CN111184914B - 一种功能化脱细胞基质生物材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种功能化脱细胞基质生物材料及其制备方法和应用，属于医用材料技术领域。本发明通过将脱细胞基质生物材料与甲基丙烯酸3‑磺酸丙酯杂化，同时实现了对脱细胞基质生物材料的交联及功能化。具体方法包括在脱细胞基质生物材料中修饰烯丙基、甲基烯丙基等碳碳双键结构，再将脱细胞基质生物材料浸泡在含有甲基丙烯酸3‑磺酸丙酯水溶液中，最后通过自由基聚合的方式对脱细胞基质生物材料进行交联及功能化。本发明通过聚合物网络实现对脱细胞基质生物材料的多位点、长程交联，同时引入了相应的功能性官能团从而实现对脱细胞基质生物材料的功能化。

Description

一种功能化脱细胞基质生物材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种功能化脱细胞基质生物材料及其制备方法和应用。
背景技术
随着人口老龄化严重，心脏瓣膜病的发病率正在提高。心脏瓣膜病是一种常见的瓣膜衰退疾病。主要表现为心脏瓣膜处狭窄或瓣膜关闭不全。
心脏瓣膜病的主要治疗方法是心脏瓣膜置换。手术方式主要分为开胸瓣膜置换手术和介入瓣膜置换手术。开胸手术对病人造成极大的创伤，风险高，恢复慢，需要体外循环支持，很多患者，尤其是老年患者无法进行开胸手术。介入瓣膜置换手术对病人创伤小，风险低，是未来瓣膜置换手术的主要发展趋势。
心脏瓣膜主要分为机械心脏瓣膜和生物心脏瓣膜。置换机械瓣的患者由于机械瓣生物相容性差，需要长期服用抗凝药物以减少机械瓣处凝血的发生。但同时，也会伴随着出血的风险。而且机械瓣的置换需要开胸手术，对患者造成巨大的创伤。而生物瓣由于其本身良好的生物相容性及介入置换技术的发展，使其成为一个非常有潜力的瓣膜种类。
目前商业应用的生物心脏瓣膜一般是由牛心包膜、猪心瓣膜和猪心包膜通过戊二醛交联制备而成。戊二醛交联的方法据有工艺简单、成本低廉、胶原蛋白结构稳定及较好的力学性能。但戊二醛交联的心脏瓣膜存在不容忽视的问题。由戊二醛交联不能对弹性蛋白起到保护作用，容易引起心脏瓣膜的力学性能下降；戊二醛交联的心脏瓣膜容易发生钙化问题，影响使用寿命；戊二醛及残余的醛基具有较强毒性，易引发炎症反应，造成瓣膜失效。
为了克服戊二醛交联的生物心脏瓣膜的缺点，很多方法被用于改进或代替戊二醛交联。例如在戊二醛交联后使用二磷酸盐类、α-氨基油酸和乙醇等试剂进行处理，封闭醛基。但是效果并不显著。此外，一些新的交联方法也被尝试用于生物心脏瓣膜的交联。如碳化二亚胺、多环氧化合物和京尼平。碳化二亚胺主要通过亲核取代促使蛋变质中的氨基与羧基反应形成酰胺键对胶原蛋白进行交联。这种方法没有引入有毒的醛基，但由于只能交联邻近的氨基和羧基，所以交联的效果较差。多环氧化合物通过环氧基与氨基、羧基、羟基等基团反应，从而将蛋白质交联起来。但由于生成的化学键容易水解，因此交联稳定性欠佳。京尼平的毒性比戊二醛小，但京尼平交联的生物心脏瓣膜长期稳定性和机械性能不如戊二醛交联方法。同时京尼平处理后生物瓣膜变为蓝色。因此，京尼平也没有被广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术中存在的不足，提供一种功能化脱细胞基质生物材料及其制备方法和应用，能够替代传统戊二醛的脱细胞基质交联方式，同时引入甲基丙烯酸3-磺酸丙酯赋予脱细胞基质生物材料更好的生物相容性。
本发明采用的技术方案如下：
一种功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，包括以下步骤：
将脱细胞基质生物材料清洗后，浸泡在甲基丙烯酸酐水溶液中，然后再浸泡在甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中，最后加入引发剂引发聚合反应，即得；实现对脱细胞基质生物材料的交联和功能化处理。
进一步地，脱细胞基质生物材料为经过脱细胞处理的动物组织，所述动物组织来源于猪、牛或羊；所述动物组织包括血管、心脏瓣膜和心包膜，其主要成分为胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺多糖中的至少一种。
在动物组织中加入脱细胞试剂进行脱细胞处理，确保细胞脱除干净，然后使用清洗液对脱细胞基质生物材料进行清洗，将残留的细胞、脱细胞试剂等杂质去除；清洗液可采用水、乙醇、丙酮等。
进一步地，甲基丙烯酸酐水溶液的浓度为1-20wt％，优选为1-5wt％。
进一步地，清洗后的脱细胞基质生物材料在4-60℃下浸泡在甲基丙烯酸酐水溶液中反应6-72h；优选为在20-40℃下浸泡在甲基丙烯酸酐水溶液中反应18-24h。
清洗后的脱细胞基质生物材料与甲基丙烯酸酐反应，通过脱细胞基质中氨基与甲基丙烯酸酐反应生成酰胺键键合。由于甲基丙烯酸酐溶液浓度低、温度低、时间短会导致脱细胞基质与甲基丙烯酸酐反应不完全，交联点密度下降，使脱细胞基质不能被充分交联，影响脱细胞基质的使用性能。温度过高会导致脱细胞基质结构遭到破坏。而甲基丙烯酸酐浓度高、时间长会造成不必要的成本浪费。因此需在在本发明所采用的温度、时间以及甲基丙烯酸酐溶液浓度下，将脱细胞基质与甲基丙烯酸酐水溶液震荡充分接触，使甲基丙烯酸酐与脱细胞基质中的氨基残基充分反应，提高接入双键的含量，提高交联密度，进而使交联脱细胞基质材料更加稳定。
进一步地，甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液浓度为10-500mmol/L。
进一步地，在4-60℃下于甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中浸泡2-72h，优选为在20-45℃下于甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中浸泡18-36h。
在浸泡在甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液之前，采用乙醇和水等体积混合的清洗剂进行清洗，将未反应的游离甲基丙烯酸酐清洗干净。在浸泡时，将脱细胞基质与甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液震荡充分接触，确保甲基丙烯酸3-磺酸丙酯均匀分散。
进一步地，引发剂为光引发剂或热引发剂；光引发剂为过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的至少一种，热引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦和2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮中的至少一种。
进一步地，采用热引发剂时反应条件为在20-45℃下聚合反应18-48h；采用光引发剂时反应条件为在紫外光源下于室温中反应5-30min。
聚合反应为自由聚合，其中单体浓度、反应时间、反应温度应在指定范围内，使聚合反应可以发生，聚合度足够大以提高交联密度，增加脱细胞基质结构的稳定性。低于指定范围会导致反应不完全，接入单体浓度过低，改善功能效果下降。而反应温度过高会破坏脱细胞基质结构。单体浓度、反应时间过高会导致成本浪费。
采用上述的方法制备得到的功能化脱细胞基质生物材料。
上述的功能化脱细胞基质生物材料在制备医用材料中的应用，医用材料为开胸生物瓣膜、介入生物瓣膜、组织工程瓣膜、人工血管或组织工程血管。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明通过聚合物网络实现对脱细胞基质生物材料的多位点、长程交联，同时引入了相应的功能性官能团从而实现对脱细胞基质生物材料的功能化；即使甲基丙烯酸酐与脱细胞基质中的氨基残基充分反应，在脱细胞基质生物材料中修饰烯丙基、甲基烯丙基等碳碳双键结构，再浸泡在含有甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中赋予其更好的生物相容性，最后通过自由基聚合的方式对脱细胞基质生物材料进行交联及功能化；本发明通过引入具有抗凝血作用的功能性单体，提高了材料的亲水性，有效降低血小板的粘附，提高了脱细胞基质生物材料的抗凝血性能；采用本发明的方法通过引入不同的物质能够使材料具备不同的功能；
2、本发明方法通过与聚合物形成互穿网络提高交联密度保护弹性蛋白，提高了弹性蛋白的稳定性，提高了脱细胞基质材料的力学性能，从而延长了材料的使用寿命；
3、本发明方法由于未引入戊二醛，同时遮蔽了大部分残基，使其与钙离子结合能力下降，因此可以有效降低钙化反应，提高抗钙化性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为弹性蛋白酶降解失重率图；
图2为钙元素含量图；
图3为相对内皮细胞粘附率图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和出示的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳实施例提供的一种功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，具体步骤如下：
1.获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；
2.将动物组织材料浸泡在0.1％EDTA溶液中1小时，再浸泡在0.1％SDS溶液中24小时进行脱细胞处理，制成脱细胞基质；
3.采用蒸馏水与酒精体积比为1：1配制的清洗液，于室温下超声清洗，将脱细胞基质清洗干净；
4.将清洗过的脱细胞基质浸泡于浓度为1wt％甲基丙烯酸酐水溶液当中25℃反应24小时；
5.将上述材料采用上述的清洗液，于室温下超声清洗清洗干净后，在25℃下浸泡在10mmol/L的甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中24h；
6.加入5mM过硫酸钾，在40℃反应24小时，采用蒸馏水超声清洗，即得。
实施例2
本发明较佳实施例提供的一种功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，具体步骤如下：
1.获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；
2.将动物组织材料浸泡在0.1％EDTA溶液中1小时，再浸泡在0.1％SDS溶液中24小时进行脱细胞处理，制成脱细胞基质；
3.采用蒸馏水与酒精体积比为1：1配制的清洗液，于室温下超声清洗，将脱细胞基质清洗干净；
4.将清洗过的脱细胞基质浸泡于浓度为5wt％甲基丙烯酸酐水溶液当中20℃反应24小时；
5.将上述材料采用上述的清洗液，于室温下超声清洗清洗干净后，在30℃下浸泡在50mmol/L的甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中24h；
6.加入20mM过硫酸钾，在37℃反应24小时，采用蒸馏水超声清洗，即得。
实施例3
本发明较佳实施例提供的一种功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，具体步骤如下：
1.获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；
2.将动物组织材料浸泡在0.1％EDTA溶液中1小时，再浸泡在0.1％SDS溶液中24小时进行脱细胞处理，制成脱细胞基质；
3.采用蒸馏水与酒精体积比为1：1配制的清洗液，于室温下超声清洗，将脱细胞基质清洗干净；
4.将清洗过的脱细胞基质浸泡于浓度为3wt％甲基丙烯酸酐水溶液当中30℃反应24小时；
5.将上述材料采用上述的清洗液，于室温下超声清洗清洗干净后，在37℃下浸泡在50mmol/L的甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中24h；
6.加入20mM过硫酸钾，在20℃反应48小时，采用蒸馏水超声清洗，即得。
实施例4
本发明较佳实施例提供的一种功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，具体步骤如下：
1.获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；
2.将动物组织材料浸泡在0.1％EDTA溶液中1小时，再浸泡在0.1％SDS溶液中24小时进行脱细胞处理，制成脱细胞基质；
3.采用蒸馏水与酒精体积比为1：1配制的清洗液，于室温下超声清洗，将脱细胞基质清洗干净；
4.将清洗过的脱细胞基质浸泡于浓度为3wt％甲基丙烯酸酐水溶液当中40℃反应18小时；
5.将上述材料采用上述的清洗液，于室温下超声清洗清洗干净后，在40℃下浸泡在200mmol/L的甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中18h；
6.加入Irgacure 2959光引发剂，在紫外交联箱中照射10min，采用蒸馏水超声清洗，即得。
实施例5
本发明较佳实施例提供的一种功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，具体步骤如下：
1.获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；
2.将动物组织材料浸泡在0.1％EDTA溶液中1小时，再浸泡在0.1％SDS溶液中24小时进行脱细胞处理，制成脱细胞基质；
3.采用蒸馏水与酒精体积比为1：1配制的清洗液，于室温下超声清洗，将脱细胞基质清洗干净；
4.将清洗过的脱细胞基质浸泡于浓度为1wt％甲基丙烯酸酐水溶液当中40℃反应18小时；
5.将上述材料采用上述的清洗液，于室温下超声清洗清洗干净后，在35℃下浸泡在500mmol/L的甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中18h；
6.加入Irgacure 2959光引发剂，在紫外交联箱中照射10min，采用蒸馏水超声清洗，即得。
实验例
采用传统戊二醛交联制备脱细胞基质生物材料制备样品：将猪心包膜浸泡于0.1wt％的乙二胺四乙酸二钠溶液中1h，再浸泡于0.1wt％的十二烷基硫酸钠溶液中24h，然后在无菌PBS溶液中漂洗1h，再依次浸泡在0.1vt％，0.5vt％，1vt％的戊二醛PBS溶液中交联24h。
实验组样品分别为实施例1-3制备得到的材料。
空白对照组为脱细胞基质生物材料。
1、经过弹性蛋白酶降解后，分别测戊二醛组样品、实施例1制备得到样品以及空白对照组样品的样品失重率，结果如图1所示。
由图1可知，实施例1的方法可以有效保护脱细胞基质中的弹性蛋白，潜在提高了其力学性能，延长使用寿命。这是由于根据本发明方法制备得到的生物材料通过与聚合物形成互穿网络提高交联密度，从而保护了弹性蛋白。
2、将戊二醛组样品和实施例2制备得到样品经过大鼠皮下植入30天后，分别测钙元素含量，结果如图2所示。
由图2可知，实施例2制备得到的材料钙含量远少于戊二醛组，因此，本发明方法可以有效降低钙化反应，这是由于根据本发明方法制备得到的脱细胞基质生物材料没有引入戊二醛，同时遮蔽了大部分脱细胞基质中的残基，使得脱细胞基质材料结合钙离子能力下降，从而降低了钙化反应。
3、将戊二醛组样品、实施例3制备得到样品以及空白对照组样品经过1天的内皮细胞共培养，测内皮细胞在材料上的相对粘附率，结果如图3所示。
由图3可知，本发明方法可以有效降提高内皮细胞在脱细胞基质生物材料上的吸附。这是由于根据本发明方法制备得到的脱细胞基质生物材料没有引入戊二醛这种具有生物毒性的交联剂，取而代之的是一种生物相容性的交联剂，同时，引入了促进内皮细胞生长迁移的功能性单体，进一步提高了生物相容性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将脱细胞基质生物材料清洗后，浸泡在甲基丙烯酸酐水溶液中，然后再浸泡在甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中，最后加入引发剂引发聚合反应，即得。
2.根据权利要求1所述的功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质生物材料为经过脱细胞处理的动物组织，所述动物组织来源于猪、牛或羊；所述动物组织包括血管、心脏瓣膜和心包膜，其主要成分为胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺多糖中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐水溶液的浓度为1-20wt%。
4.根据权利要求1所述的功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述清洗后的脱细胞基质生物材料在4-60℃下浸泡在甲基丙烯酸酐水溶液中反应6-72h。
5.根据权利要求1所述的功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液浓度为10-500mmol/L。
6.根据权利要求1所述的功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，在4-60℃下于甲基丙烯酸3-磺酸丙酯水溶液中浸泡2-72h。
7.根据权利要求1所述的功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述引发剂为光引发剂或热引发剂；所述热引发剂为过硫酸钾、过硫酸钠和过硫酸铵中的至少一种，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦和2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的功能化脱细胞基质生物材料的制备方法，其特征在于，采用所述热引发剂时反应条件为在20-45℃下聚合反应18-48h；采用所述光引发剂时反应条件为在紫外光源下于室温中反应5-30min。
9.采用权利要求1-8中任一项所述的方法制备得到的功能化脱细胞基质生物材料。
10.权利要求9所述的功能化脱细胞基质生物材料在制备医用材料中的应用，所述医用材料为开胸生物瓣膜、介入生物瓣膜或组织工程血管。
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