴드에 주입하였고, 스캐폴드에 흡수된 후에 50 ㎕의 트롬빈 용액을 스캐폴드에 가하였다. 이 트롬빈은 우형 혈장으로부터 얻은 것이고, 제품 번호 T6634, 제품 설명 9002-04-4이고, 이는 100 유닛/㎖ (1 ㎕당 0.1 유닛에 상응하는)의 농도에서 제조되었다. 5 ㎕의 트롬빈 (0.1 유닛 x 5 ㎕에 상응하는), 즉 0.5 유닛을 40 mM의 CaCl₂용액 495 ㎕에 가하였다. 이 50 ㎕의 트롬빈 희석 용액을 각 스캐폴드에 가하였다.

5분 후 웰에 3 ㎖의 성장 배지를 가하였고, 3~4일 마다 배지를 교체하면서, 스캐폴드를 3주 배양하였다.

상기 스캐폴드를 최종적으로 급속 동결시키고 이어서 냉동 절편을 수행하였다. 절편을 고정시키고 톨루이딘 블루로 착색하였다.

각 도 10 및 도 11의 하단에 설명된 실험 중에 다음 결과를 관찰하였다.

이 실험은 MPEG-PLGA/수화겔 스캐폴드(SCAS)가 연골 세포를 연골 조직으로부터 스캐폴드 구조로 이동시킨다는 사실을 증명한다. 연골 세포를 인간의 무릎 관절 중의 결함으로 둘러싸인 연골로부터 스캐폴드로 이동시키는 것은 최적의 히알린과 유사한 관절 연골의 재생 반응을 위하여 필수적이기 때문에 중요하다.

실시예 7 (DK 출원 PA2006 00337로부터) - 중합체(polymer) 생분해성 시험. 다공성 물질의 생분해성은 다음과 같이 측정될 수 있다.

1 ｇ의 다공성 물질을 배지 (DEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium) 중의 10% 우태아혈청) 중에 완전히 담그고, 37℃에서 28일의 기간 동안 보관한다. 상기 배지를 1주에 2회, 즉 3, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일에 교환한다. 28일에, 상기 다공성 물질을 GCP에 의하여 분석하였다. 생분해성은 최초 값에 대한 평균 분자량 수(number)/중량으로서 측정하였다.

다공성 MPEG-PLGA (2~30 kDa, L:G 50:50)를 시험하였고, 상기 생분해성은 약 0.5 (최초 값에 대한 최종 M_n _/w 값)이었다.

요약

PLGA를 더 친수성으로 만들려는 시도로서, MPEG 또는 PEG를 PLGA와 공중합시켜 MPEG/PEG 함량이 낮은 (<20% MPEG/PEG) 공중합체를 얻었다. 이들 중합체를 시험하고 보통의 PLGA와 비교하였을 경우, 세포의 MPEG-PLGA 및 PLGA-PEG-PLGA에 대한 초기 접착은 보통의 PLGA보다 우수하였고 세포의 형태학 및 부착이 더 우수하였다.

놀랍게도, 이 명세서로부터 PEG 함유 중합체는 단백질 및 세포의 부착을 저항한다고 알려진다. PEG 함량이 높은 중합체는 생물학적 시험에 있어서 부착 및 형태가 빈약하기 때문에 중합체의 성능 향상의 핵심은 중합체 중에 PEG 함량을 낮게 유지(많아야 20몰-%,,바람직하게 많아야 14몰-%)하는 것이다.

PLA는 PLGA에 비하여 분해 시간에 길고, 우리의 시험은 폴리에테르-PLGA의 PLGA 부분에 있어서 락티드 함량이 높을수록 세포의 접착이 느려진다는 것을 보여준다.

알려진 합성 생분해성 중합체는 일반적으로 생물학적 환경에 있어서 초기 세포 부착이 느린 소수성 물질이다. 우리는 MPEG-PLGA 블록 공중합체를 합성함으로써 PLGA의 친수성을 변형하려고 시도하였다. 우리의 제1 중합체는 G:L의 비율이 50:50 (mol)인 1.9~30 kDa의 MPEG-PLGA이었다. 이들을 동결 건조하여 얇은 다공성 판으로 제조하였다. 생물학적 분석에 있어서, 초기 및 장기 세포 접착 모두 우수하였고, 성능이 변형되지 않은 PLGA보다 우수하였다. 놀랍게도, 본 명세서는 중합체에 PEG를 결합시키면 세포 및 단백질의 부착에 대한 저항이 발생한다는 사실을 설명하였다. 우리의 성공의 핵심은 PEG 함량을 낮추는 것 (6%)인 듯 보인다. PEG 함량이 높은 경우 (MPEG-PLGA 5~30 kDa, 14% PEG), 우리는 낮은 PEG 물질 및 보통의 PLGA와 비교하여 초기 및 장기 모두에서 세포 부착이 감소되는 것을 보았다.

실시예 8 (DK 출원 PA2006 00337로부터) - 중합체의 정제

상기 중합체를 적절한 용매 (예컨대, 디옥산, 테트라히드로푸란, 클로로포름, 아세톤)에 용해시키고, 비용매 (예컨대, 물, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 또는 2-프로판올) 중에서 -40℃ 내지 40℃에서 교반하여 침전시킨다. 중합체를 옮겨 놓고 용매를 폐기하여 중합체를 40~120℃에서 진공 오븐 중에서 밤새 건조한다.

이 중합체를 NMR 분광법 및 GPC를 이용하여 분석하여 구조, 분자량 및 순도를 확인한다.

여러 가지 MPEG-PLGA 중합체의 합성예

스캐폴드 제조 방법

중합체 (예컨대 1.9~30 kDa)를 적절한 용매 (예컨대, 디옥산) 중에 0.5~10% (w/v)의 농도로 용해시킨다. 이 용액을 형틀에 붓고 얼려서 다공성 시트로 동결 건 조한다. 세포외 기질로부터의 성분은, 이들 성분을 용매 중에서 분산시킴으로써 또는 이들 성분의 분산/용액을 이용하여 상기 다공성 시트를 연속 처리함으로써 포함(incorporate)될 수 있다.

스캐폴드 시험

1차 섬유모세포(primary fibroblast)를 스캐폴드 표면에 2.5 x 10⁴ 세포/㎠의 농도로 씨드(seed)함으로써 MPEF-PLGA 및 PLGA의 상이한 스캐폴드에 대한 생체 적합성 연구를 수행하였다. 중성 적색을 사용하여 세포를 착색한 다음, Evolution MP cooled color camera (Media Cybernetics)를 장착한 도립 현미경 Leica DMIRE2를 사용하여 측정하고, Image Pro Plus 5.1 소프트웨어 (Medica Cyberntics)를 사용하여 디지털 이미지를 얻음으로써, 1,3 및 7일에 세포 부착, 생육성(生育性) 및 성장의 평가를 수행하였다.

PLGA의 동결 건조된 스캐폴드의 생체 적합성에 대한 비교 연구는 일반적으로 초기의 매우 소량의 세포를 제외하고는 미세 형태에 세포가 부착되는 것을 보여주었다. 이들 스캐폴드를 MPEG-PLGA 2-30 kDa와 비교하면, 우리는 우수한 습윤력 때문에 더 다량의 세포가 스캐폴드에 부착하므로 MPEG-PLGA 스캐폴드의 더 나은 생체 적합성을 본다.

세포는 미세 형태와 함께 성장하는 중이고, 시험 초기부터 MPEG-PLGA 1.9-30 kDa에 잘 접착하며 1일로부터 7일까지 세포량의 증가가 보인다. MPEG-PLGA의 MPEG 부분의 크기가 5-30 kDa로 증가하여 스캐폴드 표면에 대한 부착이 없거나 거의 없 이 현저하게 감소된 생체 적합성을 주는 단독으로 둥근 세포를 얻는다. 그리고 이것은 1일부터 7일까지 악화(worsen)된다.

MPEG PLGA 2-15 kDa를 MPEG-PLGA 2-20 kDa 및 MPEG-PLGA 2-30 kDa와 비교하여 시험하는 경우, 우리는 PLGA 부분의 크기가 증가할수록 섬유모세포의 부착 및 생육성이 증가하는 것을 본다. 이는 2-30 kDa의 생체 적합성이 가장 좋다는 것을 의미한다. 크기가 2-15 kDa부터 2-20 kDa까지 증가시키면 2-20 kDa부터 2-30 kDa까지의 단계와 비교하여 가장 큰 긍정적인 효과를 얻을 수 있다.

MPEG-PLGA 2-20 kDa 중의 락티드 함량을 60%에서 80%로 증가시키면 섬유모세포의 부착 및 생육성이 감소된다. 이러한 효과는 MPEG-PLGA 2-15 kDa 60% 락티드를 MPEG-PLGA 2-15 kDa 80% 락티드와 비교하는 경우 더욱 현저하다.

생체 적합성 시험의 요약:

주관적으로 + 부터 +++++를 사용하여 결과의 등급을 나누었는데, 여기서 +는 낮은 접착력 및 낮은 생육성을, +++++는 뛰어난 접착 및 생육성을 의미한다.

인간 각질 세포는 다층의 분화된 재건 표피를 형성하도록 MPEG-PLGA 스캐폴드에 밀집된 섬유모세포 위의 시험관내에서 배양할 수 있다 (도 1 참조). 재건된 표피는 생체내의 보통의 표피와 유사한 형태학적 특징을 보인다.

조직학 표본에 대하여, 우리는 기저(基底) 세포층 (기저층) 및 중간층 유사물과 결합한 최후 덮는(overlying) 각질층(角質層)의 분명한 증거를 발견하지만, 그러나, 최종 성숙의 결핍은 스캐폴드 물질이라기보다는 생체내 모델을 선택하였기 때문이라고 보아야 한다.

실시예 9: ( MPEG - PLGA ) 폴리락테이트 스캐폴드 중의 연골 세포를 사용한 연골 재생. 염소 중의 생체내 연구.

최근에는 임상 연골 조직 기술을 위한 다공성 스캐폴드가 소개되어 있다. 다양한 스캐폴드 물질이 존재하여 최적의 스캐폴드를 확인할 필요가 있다. 본 발명의 연구 목적은 염소 대퇴 돌기 전(全)두께 연골 결함 모델에 있어서 연골 현탁액과 결합한 MPEG-PLGA의 연골 재생 반응을 연구하는 것이다.

방법

이 연구를 위하여 10 마리의 염소를 사용하였고, 이 연구를 덴마크 포울럼의 연구 센터에서 수행하였다. 내측 대퇴 돌기 모두에 6 ㎜의 원형 결함을 형성하였다. 연골 세포 배양을 위하여 연골 조직을 채취하였다. 제2 개방 수술에서, 상기 결함들을 다음의 2개 치료 그룹으로 무작위 배분하였다. 1. 빈 결손 (대조군). 2. MPEG-PLGA 동결 건조 다공성 스캐폴드 중의 피브린/연골 세포 용액. 동물들을 4 개월간 지켜보았다. 분석: ICRS 육안 점수 (1~12). 재생 조직의 경직도를 측정하기 위하여 기계적 시험을 수행하였다. 조직학적 분석은 O, Driscoll 및 Pinada 연골 점수 및 결손을 채우는 퍼센트에 의해 수행되었다.

결과

ICRS 및 조직학 점수는 그룹 간에 매우 현저한 차이를 보여주었다. 무결함 중에는 어떠한 재생 조직도 관찰되지 않은 반면에, 조직 특성이 히알린 연골에 근접한 조직 특성 및 높은 결손 채움을 입증하는 MPEG-PLGA/세포 그룹에서는 연골 재 생이 관찰되었다. 기계적 시험은 양 치료군 사이에 아무런 차이도 나타내지 않았다.

결론

MPEG-PLGA/세포 구조체는 양호한 표현형 특성과 함께 광범위한 연골 재생 반응을 나타내었다. 예상한 바와 같이, 빈 결함 중에서는 어떠한 재생도 보이지 않았다. 배양 연골 세포와 결합한 다공성 MPEG-PLGA 스캐폴드는 생체내 연골 조직 공학을 위한 좋은 기술인 것처럼 보인다.

실시예 10: 피브리노겐 겔 스캐폴드 및 미세 관절 중의 연골 세포를 사용한 연골 재생. 염소의 생체내 연구.

도입

연골 조직 기술의 현재 임상 초점은 히알린 연골을 일관되게 형성하고 관절경 기술과 함께 적용될 수 있는 방법을 개발하는 것이다. 본 연구는 염소의 대퇴 돌기의 가장 두꺼운 연골 결함 모델에 있어서, 과점도의 연골 세포 현탁액에 기초한 주입 가능한 피브린의 연골 재생 반응을 조사하는 것이 목적이다.

방법

이 연구를 위하여 10 마리의 염소를 사용하였다. 내측 대퇴 돌기 모두에 있어서 6 ㎜의 원형 결손이 발생하였다. 연골 세포를 배양하기 위하여 연골 조직을 채취하였다. 제2 개방 수술에서 상기 결손을 다음의 2 가지 치료군으로 무작위 배분하였다. 1. 미세 골절 (연골밑(subchondral) 뼈를 통한 1 ㎜ 천자(punctures)) (대조군) 2. 결함 중의 피브린/연골 세포 페이스트(paste). 동물을 4 개월간 지켜 보았다. 분석: ICRS 현미경 점수 (0~12). 재생 조직의 경직도를 측정하기 위하여 기계적 시험을 수행하였다. O.Driscoll과 Pinada 연골 점수 및 결함 충전 퍼센트에 의하여 조직학 분석을 수행하였다.

결과

상기 ICRS 점수는 그룹간에 동일한 점수를 나타내었다. 기계적 시험도 치료군간에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 그러나, 모든 군에서 손상되지 않은 연골보다 현저하게 경직되었다. 조직학은 모든 군에서 제한된 재생 반응을 나타내었다. 연골밑 뼈의 미세 골절 군에서 낭포(囊胞)를 수반하는 변화가 관찰되었다. 연골 점수 및 조직 충전은 양 군에서 동일하였다.

결론

현미경 및 조직학 점수는 미세 골절 및 피브린/연골 세포가 제한된 연골 재생 반응을 자극하였다는 사실을 나타내었다. 기계적 시험을 통하여 조직 경직도에 기여하는 연골밑 뼈 중에서 형성되는 연골 회복 조직의 층이 얇다는 것을 나타내면서 보통의 연골에 비하여 모든 치료군에서 경직도가 증가하였다는 사실을 개시하였다. 결론적으로, 연골 세포 현탁액에 기초한 고점도 피브린은 미세 골절보다 더 연골 회복을 자극하지 않았다. 이는 아마도 동물의 긴장에 기인하여 주입된 물질의 가능한 손실뿐만 아니라 기타의 연골 조직 공학 방법과 비교하여 세포 봉쇄 및 세포 지지가 불충분하다는 사실에 의하여 설명될 수 있을 것이다.

Claims

인간을 포함하는 살아있는 포유류 개체의 조직에서의 결손을 살아있는 포유류 세포의 이식에 의하여 복구하는 방법으로서,

i) 생체적합성 스캐폴드를 포함하는 제1 성분(component)과; 포유류 세포 및 생물학적으로 허용가능한 고정제 전구체를 포함하는 제2 성분을 상기 고정제 전구체의 고정제로의 전환 전에 상기 결손 위치에 동시(concomitant)에 적용(application)하는 단계 및

ii) 고정제 전구체를 고정제로 전환시킴으로써 상기 포유류 세포를 상기 스캐폴드에 고정시키고, 상기 스캐폴드를 상기 살아있는 포유류 조직에 고정시키는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 성분의 적용 전에, 상기 제1 성분이 상기 결손 위치에 적용되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 성분 전에 또는 동시에, 상기 제2 성분이 상기 결손 위치에 적용되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나에 있어서, 고정제 전구체 전환제를 포함하는 제3 성분이 상기 결손 위치에 동시에 적용되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 전환제는 상기 제1 성분의 일부로서 적용되는 것인 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 전환제는 상기 생물학적으로 허용가능한 스캐폴드 중에 혼입되는 것인 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전환제는 가교제인 것인 방법.
제6항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전환제는 단백질 또는 다당류인 것인 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전환제는 상기 생물학적으로 허용가능한 스캐폴드와 함께 동결건조되거나 또는 용매로서 적용되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 고정제는 히드로겔의 형태인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 상기 살아있는 포유류 조직과 면역 적합성(immuno-compatible)인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 포유류 세포는 상기 포유류 개체로부터 얻어지거나 유래된 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 세포 현탁액 또는 체외이식 조직(tissue explant)의 형태인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 그 기원이 자가유래, 동종유래 (동종성) 또는 이종성인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 다능(multipotent) 또는 다능성(pluripotent) 줄기 세포로부터 유래된 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 포유류 세포는 섬유모세포, 피부세포, 각질세포, 연골세포, 내피세포, 연골세포, 골모세포 및 치주세포로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 성분 중의 세포는 표적 조직 또는 결손의 재생 또는 복구를 가져오기 위한 약 0.1 x 10⁴ cells/ml 내지 약 10 x 10⁶ cells/ml와 같은 충분한 양으로 세포가 존재하는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조직 결손은 연골 결손, 뼈 결손, 피부 결손 및 치주 결손으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 내시경, 관절경 또는 최소 침습(invasive) 수술, 및 통상적인 또는 주된 절개 수술(open surgery)과 같은 수술 방법으로서 또는 수술 방법의 도중에 수행되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생체적합성 스캐폴드는 친수성이고/이거나 생체적합성 습윤제의 적용에 의하여 결손 위치 위로의 삽입 전에 조제되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 스캐폴드는 물 및/또는 등장성 버퍼에 삼투성(porous)인 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 스캐폴드는 25kDa 및 75kDa 사이와 같 은, 약 1kDa 및 약 1백만 kDa 사이와 같은, 약 1kDa 보다 큰 분자량의 중합체를 포함하거나 필수적으로 구성된 것인 방법.
제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 막, 비직조 및 직조된 파이버, 동결건조된 중합체 시트와 같은 동결건조된 중합체로 구성된 군에서 선택된 형태인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 합성인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추가적인 화합물은 스캐폴드에서와 같이, 상기 제1 및/또는 제2 성분 내로 포함되는 것이고, 상기 추가적인 화합물은 히알루론산 (HA), 히드록실 아피타이트 (예컨대, 입상반(granule)의 형태), IGF-1과 같은 성장 인자, 콜라겐으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드의 구멍(pore)은 세포 부착 및/또는 콘드로이틴 황산염, 히알루로난, 헤파린 황산염(heparin sulfate), 황 산 헤파란, 데르마탄 황산, 성장 인자, 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐, 젤라틴 및 애그래칸(aggrecan)으로 구성된 군에서 선택되는 요소와 같은 조직 재생을 위한 내부 성장을 용이하게 하는 요소에 의해 부분적으로 채워진 것인 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 히알루론산은 스캐폴드 내로 포함된 것인 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산은 약 0.1 및 약 15wt% 사이 비율로 스캐폴드 내에 존재하는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 폴리랙타이드 (PLA), 폴리카프로 락톤 (PCL), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (PLGA), MPEG-PLGA (메톡시폴리에틸렌글리콜)-폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)로 구성된 군에서 선택된 것인 화합물을 포함하는 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 스캐폴드는 PLGA 또는 MPEG-PLGA를 포함하거나 구성 되는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 MPEG-PLGA는 일반식: A-O-(CHR¹CHR²O)_n-B의 중합체로;

상기 A는 적어도 4000g/mol의 분자량의 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기이고, 상기 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기내 (i) 락티드 유닛 및 (ii) 글리콜리드 유닛의 몰비율이 80:20 내지 10:90 범위로 존재하고,

상기 B는 A에서 정의된 바와 같은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 또는 수소, C_1-6알킬 및 히드록시 보호기로 구성된 군에서 선택된 것이고,

B는 A에서 정의된 바와 같은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 또는 수소, C₁ _- ₆알킬 및 히드록시 보호기로 구성된 군에서 선택된 것이고, 각각 -(CHR¹CHR²O)- 유닛내에 하나의 R¹ 및 R²는 수소 및 메틸로부터 선택된 것이고, 같은 -(CHR¹CHR²O)- 유닛내에 다른 R¹ 및 R²는 수소이고,

n은 중합체 사슬안에 -(CHR¹CHR²O)- 유닛의 평균 숫자를 나타낸 것이고, 10 내지 1000의 범위내의 정수이고,

상기 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기내 조합된 양의 (i) 락티드 유닛 및 (ii) 글리콜리드 유닛에 (iii) 폴리알킬렌 글리콜 유닛 -(CHR¹CHR²O)- 의 몰 비율은 많아야 20: 80이고,

상기 중합체의 분자량은 적어도 10,000g/mol이고, 바람직하게는, 적어도 15,000g/mol인 것인 방법.
제31항에 있어서, 상기 각각의 유닛내에 R¹ 및 R²는 수소인 것인 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 B는 A에서 정의된 바와 같은 폴리(락티드-코-글리콜리드) 잔기인 것인 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, B는 C₁ _-6-알킬인 것인 중합체.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B는 히드록시 보호기인 것인 중합체.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B는 히드록시기인 것인 중합체.
제29항 또는 제36항에 있어서, 상기 스캐폴드는 용액 내 화합물을 포함하는 용액의 동결 건조에 의해 제조되는 것인 방법.
제29항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 50 내지 97%의 범위내에 다공도를 갖는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생체적합성 스캐폴드 내에는 단백질 또는 다당류와 같은 생물학적 중합체를 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 상기 생물학적 중합체는 젤라틴, 콜라겐, 알지네이트, 키틴, 키토산, 케라틴, 실크, 셀룰로오스 및 그 유도체 및 아가로스로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 생물학적으로 허용가능한 고정제 전구체는 피브리노겐과 같이 생물학적으로 수득되거나 유래된 요소인 것인 방법.
제41항에 있어서, 상기 피브리노겐은 재조합적으로 제조된 것인 방법.
제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 피브리노겐은 개개의 포유류 또는 유전자 도입(transgenic) 숙주와 같은 동일한 종들로부터 수득되거나 유래된 숙주 세포와 같은 포유류 숙주 세포로부터 분리된 것인 방법.
제41항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 사용된 피브리노겐의 농도는 1-100mg/ml인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전환제는 트롬빈, 트롬빈 유사체, 재조합 트롬빈 또는 재조합 트롬빈 유사체로 구성된 군에서 선택되는 것인 방 법.
제45항에 있어서, 상기 사용된 트롬빈의 농도는 0.1NIH 유닛 및 150NIH 유닛사이이고/또는 1-100mg/ml 피브리노겐을 중합체화하기 위한 적절한 수준의 트롬빈인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 살아있는 포유류 조직은 결합 조직, 피부, 연골, 뼈, 인대 및 치주조직으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 시트, 막, 몰드된(molded) 형태, 플러그(plug), 튜브, 스피어(sphere), 결손 위치에 삽입되기 위해 제조된 3차원 형태, 또는 임플란트(implant), 성형(cosmetic) 임플란트, 재건(reconstructive) 임플란트로 구성된 군에서 선택된 형태인 것인 방법.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 재건 수술 또는 성형 수술에서 수행되는 것인 방법.
살아있는 포유류 세포들의 이식에 의해 살아있는 포유류 조직의 결손을 치료하기 위한 부분들의 키트로, 상기 키트는 전술한 항 중 어느 하나의 항에 따라 정의된 제1성분 및 제2성분를 포함하고, 상기 제1성분 및 제2성분은 서로 분리된 것인 부분들(parts)의 키트.
제50항에 있어서, 전술한 항 중 어느 하나의 항에 따라 정의된 전환제는 추가적으로 제공되고, 상기 전환제는 제1성분 및 제2성분로부터 분리된 것인 부분들의 키트.
제50항에 있어서, 상기 전환제는 상기 제1성분의 부분인 것인 부분들의 키트.
제50항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 키트는 통합된 공급 장치를 포함하는 것으로, 다음의 기능적으로 연결된 장치들:

(i) 사용에 앞서 상기 제2성분를 포함하는 적어도 하나의 용기(container),

(ii) 상기 용기 밖에 상기 제2성분를 가압하기 위한 강제 도포기(force applicator), 및 (iv) 전달장치에 (iii) 커넥터로, 상기 전달장치는 살아있는 포유류 조직에 결손 위치에 삽입된 제1성분으로 제2성분의 직접 적용을 위해 적절한 것,

을 포함하는 것인 부분들의 키트.
제53항에 있어서, 상기 통합된 공급 장치는 두개의 용기, 상기 세포 현탁액을 포함하는 제1용기 및 상기 고정제 전구체를 포함하는 제2용기를 포함하고, 상기 제1용기 및 제2용기는, 상기 전달 수단들에 의한 전달 이전에 제2성분를 제조하기 위해 상기 세포 현탁액 및 상기 고정제 전구체를 동시적으로 혼합하는 것을 허용하는 공통 커넥터(common connector)에 의해 결합된 것인, 부분들의 키트.
제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 통합된 공급 장치는 상기 전환제를 포함하는 추가적인 용기를 포함하고, 상기 추가적인 용기는, 상기 제1성분에 공통 커넥터에 의해 연결되고, 상기 조직 내 결손 위치에 삽입된 상기 제1성분로 전달 수단에 의한 전달 이전에, 제1성분에 즉각적으로 상기 전환제가 혼합되는 것을 허용하기 위해 상기 공통 커넥터에 의해 제2성분가 결합된 것인, 부분들의 키트.
제54항 또는 제55항에 있어서, 그리고 상기 제2용기들 및/또는 추가 용기는 분리된 독립적인 강제 도포기들 또는 공통 강제 도포기일 수 있는 강제 도포기에 의해 기능적으로 연결된 것인, 부분들의 키트.
제53항 내지 제56항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1용기, 제2용기 및/또는 상기 제3용기와 같은 적어도 하나의 용기는 주사기 몸체(syringe body) 형태이고, 상기 강제 도포기는 개개의 주사기 플런저(plunger) 형태인 것인, 부분들의 키트.
제53항 내지 제57항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 커넥터는 적어도 하나의 튜브인 것이나, 포함하는 것으로, 상기 하나 또는 그 이상의 용기들에 연결된 기부(proximal) 말단(들) 및 상기 전달 장치에 연결된 단일 원위부(distil) 말단을 갖는 것인, 부분들의 키트.
제58항에 있어서, 상기 커넥터는 제2성분 및 임의적으로 상기 전달 장치내로 진입이전에 상기 전환제의 혼합을 통해 허용하기 위한 혼합 장치를 포함하는 것인, 부분들의 키트.
제53항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 전달 장치는 주사기, 카테터(catheter), 바늘, 및 튜브, 스프레이 장치 및 압력 총(gun)으로 구성된 군에서 선택되는 의료 장치의 형태인 것인, 부분들의 키트.