CN1253559C

CN1253559C - 一种移植材料的制造方法

Info

Publication number: CN1253559C
Application number: CN 03136597
Authority: CN
Inventors: 曹谊林; 胡晓洁; 王敏
Original assignee: University Shanghai 2nd Medical
Current assignee: University Shanghai 2nd Medical; Shanghai Second Medical University
Priority date: 2003-05-22
Filing date: 2003-05-22
Publication date: 2006-04-26
Anticipated expiration: 2023-05-22
Also published as: CN1460715A

Abstract

本发明关于一种用于生物体角膜基质环(ICR)植入手术的移植材料的制造方法，包括以下步骤：步骤一、制备生物支架；步骤二、分离培养生物体角膜基质细胞；和步骤三、制备角膜基质细胞-生物支架复合物、并预制角膜基质组织；还可进一步包括步骤四，将步骤三中获得的形成细胞-生物材料复合物植入生物体角膜基质板层内，获得新生的组织工程角膜基质组织。将由本发明获得的角膜基质组织植入生物体角膜基质的周边，增加角膜厚度、以治疗屈光不正，相较现有技术中采用其它聚合体材料的ICR具有更可靠的效果、更稳定、预期性更好。而且这种材料与角膜之间完全可以达到真正的生物愈合，彻底避免其他替代材料移植可能导致的角膜溶解、房水渗漏与植入物脱出等并发症。

Description

一种移植材料的制造方法

技术领域

本发明关于一种移植材料的制造方法，尤其是一种应用于生物体角膜基质环(intrastromal corneal ring，ICR)植入手术的、利用组织工程学构建的移植材料的制造方法。

背景技术

近年来，眼科界采用的矫正生物体眼睛屈光度的角膜屈光手术一般有许多种，例如放射状角膜切开术(RK)、准分子激光角膜切削术(PRK)、自动角膜板层成型术(ALK)、和准分子激光角膜原位磨镶术(LASIK)等，手术种类繁多，各有所长。关于屈光性手术临床实践评价标准是通常为有效性，预测性，稳定性和安全性，手术方式选择必须综合估计风险-效益比。RK，PRK，ALK，和LASIK等手术技术相对比较成熟、并有较好的临床效果。但是这些技术仍存在许多不尽人意之处，诸如手术后生物体的眼睛存在屈光度回退、散光、晕光、最佳矫正视力下降、角膜切口裂开、角膜雾状浑浊，眼压升高和角膜穿孔等并发症和危险因素，因而眼科界仍然在努力寻找一种更安全、可靠的屈光手术。

角膜基质环(intrastromal corneal ring，ICR)植入手术就是这样一种新兴的屈光手术。该技术将ICR植入生物体角膜基质的周边约2/3深度处，增加角膜周边厚度，通过ICR力的扩张作用，导致角膜中央区产生弧长缩短效应，使角膜曲率减小，屈光度减小，从而纠正屈光。其区别目前流行的屈光手术(RK、PRK和LASIK手术)的主要特点在于，该手术不损伤角膜结构的完整性，极大避免了这些手术后可能出现的危险，具有有效、稳定、可逆、预期性好、并发症少等优点，因此ICR植入技术很可能成为理想的屈光手术。

目前，ICR植入手术所使用的角膜基质环ICR一般有一体开放式环型和两段弧型两形式，相关现有技术可参考第6228114B1号美国专利。已经商业化的ICR通常是采用与生物体适应性较好的聚合体材料制成的透明环状体，如美国专利第6511508B1、6228114B1号。例如，可采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制作成ICR，而相关地PMMA在角膜内稳定的理化性质已经被证实。但是，所采用的聚合体材料，如PMMA，大多属于非渗透性、非柔韧性以及无孔性材料，这类材料与生物体角膜之间不能达到真正的生物愈合，最终有可能导致角膜溶解、房水渗漏与植入物脱出等晚期并发症。而且，此类聚合体材料(如PMMA)长期存在生物体角膜内可能导致的其他不良生物学反应尚有待于进一步观察和研究。

由于ICR植入手术所需要的ICR材料来源的这种不安全因素，已经成为制约该技术进一步广泛开展的严重障碍。

近来，随着生命科学、材料科学以及相关物理、化学学科的发展，人们提出了一个新的概念——组织工程。它是应用细胞生物学和工程学原理，研究开发修复、改善损伤组织结构和功能的生物替代物的一门科学。其基本方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物支架，植入机体组织缺损部位，在支架材料逐步降解过程中，细胞继续增殖并分泌基质，最终形成相应组织，达到修复组织缺损，重建功能的目的。

应用组织工程技术重建组织，有望从根本上解决组织器官移植手术供体材料缺乏的问题。此项技术已经成功构建了软骨、骨、肌腱、皮肤等各种组织。

因此，将组织工程角膜基质作为ICR材料来源，综合ICR植入技术和组织工程所提供的优质、可靠组织来源的优势，进一步完善ICR植入术式，就成为相关技术人士所关注及研究的课题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种用于生物体角膜基质环(ICR)植入手术的、利用组织工程学构建的移植材料的制造方法，其应用组织工程技术构建角膜基质组织可为ICR植入术提供稳定、可靠的移植材料。

本发明的技术要点是：该移植材料的制造方法包括以下步骤：步骤一、制备生物支架；步骤二、分离培养生物体角膜基质细胞；和步骤三、制备角膜基质细胞-生物支架复合物，并预制角膜基质组织。

本发明移植材料的制造方法进一步包括步骤四，将步骤三中获得的形成细胞-生物材料复合物植入生物体角膜基质板层内，获得新生的组织工程角膜基质组织。

步骤一包括：取片状直径为14μm的非编织聚羟基乙酸(PGA)纤维3-7mg，剪成直径为5mm的圆盘状，在75％的酒精浸泡消毒30-45分钟后，再用4℃无菌磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS；含青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)反复冲洗3次，室温下自然晾干。

步骤二包括：在无菌条件下取得生物体眼球，经PBS清洗后，放入消毒盘内；解剖该生物体眼球，分离角膜上皮层、角膜基质层和角膜内皮层组织；取出角膜基质层组织放入4℃的PBS中清洗后，剪成1-2mm³大小的组织块。将组织块置入15ml离心管中，加入150-250u/ml II型胶原酶4-7ml，移入恒温振荡器内，在37℃、振荡频率80-120次/分钟的条件下振荡40-70分钟；收集角膜基质细胞悬液，以1000r/min的速度离心5-8分钟，弃去上清液，经PBS反复冲洗、离心、弃去上清液，再加入培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数，取细胞活力＞75％的角膜基质细胞备用。将角膜基质细胞和培养液的混合体放入5％CO₂、37℃饱和湿度培养箱中进行细胞培养。

步骤二中使用的培养液为PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺300μg/ml、维生素C 50μg/ml、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。

步骤三包括：在无菌条件下，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％的乙烯二胺四乙酸(Ethylene Diamine-Tetraacidic Acid，EDTA)消化收集经步骤二培养了5-8天的角膜基质细胞，以1～4×10⁷/ml的浓度30～50μl接种PGA，并加入相应的培养液10ml，再放入5％CO₂培养箱中进行培养，隔日更换新鲜培养液。

步骤三中所使用的培养液为PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺300μg/ml、维生素C 50μg/ml、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的Ham’F-12培养液10ml。

本发明应用组织工程技术将角膜基质细胞接种于生物材料，形成细胞-生物材料复合物植入角膜基质板层内，获得了新生的组织工程角膜基质组织。经组织工程获得的角膜基质具有与正常角膜基质类似组织学结构，其生物学性能也与正常角膜相类似，具有良好的组织相容性。而且，随着时间的延长，组织工程技术构建的角膜基质组织逐渐呈现透明。一般在术后8周左右，生物支架材料基本降解完全，此时组织工程角膜基质基本接近透明。

将由本发明获得的角膜基质组织植入生物体角膜基质的周边，增加角膜厚度、以治疗屈光不正，相较现有技术中采用其它聚合体材料的ICR具有更可靠的效果、更稳定、预期性更好。而且这种材料与角膜之间完全可以达到真正的生物愈合，彻底避免其他替代材料移植可能导致的角膜溶解、房水渗漏与植入物脱出等并发症。

附图说明

图1是本发明步骤二所采用的生物支架的微观放大示意图；

图2是本发明步骤三中角膜基质细胞-PGA生物支架复合物在生物体外培养6天时的状态示意图；

图3是图2的局部放大示意图；

图4是本发明将角膜基质细胞-PGA复合物植入实验母兔眼睛的角膜板层手术前、后，实验母兔眼睛的状态图；

图5是本发明将角膜基质细胞-PGA复合物植入实验母兔角膜板层手术后3周，生物支架PGA部分降解、新生角膜基质组织逐渐形成的示意图；

图6是本发明将角膜基质细胞-PGA复合物植入实验母兔角膜板层手术后6周，生物支架PGA基本降解、新生角膜基质组织大部分形成的示意图；

图7是本发明将角膜基质细胞-PGA复合物植入实验母兔角膜板层手术后8周，生物支架PGA降解完成、新生角膜基质组织基本形成的示意图；

图8是图7的局部放大示意图；

图9是本发明Western Blot检测分析图；

图10是本发明角膜基质细胞表达GFP示意图；

图11是本发明GFP标记一周的角膜基质细胞-PGA复合物的示意图；

图12是本发明GFP标记的角膜基质组织的组织学切片的示意图。

具体实施方式

现结合说明书附图，对本发明用于角膜基质环植入手术的移植材料的制造方法作进一步详细说明。

本发明移植材料的制造方法主要包括以下步骤：步骤一、制备生物支架；步骤二、分离培养生物体角膜基质细胞；和步骤三、制备角膜基质细胞-生物支架复合物，并预制角膜基质组织。本发明移植材料的制造方法进一步包括步骤四，将步骤三中获得的形成细胞-生物材料复合物植入生物体角膜基质板层内，获得新生的组织工程角膜基质组织。

以下通过具体的实验来对本发明的移植材料物制造方法进行说明：

以20窝新西兰大白兔作为实验动物，其中新生兔为5天年龄，母兔为60天年龄，体重约3.5-4.5公斤；将实验动物随机分为实验组和对照组。

接下来进行本发明的步骤一：制备生物支架聚羟基乙酸Polyglicolic Acid(PGA)(参阅图1)。

取直径为14μm的片状非编织聚羟基乙酸(PGA)纤维5mg，剪成直径为5mm的圆盘状，在75％的酒精中浸泡消毒45分钟后，用4℃无菌磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS含青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)反复冲洗3次，室温下自然晾干。然后放入直径为100mm培养皿中，备用。

再进行步骤二：分离培养生物体角膜基质细胞。

采用注射过量戊巴比妥钠的方法处死若干新生兔，在无菌条件下取出其眼球，经PBS清洗后，放入消毒盘内。在手术显微镜下，解剖分离所取眼球的角膜上皮层、角膜基质层和角膜内皮层组织；取出角膜基质层组织放入4℃的PBS中清洗；然后，将角膜基质层组织剪成2mm³大小组织块。将剪好的组织块放入15ml的离心管中，加入200u/ml II型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，MSA)5ml，再移入恒温振荡器内，在37℃、振荡频率110次/分钟的条件下，消化50分钟；收集细胞悬液，以1000r/min速度离心5-8分钟，弃去上清液；用PBS反复冲洗3次，离心，弃去上清液；加入条件培养液10ml。

所使用的培养液为PH7.40，含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，L-谷氨酰胺300μ，维生素C 50μ，青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的Ham′F-12(Gibco，Gland，Island，NY，MSA)培养液。

将角膜基质细胞和培养液混匀，台盼蓝染色计数，取细胞活力＞75％的角膜基质细胞用于实验。将角膜基质细胞移入培养皿后，放入5％CO₂、37℃饱和湿度培养箱中进行细胞培养。隔日换液；原代细胞培养5-8天；备用。

在倒置相差显微镜下观察原代培养细胞：原代细胞8小时后开始贴壁，24小时后，细胞逐渐向两极伸展，呈梭型或不规则三角形。4天后，角膜基质细胞排列呈放射状或指纹状走行。细胞内颗粒少，未见空泡，细胞浆分布均匀，胞膜清晰。培养约7天后，细胞可铺占培养皿底面积70％。

然后进行步骤三：制备角膜基质细胞-生物支架复合物，并预制角膜基质组织。

在无菌条件下，用0.25％胰蛋白酶和0.02％的乙烯二胺四乙酸(Ethylene Diamine-Tetraacidic Acid，EDTA)消化、收集原代培养7天的角膜基质细胞；将得到的角膜基质细胞以1×10⁷/ml的浓度30μl接种PGA，并加入培养液10ml；放入5％CO₂培养箱中进行培养，隔日更换新鲜培养液。如此培养一周，预制角膜基质组织，作为移植材料供角膜基质环(ICR)植入手术用。。

所加入的培养液为PH7.40，含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，L-谷氨酰胺300μ，维生素C 50μ，青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的Ham′F-12培养液。

将角膜基质细胞接种于PGA后，每天倒置相差显微镜观察细胞在生物支架PGA中的生长、增殖、基质分泌和细胞形态变化状况。取培养第6天的细胞-PGA复合物，PBS洗涤，2.5％的戊二醛固定，酒精梯度脱水，醋酸正戊酯置换，CO₂临界点干燥，离子喷射仪喷金，扫描电镜(SEM-520)观察。

在光镜下可见(参阅图2及图3)：接种于PGA后的角膜基质细胞呈圆形，均匀密布于PGA纤维表面及PGA纤维形成的孔隙中。第48小时，粘附在生物支架上的细胞沿PGA纤维纵轴方向向两极伸展，细胞形态由圆形转变为长梭形。第6天，细胞分泌基质并向邻近PGA纤维支架拓展，邻近细胞相互接触直至连接成小片状，形成拉网状结构充填于PGA纤维形成的孔隙中。

扫描电镜观察：复合物体外培养第6天，角膜基质细胞呈梭形或多角形，较扁平，细胞表面有细小绒毛与褶皱。细胞在PGA接触部位伸出伪足，粘附和包绕PGA纤维。分泌基质连接成片覆盖沉积于PGA表面。

本发明还可包括步骤四：角膜基质细胞-PGA复合物构建角膜基质层组织。

将角膜基质细胞-PGA复合物植入实验组母兔角膜基质层内。具体操作如下：在母兔的耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉平稳后，常规消毒，用开睑器开睑，1#缝线悬吊上下直肌，手术显微镜下，自10点至2点，掀起角膜基质瓣，其深度约达角膜全层的1/3～1/2，植入角膜基质细胞-PGA复合物，基质瓣复位，10-0缝线缝合切口。手术后持续观察8周。

同时，对对照组的母兔采用与实验组母兔相同的手术方法，在其角膜基质层内植入PGA，设置角膜基质细胞空白的生物材料对照组。手术后亦连续观察8周。

如图4所示，实验组的母兔在手术后，细胞与生物材料复合物占据角膜中央，呈白色，不透明。第4周，PGA降解加速，中央角膜组织逐渐恢复透明，至第8周，角膜中央基本透明。

手术后第3、6、8周对实验组和对照组的母兔分别取材，用4％甲醛磷酸缓冲液固定组织24小时，石蜡包埋，组织学切片，H-E染色，进行组织学切片观察。

实验组：第3周，聚羟基乙酸部分降解，新生组织逐渐形成(图5)。第6周，聚羟基乙酸降解基本完全，新生角膜基质样组织大部形成，新生组织呈嗜酸性，染色偏红与周围组织存在明确分界线(图6)。第8周，聚羟基乙酸降解吸收完全，新生角膜基质样组织基本形成，胶原与角膜表面平行，排列较整齐，新生组织与周围组织染色相似，分界线不明显。(图7)。

对照组：PGA植入后第8周，PGA充填区域遗留明显组织缺损，正常组织与生物材料植入部位交界处见少量成纤维细胞增生，包绕未彻底降解的PGA，无明显的组织形成，与实验组存在显著差异(图8)。

再进行Western-blot检测I型胶原表达。

取正常兔的角膜组织和实验组的母兔第8周新生组织约3mm³大小，PBS洗涤后，加入裂解液，4℃过夜。将获取的蛋白质样品进行PAGE胶电泳，转膜，加入鼠抗兔I型胶原抗体以及β-actin抗体为内参照，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，加入DAB显色剂显色5分钟。

Western Blot检测结果显示实验组母兔第8周新生组织中基质细胞表达I型胶原如图9所示。图中左边为第8周实验组母兔的角膜基质组织；中间为正常兔的角膜基质组织；右边为体外培养的原代角膜上皮细胞。

接下来进行超微结构观察和胶原纤维直径分布统计学分析。

分离获取实验组母兔第8周的新生角膜基质组织和正常兔的角膜基质组织，置于2.5％戊二醛液中固定24小时，再用1％锇酸液固定1小时；然后，用50％、70％、80％、90％及100％酒精溶液梯度脱水，用1∶1丙酮包埋液渗透，EPON包埋；最后超薄切片、使用透射电镜观察。随机抽取正常兔的角膜胶原纤维300次和实验组母兔的角膜组织胶原纤维363次，测得胶原纤维直径进行Student t统计学检测。

随机抽取正常兔的角膜300次，测得胶原纤维直径平均为(28.5±3.5)nm；随机抽取实验组母兔的新生角膜组织胶原纤维363次，测得胶原纤维直径平均为(29.0±4.7)nm。Student t统计学分析，显示实验组母兔的新生角膜基质组织和正常兔的角膜胶原纤维直径分布无显著差异(P＞0.05)。

最后，应用绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein，GFP)基因转染技术示踪用组织工程技术构建的实验组母兔的角膜基质组织。

在无菌条件下分离新生兔的角膜基质层组织，加入1.5％II型胶原酶5ml，在37℃恒温振荡器内消化40分钟，收集细胞悬液，以1000r/min速度离心5分钟，弃去上清液。再用PBS反复冲洗3次，离心，弃去上清液，加入条件培养液10ml(含10％FBS的F-12培养液)，混匀，台盼蓝染色计数，取细胞活力＞85％的角膜基质细胞用于实验。

将角膜基质细胞接种于培养皿后，进行细胞培养。隔日换液。4日后，弃去培养液，加入含PLNCX2-EGFP病毒液2ml以及终浓度8μg/μL Polybrene，200mg/L G418持续筛选一周。再在Nikon荧光显微镜下观察转染结果。

收集转染PLNCX2-EGFP后的角膜基质细胞，10⁷/ml的浓度50μl接种PGA，加入条件培养液10ml，放入培养箱中进行培养，构建角膜基质细胞-PGA复合物，隔日换液，培养一周。荧光显微镜下观察细胞在生物支架PGA中的生长、增殖、基质分泌和细胞形态变化状况。

将角膜基质细胞-PGA复合物植入实验组母兔角膜基质板层内：在兔的耳缘静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)，麻醉平稳后，手术显微镜下，掀起角膜基质瓣，植入角膜基质细胞-PGA复合物，基质瓣复位。术后第8周取材。冰冻切片，荧光显微镜下观察以及H-E染色观察。

经PT67细胞包装产生的PLNCX2-EGFP具有完整的包膜蛋白。用此病毒可直接感染角膜基质细胞，GFP在角膜基质细胞中获得有效表达，经蓝光(408nm)激发，荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光(508nm)。PLNCX2-EGFP转染的角膜基质细胞与PGA形成的复合物体外培养过程中，在荧光显微镜下也可见GFP稳定表达(图10、11)。荧光显微镜下：实验组第8周组织学切片可检测到含EGFP绿色荧光的组织工程化角膜基质组织(图12)。

Claims

1、一种移植材料的制造方法，包括以下步骤：

步骤一：制备生物支架；

步骤二：分离培养新生兔角膜基质细胞；

步骤三：制备角膜基质细胞-生物支架复合物、并预制角膜基质组织。

2、权利要求1所述的移植材料的制造方法，其特征在于：步骤一包括：取片状直径为14μm的非编织聚羟基乙酸纤维3-7mg，剪成直径为5mm的圆盘状，在75％的酒精浸泡消毒30-45分钟后，再用4℃无菌磷酸缓冲液反复冲洗3次，室温下自然晾干。

3、如权利要求1所述的移植材料的制造方法，其特征在于：步骤二包括：在无菌条件下取得并分离角膜上皮层、角膜基质层和角膜内皮层组织；取出角膜基质层组织放入4℃的PBS中清洗后，剪成1-2mm³大小的组织块。

4、如权利要求3所述的移植材料的制造方法，其特征在于：步骤二还包括：将组织块置入15ml离心管中，加入150-250u/ml II型胶原酶4-7ml，移入恒温振荡器内，在37℃、振荡频率80-120次/分钟的条件下振荡40-70分钟；收集角膜基质细胞悬液，以1000r/min的速度离心5-8分钟，弃去上清液，经PBS反复冲洗、离心、弃去上清液，再加入培养液10ml，混匀，台盼蓝染色计数，取细胞活力＞75％的角膜基质细胞备用。

5、如权利要求4所述的移植材料的制造方法，其特征在于：步骤二进一步包括：将角膜基质细胞和培养液的混合体放入5％CO₂、37℃饱和湿度培养箱中进行细胞培养。

6、如权利要求4或5所述的移植材料的制造方法，其特征在于：步骤二所使用的培养液为PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺300μg/ml、维生素C 50μg/ml、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。

7、如权利要求1所述的移植材料的制造方法，其特征在于：步骤三包括：在无菌条件下，用0.25％的胰蛋白酶和0.02％的乙烯二胺四乙酸消化收集经步骤二培养了5-8天的角膜基质细胞，以1～4×10⁷/ml的浓度30～50μl接种PGA，并加入相应的培养液10ml，再放入5％CO₂培养箱中进行培养，隔日更换新鲜培养液。

8、如权利要求7所述的移植材料的制造方法，其特征在于：步骤三中所使用的培养液为PH7.35-7.45，含10％胎牛血清、L-谷氨酰胺300μg/ml、维生素C 50μg/ml、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml的Ham’F-12培养液10ml。