CN112354015B - 一种异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：(1)脱细胞前处理：采用循环渐进压力模块+分段超声模块，对猪肌腱组织进行疏松化；(2)脱细胞；(3)脱细胞后处理：吸除水洗液，加入中和液中和；吸除中和液，然后水洗两次。本发明提供的异种脱细胞肌腱组织材料经过脱细胞前、中、后的一系列处理，尽可能地去除了细胞组分、DNA成分和免疫抗原成分，同时保存了肌腱组织的较高力学性能，改善脱细胞肌腱组织的pH，有利于细胞粘附增殖，组织诱导再生。该异种脱细胞肌腱组织材料可用于临床上肌腱缺损修复、韧带损伤修复和前交叉韧带损伤重建手术，弥补了现有技术的不足。

Description

一种异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及骨骼韧带修复器具领域，尤其涉及一种异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法。

背景技术

韧带肌腱组织损伤缺损是常见骨科疾病，手术缝合修复或者手术重建是临床治疗的重要方法。在手术中肌腱韧带缺损是非常常见的，肌腱移植物是临床的常用医用耗材。一直以来，临床医生普遍采用患者自体肌腱进行肌腱韧带重建，但是这种手术方式存在供区损伤，肌腱来源不足，手术耗时长，康复缓慢的缺点，相当于“拆东墙补西墙”。异体肌腱移植物是取自捐献尸体的肌腱韧带组织，进行相关处理后，用于韧带重建修复，但是这种异体移植物仍然存在来源不充足，免疫排斥和传播疾病风险。因此临床需要一种来源充足、尺寸满足要求的肌腱移植物，动物源的异种肌腱可以满足这一要求。

异体/异种肌腱直接应用于患者存在很强的免疫反应，影响移植物在体内的再生重塑。因此，异体/异种肌腱必须经过脱细胞处理，尽可能的去除肌腱组织内细胞成分和DNA成分，才能尽可能的减轻免疫排斥反应。脱细胞方法是通过物理、化学及酶学手段，将异体组织中的细胞成份尽可能的去除，从而降低其免疫原性，降低宿主抗移植物反应。物理方法常用的有机械震荡、血管扩张灌注、热震荡、超声震荡和手工破坏法。化学试剂大致包括以下几类：去垢剂、溶剂、酸碱溶液、高渗或低渗的离子溶液。其中去垢剂是一类可溶于水的脂类，能够裂解脂膜，溶解抗原，清除免疫复合物。自从发现其具有溶解细胞膜的特性后就在脱细胞操作中被广泛使用。但是上述脱细胞方法处理后脱细胞组织为酸性，不利于细胞的浸润粘附和增殖，影响组织再生。而且，肌腱组织由于其组织结构致密，裂解液渗入困难，脱细胞不完全，导致细胞、DNA残留，免疫源性不能降低到理想水平。目前已有异种组织用于临床组织修补，如猪小肠粘膜下层组织，猪真皮组织。而异种组织的脱细胞程度，抗原清除率直接影响其临床效果。此外，肌腱移植物对力学要求高，这使得异种肌腱移植物在脱细胞处理过程中不能损伤异种肌腱的力学性能。

鉴于上述难点，本发明拟提供一种具有良好力学性能的异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法。

发明内容

制备异种脱细胞肌腱组织材料目前存在以下难点：1肌腱组织由于其组织结构致密，裂解液渗入困难，脱细胞不完全，导致细胞、DNA残留，免疫源性不能降低到理想水平；2目前脱细胞方案容易导致脱细胞组织成酸性，不利于细胞粘附增殖；3肌腱移植物对力学性能要求高，脱细胞过程容易损伤原有组织的机械性能，导致脱细胞肌腱组织不能满足临床手术修复的要求。为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法，该材料经过脱细胞前、中、后的一系列处理，尽可能的去除了细胞组分、DNA成分和免疫抗原成分，同时保存了肌腱组织的较高力学性能，改善脱细胞肌腱组织的pH，有利于细胞粘附增殖，组织诱导再生。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，脱细胞前处理：采用循环渐进压力模块+分段超声模块，对肌腱组织结构进行疏松化；

步骤二，脱细胞：

S1，对前处理后的肌腱用去离子水进行水洗两次；

S2，吸除水洗液，加入10-50mL消化液，置于50-500rpm揺床中消化0.5-4h；

S3，终止消化，然后水洗24-72小时，吸除水洗液，加入除垢剂，于50-500rpm揺床中处理1-4h；

S4，吸除除垢剂，加入去离子水水洗24-72h，重复三个水洗循环；

步骤三，脱细胞后处理：吸除水洗液，加入中和液，50-500rpm揺床中中和处理2-48h；吸除中和液，加入足量去离子水于揺床中水洗4-48h，重复两个水洗循环。

进一步地，上述脱细胞前处理后，猪肌腱组织变成扁平状，其厚度为原来的1/5-1/2。

进一步地，步骤二的S1中水洗的条件为在50-500rpm揺床中，水洗12-72h。

进一步地，消化液为含胰酶的EDTA标准溶液，其中，胰酶的浓度为0.02-0.2％；消化液与待消化肌腱的体积比为5-10:1。

进一步地，步骤二S3中的终止消化的具体步骤为：吸除消化液，加入体积是消化液体积3-5倍的终止液，50-500rpm揺床中终止消化12-72h。

进一步地，终止液由在DMEM培养基中加入5-20％FBS、0-2％青霉素、0-2％链霉素和0-2％两性霉素B配制而成。

进一步地，除垢剂包括如下浓度的组分：0-10％次氯酸溶液、过氧乙酸、过氧化氢溶液中的一种或几种和1-10％曲通X-100，除垢剂与待消化肌腱体积比为3-10:1。

进一步地，中和液为碳酸氢钠溶液、碳酸氢钙溶液、碳酸钙溶液中的一种或两种，浓度为1-10％；中和液与除垢剂的体积比为3-5:1。

进一步地，制备的异种脱细胞肌腱组织材料需要进行冷冻干燥并冷冻保存。

本发明的第二个方面是提供上述制备方法制备的异种脱细胞肌腱组织材料。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供了一种异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，经过脱细胞前、中、后的一系列处理，尽可能地去除了细胞组分、DNA成分和免疫抗原成分，同时保存了肌腱组织的较高力学性能，改善脱细胞肌腱组织的pH，有利于细胞粘附增殖，组织诱导再生。该异种脱细胞肌腱组织材料可用于临床上肌腱缺损修复、韧带损伤修复和前交叉韧带损伤重建手术，弥补了现有技术的不足。

附图说明

图1为本发明一实施例中所用的猪趾长屈肌腱的测量图。猪趾长肌腱肌腱尺寸满足临床上ACL重建的移植物的要求，因此具有巨大的临床转化和应用的前景；

图2为本发明实施例1中脱细胞处理后的肌腱组织的电镜扫描图；显示肌腱脱细胞后，胶原纤维变疏松多孔，有利于细胞的粘附和迁移浸润；

图3为本发明实施例2中脱细胞处理后的肌腱组织的电镜扫描图；

图4为本发明实施例3中脱细胞处理后的肌腱组织的电镜扫描图；

图5为本发明一实施例中中和前和中和后的脱细胞肌腱与细胞共培养的免疫荧光结果；其中，A为免疫荧光染色结果，B为A图的统计柱状图；

图6为本发明一实施例中中和前和中和后的脱细胞肌腱与细胞共培养的扫描电镜图；

图7为本发明提供的猪脱细胞肌腱和正常猪肌腱的HE染色图；

图8为本发明提供的脱细胞肌腱(实验组)、正常猪肌腱与未进行脱细胞前处理的脱细胞肌腱(对照组)的生物力学检测结果；

图9为本发明三个实施例提供的脱细胞肌腱的生物力学检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种异种脱细胞肌腱组织材料及其制备方法。鉴于上述难点，本发明在制备异种脱细胞肌腱组织材料过程中，进行了针对性的处理：

1.由于满足临床要求的肌腱移植物直径较大，加上肌腱组织本身结构致密，在脱细胞之前，我们对肌腱组织进行预压以及超声处理，使其厚度减少，降低肌腱内部胶原纤维的精密度，利于脱细胞液渗透。

2.本发明在肌腱组织脱细胞处理后，进一步进行了脱细胞后处理，采用专门的中和液，调节脱细胞肌腱组织的pH，使其有利于组织细胞的粘附增殖，诱导组织再生。

3.脱细胞处理容易损伤肌腱组织的力学性能，主要是消化液消化和除垢剂处理两个阶段，本发明通过调节消化液的浓度和除垢剂的浓度配比，在充分消化去除免疫抗原的同时，尽可能的保护肌腱组织的力学性能。

基于上述，本发明提供的异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，脱细胞前处理：采用循环渐进压力模块+分段超声模块，对肌腱组织结构进行疏松化；避免锐性切割损伤肌腱组织的力学性能。循环加压可降低肌腱组织内部纤维组织的紧密程度，利于脱细胞裂解液渗透进入肌腱内部；

步骤二，脱细胞：

S1，对前处理后的肌腱用去离子水进行水洗两次；

S2，吸除水洗液，加入10-50mL消化液，置于50-500rpm揺床中消化0.5-4h；

S3，终止消化，然后水洗24-72小时，吸除水洗液，加入除垢剂，于50-500rpm揺床中处理1-4h；

S4，吸除除垢剂，加入去离子水水洗24-72h，重复三个水洗循环；

步骤三，脱细胞后处理：吸除水洗液，加入中和液，50-500rpm揺床中中和处理2-48h；吸除中和液，加入足量去离子水于揺床中水洗4-48h，重复两个水洗循环；制备的异种脱细胞肌腱组织材料需要进行冷冻干燥并冷冻保存。

在本发明一优选的实施例中，上述脱细胞前处理后，猪肌腱组织变成扁平状，其厚度为原来的1/5-1/2。

在本发明一优选的实施例中，步骤二的S1中水洗的条件为在50-500rpm揺床中，水洗12-72h。

在本发明一优选的实施例中，消化液为含胰酶的EDTA标准溶液，其中，胰酶的浓度为0.02-0.2％。

在本发明一优选的实施例中，步骤二S3中的终止消化的具体步骤为：吸除消化液，加入体积是消化液体积3-5倍的终止液，50-500rpm揺床中终止消化12-72h。

在本发明一优选的实施例中，终止液由在DMEM培养基中加入5-20％FBS、0-2％青霉素、0-2％链霉素和0-2％两性霉素B配制而成。

在本发明一优选的实施例中，除垢剂包括如下浓度的组分：0-10％次氯酸溶液、过氧乙酸、过氧化氢溶液中的一种或几种和1-10％曲通X-100溶液，除垢剂与待消化肌腱体积比为3-10:1。

在本发明一优选的实施例中，中和液为碳酸氢钠溶液、碳酸氢钙溶液、碳酸钙溶液中的一种或两种，浓度为1-10％，中和液与除垢剂的体积比为3-5:1。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

本实施提供一种异种脱细胞肌腱组织材料，其制备方法包括如下步骤：

步骤一，脱细胞前处理：采用循环渐进压力模块，对猪趾长屈肌腱(如图1)进行疏松化，使其变成扁平状，其厚度减少到原来的1/5，便于后续脱细胞液的渗透。

步骤二，脱细胞：

(1)将解冻的肌腱浸于去离子水中，于500rpm揺床中水洗12h。

(2)更换去离子水，继续于500rpm揺床中水洗12h。

(3)吸除水洗液，加入50mL消化液(含0.02％胰酶的EDTA标准溶液)，50rpm揺床中消化4h。

(4)吸除消化液，加入150mL终止液(DMEM培养基中添加5％FBS、2％青霉素和2％两性霉素B配制而成)，500rpm揺床中终止消化12h。

(5)吸除终止液，加入去离子水，水洗24小时。

(6)吸除水洗液，加入30ml除垢剂(含有浓度为10％的次氯酸溶液和浓度为1％的曲通X-100溶液)，于500rpm揺床中处理1h。

(7)吸除除垢剂，加入去离子水水洗24h，重复三个水洗循环。

步骤三，脱细胞后处理：吸除水洗液，加入90ml中和液(碳酸氢钠溶液)，于500rpm揺床中中和处理2h。吸除中和液，加入足量去离子水于揺床中水洗48h，重复两个水洗循环。之后将制备的脱细胞肌腱组织进行冷冻干燥，冷冻保存。

对本实施例获得的脱细胞肌腱组织进行电镜扫描，结果如图2，由图2可知肌腱脱细胞处理后，胶原纤维变疏松多孔，有利于细胞的粘附和迁移浸润。

实施例2

本实施提供一种异种脱细胞肌腱组织材料，其制备方法包括如下步骤：

步骤一，脱细胞前处理：采用压力模块+分段超声模块，对解冻的猪趾长屈肌腱进行循环渐进式加压，疏松化处理，使其变成扁平状，其厚度减少到原来的1/3，便于后续脱细胞液的渗透。

步骤二，脱细胞：

(1)将解冻的肌腱浸于去离子水中，50rpm揺床中水洗72h。

(2)更换去离子水，继续50rpm揺床中水洗72h。

(3)吸除水洗液，加入10mL消化液(含0.2％胰酶的EDTA标准溶液)，50rpm揺床中消化4h。

(4)吸除消化液，加入50mL终止液(在DMEM培养基中加入10％FBS、1％青霉素、2％链霉素和1％两性霉素B配制而成)，50rpm揺床中终止消化72h。

(5)吸除终止液，加入去离子水，水洗72小时。

(6)吸除水洗液，加入20ml除垢剂(含有浓度为10％的曲通X-100溶液)，于50rpm揺床中处理4h。

(7)吸除除垢剂，加入去离子水水洗72h，重复三个水洗循环。

步骤三，脱细胞后处理：吸除水洗液，加入100ml中和液(碳酸氢钙溶液)，于50rpm揺床中中和处理48h。吸除中和液，加入足量去离子水于揺床中水洗48h，重复两个水洗循环。之后将制备的脱细胞肌腱组织进行冷冻干燥，冷冻保存。

对本实施例获得的脱细胞肌腱组织进行电镜扫描，结果如图3。

实施例3

本实施提供一种异种脱细胞肌腱组织材料，其制备方法包括如下步骤：

步骤一，脱细胞前处理：采用压力模块，对解冻的猪趾长屈肌腱进行循环渐进式加压，使其变成扁平状，其厚度减少到原来的1/2，便于后续脱细胞液的渗透。

步骤二，脱细胞：

(1)将解冻的肌腱浸于去离子水中，300rpm揺床中水洗40h。

(2)更换去离子水，继续300rpm揺床中水洗40h。

(3)吸除水洗液，加入30mL消化液(含0.12％胰酶的EDTA标准溶液)，300rpm揺床中消化2.5h。

(4)吸除消化液，加入90mL终止液(在DMEM培养基中加入20％FBS、2％青霉素和2％链霉素配制而成)，300rpm揺床中终止消化40h。

(5)吸除终止液，加入去离子水，水洗40小时。

(6)吸除水洗液，加入25ml除垢剂(含有浓度为5％的次氯酸溶液和浓度为4％的曲通X-100)，于300rpm揺床中处理2.5h。

(7)吸除除垢剂，加入去离子水水洗40h，重复三个水洗循环。

步骤三，脱细胞后处理：吸除水洗液，加入100ml中和液C，于300rpm揺床中中和处理25h。吸除中和液，加入足量去离子水于揺床中水洗25h，重复两个水洗循环。之后将制备的脱细胞肌腱组织进行冷冻干燥，冷冻保存。

对本实施例获得的脱细胞肌腱组织进行电镜扫描，结果如图4。

验证实施例1

本发明涉及的脱细胞处理猪肌腱组织分为脱细胞前，脱细胞处理，脱细胞后三个阶段。本验证例对中和前后的脱细胞体外与细胞共培养，验证对细胞的生物相容性。结果如图5和6所示。由图5可知细胞在中和后脱细胞肌腱上粘附显著增加，每视野细胞数量比中和前组显著增加。由图6可知细胞在中和后的脱细胞肌腱上粘附形态良好，数量多；而在中和前脱细胞肌腱上细胞粘附数量少，粘附不佳。

验证实施例2

对上述3个实施例制备的猪脱细胞肌腱进行扫描电镜检测观察其微观结构，以正常猪肌腱为对照组，结果如图7所示。结果显示，正常猪肌腱纤维组织致密，没有空隙，组织中有细胞及细胞核成分(箭头所示)。而脱细胞处理后的脱细胞肌腱胶原纤维排列疏松，多孔结构，未见细胞及细胞核DNA成分，表明在脱细胞过程中已去除肌腱内部细胞及核DNA成分。

验证实施例3

对脱细胞肌腱进行生物力学检测，分别对正常猪肌腱、未进行脱细胞前处理的脱细胞肌腱(对照组)，按本发明介绍的流程处理的脱细胞肌腱(实验组)进行拉力检测。结果如图8所示，结果显示不进行脱细胞前处理的猪肌腱，由于直径较大，纤维致密，脱细胞液渗入困难，导致脱细胞时间较长，大大损害了脱细胞肌腱的生物力学性能。对脱细胞肌腱进行脱细胞细胞前处理后，脱细胞时间大为改善，脱细胞肌腱的生物力学性能较正常猪肌腱稍微降低，表明本发明的脱细胞流程可显著降低脱细胞处理对猪肌腱本身生物力学性能的损害。

对三个实施例制备的脱细胞肌腱进行生物力学检测，结果如图9所示。结果表明，3个实施例均可保护脱细胞处理对猪肌腱生生物力学的损害。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，脱细胞前处理：采用循环渐进压力模块+分段超声模块，对肌腱组织结构进行疏松化；

步骤二，脱细胞：

S1，对前处理后的肌腱用去离子水进行水洗两次；

S2，吸除水洗液，加入10-50mL消化液，50-500rpm揺床中消化0.5-4h；

S3，终止消化，然后水洗24-72小时，吸除水洗液，加入除垢剂，于50-500rpm揺床中处理1-4h；

S4，吸除所述除垢剂，加入去离子水水洗24-72h，重复三个水洗循环；

步骤三，脱细胞后处理：吸除水洗液，加入中和液，置于50-500rpm揺床中中和处理2-48h；吸除中和液，加入足量去离子水于揺床中水洗4-48h，重复两个水洗循环；

脱细胞前处理后，所述肌腱组织变成扁平状，其厚度为原来的1/5-1/2，且经超声处理使内部致密胶原组织疏松化；

所述消化液为含胰酶的EDTA标准溶液，其中，所述胰酶的浓度为0.02-0.2％；所述消化液与待消化肌腱的体积比为5-10:1；

所述除垢剂包括如下浓度的组分：0-10％次氯酸溶液和1-10％曲拉通X-100；所述除垢剂与待消化肌腱体积比为3-10:1；

所述肌腱组织为猪肌腱组织。

2.根据权利要求1所述的异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，其特征在于，所述步骤二S1中所述水洗的条件为在50-500rpm揺床中，水洗12-72h。

3.根据权利要求1所述的异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，其特征在于，步骤二S3中所述终止消化的具体步骤为：吸除消化液，加入体积是消化液体积3-5倍的终止液，50-500rpm揺床中终止消化12-72h。

4.根据权利要求3所述的异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，所述终止液由在DMEM培养基中加入5-20％FBS、0-2％青霉素、0-2％链霉素和0-2％两性霉素B配制而成。

5.根据权利要求1所述的异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，其特征在于，所述中和液为碳酸氢钠溶液、碳酸氢钙溶液、碳酸钙溶液中的一种或两种，浓度为1-10％；所述中和液与除垢剂的体积比为3-5:1。

6.根据权利要求1所述的异种脱细胞肌腱组织材料的制备方法，其特征在于，所述异种脱细胞肌腱组织材料需要进行冷冻干燥并冷冻保存。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的制备方法制备的异种脱细胞肌腱组织材料。

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