WO2018155925A2 - 하이드로겔 중합체를 이용한 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직 - Google Patents

하이드로겔 중합체를 이용한 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직 Download PDF

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing decellularized tissue using a hydrogel polymer and a decellularized tissue prepared therefrom.
  • Decellularized biological tissue is a technology that can be applied to various tissue engineering fields that require extracellular matrix (ECM) proteins such as cell reactivity investigation, tissue transplantation, and tissue regeneration of its three-dimensional structure. Be in the spotlight.
  • ECM extracellular matrix
  • Tissue decellularization is a technique for selectively removing residual cellular components from tissues obtained from living bodies, and using residual extracellular matrix.
  • the decellularized tissues are used for tissue reconstruction, artificial organ transplantation materials, and skin substitutes. Widely used.
  • the previously reported decellularization methods mainly use a combination of physical, chemical and enzymatic treatments.
  • the general decellularization method is to destroy cell membranes by physical treatment or ionic solution, and to separate cellular components from extracellular matrix through enzymatic treatment and then to wash cells It involves the removal of internal substances, cell nuclei, and cell debris.
  • Tissues rich in extracellular matrix such as skin maintain a relatively intact circle even after decellularization, and thus tissues with a three-dimensional structure after decellularization can be used as they are.
  • the post-treatment process is essential, such as dissolving the extracellular matrix obtained after decellularization and using it as a bio ink for 3D printing.
  • limited resources because of realistic and ethical issues such as human tissues, only limited tissues have limitations that can be utilized after decellularization.
  • Decellularization using existing physical, chemical, and enzymatic methods results in disruption of the structure inherent in biological tissues or loss of extracellular matrix proteins.
  • the biological tissue is physically weakened through this process.
  • long-term decellularization of large animals requires a long process, which inevitably leads to loss of extracellular matrix proteins and disruption of structural properties.
  • the present invention is to solve the above-mentioned problems of the prior art, an object of the present invention is to prevent the loss of extracellular matrix protein in the decellularization process, to maintain the structural characteristics of the tissue, regardless of the type of tissue efficiently It is to provide a method for producing decellularized tissue capable of removing internal cells and decellularized tissue prepared therefrom.
  • injecting a hydrogel monomer solution into the isolated tissue Polymerizing the hydrogel monomer to form a hydrogel-tissue; And removing the cells in the hydrogel-tissue; there is provided a method for producing decellularized tissue.
  • the isolated tissue may be selected from tissues isolated from organs of the mammal, or embryonic mammals and posterior tissues of the mammal.
  • the hydrogel monomer is acrylamide, methacrylamide, bis-acrylamide, polyaniline, NN-dimethylacrylamide (DMA), N, N '-(1,2 -Dihydroxyethylene) bisacrylamide (DHEBA), N, N-methylenebisacrylamide, acrylic acid, methacrylic acid, vinylsulfonic acid, styrenesulfonic acid, polyacrylic acid, polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), Polyethylene oxide (PEO), glycidyl acrylate, methyl methacrylate (MMA), sodium polyacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), glycerol methacrylate, N-vinylpyrrolidone, N Acloylpiperidine, N-acryloylpyrrolidine, cystamine bisacrylamide, propylene glycol (PPG), ethylene glycol diacetone acrylamide (DAA, diacetone acrylamide) or mixtures thereof
  • DMA NN-dimethyl
  • the hydrogel-tissue forming step may be carried out in the presence of a thermal polymerization initiator, a photopolymerization initiator or a catalyst.
  • the hydrogel-tissue forming step may be performed by irradiation or pH change.
  • the thermal polymerization initiator may be 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride.
  • the step of removing the cells in the tissue may be performed by detergent treatment, fixed hydraulic perfusion, enzyme treatment, freeze / thaw cycles or ultrasonic application.
  • the cleaning solution may be sodium dodecyl sulfate (SDS, sodium deoxycholate), sodium deoxycholate (SD), Triton X-100 (Triton X-100) or a mixture thereof.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • SD sodium deoxycholate
  • Triton X-100 Triton X-100
  • the hydrogel monomer solution may comprise a cleavable crosslinker (cleavable crosslinker).
  • a decellularized tissue prepared by the method according to an embodiment of the present invention.
  • preparing a decellularized tissue prepared by the method according to an embodiment of the present invention Cutting the crosslinker; And removing the hydrogel of the decellularized tissue, the sterilization method of the decellularized tissue is provided.
  • a tissue comprising a hydrogel polymer supporting the tissue and the tissue, wherein the cells in the tissue is removed
  • the hydrogel polymer is acrylamide (acrylamide), methacryl Amide, bis-acrylamide, polyaniline, NN-dimethylacrylamide (DMA), N, N '-(1,2-dihydroxyethylene) bisacrylamide (DHEBA), N, N-methylene Bisacrylamide, acrylic acid, methacrylic acid, vinylsulfonic acid, styrenesulfonic acid, polyacrylic acid, polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene oxide (PEO), glycidyl acrylate, methyl methacrylate (MMA ), Sodium polyacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), glycerol methacrylate, N-vinylpyrrolidone, N-acloylpiperidine, N-acylylpyrrolidine, cystaminebisacrylic maybe De (cylamide), methacryl Am
  • the decellularized tissue may be used as a support for cell culture, tissue transplant material, restorative material or artificial organ material.
  • the method for producing decellularized tissue of the present invention by pretreating the hydrogel polymer to support the tissue, it is possible to prevent loss of extracellular matrix protein or disruption of structural characteristics of the tissue during decellularization. Since hydrogel supports tissues, the strength of physical and chemical treatments for decellularization can be controlled, and thus, damaged or large tissues in which tissue perfusion is not possible regardless of the type of tissue. The decellularization process can also be efficiently performed.
  • the empty space generated in the decellularized tissue of the present invention can be used as a support for cell culture, and can be utilized as a material for tissue transplantation, restorative material or artificial organs through cell repopulation.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a method for preparing decellularized tissue according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a is an image comparing the before and after decellularization of the decellularized mouse liver (liver) prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2b is the data confirming the removal of cellular components after decellularization of mouse liver tissue.
  • Figure 3 compares the size and shape of the tissue before and after decellularization prepared according to one embodiment of the present invention and conventional methods.
  • Figure 4 is to observe whether the extracellular matrix protein (collagen) and the microstructure of the tissue of the decellularized tissue prepared according to one embodiment of the present invention and the conventional method.
  • extracellular matrix protein collagen
  • FIG. 4 is to observe whether the extracellular matrix protein (collagen) and the microstructure of the tissue of the decellularized tissue prepared according to one embodiment of the present invention and the conventional method.
  • Figure 5 is to observe the maintenance of collagen and glycosaminoglycans (GAG) in decellularized mouse kidney tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • GAG glycosaminoglycans
  • Figure 6 shows the type of decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7a is to observe the efficacy as a support for cell culture of decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7b is to observe the results of culturing the cells in decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8a is a schematic of the transplant experiment of decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8b is to confirm whether the blood vessels generated 1 week, 7 weeks after transplantation of decellularized mouse kidney tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8c confirms whether the blood vessels generated three weeks after transplantation of decellularized mouse liver tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8D shows whether blood vessels are formed after 3 weeks of transplantation of decellularized human liver tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8e confirms the newly generated blood vessels and fibroblasts in the decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8F is an image showing cell depth in tissues one, three and seven weeks after transplantation of decellularized tissues prepared according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 8g confirms the dividing cells of decellularized human liver, mouse kidney tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9a is a graph showing the changes in extracellular matrix protein and tissue fibrosis and immune rejection 3 weeks and 7 weeks after transplantation of decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • 9B is a graph showing changes in mRNA expression levels of extracellular matrix proteins and tissue fibrosis-related proteins 3 and 7 weeks after transplantation of decellularized tissues prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9c shows the results of observing the immune rejection reaction 3 weeks and 7 weeks after the transplantation of decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 confirms the imaging characteristics of the decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • 11 is to confirm the management characteristics of the decellularized tissue prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12A is a schematic diagram of a method for removing hydrogel in tissue using a cleavable crosslinker.
  • Figure 12b shows the result of removing the hydrogel in the organ tissues of decellularized mice and organ tissues of porcine (porcine) using a cleavable crosslinking agent.
  • FIG. 13 is an image showing decellularized tissue prepared according to the use of various hydrogel monomers and combinations thereof.
  • injecting a hydrogel monomer solution into the isolated tissue Polymerizing the hydrogel monomer to form a hydrogel-tissue; And removing the cells in the hydrogel-tissue; there is provided a method for producing decellularized tissue.
  • hydrogel-tissue refers to a complex in which the hydrogel polymer and tissue are bound so that the tissue can be supported by the hydrogel polymer.
  • hydrogel refers to a substance in the form of a gel in which water is used as a dispersion medium, and the inside of the hydrogel has a network structure formed between hydrophilic compounds.
  • the isolated tissue may be selected from tissues isolated from organs of a mammal, or embryonic mammals and post-mortem tissues of a mammal.
  • the mammal is a cow, horse, camel, llama, donkey, yak, sheep, pig, goat, deer, alpaca, dog, raccoon, weasel, fox, cat, rabbit, hamster, mormot, mouse, squirrel, raccoon, etc. It may include, but is not limited to, it may be a mouse or a pig.
  • the separated tissue may be a tissue capable of decellularization treatment by having an extracellular matrix structure.
  • the tissue may include liver, kidney, urinary tract, bladder, urethra, tongue, amygdala, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, anus, pancreas, heart, blood vessel, spleen, lung, brain, bone, spinal cord, cartilage, testis.
  • Uterine, fallopian tube, ovary, placenta, cornea, skeletal muscle, muscle, nerve and skin may be one or more selected, preferably brain, heart, liver, lung, kidney or spleen, but is not limited thereto. It is not.
  • the method of separating a tissue can use a well-known method.
  • the present inventors have made diligent efforts to improve the decellularization efficiency and develop a decellularization method that can be applied to various tissues. As a result, the present inventors confirmed that the above object can be achieved by pre-treating hydrogel as a support for tissues. .
  • Hydrogel monomer may be injected into the tissue for hydrogel pretreatment. Injection of the hydrogel monomer may be carried out by immersing the tissue in a hydrogel monomer solution.
  • the hydrogel monomer is acrylamide, methacrylamide, bis-acrylamide, polyaniline, NN-dimethylacrylamide (DMA), N, N '-(1,2-di), which are hydrophilic compounds.
  • Hydroxyethylene) bisacrylamide DHEBA
  • N, N-methylenebisacrylamide acrylic acid, methacrylic acid, vinylsulfonic acid, styrenesulfonic acid, polyacrylic acid, polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene oxide (PEO), glycidyl acrylate, methyl methacrylate (MMA), sodium polyacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), glycerol methacrylate, N-vinylpyrrolidone, N-a Cloylpiperidine, N-acrylopyrrolidine, cystamine bisacrylamide, propylene glycol (PPG), ethylene glycol diacetone acrylamide (DAA, diacetone acrylamide) or mixtures thereof One can.
  • properties of the hydrogel polymer may be reflected in decellularized tissues.
  • the polyacrylate when using the polyacrylate can be made larger or smaller than the volume of the tissue 8 times, when using the polyacrylic acid it is possible to obtain a high elastic tissue.
  • the hydrogel monomer may be polymerized to form a hydrogel-tissue.
  • Formation of the hydrogel-tissue can be carried out in the presence of a thermal polymerization initiator, a photopolymerization initiator or a catalyst, or by irradiation or pH change.
  • the thermal polymerization initiator is 2,2'-azobis [2- ( 2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride, but is not limited thereto.
  • a decellularization process may be performed to remove cells from the tissue.
  • the decellularization may be performed by detergent treatment, fixed hydraulic perfusion or ultrasonic application.
  • the cleaning solution may be a powerful cleaning agent such as sodium dodecyl sulfate (SDS, sodium deoxycholate), triton X-100 (Triton X-100) or a mixture thereof. It is not limited to this.
  • the fixed water pressure may be 3,000 atm to 10,000 atm, but is not limited thereto.
  • Hydrogel polymers bound to tissues prevent the loss of extracellular matrix proteins and disruption of cellular structure due to decellularization, thus efficiently decellularizing tissues while maintaining their original shape regardless of tissue type or decellularization intensity. can do.
  • damaged tissues or large tissues that cannot be perfused can be rapidly decellularized.
  • Decellularized tissue prepared in this manner can also maintain physical properties such as inherent elasticity.
  • the decellularized tissue may maintain transparency even without refractive index correction, unlike a tissue to which a conventional 3D imaging technique is applied.
  • it may be easy to observe the structure, such as bone or blood vessels, or obtain three-dimensional distribution information of the extracellular matrix protein in the tissue.
  • the decellularized tissue may be formed inside the empty space by the cell removal to provide a structure suitable for cell culture, through which it can be utilized in in vitro disease model, mechanism research.
  • the hydrogel monomer solution injected into the separated tissue may include a cleavable crosslinker.
  • Cleavable crosslinkers generally refer to compounds that copolymerize with monomers to form a crosslinked polymer network, but which can be cleaved by changes in the external environment such as heat, UV, pH changes.
  • the cleavable crosslinking agent N, N ′-(1,2-dihydroxyethylene) bisacrylamide (DHEBA) or cystamine bisacrylamide (BAC) may be used, but is not limited thereto.
  • N, N '-(1,2-dihydroxyethylene) bisacrylamide (DHEBA) is mixed with a hydrogel monomer solution as a crosslinking agent to decellularize the tissue, the pH is raised to 12 and the crosslinking agent The hydrogel can be removed from the tissue by cleaving (see FIGS. 12A, B).
  • another embodiment of the present invention includes a tissue and a hydrogel polymer supporting the tissue, wherein the cells in the tissue are decellularized tissue, wherein the hydrogel polymer is acrylamide, methacryl Amide, bis-acrylamide, polyaniline, NN-dimethylacrylamide (DMA), N, N '-(1,2-dihydroxyethylene) bisacrylamide (DHEBA), N, N-methylene Bisacrylamide, acrylic acid, methacrylic acid, vinylsulfonic acid, styrenesulfonic acid, polyacrylic acid, polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene oxide (PEO), glycidyl acrylate, methyl methacrylate (MMA ), Sodium polyacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), glycerol methacrylate, N-vinylpyrrolidone, N-acloylpiperidine, N-acylylpyrrolidine, cystaminebisacrylic Probably this (Cyl,
  • the decellularized tissue of the present invention can be applied to a wide range of implantable material because it can maintain the long-term structure after the transplantation, as well as the organ organs or tissues for transplantation through the cell reproduction, and easy generation of blood vessels and cell penetration.
  • the decellularized tissue of the present invention is easy to dry, ethanol sterilization and the like, it is possible to simplify the process for manufacturing the implant.
  • the decellularized tissue may be used as a cell culture support, tissue transplant material, restorative material or artificial organ material.
  • the mixed solution was heated to 37 ° C. to initiate the polymerization reaction and hold the reaction for 2 hours to obtain a complex formed by the polymerization reaction of acrylamide, bis-acrylamide and liver tissue.
  • the dehydrogenated tissue was finally prepared by removing the hydrogel around the complex, adding 4% SDS (sodium dodecyl sulfate) solution, and reacting at 37 ° C. for 1-3 days.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • Liver tissue was observed before and after decellularization using a microscope, and the removal of cellular components was confirmed using a staining reagent (Hoechst) that can confirm nuclear information in the tissue. Observation results of the liver tissue and whether the cellular components are removed are shown in FIGS. 2 and 3, respectively. Through the image of FIG. 2 and the result of using DNA quantitative analysis, Western blot, and immunohistochemistry of FIG. 3, it can be confirmed that cellular components in liver tissue were removed by decellularization.
  • Hoechst staining reagent
  • Example 2 Observation of extracellular matrix protein and cell structure according to decellularization method
  • the decellularized tissues prepared by the enzymatic and chemical methods and the decellularized tissues prepared according to Example 1 were observed before and after decellularization, and the results are shown in FIG. 3. .
  • the enzymatic method did not effectively decellularize the tissue, and the chemical method showed that the tissue size was significantly reduced due to the strong detergent.
  • the decellularization proceeds after the polymerization reaction with the hydrogel monomer according to Example 1, it can be seen that it can exhibit excellent decellularization efficiency without reducing the size of the tissue by using a strong detergent.
  • Example 3 Observation of the degree of decellularization according to the type of tissue
  • Example 1 In order to confirm whether the decellularization method of Example 1 is limited to liver tissue, the same decellularization method as in Example 1 was performed on embryos, brains, and hearts of mice, and the results are shown in FIG. 6. It was.
  • Example 1 can efficiently perform decellularization of embryos, brain heart, lungs, kidneys, spleen, etc. in addition to liver tissue.
  • the decellularization effectively proceeded in the embryo, the brain, which is a weak tissue that could not achieve efficient decellularization by the conventional method.
  • Example 1 To determine whether the decellularized tissue prepared according to Example 1 can be applied as a support for cell culture, incubating HeLa cells in the decellularized kidney tissue prepared according to Example 1, and illustrating the observation results. Shown in 7a. In addition, the observation results are shown in FIG. 7B by culturing various cells such as HeLa cells, HT-22, and primary cells in the decellularized brain, liver, lung, and kidney tissues prepared according to Example 1.
  • FIG. 7B by culturing various cells such as HeLa cells, HT-22, and primary cells in the decellularized brain, liver, lung, and kidney tissues prepared according to Example 1.
  • indices of growth rate, cell death, etc. of the cells were not significantly different from those of normal cell culture.
  • cells cultured in decellularized tissues gradually penetrated into the tissues over time and were deep (Depth You can see that) deepens.
  • FIG. 7B HT-22 cells in liver tissues were stably present without departure, and in the case of brain tissues, astrocytes and neurons were stably present.
  • Example 1 1 week, 3 weeks after transplanting decellularized mouse kidney, liver and human liver tissue prepared in the same manner as in Example 1 to determine whether the decellularized tissue prepared according to Example 1 can be applied as a material for transplantation Each tissue was observed at week and 7 weeks, and the results are shown in FIGS. 8B to 8D.
  • blood vessels may be generated after transplantation in the case of transplanting not only decellularized mouse kidneys and liver tissues but also human liver tissues.
  • blood vessels in decellularized tissues CD31
  • fibroblasts ( ⁇ SMA) can be confirmed that the production, referring to Figure 8g can be seen to divide the cells (Ki67).
  • FIG. 8F it can be seen that cells gradually developed inside the decellularized tissue with time after transplantation.
  • Example 1 may exhibit excellent efficacy as a material for transplantation.
  • Example 5 In order to confirm whether the decellularized tissue transplanted in Example 5 is undergoing normal tissue regeneration process, microarray analysis is performed on tissues 3 and 7 weeks after transplantation, and the results 9A to 9C.
  • 9A and 9B mRNA expression of tissue-associated fibrosis-related protein was decreased at 7 weeks compared to 3 weeks after transplantation, and extracellular matrix-related mRNA expression was increased or decreased depending on the type.
  • extracellular matrix protein increased as blood vessels were newly formed or tissue regeneration proceeded.
  • the immune rejection response of the transplanted tissue was decreased in the pro-inflammatory mRNA expression and anti-inflammatory mRNA expression increased 7 weeks compared to 3 weeks after transplantation You can check it.
  • FIG. 10 After decellularizing the mouse embryo in the same manner as in Example 1, the bone was stained and visually observed, and the results are shown in FIG. 10. Referring to FIG. 9, when dehydrogenation is performed after pretreatment of the hydrogel polymer to support the tissue, it can be seen that the bone structure can be clearly observed with the naked eye without undergoing refractive index correction as in the conventional tissue clearing.
  • the decellularized mouse embryos were dehydrated (dehydration) and then rehydrated (rehydration) while observing the embryo morphology at each step visually, and compared the area, the results are shown in Figure 11. Referring to FIG. 11, it can be seen that tissues are not deformed even after repeated dehydration and rehydration, thereby improving management characteristics such as sterilization, storage, and transportation.
  • the mixed solution was heated to 37 ° C. to initiate the polymerization reaction and hold the reaction for 2 hours to obtain a complex formed by the polymerization reaction of acrylamide, bis-acrylamide and liver tissue.
  • the dehydrogenated tissue was finally prepared by removing the hydrogel around the complex, adding 4% SDS (sodium dodecyl sulfate) solution, and reacting at 37 ° C. for 1-3 days.
  • the pH of the prepared decellularized tissue was adjusted to 12 to cut the crosslinking agent of the hydrogel in the tissue.
  • Decellularized tissue was sterilized by de-geling the hydrogel in the tissue through cleavage of the crosslinker, and the results are shown in FIG. 12B.

Abstract

본 발명은 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직에 관한 것으로, 본 발명의 탈세포화 조직의 제조방법은 탈세포화 과정에서 세포외기질 단백질의 손실을 방지하고 조직의 구조 특성을 유지하며, 조직의 종류에 관계없이 효율적으로 조직 내 세포를 제거할 수 있고, 이로부터 제조된 탈세포화 조직은 세포 배양용 지지체, 조직 이식용 소재, 수복재 또는 인공 장기용 소재로 이용될 수 있다.

Description

하이드로겔 중합체를 이용한 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직
본 발명은 하이드로겔 중합체를 이용한 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직에 관한 것이다.
탈세포화(decellularized) 생체조직은 이의 3차원 구조에 대한 세포 반응성 조사, 조직 이식, 조직 재생 등 세포외기질(ECM, extracellular matrix) 단백질을 필요로 하는 다양한 조직공학 분야에 적용할 수 있는 기술로 최근 각광받고 있다.
조직 탈세포화는 생체로부터 획득한 조직에서 세포 성분을 선별적으로 제거한 후, 잔류의 세포외기질을 이용하기 위한 기술로, 탈세포화된 조직은 조직재건수술, 인공장기 이식용 소재, 피부 대체재 등으로 광범위하게 사용되고 있다.
기존에 보고된 탈세포화 방법은 주로 물리적, 화학적, 효소적 처리를 병용한다. 일반적인 탈세포화 방법은 물리적 처리나 이온성 용액(ionic solution)을 이용하여 세포막을 파괴시키고, 효소적 처리를 통해 세포외기질로부터 세포의 구성성분(cellular component)을 분리시킨 다음, 세정액을 이용하여 세포 내 물질, 세포핵 물질, 세포 잔류물(debris)을 제거하는 과정으로 이루어진다.
피부와 같이 세포외기질이 풍부한 조직은 탈세포화 이후에도 비교적 손상 없는 원형을 유지하므로, 탈세포화 후 3차원적 구조가 유지된 조직을 그대로 이용할 수 있다. 반면 세포 성분이 많은 조직의 경우, 탈세포화 후 확보한 세포외기질을 용해시켜 3D 프린팅을 위한 바이오잉크로 사용하는 등 후처리 공정이 필수적으로 수반된다. 특히, 인체 조직과 같이 현실적, 윤리적 문제 때문에 한정된 자원을 이용하는 경우 극히 제한된 조직만이 탈세포화 후 활용 가능한 한계가 있다.
기존의 물리적, 화학적, 효소적 방법을 이용하여 탈세포화를 진행하면 생체조직 고유의 구조가 붕괴되거나 세포외기질 단백질의 손실이 발생한다. 또한, 이러한 처리 과정을 거치면서 생체조직이 물리적으로 약화되는 문제가 발생하기도 한다. 특히, 대형 동물의 장기 탈세포화는 장시간의 처리 과정이 요구되고, 이는 필연적으로 세포외기질 단백질의 손실과 구조 특성의 붕괴를 초래한다.
탈세포화 시간을 단축시키기 위해 세정액을 강하게 사용하거나 물리적 힘을 증가시키는 등 추가의 조치가 이루어지고 있으나, 이 또한 세포외기질 단백질의 손실과 구조 특성의 붕괴를 수반한다.
탈세포화 과정 중 조직의 물리적 특성이 약화되어 구조적 특성이 붕괴되거나 세포외기질 단백질의 손실이 발생하는 경우, 이식 후 체내의 결합조직 세포가 이식체 내부로 침투하여 새로운 세포외기질을 생산하고 충분한 재생이 진행되는데 한계를 나타낸다. 기존 보고에 따르면, 피부 조직의 복강 또는 복막 대체의 경우 4~6주 이내에 이식된 조직의 자연적 분해 과정이 진행되고, 이에 따라 재수술이 요구되거나 충분한 재생력이 구현되지 않는 문제가 발생한다.
반면, 이러한 문제를 해결하기 위해 물리적, 화학적 처리의 강도를 약화시키면 세포 성분이 충분히 제거되지 않아 탈세포화 조직의 활용이 어려운 한계가 있다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 탈세포화 과정에서 세포외기질 단백질의 손실을 방지하고 조직의 구조 특성을 유지하며, 조직의 종류에 관계없이 효율적으로 조직 내 세포를 제거할 수 있는 탈세포화 조직의 제조방법 및 이로부터 제조된 탈세포화 조직을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분리된 조직에 하이드로겔(hydrogel) 단량체 용액을 주입하는 단계; 상기 하이드로겔 단량체를 중합시켜 하이드로겔-조직을 형성하는 단계; 및 상기 하이드로겔-조직 내 세포를 제거하는 단계;를 포함하는, 탈세포화 조직의 제조방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 분리된 조직은, 포유동물의 장기로부터 분리된 조직, 또는 포유동물의 배아 및 포유동물의 사후 조직으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 하이드로겔 단량체는 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 폴리아닐린, N-N-디메틸아크릴아마이드(DMA), N,N'-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA), N,N-메틸렌비스아크릴아마이드, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐술폰산, 스티렌술폰산, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 글리시딜아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트(MMA), 소듐 폴리아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 글리세롤 메타크릴레이트, N-비닐피롤리돈, N-아클로일피페리딘, N-아크로일피롤리딘, 시스타민비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide), 프로필렌글리콜(PPG), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 디아세톤 아크릴아마이드(DAA, diacetone acrylamide) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 하이드로겔-조직 형성 단계는 열중합 개시제, 광중합 개시제 또는 촉매의 존재 하에 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 하이드로겔-조직 형성 단계는 방사선 조사 또는 pH 변화에 의해 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 열중합 개시제는 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조직 내 세포를 제거하는 단계는 세정액(detergent) 처리, 고정수압 관류, 효소 처리, 동결/해동 반복 사이클 처리 또는 초음파 인가에 의해 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 세정액은 소듐 도데실 설페이트(SDS, sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트(SD, sodium deoxycholate), 트리톤X-100 (Triton X-100) 또는 이들의 혼합물 일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 하이드로겔 단량체 용액은, 절단 가능한 가교제(cleavable crosslinker)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 제조된, 탈세포화 조직이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 제조된 탈세포화 조직을 준비하는 단계; 상기 가교제를 절단하는 단계; 및 상기 탈세포화 조직의 하이드로겔을 제거하는 단계;를 포함하는, 탈세포화 조직의 멸균방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 조직 및 상기 조직을 지지하는 하이드로겔 중합체를 포함하고, 상기 조직 내 세포가 제거된 탈세포화 조직으로서, 상기 하이드로겔 중합체는 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 폴리아닐린, N-N-디메틸아크릴아마이드(DMA), N,N'-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA), N,N-메틸렌비스아크릴아마이드, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐술폰산, 스티렌술폰산, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 글리시딜아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트(MMA), 소듐 폴리아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 글리세롤 메타크릴레이트, N-비닐피롤리돈, N-아클로일피페리딘, N-아크로일피롤리딘, 시스타민비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide), 프로필렌글리콜(PPG), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 디아세톤 아크릴아마이드(DAA, diacetone acrylamide) 또는 이들의 혼합물이 중합된, 탈세포화 조직이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 탈세포화 조직은, 세포 배양용 지지체, 조직 이식용 소재, 수복재 또는 인공 장기용 소재로 이용될 수 있다.
본 발명의 탈세포화 조직의 제조방법은 하이드로겔 중합체를 전처리하여 조직을 지지함으로써, 이후 탈세포화 과정에서 세포외기질 단백질의 손실이나 조직의 구조 특성 붕괴를 방지할 수 있다. 하이드로겔이 조직을 지지하기 때문에 탈세포화를 위한 물리적, 화학적 처리 등의 강도를 조절할 수 있고, 이에 따라 조직의 종류에 관계없이 조직 관류(perfusion) 처치가 가능하지 않은 상태의 손상된 조직이나, 대형 조직에 대해서도 효율적으로 탈세포화 과정을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 탈세포화 조직에 생성된 빈 공간을 이용해 세포 배양용 지지체로 이용 가능하고, 세포 재증식(repopulation)을 통해 조직 이식용 소재, 수복재 또는 인공 장기용 소재로 활용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화 조직의 제조방법을 도식화한 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 생쥐 간(liver)의 탈세포화 전, 후를 비교한 이미지이다.
도 2b는 생쥐 간 조직의 탈세포화 이후 세포 성분의 제거 여부를 확인하는 데이터이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 종래 방법에 따라 제조된 탈세포화 전, 후 조직의 크기 및 형태를 비교한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예 및 종래 방법에 따라 제조된 탈세포화 조직의 세포외기질 단백질(collagen) 및 조직의 미세구조 유지 여부를 관찰한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 생쥐 신장(kidney) 조직에서의 콜라겐과 글리코사미노글리칸(GAG) 유지 여부를 관찰한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 종류를 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 세포 배양용 지지체로서의 효능을 관찰한 것이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직에 세포를 배양한 결과를 관찰한 것이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 이식 실험을 도식화한 것이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 생쥐 신장 조직의 이식 1주, 7주 후 혈관 생성 여부를 확인한 것이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 생쥐 간 조직의 이식 3주 후 혈관 생성 여부를 확인한 것이다.
도 8d는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 인간 간 조직의 이식 3주 후 혈관 생성 여부를 확인한 것이다.
도 8e는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직 내 새로 생성된 혈관과 섬유아세포를 확인한 것이다.
도 8f는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 이식 1주, 3주 및 7주 후의 조직 내 세포 깊이를 나타내는 이미지이다.
도 8g는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 인간 간, 생쥐 신장 조직의 분열하는 세포를 확인한 것이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 이식 3주 및 7주 후의 세포외기질단백질과 조직섬유화 및 면역거부반응의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 이식 후 3주 및 7주의 세포외기질단백질과 조직섬유화 관련 단백질의 mRNA 발현 레벨의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 이식 3주 및 7주 후의 면역거부반응을 관찰한 결과를 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 영상학적 특성을 확인한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 탈세포화 조직의 관리 특성을 확인한 것이다.
도 12a는 절단 가능한 가교제(cleavable crosslinker)를 이용한 조직 내 하이드로겔 제거 방법을 도식화한 것이다.
도 12b는 절단 가능한 가교제를 이용하여 탈세포화된 생쥐의 장기 조직 및 돼지(porcine)의 장기 조직 내 하이드로겔을 제거한 결과를 나타내는 것이다.
도 13은 다양한 하이드로겔 단량체 및 이들의 조합의 사용에 따라 제조된 탈세포화 조직을 나타내는 이미지이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 분리된 조직에 하이드로겔(hydrogel) 단량체 용액을 주입하는 단계; 상기 하이드로겔 단량체를 중합시켜 하이드로겔-조직을 형성하는 단계; 및 상기 하이드로겔-조직 내 세포를 제거하는 단계;를 포함하는, 탈세포화 조직의 제조방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “하이드로겔-조직”은 하이드로겔 중합체에 의해 조직이 지지될 수 있도록, 하이드로겔 중합체와 조직이 결합한 상태의 복합체를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "하이드로겔(hydrogel)"은 물을 분산매로 하는 겔(gel) 형태의 물질을 의미하며, 상기 하이드로겔 내부는 친수성 화합물 간 형성된 네트워크 구조로 이루어져 있다.
상기 분리된 조직은, 포유동물의 장기로부터 분리된 조직, 또는 포유동물의 배아 및 포유동물의 사후 조직으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 포유동물은 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트, 생쥐, 다람쥐, 미국너구리 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 생쥐 또는 돼지일 수 있다.
상기 분리된 조직은 세포 외 매트릭스 구조를 가짐으로써 탈세포화 처리가 가능한 조직일 수 있다. 예를 들어, 상기 조직은 간장, 신장, 뇨관, 방광, 요도, 혀, 편도, 식도, 위, 소장, 대장, 항문, 췌장, 심장, 혈관, 비장, 폐, 뇌, 뼈, 척수, 연골, 정소, 자궁, 난관, 난소, 태반, 각막, 골격근, 근육, 신경 및 피부로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 뇌, 심장, 간, 폐, 신장 또는 비장일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 조직을 분리하는 방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.
종래 SDS(sodium dodecyl sulfate)와 같은 강력한 세정제를 처리하거나 고강도의 물리적 처리를 이용하여 조직의 탈세포화를 수행하는 경우, 세포외기질(ECM) 단백질의 손실이 발생하거나 조직의 구조가 붕괴되는 문제가 있었다. 특히, 이러한 한계로 인해 배아, 뇌와 같이 골격의 강도가 약한 조직에서는 효율적으로 탈세포화를 수행할 수 없었다.
이에 본 발명자들은 탈세포화 효율을 향상시키고 다양한 조직에 적용할 수 있는 탈세포화 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 하이드로겔을 전처리하여 조직의 지지체로 사용함으로써 위와 같은 목적을 달성할 수 있음을 확인하였다.
하이드로겔 전처리를 위해 상기 조직에 하이드로겔 단량체를 주입할 수 있다. 상기 하이드로겔 단량체의 주입은 조직을 하이드로겔 단량체 용액에 침지시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 하이드로겔 단량체는 친수성 화합물인 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 폴리아닐린, N-N-디메틸아크릴아마이드(DMA), N,N'-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA), N,N-메틸렌비스아크릴아마이드, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐술폰산, 스티렌술폰산, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 글리시딜아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트(MMA), 소듐 폴리아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 글리세롤 메타크릴레이트, N-비닐피롤리돈, N-아클로일피페리딘, N-아크로일피롤리딘, 시스타민비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide), 프로필렌글리콜(PPG), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 디아세톤 아크릴아마이드(DAA, diacetone acrylamide) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 이와 같이 하이드로겔 단량체의 다양한 조합을 사용하는 경우, 탈세포화된 조직에 하이드로겔 중합체의 특성이 반영될 수 있다. 예를 들어, 도 13에 나타낸 바와 같이, 폴리아크릴레이트를 사용하는 경우 조직의 부피가 8배 이상 커지거나 작아지게 할 수 있으며, 폴리아크릴산을 사용하는 경우 탄성이 높은 조직을 얻을 수 있다.
조직으로 하이드로겔 단량체의 주입이 완료되면, 상기 하이드로겔 단량체를 중합시켜 하이드로겔-조직을 형성할 수 있다. 하이드로겔-조직의 형성은 열중합 개시제, 광중합 개시제 또는 촉매의 존재 하에 수행되거나, 방사선 조사 또는 pH 변화에 의해 수행될 수 있다. 열중합 개시제(thermal initiator) 존재 하에 하이드로겔을 중합하는 경우 온도 변화만으로 비교적 간단하게 단량체의 중합 개시 시점을 조절할 수 있으며, 구체적으로, 상기 열중합 개시제는 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하이드로겔-조직이 형성되어 상기 조직의 지지가 완료되면, 조직 내 세포를 제거하는 탈세포화 과정을 수행할 수 있다. 이 때, 상기 탈세포화는 세정액(detergent) 처리, 고정수압 관류 또는 초음파 인가에 의해 수행될 수 있다. 이 때, 상기 세정액은 소듐 도데실 설페이트(SDS, sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트(SD, sodium deoxycholate), 트리톤X-100 (Triton X-100) 또는 이들의 혼합물과 같은 강력한 세정제일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 고정수압은 3,000atm 내지 10,000atm일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
조직에 결합된 하이드로겔 중합체가 탈세포화에 따른 세포외기질 단백질의 손실이나 세포 구조의 붕괴를 방지하므로, 조직의 종류나 탈세포화 강도에 관계없이 조직의 원형을 유지하면서 효율적으로 탈세포화 조직을 제조할 수 있다. 특히, 관류(perfusion) 처리가 불가능한 손상 조직이나 대형 조직도 신속하게 탈세포화할 수 있다. 이와 같은 방법으로 제조된 탈세포화 조직은 고유의 탄성 등 물리적 특성 또한 유지될 수 있다.
나아가, 상기 탈세포화 조직은 종래 3차원 영상화 기술이 적용된 조직과 달리 굴절률 보정 없이도 투명성을 유지할 수 있다. 특히, 뼈 또는 혈관과 같은 구조 관찰이나 조직 내 세포외기질 단백질의 3차원 분포 정보의 획득이 용이할 수 있다.
상기 탈세포화 조직은 세포 제거에 의해 내부에 빈 공간이 형성되어 세포 배양에 적합한 구조를 제공할 수 있고, 이를 통해 체외 질병모델, 기전연구 등에도 활용될 수 있다.
한편, 분리된 조직에 주입되는 상기 하이드로겔 단량체 용액은, 절단 가능한 가교제(cleavable crosslinker)를 포함할 수 있다. 절단 가능한 가교제는 일반적으로 단량체와 공중합하여 가교 결합된 중합체 네트워크를 형성하나, 열, UV, pH 변화와 같이 외부 환경 변화에 의해 절단 될 수 있는 화합물을 의미한다. 절단 가능한 가교제로서는 N,N′-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA) 또는 시스타민 비스아크릴아마이드(BAC)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, N,N′-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA) 를 가교제로서 하이드로겔 단량체 용액에 혼합하여 조직의 탈세포화를 수행하는 경우, pH를 12로 높여 가교제를 절단시킴으로써 조직으로부터 하이드로겔을 제거할 수 있다(도 12a, b 참조).
따라서, 본 발명의 다른 일 실시예는, 조직 및 상기 조직을 지지하는 하이드로겔 중합체를 포함하고, 상기 조직 내 세포가 제거된 탈세포화 조직으로서, 상기 하이드로겔 중합체는 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 폴리아닐린, N-N-디메틸아크릴아마이드(DMA), N,N'-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA), N,N-메틸렌비스아크릴아마이드, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐술폰산, 스티렌술폰산, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 글리시딜아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트(MMA), 소듐 폴리아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 글리세롤 메타크릴레이트, N-비닐피롤리돈, N-아클로일피페리딘, N-아크로일피롤리딘, 시스타민비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide), 프로필렌글리콜(PPG), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 디아세톤 아크릴아마이드(DAA, diacetone acrylamide) 또는 이들의 혼합물이 중합된, 탈세포화 조직을 제공한다. 한편, 본 발명의 탈세포화 조직은 세포 재증식(reproduction)을 통해 이식용 인공장기 내지 조직뿐만 아니라, 이식 후 장기간 구조를 유지할 수 있고 혈관 생성 및 세포 침투가 용이하므로 광범위한 이식용 소재로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 탈세포화 조직은 건조, 에탄올 멸균 등의 처치가 용이하므로, 이식체 제조를 위한 공정을 단순화할 수 있다.
이에 따라, 상기 탈세포화 조직은, 세포 배양용 지지체, 조직 이식용 소재, 수복재 또는 인공 장기용 소재로 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 탈세포화 조직 제조
생쥐의 간을 적출하여 생리식염수로 세정한 후, 전체 용액 기준 아크릴아마이드(acrylamide) 10중량%, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide) 0.1중량% 및 열중합 개시제 0.05중량%를 포함하는 혼합 용액에 첨가하여 4℃에서 1일 동안 유지하였다. 이 때, 상기 열중합 개시제로는 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드를 사용하였다.
이후, 혼합 용액을 37℃로 승온하여 중합 반응을 개시하고 2시간 동안 반응을 유지시킴으로써 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드와 간 조직의 중합 반응으로 형성된 복합체를 수득하였다.
상기 복합체 주변의 하이드로겔을 제거하고, 4% SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액에 투입하여 1~3일 동안 37℃에서 반응시킴으로써 최종적으로 탈세포화 조직을 제조하였다.
현미경을 이용하여 탈세포화 과정 전, 후의 간 조직을 관찰하였고, 조직 내 핵 정보를 확인할 수 있는 염색시약(Hoechst)을 이용하여 세포 성분의 제거여부를 확인하였다. 간 조직의 관찰 결과와 세포 성분의 제거 여부를 각각 도 2와 도 3에 나타내었다. 도 2의 이미지 및, 도 3의 DNA 정량분석, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법을 이용한 결과를 통해 탈세포화 과정으로 간 조직 내 세포 성분이 제거되었음을 확인할 수 있다.
실시예 2: 탈세포화 방법에 따른 세포외기질 단백질 및 세포 구조 특성 관찰
상기 실시예 1에 따라 탈세포화 조직을 제조하는 경우 효과적으로 세포외기질(ECM) 단백질의 손실을 방지하고 세포 구조를 유지할 수 있는지 확인하기 위해, 기존의 탈세포화 방법과의 비교 실험을 수행하였다.
구체적으로, 트립신(trypsin), 1% SDS 및 2% Triton X-100 용액을 처리하는 효소적 방법 및 4% SDS 용액을 처리하는 화학적 방법을 이용하되, 하이드로겔 단량체와의 중합 반응 없이 탈세포화된 생쥐 간 조직을 제조하였다.
이러한 효소적 방법과 화학적 방법에 의해 제조된 탈세포화 조직과 상기 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 조직 각각에 대해 탈세포화 전, 후의 조직 크기 및 형태를 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참고하면, 효소적 방법은 조직의 탈세포화가 효과적으로 이루어지지 않았고 화학적 방법은 강한 세정제로 인해 조직의 크기가 현저히 감소하였음을 확인할 수 있다. 반면, 상기 실시예 1에 따라 하이드로겔 단량체와의 중합 반응 후 탈세포화를 진행하는 경우 강한 세정제를 사용함에 따른 조직 크기의 축소가 발생하지 않으면서도 우수한 탈세포화 효율을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
또한, 각각의 탈세포화 조직을 대상으로 세포외기질 단백질 및 조직의 미세구조 유지 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4를 참고하면, 기존의 방법과 달리 상기 실시예 1의 방법에 따라 탈세포화 조직을 제조하는 경우, 세포외기질 단백질인 Ⅳ형 콜라겐(collagen type Ⅳ)과 조직의 미세구조를 원형에 가깝게 유지할 수 있음을 확인할 수 있다.
한편, 상기 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 조직에서 Ⅳ형 콜라겐 외 세포외기질 단백질도 손실 없이 유지되는지 생쥐 신장 조직에 대한 면역염색을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5를 참고하면, Ⅰ형, Ⅲ형 콜라겐, 파이브로넥틴(fibronectin), HSPG, 라미닌, 니도겐(Nidogen) 등 다양한 세포외기질 단백질도 손실 없이 유지되는 것을 확인할 수 있다. 한편, 대표적인 세포외기질단백질인 콜라겐 및 글리코사미노글리칸(glycosaminogltcan, GAG)의 탈세포화 전, 후 단백질 양을 비교하는 경우에도 차이가 매우 적은 것을 확인할 수 있다.
실시예 3: 조직의 종류에 따른 탈세포화 정도 관찰
상기 실시예 1의 탈세포화 방법이 간 조직에만 국한되는 것인지 확인하기 위해, 생쥐의 배아, 뇌, 심장 등을 대상으로 상기 실시예 1과 동일한 탈세포화 방법을 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참고하면, 상기 실시예 1의 방법은 간 조직 외에도 배아, 뇌 심장, 폐, 신장, 비장 등의 탈세포화를 효율적으로 진행할 수 있음을 알 수 있다. 특히, 기존의 방법으로는 효율적인 탈세포화를 달성할 수 없었던 약한 조직인 배아, 뇌에서도 효과적으로 탈세포화가 진행되었음을 확인할 수 있다.
실시예 4: 세포 배양용 지지체로서의 효능 관찰
상기 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 조직이 세포 배양용 지지체로 적용될 수 있는지 확인하기 위해, 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 신장 조직에 헬라세포(HeLa cell)을 배양하고, 관찰 결과를 도 7a에 나타내었다. 또한, 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 뇌, 간, 폐 및 신장 조직에 헬라 세포, HT-22, 일차세포(primary cell) 등의 다양한 세포를 배양하여 관찰 결과를 도 7b에 나타내었다.
도 7a를 참고하면, 세포의 성장 속도, 세포 사멸 등의 지표는 일반 세포 배양과 큰 차이가 없었으며, 특히, 탈세포화 조직에서 배양된 세포가 시간이 지남에 따라 점점 조직 내로 침투하여 깊이(Depth)가 깊어지는 것을 확인할 수 있다. 도 7b를 참고하면, 간 조직 내 HT-22 세포가 이탈 없이 안정적으로 존재하였고, 뇌 조직의 경우 성상교세포(astrocyte) 및 뉴런(neuron)이 안정적으로 존재하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 상기 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 조직이 세포배양 지지체로 우수한 효능을 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 5: 조직 이식용 소재로서의 효능 관찰
상기 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 조직이 이식용 소재로서 적용될 수 있는지 확인하기 위해, 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 탈세포화 생쥐 신장, 간 및 인간 간 조직을 이식한 후 1주, 3주 및 7주 경과 시점에 각각의 조직을 관찰하였고, 그 결과를 도 8b 내지 8d에 나타내었다.
도 8b 내지 8d를를 참고하면 탈세포화 생쥐 신장 및 간 조직뿐만 아니라 인간 간 조직을 이식하는 경우에도 이식 후 혈관이 생성되었음을 확인할 수 있다.. 또한, 도 8e를 참고하면 탈세포화 조직 내 혈관(CD31) 및 섬유아세포(αSMA)가 생성되었음을 확인할 수 있고, 도 8g를 참고하면 분열하는 세포(Ki67)을 확인할 수 있다. 도 8f를 참고하면, 이식 후 시간이 경과에 따라 점차적으로 탈세포화 조직 내부 깊이 세포가 생성된 것을 알 수 있다.
이러한 결과는 상기 실시예 1에 따라 제조된 탈세포화 조직이 이식용 소재로서 우수한 효능을 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 6: 이식된 탈세포화 조직의 조직 재생 효과
상기 실시예 5에서 이식된 탈세포화 조직이 정상적인 조직의 재생과정 단계를 진행하고 있는지 여부를 확인하기 위해, 이식 후 3주 및 7주 경과 시점의 조직에 대해 마이크로어레이 분석을 수행하고, 그 결과를 도 9a 내지 9c에 나타내었다. 도 9a 및 9b를 참고하면, 조직섬유화와 관련된 단백질의 mRNA 발현 은 이식 후 3주 대비 7주차에 감소하였고, 세포외기질단백질 관련 mRNA 발현은 종류에 따라 증가하거나 감소하였다. 이러한 결과를 통해, 혈관이 새로 형성되거나 조직 재생이 진행됨에 따라 세포외기질단백질이 증가한 것임을 유추할 수 있다. 또한, 도 9c를 참고하면, 이식된 조직의 면역거부반응은 이식 후 3주 대비 7주차에 전염증성(pro-inflammatory) mRNA 발현은 감소하고, 항염증성(anti-inflammatory) mRNA 발현은 증가하는 것을 확인할 수 있다.
실시예 7: 탈세포화 조직의 영상학적 특성 및 관리 특성 확인
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 생쥐 배아를 탈세포화 한 뒤 뼈를 염색한 후 육안으로 관찰하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 9를 참고하면, 하이드로겔 중합체를 전처리하여 조직을 지지한 뒤 탈세포화를 진행하는 경우, 종래 조직 투명화와 같이 굴절률 보정을 거치지 않아도 뼈 구조를 육안으로 명확하게 관찰할 수 있음을 알 수 있다.
한편, 상기 탈세포화 생쥐 배아를 탈수화(dehydration)한 뒤 재수화(rehydration)하면서 각 단계별 배아 형태를 육안으로 관찰하고, 면적을 비교하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11을 참고하면, 탈수화 및 재수화를 반복하여도 조직이 변형되지 않으므로 멸균, 보관, 운반과 같은 관리 특성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: 탈세포화 조직의 멸균
돼지의 간을 적출하여 생리식염수로 세정한 후, 전체 용액 기준 아크릴아마이드(acrylamide) 10중량%, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide) 0.1중량%, N,N′-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA) 0.1중량% 및 열중합 개시제 0.05중량%를 포함하는 혼합 용액에 첨가하여 4℃에서 1일 동안 유지하였다. 이 때, 상기 열중합 개시제로는 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드를 사용하였다.
이후, 혼합 용액을 37℃로 승온하여 중합 반응을 개시하고 2시간 동안 반응을 유지시킴으로써 아크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드와 간 조직의 중합 반응으로 형성된 복합체를 수득하였다. 상기 복합체 주변의 하이드로겔을 제거하고, 4% SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액에 투입하여 1~3일 동안 37℃에서 반응시킴으로써 최종적으로 탈세포화 조직을 제조하였다.
상기 제조된 탈세포화 조직의 pH를 12로 조정하여 조직 내 하이드로겔의 가교제를 절단하였다. 가교제의 절단을 통해 조직 내 하이드로겔을 제거(de-gel)함으로써 탈세포화 조직을 멸균하고, 그 결과를 도 12b에 나타내었다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (13)

  1. 분리된 조직에 하이드로겔(hydrogel) 단량체 용액을 주입하는 단계;
    상기 하이드로겔 단량체를 중합시켜 하이드로겔-조직을 형성하는 단계; 및
    상기 하이드로겔-조직 내 세포를 제거하는 단계;를 포함하는, 탈세포화 조직의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 조직은, 포유동물의 장기로부터 분리된 조직, 또는 포유동물의 배아 및 포유동물의 사후 조직으로부터 선택되는 것인, 탈세포화 조직의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔 단량체는 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 폴리아닐린, N-N-디메틸아크릴아마이드(DMA), N,N'-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA), N,N-메틸렌비스아크릴아마이드, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐술폰산, 스티렌술폰산, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 글리시딜아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트(MMA), 소듐 폴리아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 글리세롤 메타크릴레이트, N-비닐피롤리돈, N-아클로일피페리딘, N-아크로일피롤리딘, 시스타민비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide), 프로필렌글리콜(PPG), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 디아세톤 아크릴아마이드(DAA, diacetone acrylamide) 또는 이들의 혼합물인, 탈세포화 조직의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔-조직 형성 단계는 열중합 개시제, 광중합 개시제 또는 촉매의 존재 하에 수행되는, 탈세포화 조직의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔-조직 형성 단계는 방사선 조사 또는 pH 변화에 의해 수행되는, 탈세포화 조직의 제조방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 열중합 개시제는 2,2'-아조비스[2-(2-이미다졸린-2-일)프로판]디하이드로클로라이드인, 탈세포화 조직의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조직 내 세포를 제거하는 단계는 세정액(detergent) 처리, 고정수압 관류, 효소 처리, 동결/해동 반복 사이클 처리 또는 초음파 인가에 의해 수행되는, 탈세포화 조직의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세정액은 소듐 도데실 설페이트(SDS, sodium dodecyl sulfate), 소듐 데옥시콜레이트(SD, sodium deoxycholate), 트리톤X-100 (Triton X-100) 또는 이들의 혼합물인, 탈세포화 조직의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 하이드로겔 단량체 용액은, 절단 가능한 가교제(cleavable crosslinker)를 포함하는, 탈세포화 조직의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항에 따른 방법으로 제조된, 탈세포화 조직.
  11. 제9항에 따른 방법으로 제조된 탈세포화 조직을 준비하는 단계;
    상기 가교제를 절단하는 단계; 및
    상기 탈세포화 조직의 하이드로겔을 제거하는 단계;를 포함하는, 탈세포화 조직의 멸균방법.
  12. 조직 및 상기 조직을 지지하는 하이드로겔 중합체를 포함하고,
    상기 조직 내 세포가 제거된 탈세포화 조직으로서,
    상기 하이드로겔 중합체는 아크릴아마이드(acrylamide), 메타크릴아마이드, 비스-아크릴아마이드(bis-acrylamide), 폴리아닐린, N-N-디메틸아크릴아마이드(DMA), N,N'-(1,2-디하이드록시에틸렌)비스아크릴아마이드(DHEBA), N,N-메틸렌비스아크릴아마이드, 아크릴산, 메타크릴산, 비닐술폰산, 스티렌술폰산, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 글리시딜아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트(MMA), 소듐 폴리아크릴레이트, 2-히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA), 글리세롤 메타크릴레이트, N-비닐피롤리돈, N-아클로일피페리딘, N-아크로일피롤리딘, 시스타민비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide), 프로필렌글리콜(PPG), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 디아세톤 아크릴아마이드(DAA, diacetone acrylamide) 또는 이들의 혼합물이 중합된, 탈세포화 조직.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 탈세포화 조직은, 세포 배양용 지지체, 조직 이식용 소재, 수복재 또는 인공 장기용 소재로 이용되는, 탈세포화 조직.
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