CN106693055A - 一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物组织工程和医用材料领域，涉及一种去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架及其制备方法。本发明采用天然的小脑脱细胞支架作为小脑再生的支架材料，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。该再生生物支架其生物力学性能与正常小脑相似，能为神经通路的重建提供生理相似的通道从而正确引导其生长；所述支架表面具备细胞膜受体识别位点、部分活性因子，有利于细胞的黏附生长并发挥生理功能；工程化的种子细胞既能分泌多种神经营养/生长因子，又能促进新的细胞外基质形成，提供再生引导信号；具有良好的生物相容性。该再生生物支架可用于制备治疗神经损伤后神经修复制剂中。

Description

一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明属生物组织工程和医用材料领域，涉及小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途，尤其涉及一种去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架及其制备方法和在制备治疗神经损伤后神经修复制剂中的用途。

背景技术

据报道，人体组织器官因为病变、损伤和衰老导致的器官功能失用导致临床上巨大的组织器官替代治疗缺口。临床实践中，由于可替代的器官来源有限，如何在体外采用人工的方法产生有功能的人体器官成为全世界关注的焦点。生物人工器官的研究已成为再生医学研究的热点，有着巨大的临床应用前景。据研究显示，生物人工器官的生成需要三个最基本的条件，其包括：具有特异性的功能细胞，理想的含有细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的生物支架以及高度模拟体内状态的生物活性环境。所述ECM已被证明可以指导胚胎干细胞的分化，也是在器官发生中可以影响细胞行为的因素；有研究显示，通过生物工程的方法可以很好的对组织器官进行去细胞化，如果ECM蛋白结构能够很好的模拟目标组织ECM在体内的情况则能更好地使前体细胞向目标组织分化。最近有学者通过生物工程的方法将器官特异性的细胞选择性地灌注到靶器官的ECM支架中，成功在体外生成有功能的生物人工心脏、肺脏和肾脏，有关论文均发表在《nature medicine》杂志上，这是国际上第一次通过生物工程的方法在不存在自体细胞的组织特异性全器官去细胞基质中生成有功能的生物人工器官。到目前为止，国内外尚未见有中枢神经系统(central nervous system，CNS)组织器官体外再生的报道，也未见有理想的CNS生物支架的报道。

业内已知，小脑是脑组织中相对独立和特殊的区域，在运动控制中发挥着重要的作用，在认知功能领域，如注意、语言、调节恐惧及愉悦的应答中发挥着一定的作用；小脑位于大脑半球后方，覆盖在脑桥及延髓之上，横跨在中脑和延髓之间，解剖位置相对独立，易于显微解剖分离，在小脑蚓部和半球表面存在有横行的沟和裂，将小脑分成许多回、叶和小叶，这是其特异性的形态表现；相较于大脑皮层的6层结构，小脑皮层分 为三层，包括：分子层，浦肯野细胞层和颗粒细胞层，而且对比于大脑所有的多种神经元，小脑主要由两种神经元包括颗粒神经元、浦肯野神经元发挥作用，且最为重要的是，小脑半球的部分切除并不会造成机体严重的功能障碍；这些特殊性使得小脑成为研究CNS组织器官体外再生的突破点。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法，进一步用于神经损伤后神经修复治疗干预中。

发明内容

本发明的目的是提供一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途，尤其涉及一种去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架及其制备方法和在制备治疗神经损伤后神经修复制剂中的用途。

本发明提供了一种对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的黏附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有显著作用和影响的新型小脑再生生物支架。本发明在现有技术的中枢神经系统器官脱细胞策略的基础上进行优化改进，制备出脱细胞彻底且ECM三维网状结构、功能更完整的小鼠小脑脱细胞支架；通对支架进行组织学观察、成分分析、免疫原性检测以及体内外相容性等研究评价其生物安全性，并进一步实验验证制得的脱细胞支架对人NSCs生物学特性的影响以及体内外生物相容性，为小脑再生的相关研究提供实验依据，为再生医学研究提供了一种方法和工具。

更具体的，本发明的一种小脑脱细胞再生生物支架，其由脱去细胞的小脑组织的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。

本发明制得的小脑脱细胞再生生物支架，采用天然的小脑脱细胞支架作为小脑再生的支架材料，具有最接近小脑组织的三维结构，其生物力学性能与正常小脑相似，能为神经通路的重建提供生理相似的通道从而正确引导其生长；所述支架表面具备细胞膜受体识别位点、部分活性因子，有利于细胞的黏附生长并发挥生理功能；工程化的种子细胞(如重编程的类小脑颗粒样细胞等)既能分泌多种神经营养/生长因子，又能促进新的细胞外基质形成，提供再生引导信号；具有良好的生物相容性。

本发明通过下述方法制备索所述的小脑脱细胞再生生物支架：其包括下述步骤：

1，小脑再生支架的制备及鉴定，其中包括：

1)小脑取材

将获得的健康成年C57BL/6小鼠小脑组织，分离并去除所有的非中枢神经组织；

2)小鼠小脑脱细胞，

按下述顺序搅拌水浴过程脱细胞：1.0％SDS，去离子水，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA，去离子水，1.0％Triton X-100，1.0M蔗糖，去离子水；脱去细胞的小脑组织浸没在青霉素G，链霉素以及两性霉素B的PBS中保存72h，制得小脑脱细胞再生生物支架，4℃PBS中保存备用；

3)支架的大体形态观察

以正常小鼠小脑为对照，观察小鼠小脑脱细胞支架的外形、颜色等变化情况；

4)小脑支架的组织学观察与评价

以正常小脑组织为对照，光镜下观察小脑脱细胞支架基质结构完整性、脱细胞程度及蛋白残留量；

5)再生生物支架残留DNA定量和片段长度分析

对残余DNA的含量和碱基对长度进行定量测定，其中，采用美国Invitrogen公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒检测提取的DNA含量，按PicoGreen dsDNA检测试剂盒说明书操作，1％琼脂糖凝胶电泳对残余DNA的碱基对长度进行测定；采用以下标准评价脱细胞的效果：(1)在DAPI和H&E切片上没有可见的细胞核；(2)DNA片段长度不超过200bp；(3)双链DNA的含量小于50ng/mg干燥ECM，为符合再生生物支架要求；

6)BDNF和NGF含量测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的含量进行测定；

2，体外生物相容性试验，包括：

1)小脑再生支架ECM对NSCs的细胞毒性作用试验；

2)小脑再生支架ECM对NSCs的增殖作用试验；

3)小脑再生支架ECM对NSCs的迁移作用试验：

4)小脑再生支架ECM对NSCs的分化作用试验；

3，小脑脱细胞支架的扫描电镜观察，采用扫描电镜观察支架的结构；

4，体内生物相容性试验，包括：

1)动物分组：

SD大鼠随机分为皮下组及颅内组，各组平均分为三个亚组：假手术组，明胶海绵组及小脑再生支架组；

2)标本组织学观察

移植后标本经多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片，分别进行HE染色，光镜观察；免疫组化染色，检测CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞浸润数目用于评价支架的免疫原性；

所获得的实验数据均经SPSS 16.0统计分析软件处理；实验结果均以x±s表示。各组均数运用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计处理，p<0.05为差异有显著性，p<0.01为差异有非常显著性。

结果显示：本发明的经过脱细胞处理的小脑经组织学证实细胞基本完全脱落，支架内未见细胞残留物，支架结构保存完好，电镜下三维网状结构完整存在，小鼠小脑脱细胞支架在HE染色及DAPI染色下未见细胞核残留，琼脂糖凝胶电泳结果显示，支架内未见长度超过200bp的DNA，DNA定量分析结果显示，支架内双链DNA的含量小于50ng/mg干重ECM，上述量化指标检测表明，本发明的脱细胞方法能完全脱去小脑内细胞；制得的ECM支架中保留了较多的胶原蛋白和葡聚糖，其中葡聚糖能够促进神经细胞的黏附和增殖，髓磷脂对神经细胞的再生及突触的形成有抑制作用，脱细胞的过程使得神经营养因子的含量明显减少，但仍保留了一定量的营养因子。

本发明采用天然的小鼠小脑脱细胞支架作为小脑再生的支架材料具有独特的优势：具有最接近小脑组织的三维结构，生物力学性能与正常小脑相似；能为神经通路的重建提供生理相似的通道从而正确引导其生长；支架表面具备细胞膜受体识别位点、部分活性因子，有利于细胞的黏附生长并发挥生理功能；工程化的种子细胞(如重编程的类小脑颗粒样细胞等)既能分泌多种神经营养/生长因子，又能促进新的细胞外基质形成，提供再生引导信号；具有良好的生物相容性。

本发明的去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架进一步用于在制备治疗神经损伤后神经修复制剂中的用途。

附图说明：

图1，再生生物支架的制备流程图。

图2：A：小鼠小脑；B：小脑再生支架。

图3：A：正常小脑H&E染色；B：小脑支架H&E染色；C：正常小脑DAPI染色；D：小脑支架DAPI染色；E：DNA片段长度不超过200bp，红色箭头指示200bp；F：双链DNA 的含量小于50ng/mg干燥ECM，红色指示50ng/mg。

图4：A：正常小脑胶原染色；B：小脑支架胶原染色；C：正常小脑GAGs染色；D：小脑支架GAGs染色；E：正常小脑髓磷脂染色；F：小脑支架髓磷脂染色。

图5：A：BDNF的含量；B：NGF的含量。

图6(A)小脑支架ECM对NSCs的细胞毒性，未显示差异(p>0.05)；(B)不同浓度小脑支架和膀胱ECM对细胞增殖存在差异(p<0.05)；(C)不同浓度小脑支架和膀胱ECM对细胞趋化存在差异(p<0.05)。

图7：NSCs分化的免疫荧光βIII-tubulin，A：阴性对照；B：小脑支架ECM；C：膀胱支架ECM和GFAP D：阴性对照；E：小脑支架ECM；F：膀胱支架ECM，G：NSCs在含小脑支架ECM培养基中向神经元分化比率较阴性对照及膀胱ECM高(p<0.05)。

图8：空白(A)及再种植后(B)小脑再生支架的扫描电镜图像。

具体实施方式

实施例1 制备小脑再生支架

1，小脑再生支架的制备及鉴定

1)小脑取材

将健康成年C57BL/6小鼠(体重20～25g，雌雄不限)采用10％水合氯醛腹腔麻醉后，1.0％SDS(十二烷基磺酸钠,Sodium Dodecyl Sulfonate)心脏灌注5min(20ml/min)。俯卧位固定，常规备皮，沿中线切开头皮，暴露颅骨。切开颅骨，完整取出小脑，注意动作轻柔，，为保证无菌，后续操作都在无菌操作台中进行，经PBS清洗干净后，PBS中仔细分离并去除所有的非小脑组织。

2)小鼠小脑脱细胞流程

后续为室温下一系列的搅拌水浴过程，顺序进行下列过程：1.0％SDS(100rpm，60min)，去离子水(60rpm，10min)，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA(60rpm，30min)，去离子水(60rpm，10min)，1.0％Triton X-100(100rpm，60min)，1.0M蔗糖(60rpm，15min)，去离子水(60rpm，30min)。脱去细胞的小脑组织浸没在含10,000U/ml的青霉素G，10mg/ml的链霉素以及25ug/ml的两性霉素B的PBS中保存72h。将该生物支架4℃PBS中保存备用。

3)支架的大体形态观察

以正常小鼠小脑为对照，观察小鼠小脑脱细胞支架的外形、颜色等变化情况。

4)小脑支架的组织学观察与评价

将小脑脱细胞支架经4％多聚甲醛固定液固定，脱水，石蜡包埋，6μm厚连续切片，分别行HE染色，用Masson’s三色法对胶原进行染色，Alcian blue对葡糖氨基葡聚糖(GAGs)进行染色，luxol fast blue法对髓磷脂进行染色。染色步骤按试剂盒说明书操作，以正常小脑组织为对照，光镜下观察小脑脱细胞支架基质结构完整性、脱细胞程度及蛋白残留量。

HE染色方法简述如下：石蜡切片脱蜡至水，苏木精染色液染色5～10min，自来水洗3～5min，1％盐酸乙醇溶液分化数秒，自来水洗3～5min，伊红复染30s～2min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。

Masson’s三色法简述如下：切片常规脱蜡至水，用配制好的试剂(A)染色5～10min，用酸性乙醇分化液分化、水洗，用氨水溶液返蓝、水洗，蒸馏水水洗1min，丽春红品红染色液染色5～10min，用乙酸溶液洗1min，磷钼酸溶液洗1～2min，用乙酸溶液洗1min，直接放入苯胺蓝染色液中染色1～2min，乙酸溶液洗1min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明5min，中性树脂封片，光镜下观察。

Alcian blue染色方法简述如下：石蜡切片脱蜡至水，阿新蓝(PH＝2.5)染30min，自来水洗5～10min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明5min，中性树脂封片，光镜下观察。

luxol fast blue染色方法简述如下：95％乙醇溶液中浸泡3min，置于0.1％Luxol固蓝溶液中，在57℃温度下，孵育过夜(16-24h)，95％乙醇溶液中浸洗30秒。去离子水中浸洗3min。切片于0.05％碳酸锂溶液中快速浸洗15s，去离子水冲洗。0.1％甲苯粉紫溶液，37℃浸染10min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明5min。中性树胶封固。

冰冻切片观察：标本获取方法见第二部分。30％的蔗糖溶液脱水，整形OTC包埋，做冰冻切片用4％多聚甲醛室温固定，PBS清洗3次。用0.25％Triton X-100/10％山羊血清破膜封闭2h，用PBS清洗3次，加入核染色剂DAPI，室温避光孵育5min，用防荧光淬灭的封片剂封固在载玻片上，压片。荧光显微镜下观察。

5)残留DNA定量和片段长度分析

DNA提取

采用美国Roche公司的DNA提取试剂盒提取支架和正常小鼠小脑组织内的DNA，按DNA提取试剂盒说明书操作，步骤如下：

(1)分别称取冻干的支架和正常小鼠小脑，约10mg，记录干重；

(2)将样品剪碎后加入到含1ml裂解液的离心管，匀浆；

(3)加入0.7μL蛋白水解酶K，65℃，孵育2h；

(4)加入30μL 10mg/ml RNA酶，充分混匀，37℃，孵育15min；

(5)加入0.4ml蛋白沉淀液，涡旋振荡20s，充分混匀，冰水浴5min，离心(26900g，20min，15℃)；

(6)将上清液转移至含有1ml异丙醇的离心管中，轻柔颠倒离心管，可见DNA析出，离心(1370×g，10min，室温)；

(7)去上清液，加入1ml 70％乙醇，轻柔颠倒离心管，漂洗DNA，离心(137×g，5min，室温)；

(8)去上清液，待DNA自然风干，加入1ml TE溶液(1×，pH8.0)，轻拍离心管，使DNA重悬，4℃孵育过夜，使DNA再水化，4℃保存备用。

DNA定量

采用美国Invitrogen公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒检测提取的DNA含量，按PicoGreen dsDNA检测试剂盒说明书操作，步骤如下：

(1)取100μL Quant-iT PicoGreen原液加入到19.9ml TE溶液中稀释200倍，制得Quant-iT PicoGreen工作液，避光保存；

(2)将Lambda DNA标准品(100μg/ml)用TE溶液按0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/ml梯度浓度稀释，取各浓度Lambda DNA标准品溶液各100μL至96孔板，分别加入100μL Quant-iT PicoGreen工作液，避光，混匀，室温孵育2～5min后，用酶标仪检测荧光信号值(激发波长480μm，发射波长520μm)，结果采用线性回归分析，建立荧光信号值和DNA浓度的回归方程，绘制标准曲线。

(3)将制备的样品DNA溶液重悬混匀后，分别取100μL至96孔板，各加入100μL Quant-iT PicoGreen工作液，避光，混匀，室温孵育2～5min后，用酶标仪检测荧光信号值(激发波长480μm，发射波长520μm)，根据回归方程计算DNA浓度，当样品DNA浓度超过1000ng/ml时，需按比例稀释，使样品浓度在标准曲线检测范围内，重新测量。根据所测样品DNA浓度计算标本DNA含量，以ng/mg干重表示。

DNA片段尺寸分析

采用琼脂糖凝胶电泳分析A、B组支架和正常大鼠脊髓内DNA片段尺寸，步骤如下：

(1)将制胶槽两端用粘胶带封好，在一端安插上样品梳，确保梳齿下缘与胶槽底面保持1mm左右间隙，且制胶槽处于水平位置。

(2)将制备的1.5％琼脂糖凝胶小心倒入制胶槽内，凝胶缓慢展开，去除气泡，形成均匀胶层，厚约3～5mm。室温下静置，待凝胶冷却固定后，小心取出样品梳，撤除两端固定胶带，将凝胶置于电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液至超过凝胶表面约1mm。

(3)DNA样品与6×加样缓冲液按5:1混匀后加入到样品孔内，DNA marker加到两侧的样品孔内。

(4)接通电源，电压设为60V，观察指示剂位置，判断电泳终止时间，约60min。

(5)凝胶呈像仪上观察电泳结果并拍照。

6)BDNF和NGF含量测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的含量进行测定。样本在含1mM PMSF及1mM EGTA的PBS溶液中匀浆，取上清。

(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

(2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(3)待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

(4)随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

(7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

(8)使用胎牛血清白蛋白作为标准，通过Lowry’s method进行定量。

2，体外生物相容性试验

NSCs培养在层粘连蛋白(10mg/L)包被的培养皿上，培养液为添加重组小鼠EGF(10ng/ml)及重组人FGF-2(10ng/ml)的神经细胞培养液，隔天换液。膀胱ECM作为参考材料来评估小脑再生支架是否有组织特异性的优势。样本冻干后剪碎至<1.0mm大小，在含1.0mg/ml胃蛋白酶的0.01N HCl中进行溶解。使用二喹啉甲酸法测定的胎牛血清白蛋白作为标准曲线，对多个稀释的溶解ECM进行蛋白浓度测定。使用0.1N的NaOH调节溶液Ph至7.4。使用10×PBS调节到液体张力平衡，1×PBS调整至需要浓度。不同浓度的 ECM(10，50，100ug/ml)用来评价对NSCs的增殖和趋化效果，不含ECM的中性胃蛋白酶PBS溶液用来作为阴性对照，所有体外实验重复三次。

1)小脑再生支架ECM对NSCs的细胞毒性作用试验

12孔板每孔1x10⁴NSCs铺在PLL包被的玻璃盖玻片上。包被后2h，100μg/ml ECM及PBS加入每孔，再培养24h。使用Live/Dead Viability Kit(Invitrogen)对细胞相容性进行判断。NSCs的生存率使用ImageJ对荧光图像进行读取来定量判定。随机选取10个视野观察、拍照并计数，不同时间重复实验3次。

2)小脑再生支架ECM对NSCs的增殖作用试验

在96孔板中加入100μl的各组细胞悬液。将培养板在培养箱培养48小时(37℃，5％CO₂)。向每孔加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育2小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

3)小脑再生支架ECM对NSCs的迁移作用试验

采用transwell小室迁徙实验对细胞迁徙功能进行测试(孔径8um，直径6.5mm)。使用30mg/ml层粘连蛋白包被滤器30min后待其完全干燥。细胞分离后重悬在未行添加的培养液中，再以每孔1x10⁴的密度再接种到transwell平板的上室。分别添加有多种浓度ECM的培养基添加到下层小室中，平板放入培养箱中培养24h。擦净小室膜上侧未迁移的细胞，甲醛固定，DAPI染色，倒置显微镜下随机选取10个视野观察细胞穿膜情况并拍照，ImageJ分析软件计数，不同时间重复实验3次。

4)小脑再生支架ECM对NSCs的分化作用试验

1x10⁴NSCs每孔接种于PLL包被的48孔板中，每孔培养基预冲洗两次，培养基为含100μg/ml小脑ECM或100μg/ml膀胱ECM的神经细胞培养液，以及不含ECM的中性胃蛋白酶PBS溶液用来作为阴性对照，培养48h。细胞用4％甲醛固定，PBS冲洗三次，5％山羊血清及0.2％Triton X-100室温下破膜封闭2h。PBS冲洗三次，4℃一抗孵育过夜，一抗为βtubulinⅢ和GFAP。PBS冲洗后，荧光二抗37℃孵育2h，PBS(1μg/ml)冲洗后，DAPI复染。荧光显微镜下随机选取10个视野观察细胞并拍照，ImageJ分析软件计数，不同时间重复实验3次。

3，小脑脱细胞支架的扫描电镜观察

采用扫描电镜观察支架的结构。将4×10⁶NSCs悬于500μl培养基中，无菌条件下通过微量注射器注射到支架中(深2.5mm，5min)，再种植后的支架培养基中培养14d。空 白及再种植的支架切片，并用扫描电镜(SEM)进行观察。样本4℃电镜液(复旦大学医学院电镜室提供)中固定24h，超纯水漂洗3次，每次5min，冷冻干燥后，观察面朝上粘贴于样品台，用真空喷涂仪在材料表面喷金，采用日本Hitachi公司SU8000扫描电子显微镜观察拍照

4，体内生物相容性试验

1)动物分组：

SD大鼠共24只，雌雄不限，体重约200-250g。随机分为皮下组及颅内组各12只SD大鼠，各组平均分为三个亚组：假手术组，明胶海绵组及小脑再生支架组。

皮下组：将SD大鼠采用10％水合氯醛腹腔麻醉后，俯卧位固定，常规备皮、消毒、铺巾，在背部棘突一侧旁约1cm处作纵行切口，长约1cm，切开皮肤、皮下组织及深筋膜，用血管钳在深筋膜下钝性分离，形成一个囊袋样空腔，明胶海绵组及小脑再生支架组分别移植入明胶海绵和小脑脱细胞支架，缝合伤口。假手术组在深筋膜下钝性分离，形成囊袋样空腔后，不作移植，直接缝合伤口。

颅内组：将SD大鼠采用10％水合氯醛腹腔麻醉后，取俯卧位固定于立体定位仪平台上，常规备皮、消毒、铺巾，沿中线切开头皮，暴露颅骨。在bregma及lamda之间，矢状窦旁开5mm钻孔。切除部分额叶，明胶海绵组及小脑再生支架组分别将明胶海绵和小脑脱细胞支架移植物填入空腔，封闭切口。假手术组在切除部分额叶后不作移植，封闭切口。

2)标本组织学观察

移植4周后标本经4％多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、6μm厚连续切片。

HE染色

石蜡切片脱蜡至水，苏木精染色液染色5～10min，自来水洗3～5min，1％盐酸乙醇溶液分化数秒，自来水洗3～5min，伊红复染30s～2min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。

免疫组化染色

检测CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞浸润数目用于评价支架的免疫原性。

(1)石蜡切片置于58～60℃烤箱60min。

(2)石腊切片常规脱蜡至水。

(3)将30％过氧化氢溶液稀释10倍后，将切片用3％的过氧化氢溶液室温孵育10min，灭 活内源性酶，双蒸水洗3遍。

(4)抗原热修复：切片转至0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中，微波加热至沸腾后断电，间隔10min，反复2次，冷却后0.01M PBS漂洗2min×2遍。

(5)滴加5％血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体，不洗。

(6)滴加适量一抗，覆盖标本即可，湿盒中4℃孵育过夜，0.01M PBS漂洗2min×3遍。

(7)滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育20min，0.01M PBS漂洗2min×3遍。

(8)滴加SABC，37℃孵育20min，0.01M PBS漂洗5min×4遍。

(9)使用DAB显色试剂盒显色，显微镜下控制反应时间(5～15min)，蒸馏水充分冲洗，终止显色。

(10)苏木素轻度复染，蒸馏水充分冲洗，1％盐酸-酒精分化。

(11)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

(12)光镜下观察。

实验数据均经SPSS 16.0统计分析软件处理。实验结果均以x±s表示。各组均数运用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计处理，p<0.05为差异有显著性，p<0.01为差异有非常显著性。

结果显示：

1.支架的大体形态观察

肉眼观，在脱细胞处理过程中可见大量白色絮状物自小脑内析出，经脱细胞处理后，小鼠脱细胞小脑支架仍维持与正常小脑形态相似的形状，呈乳白色，略有皱缩，长度约8mm；

2.支架的脱细胞程度鉴定

HE染色结果显示，正常小鼠小脑组织结构较致密，皮层有明显的典型三层结构，分子层、浦肯野细胞层、颗粒细胞层，而经脱细胞方法处理后，脱细胞适度，可见支架极少量细胞碎片残留，ECM网状结构完整，荧光显微镜下正常小鼠小脑组织冰冻切片可见DAPI染核的正常分布，而经过脱细胞处理后，仅可见及少量细胞核，可见小脑ECM支架轮廓完整；

正常小鼠小脑各个长度的DNA片段皆可查见，有大量长度超过1000bp以上的DNA片段，经脱细胞处理后，几乎检测不到DNA片段残留；

采用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒进行小鼠小脑脱细胞支架内残留DNA的 定量分析，残留DNA定量分析结果如正常小鼠小脑内的DNA含量为1010.2±352.3ng/mg干重，经脱细胞处理后，小鼠小脑脱细胞支架内残留的DNA含量为32.3±11.5ng/mg干重，明显下降，具有统计学意义(p<0.01)，琼脂糖凝胶电泳结果(图3F)。

3.支架的组织学分析

Masson’s三色法显示，正常小鼠小脑胶原组织染色呈红色阳性反应，结构完整，形态规则，脱细胞方法处理后，脱细胞彻底，仍可见多量胶原存留，轮廓及网状结构完整；

Alcian blue染色显示，正常小鼠小脑葡聚糖染色呈蓝棕色阳性反应，结构完整，形态规则，脱细胞方法处理后，脱细胞彻底，仍可见较多量葡聚糖存留，轮廓及网状结构完整；

luxol fast blue染色显示，正常小鼠小脑髓磷脂染色呈蓝色阳性反应，结构完整，形态规则，脱细胞方法处理后，脱细胞彻底，仅可见少量髓磷脂存留，呈弱阳性，轮廓及网状结构尚完整；

4.BDNF和NGF含量测定

小脑脱细胞支架的BDNF含量(21.4+5.2pg/mg)较之正常小脑BDNF的含量(60.2+12.1pg/mg)明显减低，有统计学差异(p<0.05)；小脑脱细胞支架的NGF含量(33.6+8.3pg/mg)较之正常小脑NGF的含量(104.3+21.5pg/mg)明显减低，有统计学差异(p<0.05；

5.体外生物相容性试验

小脑再生支架ECM(100μg/ml)对NSCs未显示明显的细胞毒性作用，存活率与对照组及膀胱ECM组进行比较，未显示统计学差异(p>0.05)；

不同浓度小脑再生支架ECM(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)对NSCs的增殖作用存在差异，较低浓度的小脑支架ECM(10μg/ml)对NSCs的影响较小，而高浓度的影响较大(100μg/ml)，差异存统计学意义(p<0.05)；膀胱ECM没有明显的作用趋势，小脑支架及膀胱ECM在较低浓度上(10μg/ml)对NSCs的增殖有明显差异(p<0.05)，而在较高浓度则没有明显差异(p>0.05)(图3-5B)；

不同浓度小脑再生支架ECM(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)对NSCs的迁移作用存在差异，较低浓度(10μg/ml)小脑支架ECM对NSCs的迁移有明显的促进作用，增加约50％，而在较高浓度时，促进作用明显减少，差异存统计学意义(p<0.05)，对应浓 度的膀胱ECM则显示为减少迁移的作用(p<0.05)，最多达约50％；

小脑再生支架ECM(100μg/ml)对NSCs有诱导分化作用。小脑ECM支架诱导NSCs较高的Tuj1阳性神经元分化效率(5％)，阴性对照只有约0.5％，膀胱ECM较阴性对照高(1.5％)，但是仍远低于小脑ECM(p<0.05)，阴性对照细胞的形态主要为未分化状，在小脑ECM组，许多细胞没有Tuj阳性的表达，但是细胞形态上有长的细胞突起，可能是向胶质细胞分化的细胞，GFAP染色证实阳性；

6.支架的扫描电镜观察

扫描电镜结果显示支架脱细胞适度，标本的细胞成分被完全除去，细胞外基质存在，ECM保存完好，相互交织成网状三维结构，内部具有纵向平行或不规则排列的孔道系统，各通道之间互相沟通形成三维立体网状结构，NSCs种植入支架14天后，在支架内可见细胞的攀附，有长的轴突长出，部分可见轴突在支架孔道中如蔓藤穿行；

7.体内生物相容性试验

术后各组动物的进食及活动正常，伤口周围未见红肿和感染，也没有出现渗液、脓肿等炎症反应，伤口为一期愈合；

组织学观察

皮下组：

植入术后4周，小脑脱细胞支架周边中性粒细胞基本消失，有少量淋巴细胞浸润，无毛细血管扩张，偶见异物巨细胞，较阴性对照及明胶海绵对照组无明显区别；

术后4周小脑脱细胞支架植入组CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞群的浸润无明显增加，较阴性对照及明胶海绵对照组无明显区别；

颅内组：

植入术后4周，小脑脱细胞支架周边无明显中性粒细胞机淋巴细胞浸润。较阴性对照及明胶海绵对照组无明显区别。部分标本可见明胶海绵及小脑支架残留，并与受体脑组织结合；

术后4周小脑脱细胞支架组未见明显CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞表达，较阴性对照及明胶海绵对照组无明显区别。

Claims (5)

1.一种小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，其由脱去细胞的小脑组织的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。

2.按权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，所述的小脑组织选自健康成年C57BL/6小鼠。

3.按权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，所述的再生生物支架是去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架。

4.制备权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架的方法：其特征在于，其包括下述步骤：

1，小脑再生支架的制备及鉴定，其中包括：

1)小脑取材

将获得的健康成年C57BL/6小鼠小脑组织，分离并去除所有的非中枢神经组织；

2)小鼠小脑脱细胞，

按下述顺序搅拌水浴过程脱细胞：1.0％SDS，去离子水，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA，去离子水，1.0％Triton X-100，1.0M蔗糖，去离子水；脱去细胞的小脑组织浸没在青霉素G，链霉素以及两性霉素B的PBS中保存72h，制得小脑脱细胞再生生物支架，4℃PBS中保存备用；

3)支架的大体形态观察

以正常小鼠小脑为对照，观察小鼠小脑脱细胞支架的外形、颜色等变化情况；

4)小脑支架的组织学观察与评价

以正常小脑组织为对照，光镜下观察小脑脱细胞支架基质结构完整性、脱细胞程度及蛋白残留量；

5)再生生物支架残留DNA定量和片段长度分析

对残余DNA的含量和碱基对长度进行定量测定，其中，采用美国Invitrogen公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒检测提取的DNA含量，按PicoGreen dsDNA检测试剂盒说明书操作，1％琼脂糖凝胶电泳对残余DNA的碱基对长度进行测定；采用以下标准评价脱细胞的效果：(1)在DAPI和H&E切片上没有可见的细胞核；(2)DNA片段长度不超过200bp；(3)双链DNA的含量小于50ng/mg干燥ECM，为符合再生生物支架要求；

6)BDNF和NGF含量测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的含量进行测定；

2，体外生物相容性试验，包括：

1)小脑再生支架ECM对NSCs的细胞毒性作用试验；

2)小脑再生支架ECM对NSCs的增殖作用试验；

3)小脑再生支架ECM对NSCs的迁移作用试验：

4)小脑再生支架ECM对NSCs的分化作用试验；

3，小脑脱细胞支架的扫描电镜观察，采用扫描电镜观察支架的结构；

4，体内生物相容性试验，包括：

1)动物分组：

SD大鼠随机分为皮下组及颅内组，各组平均分为三个亚组：假手术组，明胶海绵组及小脑再生支架组；

2)标本组织学观察

移植后标本经多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片，分别进行HE染色，光镜观察；免疫组化染色，检测CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞浸润数目用于评价支架的免疫原性。

5.权利要求1,2或3所述的小脑脱细胞再生生物支架在用于制备治疗神经损伤后神经修复制剂中的用途。