CN112272517B - 组织去细胞化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产至少一部分无总动脉的小叶器官的去细胞化细胞外基质(ECM)支架的方法，所述方法包括：a)闭合传入血管以基本上封闭非人类供体或死亡/脑死亡的人类供体内无总动脉和/或主动脉的靶小叶器官或其部分；b)可选地：(i)清除至少一部分所述闭合的传入血管中的凝结物和/或血液；和/或(ii)灌注所述器官或其部分以确认所述传入血管的闭合；c)从供体中取出所述封闭的器官或其部分；和d)向所述封闭的器官或其部分灌注洗涤剂和酶溶液，以获得去细胞化ECM支架。还提供了生产人造器官的方法、以及通过所述方法生产的人造器官。

Description

组织去细胞化的方法
技术领域
本发明涉及生产至少一部分无总动脉的小叶器官的去细胞化细胞外基质(ECM)支架的方法、通过该方法获得或可获得的支架、重新填充支架的方法以及包含所述支架的人造器官。
背景技术
对于许多患者来说，器官移植是重要的挽救生命的治疗。然而，尽管器官捐献者的数量增加了，但仍无法满足器官的需求。英国国民健康服务系统(National HealthService)的数据显示，在2016年3月至2017年3月之间，在英国的积极等待移植的名单上有411名患者死亡。捐献者和接受者必须进行组织匹配以减少移植排斥的可能性，甚至，绝大多数接受者在其余生中都需要进行免疫抑制，这可能会导致并发症，例如感染风险的增加或其他器官的损伤。
器官生物工程涉及在支持性支架上接种细胞，是器官移植领域中正在发展的领域。目前，血管、膀胱、气道和尿道等简单器官的成功构建和移植已经成为可能。通常，这些器官的构建涉及将自体细胞接种到简单的生物材料支架上。由于其结构简单(包括空心和薄壁)，一旦植入患者体内，这些人造器官就可以通过来自相邻组织的氧气和营养物质的扩散而得到支持，直到血管生成。但是，较复杂的器官不能通过扩散来支持，并需要连接接受者的血液供应，这对开发包括传入血管(afferent blood vessel)和传出血管(efferentblood vessel)的人造器官构成了挑战。
已经提出的有关该问题的一种潜在解决方案涉及肾脏移植，是使用由人或动物肾脏的细胞外基质(ECM)产生的完整支架。使用洗涤剂灌注肾动脉使供体肾脏去细胞化，并产生具有完整血管网络以及保留各种结构蛋白和三维结构的ECM支架(Katari et al 2014)。尽管所述支架在人造肾脏的开发中显示出前景，但是作者总结说在支架上接种细胞和细胞的生长尚未达到能够生产人造肾脏以用于移植的程度。胰腺的灌注-去细胞化是通过前肝型门静脉的导管插入术进行的，其中肝前型门静脉是由脾静脉和肠系膜上静脉的汇合形成的(Goh et al 2013)。作者指出，试图通过其他循环系统(例如胰管)灌注器官的尝试未能成功地产生可用的去细胞化的ECM支架。
去细胞化的ECM支架在人造器官的开发中显示了前景，但是仍然存在重大的技术挑战，特别是对于具有复杂结构的器官，例如具有小叶结构且缺乏总动脉和/或主动脉的器官。其中一种这样的器官是胸腺，它由两个小叶(lobe)组成，每个小叶都接收来自甲状腺下动脉和胸腔内动脉的分支的血液供应。由于缺乏向器官供应的总动脉或主动脉或静脉或导管，因此无法使用对于诸如肾脏或胰腺的器官所使用的灌注-去细胞化的方法。迄今为止，只能通过在洗涤剂溶液中机械摇动或旋转器官来获得胸腺支架，这导致了整个支架的特性不佳，并且无法维持精细的网状结构和脉管系统(Fan et al 2015)。
发明概述
无总动脉的小叶器官通常发育为单独的小叶，其作为独立的血管化结构迁移到它们的最终位置，此后小叶可通过结缔组织层相互粘附。由于缺乏对整个器官的总动脉供应，或实际上有时缺乏对其小叶的总动脉供应，因此无法应用灌注-去细胞化方法从这些器官中获得ECM支架。不过，本发明人已经开发了允许对这种小叶器官进行全器官灌注的技术。本发明的方法通过封闭传入血管来创建人工灌注系统，这使得将灌注-去细胞化方法能够应用于此类器官。
因此，本发明第一方面提供了一种生产至少一部分无总动脉的小叶器官的去细胞化细胞外基质(ECM)支架的方法。所述方法包括：a)闭合(close)传入血管以基本上封闭(seal)非人类供体或死亡/脑死亡的人类供体中无总动脉和/或主动脉的靶小叶器官或其部分；b)可选地：(i)清除至少一部分所述闭合的传入血管中的凝结物和/或血液；和/或(ii)灌注所述器官或其部分以确认所述传入血管的闭合；c)从供体中取出所述封闭的器官或其部分；和d)向所述封闭的器官或其部分灌注洗涤剂和酶溶液，以获得去细胞化ECM支架。由本发明所述方法提供的新的人工灌注系统方式使得从无总动脉的小叶器官获得去细胞化ECM支架，同时保留包括血管网络在内的ECM的精细网状结构。在本发明的实施方案中，所述ECM支架获自所述小叶器官的一部分，例如一个小叶或腺体，所述小叶或腺体缺少总动脉的供应。
在本发明的一个实施方案中，可以在进行上述步骤a-d之前从存活的人类供体中取出靶器官或其部分。本实施方案获得的去细胞化ECM支架可以如下所述进行使用。
基本上封闭靶器官，或其部分，意味着供应所述器官或小叶的关键血管是被闭合的，从而形成人工灌注系统。通常，将留出一条或两条血管保持开放以便随后插管以灌注所述器官。优选地，仅留一条血管保持开放以便随后插管。闭合血管的合适技术对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，可以夹紧、缝合或堵塞所述传入血管。在本发明的优选实施方案中，绑扎所述传入血管。
所述供体可以是非人类供体，优选为非人类哺乳动物，例如猪。可选地，所述供体可以是死亡/脑死亡的人类供体，例如脑死亡、有心跳、呼吸的潜在器官供体。所述人类供体可以是儿童、成人或老年供体。由于所述支架的来源可能是同种或异种的，因此最好是最大程度的去细胞化。然而，这必须与保持ECM完整性和生物活性的需求相平衡，因为已证明ECM会影响细胞迁移、增殖和分化。所述ECM的三维结构、表面拓扑结构和组成均会导致这些影响。尽管术语去细胞化(decellularisation)尚未通过定量指标来充分定义，但已提出了一些最低限度的标准，包括每毫克ECM干重中少于50ng dsDNA、小于200bp DNA片段长度和/或在组织的组织学染色中无可见的核物质。通过本发明的方法生产的去细胞化ECM可以满足这些标准中的任何一个或多个。
如上所述，本发明的所述方法可选地包括清除至少一部分所述闭合的传入血管中的凝结物和/或血液的步骤。这可以通过使用惰性缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))清洗所述血管来实现。从所述闭合的传入血管中去除凝结物和/或血液有助于确保已建立的人工灌注系统没有任何堵塞，并且随后可以自由地注入洗涤剂。
所述方法可以另外地或可选地包括向所述封闭的器官或其部分进行灌注以确认传入血管闭合的步骤。通常，将通过在封闭器官或其部分的步骤中对尚未闭合的传入血管插管以进行所述灌注。可以使用诸如PBS的惰性缓冲液来进行所述灌注的步骤，并且可以用于鉴定任何其他仍然需要闭合(例如，由于各个供体之间的解剖学差异)的传入血管。所述灌注的步骤还可能有益于鉴定血管的任何不完全闭合，而这种不完全封闭可能不利于通过其闭合形成的人工灌注，因此能够在靶器官或其部分的灌注-去细胞化之前对其进行纠正。
许多合适的洗涤剂和酶溶液可用于靶器官或其部分的灌注-去细胞化作用。具体地，所述洗涤剂可以选自脱氧胆酸钠(SDC)、十二烷基硫酸钠(SDS)和Triton X-100中的一种或多种。在本发明的优选实施方案中，所述洗涤剂是SDC，其已显示出产生保留了ECM的精细的天然网状结构和脉管系统的去细胞化ECM支架。另外，所述洗涤剂是无毒的，并且在一个或多个灌注-去细胞化循环完成后，可以简单地用水冲洗掉。相反，SDS可能需要使用其他洗涤剂去除。
可基于待灌注的所述器官或其部分的体积、一个或多个灌注循环的持续时间以及灌注速率来优化洗涤剂的浓度。例如，可以向所述器官或其部分灌注约1％至约10％(w/v)的SDC，优选约1％至约7％(w/v)，更优选约2％至约6％(w/v)的SDC。在本发明的优选实施方案中，可以向所述器官或其部分灌注约4％(w/v)的SDC。可选地，可以向所述器官或其部分灌注约0.05％至约1％(w/v)的SDS，优选约0.05％至约0.5％(w/v)的SDS，更优选可以向所述器官或其部分灌注约0.1％(w/v)的SDS。可以向所述器官或其部分灌注约0.05％至约5％(w/v)的Triton X-100，优选约0.1％至约2％(w/v)，更优选可以向所述器官或其部分灌注约1％(w/v)的Triton X-100。在本发明的用于所述器官或其部分的灌注-去细胞化的洗涤剂为SDS的实施方案中，一旦所述灌注-去细胞化的步骤完成，可以用另一种洗涤剂例如Triton X-100洗涤所述器官或其部分。
本发明中使用的洗涤剂和酶溶液优选包含一种或多种酶，例如核酸内切酶(例如脱氧核糖核酸酶I)或蛋白酶(例如胰蛋白酶)。所述洗涤剂和酶可以以分开的溶液提供或者可以在单一溶液中混合。
所述器官或其部分的灌注-去细胞化优选利用洗涤剂-酶进行处理(DET)，这是本领域技术人员所熟知的。如上所述，向无总动脉的靶小叶器官或其部分供血的主要传入血管是闭合的，以基本上封闭所述器官或其部分，其中一条或两条血管保持开放以便随后插管灌注所述器官或其部分。因此，所述洗涤剂和酶通过保持开放的血管灌注到所述器官或其部分中。通常，所述器官或其部分被灌注约1至约4小时，优选约1至约2小时。在本发明的实施方案中，向所述器官或其部分灌注洗涤剂仅需要约1.5小时。
可以向所述封闭的器官或其部分以约0.2ml/min至约1ml/min，优选约0.5ml/min至约0.9ml/min的速率灌注洗涤剂。在本发明的优选实施方案中，可以以约0.6至约0.8ml/min的速率灌注所述器官或其部分。
在本发明的实施方案中，可向所述封闭的器官或其部分灌注单个循环，这已被证明可避免在所述精细血管中形成沉淀。例如，所述器官或其部分可以用洗涤剂灌注约1.5小时的单个循环。可选地，可以使用洗涤剂灌注第二个循环，使所述器官或其部分灌注两个循环，每个循环约1.5小时。
在灌注过程中，所述封闭的器官或其部分可以自由地漂浮在溶液中，这已被证明可减少张力并避免导管或套管接触血管壁的风险。然而，在本发明的可选实施例中，所述器官或其部分可以简单地浸没在合适的容器中，并且不必自由地漂浮。可以在生物反应器或封闭系统中灌注所述器官或其部分。
如上所述，无总动脉和/或主动脉的小叶器官是作为单独的小叶发育的器官，这些小叶作为独立的血管化结构迁移到其最终位置。这些器官包括胸腺、甲状腺、甲状旁腺和唾液腺。由于缺少对整个器官的总动脉供应或缺乏实际上对其特定部分(如小叶或腺体)的总动脉供应，之前尚不可能采用灌注-去细胞化方法从这些器官或其部分中获得ECM支架。
所述胸腺由两个小叶组成，在中部融合在一起，被包围在囊腔中，并随着血管延伸至内部。所述小叶由紧密的外部皮层和内部较不紧密的髓质组成。在两个小叶中，来自骨髓的造血前体(称为胸腺细胞)成熟为T细胞。一旦成熟，T细胞就会从胸腺中迁移出，并组成外周T细胞，以负责指引获得性免疫系统的许多部分。由于染色体异常(如在DiGeorge综合征中)，胸腺在幼年时丧失会导致严重的免疫缺陷和对感染的高度易感性。所述胸腺缺少一条向整个器官供应血液的总动脉，而是从胸廓内动脉(也称为乳内动脉)和甲状腺下动脉的分支获得血液供应，有时还可以看到来自甲状腺上动脉的分支。用于封闭胸腺而闭合的所述血管可包括右颈总动脉或左颈总动脉、右锁骨下动脉、右乳内动脉、右侧肋颈干、右主动脉弓、左主动脉弓、左侧肋颈干、左乳内动脉。如上所述，留出一条或两条血管保持开放以便随后灌注所述器官。在本发明的优选实施方案中，仅留出一条血管保持开放。例如，当闭合所述右颈总动脉时，可以通过所述左颈总动脉灌注所述胸腺，或者当闭合所述左颈总动脉时，可以通过所述右颈总动脉灌注所述胸腺。
所述甲状腺是一种蝴蝶形器官，位于人类的脖子前部。所述甲状腺由左右两个叶(或小叶，lobe)组成，由狭窄的峡部相连。所述甲状腺的主要功能是产生含碘的甲状腺激素、三碘甲状腺素(T3)和甲状腺素(T4)以及肽激素降钙素。所述甲状腺激素对人体具有广泛的作用，包括代谢、心血管、发育作用，并在维持正常的性功能、睡眠和思维方式方面发挥作用。所述甲状腺缺少向整个器官供血的总动脉，而是从甲状腺下动脉(锁骨下动脉的甲状腺颈干的分支)以及甲状腺上动脉(颈外动脉的一个分支)获得血液供应，有时还接受甲状腺最下动脉(thyroid Ima artery，其大小可能从很小到甲状腺下动脉的大小不等)的血液供应。与甲状腺上动脉连接后，用于封闭甲状腺而闭合的血管可能包括右颈总动脉或左颈总动脉。当甲状腺的两个小叶通过穿过峡部的血管连接时，可以利用本发明的方法使整个器官的ECM支架去细胞化。可选地，所述方法可以应用于甲状腺的单个小叶以产生该小叶的去细胞化ECM支架。每个甲状腺的小叶可通过右颈总动脉或左颈总动脉进行灌注。
人类中通常有四个甲状旁腺，分为两对腺体，通常位于甲状腺的左叶和右叶后面。两侧的两个所述甲状旁腺位置较高，称为上甲状旁腺，较低的两个甲状旁腺称为下甲状旁腺。甲状旁腺的主要功能是将人体的钙和磷酸盐水平维持在非常狭窄的范围内，以使神经和肌肉系统正常运作。甲状旁腺的血液供应与上覆的甲状腺相对应，每个甲状旁腺都缺少一条总动脉或主动脉。本发明的去细胞化方法可以应用于单个的甲状旁腺。
哺乳动物的唾液腺是通过导管系统产生唾液的外分泌腺。人类有三个成对的大唾液腺(腮腺、颌下腺和舌下腺)以及数百个成对的小唾液腺。每个大唾液腺都缺少一条总动脉或主动脉。本发明的去细胞化方法可以应用于腮腺、颌下腺或舌下腺。
本发明还提供了通过本发明的方法获得或可获得的去细胞化ECM支架。已经证明本发明的方法使ECM的结构和脉管系统高度保留的同时实现了无总动脉的小叶器官的成功去细胞化。所述方法可以应用于整个器官或其部分，例如小叶或腺体。
在另一方面，本发明提供了一种生产人造器官的方法，所述方法包括用基质细胞(例如上皮细胞和间充质细胞的组合)重新填充通过本发明的方法获得或可获得的去细胞化ECM支架，并在体外培养所述重新填充的支架约4至7天，然后优选地用供体细胞接种所述重新填充的支架。
所述去细胞化ECM支架可以以约2:1至约5:1的比例重新填充上皮细胞和间充质细胞。优选地，所述支架以约5:1的比例重新填充上皮细胞和间充质细胞。通常通过来自器官组织供体的细胞的体外扩增获得(即同种异体或异种细胞)所述基质细胞，并可以通过直接针头注射将其递送至所述支架，使细胞在所述支架上和/或所述支架内成功分布。然而，在本发明的实施方案中，所述基质细胞可以是自体细胞。所述细胞可以分开递送、同时递送或顺序递送。所述顺序递送可能涉及在彼此间隔至少1、2、5、10、20、30、40、50或60分钟之内，或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、36或48小时之内递送细胞群。但是，在本发明的优选实施方案中，所述上皮细胞和间充质细胞是同时递送，或者从分开的来源或以如上所述的合适比例预混在一起后进行递送。通常，以细胞悬液的形式注射细胞，所述细胞悬液包含以约2:1至约5:1的比例混合的上皮细胞和间充质细胞，并可具有约10μl至约100μl的体积，优选约10μl至约60μl的体积，更优选约30μl至约40μl的体积。例如，单次注射可包含约30μl至约40μl体积的悬浮液，所述悬浮液包含约2×106个上皮细胞和约0.4×106个间充质细胞。
通过内皮细胞(可选地与间充质细胞组合)重新填充去细胞化ECM支架是支架血运重建的重要步骤。例如，可以在支架的多个位点注射内皮细胞(优选包括周细胞样细胞)和间充质细胞。可选地，可以将内皮细胞(优选包括周细胞样细胞)和间充质细胞注射到一个或多个传入血管中以使所述支架血运重建。所述细胞可以作为组合物，以优化的适合所述支架体积的体积注射。类似地，可以基于所述组合物的体积来优化所述组合物中细胞的浓度，以确保注射足够数量的细胞以使所述支架充分血运重建。
通常在体外维持重新填充的支架，以使细胞在支架的网状ECM上迁移并在约4至约7天的时间内进行初始分化(例如细胞极化、粘附分子的上调/下调)。然后可以递送不同来源的供体细胞(通常是同种或异种细胞，但优选地可以是自体的)，例如通过直接针头注射到之前注射的支架区域内或之上。例如，所述供体细胞可以是干细胞，例如造血干细胞(HSC)，包括来自产后胸腺的Lin-/CD45+/CD3-/CD4-/CD8a-胸腺细胞，来自胎儿肝脏的CD34+细胞，来自脐带血的CD34+细胞(CBC)，来自成人骨髓的CD34+细胞或来自动员外周血(成人)的CD34+细胞。所述供体细胞可以是iPSC衍生的基质细胞和/或内皮细胞，任选地与HSC或T细胞祖细胞组合，并且可以是患者特异性的(即自体的)。可选地，所述供体细胞可以来自任何谱系(例如内胚层、中胚层或神经嵴)，并可包括胸腺细胞、胸腺上皮细胞、间充质细胞、树突状细胞、内皮细胞、周细胞、巨噬细胞或B细胞。通常，在递送供体干细胞之后和在植入受体之前，将所述器官在体外再维持24小时或更长时间。应当理解，所述支架可能不需要完全用接种的细胞增殖，以用于植入接受者中。例如，所述支架可在其至少70％、80％、90％、95％或99％的表面上具有接种的细胞。
可选地，在植入受体之前，可以将体外扩增的内皮细胞另外递送至所述器官。不受理论的限制，可以相信此类细胞在植入后有助于所述器官的加速血管形成。实际上，可以通过在生产所述支架时产生的人工灌注系统将此类内皮细胞递送至所述器官。所述内皮细胞的这种递送可以帮助所述器官的血管树重新内皮化。可选地，可以通过相同途径递送所述供体干细胞。
在本发明一个可选的实施方案中，可以用基质细胞重新填充去细胞化ECM支架，以形成可以植入受体中的重新填充的支架。一旦植入受体中，所述重新填充的支架就形成血管，随后可以在体内从血液循环中直接重新增殖自体干细胞，例如HSC。驻留在植入位点的间充质和/或免疫细胞也可侵入支架并帮助重塑和/或支持接种的细胞存活和/或分化和发挥功能。所述重新填充的支架在移植前可能在其至少70％、80％、90％、95％或99％的表面上具有接种的细胞。
如上所述的去细胞化ECM支架或重新填充的ECM支架可另外进行处理，以增强细胞对所述支架的粘附和/或细胞在所述支架上的生长。此类处理可包括应用蛋白质(例如生长因子或细胞外基质蛋白)，例如包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或蛋白聚糖中的一种或多种。在本发明的实施方案中，可以修饰接种在所述支架上的所述细胞以产生生长因子，例如VEGF，其可加快血管形成。所述细胞的修饰通常是指细胞的遗传修饰，并且可以利用本领域已知的标准技术。
本发明还提供了人造器官，其包含通过本发明的方法获得或可获得的去细胞化ECM支架。如上所述，可以通过用基质细胞重新填充本发明的去细胞化ECM支架来产生所述人造器官。所述人造器官可用于治疗，例如，提供替代器官以治疗先天性疾病或获得性疾病。
如上所述，用于重新填充本发明的去细胞化ECM支架的细胞可从供体组织获得，培养所述供体组织以提供所需的细胞类型，并且可在接种到所述支架上之前在体外扩增。这样，单个组织供体可以提供多种人造器官。由于在支架上生长的细胞是人造器官任何潜在免疫原性的关键(因为已经从支架上去除了细胞，所以支架本身不是免疫原性的，因此不必从组织匹配的供体中获得支架)，这在特别缺少合适的组织供体的情况下提供了重要优势。
包括通过本发明的方法获得或可获得的包含去细胞化ECM支架的所述人造器官可以是胸腺，并且可以用于治疗疾病，诸如DiGeorge综合征(迪格奥尔格综合征)，该病是一种先天性染色体疾病，其引起许多症状，包括胸腺缺失或胸腺发育不良，导致严重的免疫缺陷。可选的，本发明的人造器官可以作为过继细胞转移中成熟细胞的来源，即用于产生治疗性细胞，例如T细胞。
在另一方面，本发明提供了用于体外检测化合物引起药理学、免疫学或毒理学反应能力的方法，所述方法包括将包含本发明的去细胞化ECM支架的人造器官与所述化合物接触。
所述人造器官可以在体外培养多达1、2、3、4、5或6天。在本发明的实施方案中，所述人造器官可以在体外培养多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。优选地，所述人造器官在体外培养长达8周。可以在标准培养条件下培养所述人造器官。但是，在本发明的优选实施方案中，在培养期间用细胞培养基灌注人造器官，例如通过生物反应器培养所述器官。
本发明还提供了一种器官移植的方法，所述方法包括通过手术将包含本发明的去细胞化ECM支架的人造器官植入患者体内。还提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括通过手术将包含本发明的去细胞化ECM支架的人造器官植入有需要的患者中。具体地，包含本发明的去细胞化ECM支架的人造器官可用于在常规器官移植中诱导免疫耐受。
本发明所用的术语“患者”或“接受者”可以包括任何哺乳动物，包括人。具体地，所述患者可以是儿童患者，例如新生儿或婴儿。所述患者可能患有需要更换器官的后天性或先天性疾病。例如，所述器官可能缺失、病变、受损，或者其功能可能受损。在接受包含本发明的去细胞化ECM支架的人造器官之前或同时，所述患者可能已经接受了另一器官的移植。不受理论的限制，可以相信重新填充去细胞化ECM支架的细胞(例如AIRE+细胞)可提供Treg细胞并诱导供体-器官耐受。
附图说明
现将参考附图仅以举例的方式详细描述本发明。
图1示出了用于绑扎特定动脉分支的手术过程的示意图，以使胸腺周围形成人工灌注系统。在传入血管中形成结1-9(在此阶段，左主动脉弓上的结6不应该太紧)，然后将导管插入左颈总动脉。切开左颈内静脉；然后在结6以下切开左主动脉弓；然后切断右颈内静脉。通过导管用缓冲溶液(例如PBS)缓慢冲洗，清洗主动脉弓并去除凝结物，然后紧紧闭合左主动脉弓上的结6。之后通过切开靠近结1-9的闭合动脉来取出插入套管/导管的胸腺，然后从锁骨下静脉切开相关的静脉。
图2显示了通过洗涤剂和酶溶液(DET)灌注的去细胞化之前(A、B)和之后(C、D)的大鼠胸腺，通过显微镜观察(B、D)和组织学观察(苏木精和曙红，H&E；A、C)。
图3显示了本发明的去细胞化胸腺支架的组织学结果：苏木精和曙红(H&E)(A)、天狼猩红(胶原蛋白，B)和马氏三色(ECM，C)染色表明无细胞核以及保留了胸腺囊腔和网状ECM。
图4显示了通过本发明的方法去细胞化之前(A图)和之后(B图)的大鼠胸腺支架的显微镜图片。低放大倍数(4×，C图)和高放大倍数(D图，比例尺＝100μm)时胸腺的H&E染色表明，实质小叶和血管结构得以保留。
图5显示了通过本发明的方法获得的胸腺支架在注射基质细胞之前(A)、之后不久(B)和在培养4天之后(C)的外观。多出的胸腺组织(图像中较暗的区域)使支架连接到套管。
图6显示了培养4天的重新填充支架的组织学结果(H&E)(A图)。免疫组织化学(IHC)图像表明健康的基质细胞呈Caspase3阴性，而大部分呈祖细胞/干细胞标记物p63阳性(B图)。只有很少的细胞(黄色*)是Caspase3阳性，表明细胞凋亡(C图)。重新填充的基质细胞表达细胞角蛋白5(CK5)、CK8和alpha6整联蛋白(CD49f)(E图)。此外，大多数上皮细胞(EpCAM阳性)正在增殖(Ki67阳性)(D图)，因此表明基质细胞重新填充所述支架并在3D结构内保持祖细胞表型(比例尺＝50μm)。
图7显示了植入NSG小鼠并在体内分别成熟8周(B)、11周(C)和21周(D)的重新填充支架的显微镜观察(A图，比例尺＝2mm)和组织学(H&E)结果。H&E染色表明存在造血起源的小圆形细胞与器官化的基质细胞相互作用。值得注意的是，在11周的时间点，支架内赫氏小体的存在证明了基质细胞的逐渐成熟。比例尺＝50μm。
图8显示了NSG小鼠中移植的体内成熟的重新填充支架的免疫组织化学，表明表达功能标记物例如HLA-DR(绿色)的人基质(EpCAM和ECadherin阳性细胞，红色)成熟，(A)。抗人波形蛋白(绿色)识别器官化的人类间充质细胞(B)，而抗人CD3(绿色)表明成熟的胸腺细胞与人胸腺基质细胞(C)接触。在移植的胸腺支架中检测到AIRE-1阳性细胞(3,3'-二氨基联苯胺，DAB染色)，表明胸腺细胞功能成熟，这对其在消除自身反应性T细胞中的作用很重要(D)。
图9显示了重新填充的去细胞化ECM支架内的细胞分化为正确的淋巴谱系。A.在体内成熟的解离的人类工程化胸腺支架的FACS分析表明，从CD34+祖细胞发育出的绝大多数(80％)CD45+细胞是CD3+淋巴谱系。B.单个阳性CD4和CD8细胞表达成熟的标志物，例如CD3+和TCRab+。
图10显示了以与正常组织相等的比例产生单和双CD4+和CD8+胸腺细胞。A.解离的新鲜人胸腺的FACS分析显示单和双阳性CD4+和CD8+胸腺细胞。B.在工程化的胸腺支架(大鼠)中从TN祖细胞体外发育而来的胸腺细胞的FACS分析，6天的时间点；这表明工程化的人胸腺支持离体的T细胞发育。
图11显示了猪胸腺在灌注去细胞化(在0.6％-0.8ml/min的4％SDC下进行4小时灌注的2个循环)之前(左图)和之后(右图)的显微镜观察结果。
图12显示了灌注-去细胞化后猪胸腺的组织学分析，表明ECM和血管结构得以保留：H&E左图；马氏三色(MT)；天狼猩红(PS)染色证明了ECM蛋白和脉管系统结构的保留。
图13显示了人胸腺在灌注去细胞化(在0.6％-0.8ml/min的4％SDC下进行4小时灌注的2个循环)之前(左图)和之后(右图)的显微镜观察结果。
图14显示了灌注去细胞化后人胸腺支架的H&E染色，表明去除了细胞成分并保留了大小血管结构。
实施例
实施例1
通过绑扎右颈总动脉、右锁骨下动脉、右乳内动脉、右侧肋颈干、右主动脉弓、左主动脉弓、左侧肋颈干、左乳内动脉和左锁骨下动脉来封闭大鼠胸腺(见图1)，然后从受试大鼠中提取胸腺。使用以下洗涤剂-酶灌注处理(DET)去细胞化封闭的胸腺，所述封闭的胸腺通过在溶液中自由漂浮的同时通过所述左颈总动脉的插管进行灌注：
a.以0.2mL/min，4℃的MilliQH2O灌注96小时；
b.室温下以0.2mL/min的4％SDC灌注1.5小时；
c.室温下以0.2mL/min的MilliQH2O灌注24小时；
d.以0.2mL/min的0.1mg/min的DNase(37℃保温)灌注30分钟；和
e.室温下以0.2mL/min PBS灌注1小时。
然后将所述支架进行灭菌处理(γ射线，1782Gy)。
所述胸腺的平行去细胞化说明了本发明方法的效率和可重复性。如图2所示，去细胞化作用产生透明的胸腺组织，同时保持囊腔。如图2C和3A所示，通过H&E染色对去细胞化胸腺的组织学分析表明不存在任何细胞核、DNA或细胞碎片。图3B和C显示了胸腺结构的囊腔和网状ECM的保留。胸腺ECM检测为同源网，并且染色强度反映了器官囊腔中ECM的丰度更高(图3B中的红色和图3C中的蓝色)。
实施例2
根据实施例1所述的方案提取大鼠胸腺并去细胞化。大鼠体重为173g。
图4显示了去细胞化胸腺的显微镜观察结果，通过H&E在去细胞化之前(4A)和之后(4B)染色。低倍率(图4C)和高倍率区域(图4D)显示在整个器官组织中保留了实质小叶以及血管结构。未检测到DNA或细胞碎片。这表明在组织学水平上通过单个插管去细胞化整个器官(双叶)。
实施例3
根据实施例1所述的方案获得胸腺支架。所述胸腺在自组织胸腺供体中离体扩增后，以5:1的比例(分别)、通过直接针头注射同时递送胸腺上皮细胞(TEC)和胸腺间充质细胞(TMC)的组合以重新填充所述胸腺。所述细胞通过针头注射器(每个小叶1针，每针40μl，每针2M TEC:0.4M TMC)注射至胸腺小叶，所述胸腺小叶在图5A-C中显示为透明组织。多出的胸腺组织(图5A-C中较暗的区域)使其连接到在培养过程中保留的套管。
将重新填充的支架维持在体外条件下，以使细胞在支架的网状ECM上迁移并在4天的时间内进行初始分化(例如细胞极化、粘附分子的上/下调)。对于体外培养，将支架连接至套管并置于培养皿中，浸没在cFAD(上皮)培养基中，所述培养基由DMEM和Ham's F12培养基(v/v 3:1)组成，补充有10％胎牛血清(FBS)、胰岛素(5μg/mL)、3,3,5-三碘-L-甲状腺素(T3)(2×10-9M)、氢化可的松(0.4μg/mL)、霍乱毒素(1×10-10M)、以及1％青霉素/链霉素。
图5显示了在注射TEC和TMC细胞后(图5A)、不久之后(图5B)和培养后4天的支架外观(图5C)。培养4天后通过H&E染色对支架进行的组织学分析如图6A所示，表明细胞粘附于支架ECM。支架中只有一小部分尚未重新填充，表明支架中存在完整的基质(黑色*)。免疫组织化学(IHC)图像表明，健康的基质细胞呈Caspase3阴性，而大多数为祖细胞/干细胞标记物p63阳性(图6B)。只有一小部分细胞(黄色*)呈Caspase3阳性，表明细胞凋亡(图6C)。重新填充的基质细胞表达了细胞角蛋白5(CK5)、CK8和alpha6整联蛋白(CD49f)(图6E)。此外，更多的上皮细胞(EpCAM阳性)正在增殖(Ki67阳性)(图6D)，因此表明基质细胞正在重新增殖支架并在3D结构内保持祖细胞表型。
实施例4
根据以上实施例3所述的方案制备了重新填充的大鼠胸腺支架。在用基质细胞进行体外培养4天后，将重新填充的支架皮下移植到8和11周的NSG小鼠中。
两个在体内成熟8周(图7B)、11周(图7C)和21周(图7D)的胸腺支架的组织学分析(H&E)表明存在造血起源的小圆形细胞与器官化的胸腺基质相互作用。值得注意的是，在11周的时间点，支架中存在赫氏小体(图7C)和胸腺细胞密度增加(图7D)，证明了基质细胞逐渐成熟。
实施例5
根据以上实施例3所述的方案制备重新填充的大鼠胸腺支架，并以通过EpCAM和ECadherin阳性细胞鉴定的人基质细胞重新填充。用基质细胞进行体外培养4天后，将重新填充的支架皮下植入11周的NSG小鼠中。
免疫组织化学分析表明，存在通过EpCAM和ECadherin阳性细胞鉴定的重新填充的人基质。基质细胞的功能成熟通过MHC II类表面受体(HLA-DR阳性细胞)的上调得到验证(图8A)。通过抗人波形蛋白免疫染色检测到间充质细胞的存在(图8B)，而抗人CD3免疫染色证明在同一区域内存在成熟的胸腺细胞(图8C)。在移植的胸腺支架中检测到自身免疫应答元件1(AIRE-1)阳性细胞证明了胸腺细胞功能成熟，这对其消除自身反应性T细胞并由此诱导耐受性起重要作用(图8D)。这证明了培养的人基质细胞能够在体内长期存活并组织类似于人类天然胸腺的功能结构(即赫氏小体和HLA-DR的表达)。
实施例6
重新填充部分胸腺支架并体内移植到NSG小鼠中，通过FACS分析进行解离和分析，结果表明人类细胞具有很高的存活率(63.9％，图9A中间图)。绝大多数活细胞是CD45+(92.9％，图9A右图)。重要的是，80％的CD45+细胞也是CD3+(图9B，左图)，从而表明胸腺支架是淋巴谱系的诱导性微环境。表达TCRab的单个阳性CD4+和CD8+细胞的存在表明，已经在体内支架中产生了成熟的功能性T细胞(图9B，中间图和右图)。
实施例7
在体外用基质细胞重新填充胸腺支架，并在注射未成熟的三阴性胸腺细胞(TN)之前，在培养基中维持7天。注射入胸腺支架后7天，通过FACS分析胸腺细胞，其在胸腺支架中向单阳性和双阳性CD4+和CD8+细胞成熟(图10B)。重要的是，支架中单个阳性CD4/CD8的比例与天然胸腺相似(图10A、B)。
本申请所在的项目已得到欧盟Horizon 2020研究与创新计划的资助，协议号为No.639429。
参考文献
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Claims (13)

1.一种胸腺的去细胞化ECM支架，其通过以下方法获得：
a）闭合传入血管以基本上封闭非人类供体或死亡的人类供体内所述胸腺；
b）可选地：（i）清除至少一部分所述闭合的传入血管中的凝结物和/或血液；和/或（ii）灌注所述胸腺以确认所述传入血管的闭合；
c）从供体中取出所述封闭的胸腺；和
d）向所述封闭的胸腺灌注洗涤剂和酶溶液，以获得去细胞化ECM支架。
2.如权利要求1所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，所述洗涤剂选自脱氧胆酸钠（SDC）、十二烷基硫酸钠（SDS）和Triton X-100中的一种或多种。
3. 如权利要求或2所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，所述SDC的浓度为1%至10%（w/v）；或所述SDS的浓度为0.05%至1%（w/v）；或所述Triton X-100的浓度为0.05%至5%（w/v）。
4.如权利要求1所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，向所述封闭的胸腺灌注洗涤剂1至4小时。
5. 如权利要求1所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，向所述封闭的胸腺以0.2 ml/min至1 ml/min的速率灌注洗涤剂。
6.如权利要求1所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，向所述封闭的胸腺灌注单个循环。
7.如权利要求1所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，所述封闭的胸腺在灌注期间自由地漂浮在溶液中。
8.如权利要求1-7任一项所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，用于封闭胸腺而闭合的血管包括右或左颈总动脉、右锁骨下动脉、右乳内动脉、右侧肋颈干、右主动脉弓、左主动脉弓、左侧肋颈干、左乳内动脉和左锁骨下动脉。
9.如权利要求8所述的去细胞化ECM支架，其特征在于，闭合右颈总动脉，并且通过所述左颈总动脉灌注所述胸腺，或者其中，闭合所述左颈总动脉，并且通过右颈总动脉灌注所述胸腺。
10.一种生产人造器官的方法，所述方法包括：用基质细胞重新填充如权利要求1-9任一项所述的去细胞化ECM支架，体外培养所述的重新填充的支架4至7天，然后可选地用供体细胞接种所述重新填充的支架。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述基质细胞为上皮细胞和间充质细胞的组合。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述去细胞化ECM支架以2:1至5:1的比例重新填充上皮细胞和间充质细胞。
13.一种人造胸腺，其包含如权利要求1-9任一项所述的去细胞化ECM支架或通过如权利要求10-12任一项所述的方法获得或可获得。
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