CN101185775A - 猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法，主要包括备料、浅表细胞破膜、浅表细胞脱除、深层细胞脱除等步骤，使用表面活性剂只需在完成浅表细胞脱除任务的同时将深层细胞破膜即可，所以只需在适当浓度的表面活性剂溶液中孵育振荡约1小时即可，对深层细胞脱除任务可以用较低的功率的超声波在较短的时间内即可完成，相互配合可使制备猪血管脱细胞的支架具有使用设备费用较低、制备时间较短、细胞脱除彻底、易于洗净表面活性剂、细胞外基质(支架)保存完好和良好的生物相容性、适度的生物降解速率、机械强度高、易于缝合固定等优点，该支架还有利于人体细胞的定植和生长，并能随着真的血管的再生而被逐渐降解和吸收。
Description
技术领域
本发明涉及一种医用材料，特别是将猪血管制备为人的血管的替代材料。属于医用假体材料领域。
背景技术
复杂心脏大血管畸形常需要使用生物血管，目前临床上应用较多的是生物血管，分为同种异体或异种异体二类，后者主要来自纯种猪。生物血管具有天然支架结构，最佳血流动力学，不需抗凝，其保存技术和临床应用成为复杂心脏外科治疗的热点。其中同种异体保存和应用技术较为成熟，但我国没有脑死亡法的规定，加之东方人的传统观念，同种异体血管几乎无法取得。而异种异体血管保存和应用处于起步研究阶段。
猪与人同源性较好，异种血管异于取得，可以制备多种型号，较小的型号比机械瓣或生物瓣更适于儿童特别是婴幼儿心脏外管道的建立。异种血管的免疫原性强，主要来源于上皮细胞，细胞外基质的组织结构和同种的相似，且二者免疫原性都很弱。因此对异种瓣膜及血管进行恰当的去细胞处理，脱去上皮细胞和成纤维细胞，保留完整的细胞外基质，得到去细胞的支架，为种植受体细胞，构建出完整的组织工程血管创造条件。
去细胞猪血管支架的要点为：(1)采用适宜的去细胞方法，即能够去细胞彻底，又能保持细胞外基质结构、功能的完整。(2)减少界面活性剂的使用降低其对人体的毒性等。
目前最常用的去细胞方法是联合应用表面活性剂、胰酶、核酸酶等脱去生物瓣膜及血管支架中的细胞成分。如曲拉通X-100和核酸酶消化方法，通过调整溶液的渗透压，达到去细胞的目的。但是曲拉通X-100去细胞需孵育振荡172小时以上，其结果用HE染色方法检测还可见极少量的蓝紫色的细胞核。德国Haverich的研究小组和英国Ingham研究小组采用各种表面活性剂分别和蛋白分解酶联合除去支架上的供体细胞，发现存在很多问题：(I)低浓度胰酶不能去除动脉壁深部的细胞成份，高浓度的胰酶可以引起支架结构的破坏。对于一定厚度的组织，很难除去其内部的细胞；(2)这些表面活性剂本身都是化学物质，对人体也有毒性，洗净后仍会有一定浓度的残留；(3)由于洗净需要数周以上的时间，可能会改变生物力学特性并可能增加感染机会等缺陷。
在化学的脱细胞方法中，如用曲拉通X-100脱细胞孵育振荡48小时后再用SDS(十二烷基硫酸钠)脱细胞孵育振荡48小时后的支架，用HE染色方法检测则未见细胞核，但细胞外基质中有蛋白多糖等成份流失。其效果也不理想。
为了避免上述的化学方法脱细胞的不足之处，我们研究了使用超高压的物理方法脱细胞，其效果理想，但其超高压设备昂贵，使用和维护费用很高，使脱细胞支架的成本较高。
发明内容
本发明的目的是为了避免上述化学方法对猪血管进行脱细胞需要时间很长，使表面活性剂深度侵入血管而难以洗净的不足之处，也避免上述超高压的物理方法对猪血管进行脱细胞的费用过高的不足之处，提供一种设备费用低、细胞脱除彻底、易于洗净表面活性剂、细胞外基质(支架)保存完好的与人体具有良好的生物相容性，适度的生物降解速率，有利于人体细胞的定植和生长的猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法。
众所周知，适当功率的超声波也具有脱细胞的作用，但在脱细胞过程中使用较大功率也会对细胞外基质(支架)产生破坏作用，如功率较小则会使细胞脱除不彻底，经多次试验的结果表明，采用超声波的物理方法与化学方法相结合可以实现使用设备费用较低、细胞脱除彻底、易于洗净表面活性剂、脱细胞的支架保存完好的猪血管脱细胞的支架，其制备方法包括以下的步骤：
A)备料：取健康猪的升主动脉和主动脉弓及不短于5mm冠状动脉，用PBS缓冲液清洗后放入二氧化碳干冰培养箱内消毒即为猪血管，备用；
B)浅表细胞破膜：将猪血管置于Tris低渗透缓冲液中孵育振荡24小时，取出后用PBS缓冲液振荡清洗数次，再置于Tris高渗透缓冲液中孵育振荡24小时，即可将猪血管的浅表细胞膜振破，取出后用PBS缓冲液振荡清洗数次；
C)浅表细胞脱除：将浅表细胞破膜后的猪血管置于适当浓度的表面活性剂溶液中孵育振荡约1小时，可使浅表细胞脱除并可使深层细胞破膜，取出用PBS缓冲液振荡清洗数次；
D)深层细胞脱除：将深层细胞已被破膜的猪血管再置于超声波破碎仪的装有双蒸水的容器中，将仪器设置在频率为20kHz，功率为135±35KW，工作5～15分钟，即可脱除猪血管的深层细胞，即为猪血管脱细胞的支架。
上述的Tris低渗透缓冲液包括Tris缓冲液10mmol/L，NaCl 0.05mmol/L，EDTA 1g/L，抑肽酶107 IU/L，青霉素钠100mg/L，链霉素105U/L；Tris高渗透缓冲液包括Tris缓冲液10mmol/L，NaCl 1.5mmol/L，EDTA 1g/L，抑肽酶107IU/L，青霉素钠100mg/L，链霉素105U/L。
上述表面活性剂溶液选用浓度为1％的曲拉通X-100溶液或浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠溶液或浓度为1％的脱氧胆酸钠溶液。
本发明使用表面活性剂和超声波的化学与物理相结合的制备方法制备猪血管脱细胞的支架，因在用超声波脱细胞前已用化学方法将猪血管的浅表细胞脱除并可使深层细胞破膜，再使用超声波的物理方法将已被破膜深层细胞脱除，就可以用较低的功率和较短的时间即可完成，而在较低的功率和较短的时间的超声波作用下，可以对细胞外基质(即支架)中的层粘连蛋白和纤维粘连蛋白不起破坏作用，又因为对深层细胞脱除任务主要是由超声波破碎仪完成，化学方法只需在完成浅表细胞脱除任务的同时只需将深层细胞破膜即可，所以只需在适当浓度的表面活性剂溶液中孵育振荡约1小时即可，只相当于用纯化学方法脱细胞时间的几十分之一，由于在表面活性剂溶液中的作用时间很短，有利于将支架上的表面活性剂清洗干净，明显减轻了单一化学方法造成化学物质残留所引起的不良后果，用本发明的化学与物理相结合的方法制备猪血管脱细胞的支架，具有使用设备费用较低、制备时间较短、细胞脱除彻底、易于洗净表面活性剂、细胞外基质(支架)保存完好和良好的生物相容性，适度的生物降解速率，机械强度高，易于缝合固定等优点，有利于人体细胞的定植和生长，并能随着真的血管的再生而被逐渐降解和吸收。
附图说明
附图1是用本发明方法制备前的血管扫描电镜图；
附图2是用本发明方法制备后的血管扫描电镜图；
附图3是用本发明方法制备后的血管层粘连蛋白的免疫组化染色图；
附图4是用本发明方法制备后的血管纤维粘连蛋白的免疫组化染色图。
具体实施方式
本发明的猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法，是经过各种脱细胞方法实验后的优选结果，现以物理方法中的超声波破碎仪和化学的表面活性剂中的曲拉通X-100为例对本发明方法作进一步详细描述如下：
A)备料：健康猪麻醉成功后按无菌手术要求取出猪的升主动脉和主动脉弓及不短于5mm冠状动脉，保留二尖瓣前叶和厚约3mm室间隔肌肉，用生理盐水冲洗，分别测量瓣环上10mm处和30mm处的动脉内径。用PBS缓冲液清洗后放入二氧化碳干冰培养箱内消毒。在超净工作台上取出消毒好的材料，装入真空包装袋中密封即为猪血管，注明血管名称、编号、血管内径、取材时间。
B)浅表细胞破膜：将猪血管从包装袋中取出后置于Tris低渗透缓冲液中孵育振荡24小时，取出后用PBS缓冲液振荡清洗数次，再置于Tris高渗透缓冲液中孵育振荡24小时，即可将猪血管的浅表细胞膜振破，取出后用PBS缓冲液振荡清洗3次，每次5～10分钟；
C)浅表细胞脱除：将浅表细胞破膜后的猪血管置于适当浓度的表面活性剂溶液即浓度为1％的曲拉通X-100溶液中孵育振荡约1小时，可使浅表细胞脱除并可使深层细胞破膜，取出后用PBS缓冲液振荡清洗不少于3次，每次0.5～1小时。
D)深层细胞脱除：将深层细胞已被破膜的猪血管再置于超声波破碎仪的装有双蒸水的容器中，将仪器设置在频率为20kHz，功率为135±35KW，工作5～15分钟，即可脱除猪血管的深层细胞，即为猪血管脱细胞的支架。
上述步骤B中所述的Tris低渗透缓冲液包括Tris缓冲液10mmol/L，NaCl 0.05mmol/L，EDTA 1g/L，抑肽酶107 IU/L，青霉素钠100mg/L，链霉素105U/L；Tris高渗透缓冲液包括Tris缓冲液10mmol/L，NaCl 1.5mmol/L，EDTA 1g/L，抑肽酶107IU/L，青霉素钠100mg/L，链霉素105U/L。
用本发明的化学与物理结合的方法制成的猪血管脱细胞的支架，其脱细胞结果和层粘连蛋白(Ln)及纤维粘连蛋白(Fn)的完好程度等经下述多种检测，其结果足以表明完全符合移植要求。
一、脱细胞检测
1)用HE染色方法检测：脱细胞后的血管经4％的多基甲醛固定，石蜡包埋，4um切片，苏木素、伊红染色，置光学显微镜下观察可见正常结构，未见蓝紫色细胞核或碎片，说明细胞已完全脱去。
2)用DAPI染色方法检测：脱细胞后的血管经DAPI染色免疫荧光染色检测，未见蓝紫色细胞核或碎片，说明细胞已完全脱去。
二、扫描电子显微镜检查
猪血管脱细胞的支架用扫描电子显微镜下观察：脱细胞前、后的血管以戊二醛固定，按电镜标本制作常规处理，观察脱细胞前后的血管内膜面的结构，脱细胞血管内膜表面细胞紧密排列，结构清晰，如图1所示。脱细胞后的血管未见细胞或其碎片残留，细胞外基质(也称为支架)结构完整、清晰，无破坏，胶原纤维清晰可见，没有断裂或异常交联，如图2所示。
三、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的检测
用免疫组化染色方法测试：脱细胞后的血管经4％多基甲醛固定，石蜡包埋后4um切片，抗原修复(纤维粘连蛋白采用微波热修复抗原，层粘连蛋白采用胃蛋白酶消化法修复)，DAB显色，常规树胶封片后光学显微镜发现层粘连蛋白存在，参见附图3，图中的黑点为层粘连蛋白。也发现纤维粘连蛋白存在，参见附图4，图中的黑点为纤维粘连蛋白。
在对比实验中，如单独使用超声波对猪血管脱细胞的方法中，当超声功率达到或超过180KW时，蛋白免疫组化染色面积减少，颜色变淡。如单独使用曲拉通X-100脱细胞48小时后再用SDS脱细胞48小时，得到的蛋白免疫组化染色面积明显减少，颜色变淡。每张免疫组化染色切片随机选择10个视野，捷达801图像分析仪测量系统准确测量免疫染色阳性区域测量面积，测量该区域的平均光密度值，二者的乘积表示蛋白的总含量，如表一所示：
统计学方法：分析免疫组化定量结果，组间采用t检验，数据以
表示。采用SPSS软件统计处理，检验水准α＝0.05。
表一
(血管脱细胞后血管支架内膜面层粘连蛋白、纤维连接蛋白免疫组化染色)
| 脱细胞分组 | 脱细胞前血管内膜面 | 曲拉通X-100脱细胞48小时后再用SDS脱细胞48小时脱细胞后的血管内膜面 | 用功率为180KW的超声波脱细胞后的血管内膜面 | 用化学和物理结合方法脱细胞后的血管内膜面 |
| Ln的阳性面积×平均光密度 | 0.0176±0.0025 | 0.0013±0.0003# | 0.0056±0.0007# | 0.0147±0.0016* |
| Fn的阳性面积×平均光密度 | 0.0159±0.0031 | 0.0024±0.0005# | 0.0073±0.0009# | 0.0134±0.00029* |
| 结果(与超高压前相比#P＜0.05，*P＞0.05) | 明显减少 | 明显减少 | 未见减少 | |
四、热皱缩温度测试
猪血管脱细胞支架的热皱缩温度测试：脱细胞前后的血管以蒸馏水为加温介质，采用热皱缩温度仪，用数字温度计测定血管热皱缩变形时的温度。如热皱缩温度降低反映胶原出现异常交联。该支架在脱细胞前、后的血管热皱缩变形时的温度没有明显变化，说明胶原交联正常，其结果如表二中的第二行所示。
五、力学性能测试
猪血管脱细胞支架的力学性能测试：脱细胞前后的血管用力学测试仪测量血管的最大负荷(支架断裂时的负荷)、伸长比(支架断裂时的长度和原长度的比值)。该支架在脱细胞前、后的血管的这些生物力学指标没有明显变化，说明力学性能正常，其结果如表二中第三行和第四行所示。
表二
| 脱细胞分组 | 脱细胞前的血管性能 | 脱细胞后的血管支架性能 |
| 热皱缩温度(℃) | 64.8±0.9 | 65.2±0.7 |
| 最大负荷(MPa) | 0.82±0.16 | 0.77±0.21 |
| 伸长比 | 1.87±0.25 | 1.80±0.27 |
综上所述，用本化学与物理相结合方法制备的猪血管脱细胞的支架符合医用移植要求。
Claims (3)
1.一种猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
A)备料：取健康猪的升主动脉和主动脉弓及不短于5mm冠状动脉，用PBS缓冲液清洗后放入二氧化碳干冰培养箱内消毒即为猪血管，备用；
B)浅表细胞破膜：将猪血管置于Tris低渗透缓冲液中孵育振荡24小时，取出后用PBS缓冲液振荡清洗数次，再置于Tris高渗透缓冲液中孵育振荡24小时，即可将猪血管的浅表细胞膜振破，取出后用PBS缓冲液振荡清洗数次；
C)浅表细胞脱除：将浅表细胞破膜后的猪血管置于适当浓度的表面活性剂溶液中孵育振荡约1小时，可使浅表细胞脱除并可使深层细胞破膜，取出用PBS缓冲液振荡清洗数次；
D)深层细胞脱除：将深层细胞已被破膜的猪血管再置于超声波破碎仪的装有双蒸水的容器中，将仪器设置在频率为20kHz，功率为135±35KW，工作5～15分钟，即可脱除猪血管的深层细胞，即为猪血管脱细胞的支架。
2.如权利要求1所述的猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法，其特征在于步骤B中所述的Tris低渗透缓冲液包括Tris缓冲液10mmol/L，NaCl 0.05mmol/L，EDTA 1g/L，抑肽酶107 IU/L，青霉素钠100mg/L，链霉素105U/L；Tris高渗透缓冲液包括Tris缓冲液10mmol/L，NaCl 1.5mmol/L，EDTA 1g/L，抑肽酶107IU/L，青霉素钠100mg/L，链霉素105U/L。
3.如权利要求1或2所述的猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法，其特征在于步骤D中所述的表面活性剂溶液选用浓度为1％的曲拉通X-100溶液或浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠溶液或浓度为1％的脱氧胆酸钠溶液。
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