CN101850136A - 一种植入式生物人工肝脏 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备生物人工肝脏支架的联合用试剂,包括:灌注液1:弱碱性低渗溶液或纯水;灌注液2:一组浓度呈梯度变化的离子型去垢剂水溶液;灌注液3:电解质水溶液;灌注液4:抗凝血因子水溶液;洗脱液1:蒸馏水;洗脱液2:非离子型去垢剂水溶液。本发明还提供了一种用前述联合用试剂制备植入式生物人工肝脏的方法;以及一种用上述方法制备的植入式生物人工肝脏。利用联合用试剂制备的生物人工肝脏支架完全去细胞化,且细胞外基质结构保持完整。该生物人工肝脏可容纳大量肝细胞并提供充足血供,使急性肝衰竭大鼠的生存时间明显延长,肝功能明显改善,具有极好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于临床医学、生物医学与再生医学领域,涉及组织工程与人工器官技术,具体涉及一种植入式生物人工肝脏。
背景技术
肝脏作为人体最重要的器官之一,承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能,由于各种原因一旦造成大量肝细胞的坏死,将出现肝衰竭,导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积,影响身体健康。
原位肝移植是迄今公认的治疗各种原因所致的终末期肝功能衰竭唯一有效的方法,但由于严重的供肝短缺,大量患者在等待肝移植的过程中死去。肝细胞移植因廉价、移植细胞易获取及冻存方便、操作简便等优点,正日益被人们所关注。最近的研究表明,利用组织工程和干细胞技术,可极大的提高移植细胞的再生和功能发挥,拓展肝细胞治疗的再生医学空间。
目前国内外多采用高分子合成的三维多孔可降解生物支架或天然基质材料结合不同来源的细胞(包括动物或人胚胎干细胞、骨髓或脐血等来源的成体干细胞、胎儿或成人的原代肝细胞等)直接进行体内移植实验,以期重建人工肝脏(或肝组织)来替代受损的宿主肝脏功能。如:在丁义涛等,生物性人工肝治疗肝衰竭的研究进展,内科急危重症杂志,2009年第15卷第3期,一文中公开,目前的生物人工肝脏支架几乎均为人工合成材料,但人工合成材料支架有其难以克服的两个缺点:一方面,由于其为人工合成材料,生物相容性比较低;另一方面,人工合成的肝脏支架没有血管结构,因此人工肝脏植入受体以后,其血供为另一个难题。
因此,用去细胞化的天然肝脏支架代替人工合成材料支架构成人工肝脏,成为了一个新的研究方向。许多研究表明去细胞化的天然肝脏支架与人工合成支架相比具有更好的生物相容性,使得细胞的贴附生长变得更加的容易。除此以外,去细胞化的天然肝脏支架上也保留了其原有的血管结构。
现有报道获取去细胞化天然人工肝脏支架方法的文献较多。如:申请号为US2005/0249816,申请日2005年10月10日的美国发明专利中公开了一种天然肝脏的去细胞化的方法:在胞膜剥离液中机械搅拌对未经处理过的离体肝脏使去掉肝脏进行去细胞化,而保留其基质结构;用有效浓度的细胞裂解液灌注肝脏使细胞分裂脱落,而保留其基质结构;用灌注液冲洗肝脏中脱离的细胞直到完全去细胞化;其中细胞裂解液可以是含有去垢剂的碱性溶液,如含0.5%Triton X-100的氨溶液,所述的灌洗液可以是蒸馏水、生理盐水或者培养基。康玉占等在公开号为CN101564554A,申请日2009年10月28日的中国发明专利以及稍后发表的文献去细胞化技术在全肝支架建立中的应用,中华医学杂志,2009,86(16):1135~1138中,均公开了一种肝脏的去细胞方法,该方法通过门静脉插管,以灌注液I即含有离子型去垢剂的Tris-Hcl溶液(十二烷基磺酸钠(SDS))灌注离体肝脏,使得肝脏由土黄色变成乳白色;以蒸馏水灌注,以充分洗脱灌注液I;以灌注液Ⅱ即含有非离子去垢剂的Tris-Hcl溶液(曲拉通X-100(Triton-100))灌注,使得肝脏变为透明;以蒸馏水灌注,以充分的洗脱灌注液II中的离子型去污剂。
上述方法中均采用浓度恒定的一种或多种去垢剂组合对离体肝脏去细胞化,因去垢剂会破坏部分细胞外基质成分,上述去细胞化灌注液使得去细胞化肝脏支架的细胞外基质受到不同程度的损坏,影响了天然肝脏支架的结构,不利于肝细胞贴附生长。
如前所述,去细胞化的天然肝脏支架保留了其原有的血管结构,为人工肝脏的植入提供了条件。然而经过处理后的天然肝脏支架由于胶原暴露,植入体内后,会发生严重的凝血现象,最终导致移植失败。
由于上述缺陷,目前尚未有由去细胞化的天然人工肝脏支架制备的可以植入体内的生物人工肝脏的报道。
目前人工肝脏所采取的移植位点多是皮下、脾、胰腺、肾包膜和腹腔内,但都受限于植入肝细胞量太少和血供无法保证,致使植入细胞无法最终替代器官功能,导致移植的失败。如能找到一种既能保证同时植入大量肝细胞(重量达到原有肝脏重量10%及以上),又能保证植入肝细胞的血液供应,支持肝细胞存活并发挥功能,对于各种原因所致的急慢性肝功能衰竭治疗具有极其重要的意义。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明提供一种新的制备人工肝脏支架的联合用试剂,包括:灌注液1:弱碱性低渗溶液或纯水;灌注液2:一组浓度呈梯度变化的离子型去垢剂水溶液;灌注液3:电解质水溶液;灌注液4:抗凝血因子水溶液;洗脱液1:蒸馏水;洗脱液2:非离子型去垢剂水溶液。所述联合用试剂还可以包括灭菌用的灌注液5。
优选的,所述弱碱性低渗溶液为质量分数为0.1%的氨水溶液;所述一组浓度呈梯度变化的离子型去垢剂水溶液分别为质量分数为1%、0.5%和0.25%的SDS溶液;非离子型去垢剂水溶液为1%的Triton X-100溶液;电解质水溶液为1g/L的PDADMAC溶液;抗凝血因子的水溶液为2g/L的肝素溶液;所述灭菌用灌注液5为含抗生素的蒸馏水;所述灌注液5所含抗生素为青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)、两性霉素B(2μg/ml)、氟康唑(0.2mg/ml)和/或甲硝唑(50μg/ml);
本发明还提供一种制备可植入体内的生物人工肝脏的方法,包括如下步骤:
a、对离体肝脏去细胞化:用灌注液1灌注至肝脏中心区成乳白色,用洗脱液1蒸馏水洗脱,然后用灌注液2灌注;用洗脱液2洗脱后得到人工肝脏支架;
b、对步骤a得到的人工肝脏支架进行抗凝修饰:用灌注液3灌注人工肝脏支架,用洗脱液1洗脱后再用灌注液4灌注,再用洗脱1洗脱,该过程至少重复7次,得到可植入体内的生物人工肝脏支架;
c、将肝细胞贴附到步骤b得到的生物人工肝脏支架上,即得到可植入体内的生物人工肝脏。所述步骤a和b中还包括用灌注液5灌注灭菌。
优选的,步骤a中,灌注液1灌注时间为12~24小时;灌注液2中各浓度的灌注液分别灌注1~2小时;灭菌时用灌注液5灌注6~12小时,洗脱液1洗脱时间30~60分钟;洗脱液2洗脱30~120分钟;
步骤b中用灌注液3灌注10分钟,然后静置20分钟,用洗脱液1灌注10分钟;接着用灌注液4灌注10分钟,然后静置20分钟;用洗脱液1灌注10分钟,该过程重复至少7次;
步骤c中贴附时,将浓度为3.3×107个/ml细胞培养基的肝细胞注入步骤b得到的生物人工肝脏支架,静置4~6小时,用细胞培养基灌注培养2小时,再用生理盐水灌注30分钟;
步骤a和步骤b灭菌时用灌注液5灌注2小时。
更优选的,步骤a中灌注液1、2、5和洗脱液1的灌注速度均为1ml/min;步骤b中灌注液3、4以及洗脱液1的灌注速度均为5ml/min,灌注液5的灌注速度为2ml/min;步骤c中细胞培养液和生理盐水的灌注速度为2ml/min。
本发明的另一目的是提供一种由上述方法制备的可植入体内的生物人工肝脏。
本发明的优点:本发明采用的去细胞化全部或部分肝脏并带有血管结构的天然支架,可以最大限度的模拟肝细胞所在的肝脏内细胞外基质环境,利于肝细胞的贴附和肝细胞特异性功能的保持,同时可以容纳大量的肝细胞。经过内部表面抗凝处理后,该生物人工肝脏可以植入门静脉系统,因为保留有原天然肝脏血管系统,所以可以为内部的肝细胞提供丰富的血供,保证内部肝细胞的存活和功能发挥。利用该发明进行移植治疗急性肝功能衰竭(AHF),生物人工肝在受者体内存活并有效替代受者受损肝脏功能,可显著延长受者生存时间,为组织工程肝脏移植治疗各种原因所致的急性肝功能衰竭提供新的途径。
附图说明
图1为本发明实施例3的植入式生物人工肝脏(大鼠用)。
图2A为本发明的实施例1中去细胞化天然肝脏支架,图2B、图2C和图2D显示了去细胞化天然肝脏的病理切片(HE染色和Masson染色),免疫荧光染色(collagen type Ⅰ和DAPI)以及扫描电镜图片。
图3为对比文件,康玉占等,去细胞化技术在全肝支架建立中的应用,中华医学杂志,2009,86(16):1135~1138的去细胞化效果图。3A为对比文件中去细胞化全肝大体图片,图3B和图3C为HE染色和扫描电镜照片。
图4A为本发明的实施例1中去细胞化天然肝脏微血管的荧光染料灌注染色,图4B和图4C为去细胞化天然肝脏中微血管的扫描电镜图片。
图5A为本发明的实施例2中内部层—层自组装抗凝表面修饰示意图。图5B为经内部表面抗凝处理的去细胞化天然肝脏支架的甲苯胺蓝染色。图5C为经过内部表面抗凝处理在植入体内3小时后的HE染色。
图6为本发明实施例3中,植入受者(大鼠)门静脉系统内的生物人工肝脏。
图7A和图7B为本发明实施例3中植入门静脉系统内72小时后的生物人工肝脏病理切片(HE染色)。
图8A为本发明实施例3中生物人工肝脏植入门静脉系统72小时后,逆转录PCR显示其中肝细胞特异性功能基因的表达情况。图8B为生物人工肝脏植入门静脉系统72小时后,免疫组织化学显示其中肝细胞白蛋白表达情况,透射电镜和PAS染色显示其中糖原合成情况。图8C为接受生物人工肝门静脉植入治疗的急性肝衰竭大鼠(90%肝切除模型)的血氨变化情况。图8D为接受生物人工肝门静脉植入治疗的急性肝衰竭大鼠(90%肝切除模型)的生存曲线。
以下通过具体实施方式对本发明做进一步说明,但并非对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1 大鼠肝脏去细胞化
用蒸馏水和质量分数为28%的浓氨水配制质量分数为0.1%的氨水溶液1000ml。用蒸馏水配制浓度分别为1%,0.5%和0.25%的SDS(十二烷基硫酸钠)各100ml。用蒸馏水配制体积分数为1%的Triton X-100溶液50ml。
手术从大鼠体内取出带有门静脉和肝上下腔静脉的大鼠肝脏中叶。分别在门静脉和肝上下腔静脉中插管。以1ml/min的速度向肝中叶中灌注0.1%的氨水溶液12小时,此时肝脏中心变成乳白色,流出的灌注液成浑浊的棕黄色;然后用蒸馏水1ml/min的速度灌注30分钟;接着用浓度分别为1%,0.5%和0.25%的SDS以1ml/min的速度分别灌注1小时;然后用1%的Triton X-100溶液以1ml/min的速度灌注30分钟,充分洗脱SDS残留。最后用含有常用抗菌剂量的抗生素如:青霉素、链霉素、两性霉素B、氟康唑和/或甲硝唑等的灭菌蒸馏水以1ml/min的速度灌注6小时。对去细胞化支架进行无菌处理。
结果如图2和图4:
图2A为去细胞化天然肝脏支架,图2B、图2C和图2D显示了去细胞化天然肝脏的病理切片(HE染色和Masson染色),免疫荧光染色(collagen type和DAPI)以及扫描电镜图片,显示出非常完全的去细胞化作用,同时保留了完整的细胞外基质,与现有技术(见图3)中去细胞化效果相比,具有明显的优势。
图4A为去细胞化天然肝脏微血管的荧光染料灌注染色,图4B和图4C为去细胞化天然肝脏中微血管的扫描电镜,图中显示灌注后天然支架保留了血管和血管网络。
实施例2 去细胞肝脏支架内部表面抗凝处理
用无菌蒸馏水配制1g/L的PDADMAC溶液和2g/L的肝素溶液。从实施例1中得到的去细胞化肝脏支架的门静脉插管中以5ml/min的速度灌注1g/L的PDADMAC溶液10分钟,然后静置20分钟;用无菌蒸馏水以5ml/min的速度灌注10分钟,去除PDADMAC溶液;接着以5ml/min的速度灌注2g/L的肝素溶液10分钟,然后静置20分钟;用无菌蒸馏水以5ml/min的速度灌注10分钟,去除肝素溶液;然后重复上述过程7次(总共进行8次),完成层—层自组装内部表面抗凝修饰后,最后用含有常用抗菌剂量的抗生素如:青霉素、链霉素、两性霉素B、氟康唑和/或甲硝唑的灭菌蒸馏水以2ml/min的速度灌注2小时。对内表面抗凝修饰后去细胞化支架进行无菌处理。然后将内表面抗凝修饰后去细胞化支架上门静脉和大鼠肝脏门静脉分支相连,内表面抗凝修饰后去细胞化支架上肝上下腔静脉和大鼠下腔静脉连接,在血液灌流中测试3个小时。
结果如图5B和图5C:
图5B为经内部表面抗凝处理的去细胞化天然肝脏支架的甲苯胺蓝染色,显示其内表面有肝素沉积。图5C显示经过内部表面抗凝处理的去细胞化天然肝脏支架在植入体内3小时后的HE染色,显示人工肝脏在植入体内3小时后不会出现血栓。
实施例3 门静脉植入式生物人工肝治疗急性肝衰竭大鼠
常规分离大鼠肝细胞,经台盼兰染色检测活性大于90%。将1×108个新鲜分离的大鼠肝细胞悬浮于3ml培养基中,并从门静脉插管,注入实施例2中经内部表面抗凝处理的去细胞化天然肝脏支架中。然后静置4个小时令肝细胞贴附。接着用细胞培养基如:RPMI1640或DMEM,以2ml/min的速度从门静脉处灌注培养2小时。最后用生理盐水以2ml/min的速度灌注30分钟,清除生物人工肝脏中的培养基,准备将该人工肝脏植入因90%肝脏切除所致的急性肝衰竭大鼠模型门静脉中。将大鼠门静脉切断,将生物人工肝脏上原有门静脉和大鼠门静脉下段相连,生物人工肝脏上原有肝上下腔静脉和大鼠门静脉上端相连。
90%肝切除所致肝衰竭模型大鼠,分为治疗组和非治疗组各10只,每12小时观察两组大鼠生命体征和肝功能,并绘制生存曲线。确定门静脉植入式生物人工肝脏对肝衰竭模型大鼠的治疗作用。
结果如下表1,图1、图6、图7和图8:
表1 植入式人工肝脏和移植受者(大鼠)原有肝脏中细胞数量(总DNA)的比较
表1为植入式生物人工肝脏和移植受者(大鼠)原有肝脏中细胞数量(总DNA)的比较,其结果显示生物人工肝脏中的肝细胞重量达到了受者原有肝脏重量的10%。
图1为植入式生物人工肝脏(大鼠用)在植入前,图6为成功植入受者(大鼠)门静脉系统内的生物人工肝脏。
图7A和图7B为植入门静脉系统内72小时后的生物人工肝脏病理切片(HE染色)显示其中状态良好的肝细胞和肝细胞周围丰富的血供。
图8A为生物人工肝脏植入门静脉系统72小时后,逆转录PCR显示其中肝细胞特异性功能基因都获得很好的表达。图8B显示生物人工肝脏植入门静脉系统72小时后,免疫组织化学显示其中肝细胞白蛋白合成旺盛,透射电镜和PAS染色显示其中糖原合成旺盛。图8C,显示接受生物人工肝门静脉植入治疗的急性肝衰竭大鼠(90%肝切除模型)的血氨水平比非治疗组明显下降。图8C,显示接受生物人工肝门静脉植入治疗的急性肝衰竭大鼠(90%肝切除模型)的生存时间比非治疗组大鼠明显延长,从16小时延长到了72小时。
根据附图中的各项指标显示,本发明中的门静脉植入式生物人工肝脏黏附生长的肝细胞重量达到了受者原有肝脏重量的10%,可容纳大量肝细胞,植入后血供充足,肝细胞生长良好,使急性肝衰竭大鼠的生存时间明显延长,肝功能明显改善,首次成为一种真正意义上的可替代受损肝脏的可移植器官。
上述实验证明,本发明方法制备的生物人工肝脏支架由于具有完整的细胞外基质,细胞贴附生长良好,且在植入体内后不会产生血栓,在体内肝细胞生长良好,在治疗急性肝衰竭大鼠的实验研究中具有的独特优势,为制备人工肝脏,解决肝源不足提供了可能,具有极好的临床应用前景。
Claims (9)
1.制备人工肝脏支架的联合用试剂,包括:灌注液1:弱碱性低渗溶液或纯水;灌注液2:一组浓度呈梯度变化的离子型去垢剂水溶液;灌注液3:电解质水溶液;灌注液4:抗凝血因子水溶液;洗脱液1:蒸馏水;洗脱液2:非离子型去垢剂水溶液。
2.根据权利要求1所述的联合用试剂,其特征是:还包括灭菌用的灌注液5。
3.根据权利要求1或2所述的联合用试剂,其特征是:所述弱碱性低渗溶液为质量分数为0.1%的氨水溶液;所述一组浓度呈梯度变化的离子型去垢剂水溶液分别为质量分数为1%、0.5%和0.25%的SDS溶液;非离子型去垢剂水溶液为1%的Triton X-100溶液;电解质水溶液为1g/L的PDADMAC溶液;抗凝血因子的水溶液为2g/L的肝素溶液;所述灭菌用灌注液5为含抗生素的蒸馏水。
4.根据权利要求3所述的联合用试剂,其特征是:所述灌注液5所含抗生素为青霉素、链霉素、两性霉素B、氟康唑和/或甲硝唑。
5.一种制备可植入体内的生物人工肝脏的方法,其特征在于:包括如下步骤:
a、对离体肝脏去细胞化:用灌注液1灌注至肝脏中心区成乳白色,用洗脱液1蒸馏水洗脱,然后用灌注液2灌注;用洗脱液2洗脱后得到人工肝脏支架;
b、对步骤a得到的人工肝脏支架进行抗凝修饰:用灌注液3灌注人工肝脏支架,用洗脱液1洗脱后再用灌注液4灌注,再用洗脱1洗脱,该过程至少重复7次,得到可植入体内的生物人工肝脏支架;
c、将肝细胞贴附到步骤b得到的生物人工肝脏支架上,即得到可植入体内的生物人工肝脏。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤a和b中还包括用灌注液5灌注灭菌。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于:步骤a中,灌注液1灌注时间为12~24小时;灌注液2中各浓度的灌注液分别灌注1~2小时;灭菌时用灌注液5灌注6~12小时,洗脱液1洗脱时间30~60分钟;洗脱液2洗脱30~120分钟;
步骤b中用灌注液3灌注10分钟,然后静置20分钟,用洗脱液1灌注10分钟;接着用灌注液4灌注10分钟,然后静置20分钟;用洗脱液1灌注10分钟,该过程重复至少7次;
步骤c中贴附时,将浓度为3.3×107个/ml细胞培养基的肝细胞注入步骤b得到的生物人工肝脏支架,静置4~6小时,用细胞培养基灌注培养2小时,再用生理盐水灌注30分钟。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征是:步骤a中灌注液1、2、5和洗脱液1的灌注速度均为1ml/min;步骤b中灌注液3、4以及洗脱液1的灌注速度均为5ml/min,灌注液5的灌注速度为2ml/min;步骤c中细胞培养液和生理盐水的灌注速度为2ml/min。
9.一种由权利要求5~8任一一项所述方法制备的可植入体内的生物人工肝脏。
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