CN110384825A - 一种利用超声震荡技术制备组织工程肌腱材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组织工程脱细胞技术领域，具体是一种超声震荡技术制备肌腱/韧带脱细胞基质材料方法。本发明使用超声震荡技术脱细胞，保留有肌腱胶原纤维或纤维束固有的力学结构单位和细胞附着结构，具有良好的力学性能和生物相容性。使用超声震荡技术脱细胞的肌腱细胞外基质除可以应用于韧带、肌腱修复重建外，因其具有纤维材料的特性，还可以广泛应用于其他生物医学领域，社会需求量大。

Description

一种利用超声震荡技术制备组织工程肌腱材料的方法

技术领域

本发明涉及组织工程生物材料制备技术领域，具体地说，是一种新的利用超声震荡技术为组织工程肌腱材料脱细胞的方法。

背景技术

肌腱、韧带损伤后自身愈合能力差，导致纤维瘢痕形成，影响肢体活动，使肌腱、韧带应力降低，增加再次损伤风险。因此肌腱、韧带缺损的修复重建对改善患者生活质量非常重要。目前修复肌腱、韧带的主要方法包括自体移植、异体移植，自体移植是目前肌腱、韧带重建最有效的治疗方法。但能引起供体部位损害，且来源有限；同种异体移植存在免疫排异反应；人工合成材料如碳纤维、聚酯材料等非降解材料，短期内能提供足够的力学强度，但其不能再生，长期使用易引起磨损断裂。都无法广泛应用。因此，研究相关替代修复材料已成为急需解决的课题。

近年来组织工程肌腱开始进入众多研究者的视线，支架材料的选择问题是组织工程韧带面临的最大问题之一。理想的肌腱细胞支架材料需要具备：①具有良好的生物相容性。②具有良好的细胞亲和力。③具有良好的生物力学。④具有适宜的降解速度。用于肌腱组织工程研究的支架材料主要有天然高分子材料和合成高分子材料两大类。来源于自然界的天然高分子材料包括天然成分胶原纤维、蚕丝、藻酸盐类制成的胶体以及取自甲壳动物体内几丁质等，其组织相容性好，但力学性能较差降解速度快的缺点。合成高分子材料主要有聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA)3种，具有良好的力学性能和降解性，但存在亲水性低、细胞黏附性能差的缺点。这些可降解人工合成支架材料，因其不具备细胞外基质(ECM)良好的细胞亲和性及生物力学性能不理想，而限制其在肌腱和韧带损伤修复领域的应用。天然材料如胶原、蚕丝等具有良好的生物相容性，但在生物力学性能、构建仿生三维结构、表面修饰及降解的调节等多方面还有待于进一步研究。

脱细胞基质(ECM)是指通过处理生物组织而形成的支架，这种使用人体或动物组织去除细胞成分仅留下ECM的脱细胞支架材料修复缺损肌腱具有较好的临床实用性和应用前景。脱细胞肌腱材料主要成分是胶原纤维，但有别于胶原纤维材料。虽然都取材于动物(如来源于牛跟腱)，但胶原材料是将动物胶原(如肌腱和韧带胶原)溶解提纯的胶原分子，在体外聚合成原纤维，其提纯胶原分子的过程完全破坏了其ECM的空间结构和成分，如何再将其制备成具有肌腱和韧带ECM结构特点的替代物或组织工程支架一直未得到满意的解决。脱细胞基质直接从动物肌腱分离，进行脱细胞后获得，具备保留有肌腱ECM固有的力学结构单位和细胞附着结构，且去除了细胞成分。这种材料保留了原生的超微结构、生化成分和肌腱细胞外基质(细胞外基质)的抗张强度，更有利于干细胞分化和肌腱细胞生长。具备良好的组织相容性、细胞亲和力、良好的生物力学及适宜的降解速度。

异体和异种肌腱脱除细胞成分以后其抗原性明显减低。现有的脱细胞方法能脱除韧带或肌腱内细胞成分，去污剂的使用成为脱细胞的主要手段，但由于肌腱结构的固有特点，肌腱细胞位于胶原纤维一级束，表面有束膜和腱膜等致密结构层层包绕，脱细胞去污剂的作用机制主要是破坏蛋白间的链接，去除细胞的同时也破坏胶原纤维蛋白等细胞外基质(ECM)的结构。而且，完整的韧带、肌腱组织脱细胞时间长，脱细胞过程如长时间震荡、脱细胞液浸泡渗透等方法同样干扰ECM的结构和生物学性能。现有报道中，去污剂在脱除细胞的同时，不同程度的破坏细胞外基质，并且影响细胞粘附和增殖。另外完整的肌腱是致密的结缔组织，纤维束的包膜结构阻碍了细胞成分脱除和细胞植入。脱细胞基质与种子细胞复合培养时，细胞很难渗透到脱细胞基质内部对其进行重塑。因此，用现有的脱细胞方法获得的脱细胞基质并不利于细胞粘附、迁移和增殖，这些因素限制了脱细胞肌腱在组织工程肌腱领域的应用。

肌腱脱细胞基质材料为一种新型的生物材料，保留有肌腱/韧带ECM固有的力学结构单位和细胞附着结构，去除了细胞成分，具有良好的力学性能和生物相容性。如何在制备脱细胞基质过程中，减少对胶原纤维结构和理化性能的破坏，是目前肌腱脱细胞基质能否在组织工程领域得到广泛应用的前提，解决这一核心技术，未来肌腱脱细胞胶原纤维材料不仅应用于肌腱、韧带修复重建，因其具有纤维材料的特性，还可以应用于其他生物医学领域，应用前景广阔。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用超声震荡技术制备组织工程肌腱材料的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下方法：

1、肌腱脱细胞基质的冻干分离方法

肌腱/韧带胶原纤维或纤维束主要成分是胶原蛋白，传统的纤维分离提取技术中，化学方法溶解胶原是其重要步骤，因此不适用于肌腱/韧带胶原纤维的分离。本发明发现，低温干燥的肌腱纤维是可以机械分离的(图1)，分离的纤维保留一定的力学强度，通过物理开松和梳理的方法，选出可胶原纤维和纤维束，为制备肌腱脱细胞基质提供实验基础。

2、肌腱脱细胞基质超声脱细胞方法

本发明研究发现：脱细胞过程中，肌腱/韧带完整的腱膜/外膜阻碍了细胞成分的脱除，切开肌腱纤维束膜后脱除细胞成分过程较完整的肌腱明显简便有效，而且ECM的基质结构和成分无明显改变，具有良好的力学特性和生物相容性。超声震荡脱细胞是利用超声波在液体中的分散效应，使液体产生空化的作用，从而使组织细胞破碎。物理方法分离的胶原纤维或纤维束无完整的腱膜或外膜包绕，使得不使用化学去污剂使用的方法而仅使用超声波震荡粉碎将细胞成分脱除成为现实。

本发明的第一方面，提供一种超声震荡技术制备肌腱/韧带脱细胞基质材料方法，包括以下步骤：

a)清除新鲜动物肌腱/韧带表面的外膜和滑膜组织；

b)将肌腱/韧带置于-56℃真空冻干48h；

c)通过物理开松的方法将低温干燥的肌腱/韧带结构松散；

d)物理除杂、梳理等工序分离肌腱胶原纤维或胶原纤维束；

e)将分离的胶原纤维或纤维束进行超声震荡粉碎脱细胞，所述的超声振幅为240μm，频率20赫兹，超声震荡时间为5分钟(美国Qsonica Q700超声波破碎仪)；

f)将步骤e得到的脱细胞基质用干燥无菌纱布汲干水分后置于-56℃真空冻干12h。

进一步的，步骤c所述的物理开松方法是指挤压、锤击、真空反爆气流冲击等方法。

进一步的，步骤e所述的超声震荡方式是将胶原纤维或纤维束至于超声波破碎仪主体箱中，超声探头悬浮在样品上方0.5cm处，温度设置不超过40℃，接受5分钟的超声波处理。

进一步的，在步骤e处理之前，将步骤d分离的胶原纤维或纤维束放入Tris溶液，加入质量浓度0.05％丝氨酸蛋白酶抑制剂，常温下摇床震荡12h。倒掉溶液，加入质量浓度0.05％胰蛋白酶(GIBCO美国)，37℃摇床震荡2h。倒掉溶液，加入90U/mL核酸酶(type II牛)，37℃摇床震荡2h。所有步骤均在摇床(150RPM)进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液(10000U/ml 10000mg/ml)溶液预防污染，每一步骤均使用PBS冲洗3遍。

本发明的第二方面，提供一种肌腱/韧带脱细胞基质材料，其采用如上所述的方法制备得到。

本发明的第三方面，提供一种如上所述的肌腱/韧带脱细胞基质材料在制备韧带、肌腱修复重建材料中的应用。

本发明优点在于：

1、与发明人在先申请(201010149791.6脱细胞肌腱或韧带胶原纤维材料及其制备方法)中公开的方法相比，本发明增加了超声震荡步骤，克服了以往使用化学去污剂进行脱细胞产生的弊端：完整的肌腱组织脱细胞时间长，脱细胞过程如长时间震荡、脱细胞液浸泡渗透等方法干扰ECM的结构和生物学性能；化学去污剂去除细胞的同时也破坏胶原纤维蛋白等细胞外基质(ECM)的结构，并且影响细胞粘附和增殖。本发明使用超声震荡技术，制备的肌腱脱细胞基质材料，不含细胞成分，对细胞外基质(ECM)损伤更小，保留有肌腱胶原纤维或纤维束固有的力学结构单位和细胞附着结构，制备的材料具备良好的生物力学特性、ECM空间结构、生物相容性和实用性。

2、低温干燥对肌腱细胞外结构影响小，可以减小其抗原性，并且便于物理开松、梳理的方法分离胶原纤维或纤维束。实验证实，无腱膜包绕的胶原纤维或纤维束，通过超声波震荡漂洗可以脱除粘附于胶原纤维表面的细胞成分，并对其生物力学和组织相容性无明显影响。

3、本发明制备的肌腱脱细胞基质可以应用于韧带、肌腱修复重建外，因其具有纤维材料的特性，还可以广泛应用于其他生物医学领域，社会需求量大。

附图说明

图1：牛低温干燥韧带或肌腱胶原纤维或纤维束是可以分离的，扫描电镜50000倍；a.冻干肌腱纤维；b.初步分离肌腱纤维束；c.进一步分离细化的肌腱纤维束。

图2：a(10倍)正常肌腱纤维束；b(10倍)脱细胞后见胶原纤维、纤维束脱细胞彻底。

图3：使用超声震荡脱细胞，胶原原纤维的螺旋结构仍然存在，超微结构完好(电镜20000倍)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：超声震荡技术用于牛肌腱脱细胞基质制备：

1)取新鲜牛肌腱/韧带，清除肌腱/韧带表面的外膜和滑膜组织。

2)将肌腱/韧带置于-56℃真空冻干仪，48h。

3)通过物理开松等方法如挤压、锤击、真空反爆气流冲击等方法将低温干燥的使得肌腱/韧带结构松散。

4)将松散的肌腱/韧带进一步物理机械梳理分离肌腱/韧带胶原纤维或胶原纤维束。

5)将分离的胶原纤维或纤维束放入10mM的低渗Tris溶液，加入0.05％丝氨酸蛋白酶抑制剂(0.05％苯甲基磺酰氟化物乙醇溶剂，35ml/L 50ml乙醇+25mgPMSF)，常温下摇床震荡12h。倒掉溶液，加入0.05％胰蛋白酶，37℃摇床震荡2h。倒掉溶液，加入90U/mL核酸酶(type II牛)，37℃摇床震荡2h。所有步骤均在在摇床(150RPM)进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液(10000U/ml/10000mg/ml)溶液预防污染，完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。

6)将脱细胞纤维或纤维束至于超声波粉碎仪主体箱中，超声探头悬浮在样品上方0.5cm处，温度设置不超过40℃，超声振幅为240μm，频率20赫兹(美国Qsonica Q700超声波破碎仪)。接受5分钟的超声波处理。

7)将胶原纤维或纤维束用干燥无菌纱布汲干水分，置于-56℃真空冻干仪，12h后干燥保存待用。

实施例2：组织学检查

取脱细胞前、后的胶原纤维或纤维束给予石蜡包埋，切片(5μm)、HE染色观察。观察细胞核成分(苏木素染色)，胶原排列形态(伊红染色)，见细胞成分完全脱除(图2)。

实施例3：电镜检查

将肌腱脱细胞基质切取约5mm长度备用，取载物盘，将冻干新鲜肌腱和冻干肌腱纤维束样本固定与载物盘台表面，喷金粉，置入扫描电镜，抽取内部空气呈真空状态，开始检测。结果显示肌腱脱细胞成三维螺旋结构未见改变(图3)。

实施例4：胶原蛋白含量测定

肌腱纤维主要由胶原蛋白组成，羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4％，可以通过测定羟脯氨酸推算胶原蛋白含量，通过使用羟脯氨酸提取试剂盒测同等干重的新鲜肌腱和脱细胞基质，肌腱脱细胞基质均值477，新鲜肌腱组均值462ug/mg，通过t检验，P值0.48＞0.05，两组差异无统计学意义，说明超声震荡技术对胶原蛋白含量无影响。

实施例5：DNA含量测定

使用DNA提取试剂盒分别提取脱细胞基质DNA，结果如下：肌腱脱细胞基质DNA含量均值0.04274ug/mg，说明使用超声震荡技术制作肌腱脱细胞基质符合制组织工程材料标准(DNA＜0.05ug/mg)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种超声震荡技术制备肌腱/韧带脱细胞基质材料方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)清除新鲜动物肌腱/韧带表面的外膜和滑膜组织；

b)将肌腱/韧带置于-56℃真空冻干48h；

c)通过物理开松的方法将低温干燥的肌腱/韧带结构松散；

d)物理除杂、梳理工序分离肌腱胶原纤维或胶原纤维束；

e)将分离的胶原纤维或纤维束进行超声震荡脱细胞，所述的超声振幅240μm，频率20赫兹，超声震荡时间为5分钟；

f)将步骤e得到的脱细胞基质用干燥无菌纱布汲干水分后置于-56℃真空冻干12h。

2.根据权利要求1所述的超声震荡技术制备肌腱/韧带脱细胞基质材料方法，其特征在于，步骤c所述的物理开松方法是指挤压、锤击、或真空反爆气流冲击。

3.根据权利要求1所述的超声震荡技术制备肌腱/韧带脱细胞基质材料方法，其特征在于，步骤e所述的超声震荡方式是将胶原纤维或纤维束至于超声波破碎仪主体箱中，超声探头悬浮在样品上方0.5cm处，温度设置不超过40℃，接受5分钟的超声波处理。

4.根据权利要求1所述的超声震荡技术制备肌腱/韧带脱细胞基质材料方法，其特征在于，在步骤e处理之前，将步骤d分离的胶原纤维或纤维束放入Tris溶液，加入质量浓度0.05％丝氨酸蛋白酶抑制剂，常温下摇床震荡12h；倒掉溶液，加入质量浓度0.05％胰蛋白酶，37℃摇床震荡2h；倒掉溶液，加入90U/mL核酸酶，37℃摇床震荡2h。

5.根据权利要求4所述的超声震荡技术制备肌腱/韧带脱细胞基质材料方法，其特征在于，所有步骤均在在摇床进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液预防污染，完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。

6.一种肌腱/韧带脱细胞基质材料，其采用如权利要求1-5任一所述的方法制备得到。

7.一种如权利要求6所述的肌腱/韧带脱细胞基质材料在制备韧带、肌腱修复重建材料中的应用。