CN110694113A - 一种脑脱细胞支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脑脱细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用去污剂浸泡漂洗法获得脑脱细胞支架作为细胞载体；(2)对步骤(1)脑脱细胞支架的预血管化，得到预血管化的脑脱细胞支架；(3)将PC12细胞移植到步骤(2)所制备的预血管化的支架中，验证预血管化的脑脱细胞支架中血管网络的形成，在组织工程中对种子细胞移植的重要性。本发明为脑脱细胞支架作为细胞载体用于中枢神经系统损伤的修复提供了实验依据，同时初步构建的脑脱细胞支架预血管化的方法为脑脱细胞支架预血管化后携带种子细胞移植在创伤性脑损伤后组织、神经再生修复提供了新的治疗策略。

Description

一种脑脱细胞支架的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种脑脱细胞支架的制备方法。
背景技术
创伤性颅脑损伤(tramatic brain injury，TBI)作为临床上最常见的中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病，致死率和致残率极高，总体预后差，给社会和家庭造成了沉重的负担。经研究发现TBI后继发性神经损伤主要是以神经细胞凋亡、丢失为主，且神经元不具备再生能力，损伤后自身无法获得再生]，因此，细胞替代治疗对于TBI后的神经再生修复具有重要的意义，这也一直是国内外TBI治疗的研究热点。然而由于移植微环境的限制和血脑屏障的存在，传统的通过输注的方式将种子细胞移植到脑损伤区的效率并不理想。同时，TBI后脑损伤局部可形成缺损空洞或软化灶，并以胶质疤痕修复为主，进一步阻碍了神经元的再生修复，因此如何使移植的种子细胞更为有效进入脑损伤区、并且存活发挥功能是当前脑损伤后神经再生修复研究所面临的重大难题。目前较多的研究发现TBI后利用壳聚糖、多肽水凝胶、丝素蛋白等生物材料构建可携带干细胞的复合支架可明显改善大鼠的神经功能恢复。构建与脑损伤区形态匹配的细胞载体支架，可有效输送种子细胞，为种子细胞的生长提供适宜的空间，并减少胶质增生。然而无论哪一种人工合成的用于神经修复的生物材料都不能代表真正的脑组织，它无法完全“拷贝”出中枢神经系统微环境，不能完全提供正常生理状态下神经组织对各种神经细胞的支持作用。而当前以“全器官脱细胞及再细胞化方案”为基础的人工生物器官作为组织工程研究的一部分，已经成为再生医学研究的热点，有着巨大的临床应用前景。相对于传统的人工生物材料，来源于脱细胞基质的支架是一种良好的天然的组织工程材料：它利用不同的方法除去组织或器官内的细胞成分和可溶性蛋白，仅保留组织结构中的不溶性基质成分，主要为细胞外基质(Extrancecellμlar matrixc，ECM)，其无免疫源性或免疫源性极低。同时，EMC具有“生理状态下呈三维空间结构，可为携带种子细胞、或为新组织的生成提供网状结构性支架；其包含有胶原、粘多糖、生长因子等可支持种子细胞粘附，存活和增殖，在组织修复和重构中起着重要的促进作用。”目前已有研究将器官特异性的种子细胞选择性灌注到靶器官的ECM支架中，在体外成功的合成有功能的生物人工心脏、肝脏、肺脏、小肠等器官。
近期有文献报道，单纯移植脑脱细胞后细胞外基质可以明显改善颅脑外伤后神经功能的恢复；移植携带有bFGF的脑脱细胞支架可以明显增强帕金森大鼠的神经保护作用。同时，小脑组织经漂洗法获得的脱细胞支架可种植神经干细胞，并诱导神经干细胞向星形胶质细胞、神经元等分化。但由于CNS特殊、复杂的解剖结构及生理功能，目前缺乏理想、可适于临床运用的大脑脱细胞支架，有关脑脱细胞支架的研究仍处于早期尝试阶段，尚无公认的脱细胞方法，因此，寻找一个制备脑组织脱细胞支架的最佳方案具有极高的研究价值。
发明内容
本发明提供一种脑脱细胞支架的制备方法，以解决背景技术中所提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种脑脱细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用去污剂浸泡漂洗法获得脑脱细胞支架作为细胞载体；(2)对步骤(1)脑脱细胞支架的预血管化，得到预血管化的脑脱细胞支架。
进一步的，所述步骤(1)具体包括以下过程：取300-400g SD大鼠，复合麻醉剂腹腔麻醉成功后打开胸腹腔，充分暴露心脏后从心尖端进针经左心室插入升主动脉，并用止血钳固定，随后剪开右心耳，灌注0.9％氯化钠注射液约300ml，至右心耳流出无色液体后停止灌注，断头取出脑组织，去除非中枢神经系统组织后将脑组织放入玻璃皿中，脱色摇床上完成脱细胞：1％TritonX-100+0.1％氨水(PH 7-8)漂洗，速度：80rpm/min，液体浑浊后更换液体，至脱细胞支架成无色透明为止；PBS漂洗：3次×5min/次；DNA酶处理3次×30min/次；PBS漂洗：3次×5min/次；将脱细胞支架置于4℃PBS中保存备用。
进一步的，所述步骤(2)具体包括以下过程：将HUVECs种植到步骤(1)所得到的脑脱细胞支架中，并使其过表达VEGF，将其移植到SD大鼠腹部皮下，经HE、CD31染色证实支架中有血管形成。
进一步的，一种脑脱细胞支架的制备方法还包括步骤(3)，将PC12细胞移植到步骤(2)所制备的预血管化的支架中，验证预血管化的脑脱细胞支架中血管网络的形成，在组织工程中对种子细胞移植的重要性。
其中，所述步骤(3)具体包括以下过程：将PC12细胞移植到预血管化的支架中，作为实验组；并以未经步骤(2)预血管化的脑脱细胞支架作为对照组，经PC12细胞在预血管化支架中存活时间与在对照组时间进行比较。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
(1)本发明为脑脱细胞支架作为细胞载体用于中枢神经系统损伤的修复提供了实验依据，同时初步构建的脑脱细胞支架预血管化的方法为脑脱细胞支架预血管化后携带种子细胞移植在创伤性脑损伤后组织、神经再生修复提供了新的治疗策略。
(2)本发明进一步证实了有功能的血管网络形成在组织工程中对种子细胞移植的重要性，也为脑脱细胞支架预血管化的实现提供了初步方案，进而为脑脱细胞支架作为TBI后种子细胞的移植载体，使种子细胞能够获得合适的微环境及空间结构成为可能。
附图说明
图1为本发明的步骤(1)中灌注取脑的示意图；其中，图1A为正面观，图1B为反面观；
图2为本发明中的步骤(1)中漂洗过程的过程图；其中，图2A-图2E分别为12h、24h、36h、48h、60h的漂洗过程图；
图3为本发明中的步骤(1)中不同时间点的HE染色图；其中，图3A-图3E分别为12h、24h、36h、48h、60h的HE染色图；
图4为本发明中的步骤(1)中不同时间点的DAPI染色；其中，图4A-图4E分别为12h、24h、36h、48h、60h的DAPI染色图；
图5为本发明中的步骤(1)脑脱细胞支架中残留成分检测图及表面结构观察图；其中，图5A为脑脱细胞支架染色图；图5B为正常脑组织(对照组)染色图；图5C为脑脱细胞支架的扫描电镜图；图5D为脑脱细胞支架中BDNF因子检测图；
图6为本发明的步骤(1)中脑脱细胞支架的免疫源性检测，其中，图6A为脑脱细胞支架皮下种植4W周的HE染色图；图6B为明胶海绵皮下种植4W周的HE染色图；图6C、D为明胶海绵皮下种植4W后CD8免疫荧光染色显示细胞毒性T淋巴细胞(10倍、40倍)；图6E、F为脑脱细胞支架皮下种植4W后CD8免疫荧光染色显示细胞毒性T淋巴细胞(10倍、40倍)。
图7为本发明的步骤(2)中脑脱细胞支架对HUVECs毒性检测图；其中，图7A为脑脱细胞支架与HUVECs共培养48h后死细胞比例的检测图；图7B为基础培养基下HUVECs培养48h后死细胞比例的检测图；图7C为脑脱细胞支架组与对照组支架的CCK8检测结果图；
图8为本发明的步骤(2)中HUVECsVEGF/GFP在脑脱细胞支架中的HE染色图；其中，左侧为3d、7d、14d、21d、28d的HE染色图；右侧为左侧的局部放大图；
图9为本发明的步骤(2)中HUVECsVEGF/GFP在脑脱细胞支架中的Ki67免疫荧光染色图；
图10为本发明的步骤(2)中HUVECsGFP在脑脱细胞支架中的HE染色图；其中，左侧为3d、7d、14d、21d、28d的HE染色图；右侧为左侧的局部放大图；
图11为本发明的步骤(2)中HUVECsGFP在脑脱细胞支架中的Ki67免疫荧光染色图；
图12为本发明的步骤(2)中HUVECsGFP组Ki67阳性细胞比例图；
图13为本发明的PC12细胞在脑脱细胞支架中的HE染色图；
图14为本发明步骤(2)中脑脱细胞支架种植腹部皮下预血管化的HE染色显示图；
图15为本发明步骤(2)中HUVECsVEGF/GFP组皮下预血管化CD31免疫荧光染色图；
图16为本发明步骤(2)中HUVECsGFP组皮下预血管化CD31免疫荧光染色图；
图17为本发明步骤(2)中空支架组皮下预血管化CD31免疫荧光染色图；
图18为本发明步骤(2)中血管管腔样结构密度统计学分析图；
图19为本发明步骤(3)中beta III Tubμlin免疫荧光染色分析显示图；
图20为本发明步骤(3)中PC12细胞在支架中存活统计分析图；其中，图20A为PC12细胞移植3d后细胞存活分析图；图20B为PC12细胞移植7d后细胞存活分析图；图20C为PC12细胞移植14d后细胞存活分析图；图20D为PC12细胞移植21d后细胞存活分析图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
一种脑脱细胞支架的制备方法，包括以下步骤：(1)采用去污剂浸泡漂洗法获得脑脱细胞支架作为细胞载体；(2)对步骤(1)脑脱细胞支架的预血管化，得到预血管化的脑脱细胞支架。
在进一步的实施例中，所述步骤(1)具体包括以下过程：取300-400g SD大鼠，复合麻醉剂腹腔麻醉成功后打开胸腹腔，充分暴露心脏后从心尖端进针经左心室插入升主动脉，并用止血钳固定，随后剪开右心耳，灌注0.9％氯化钠注射液约300ml，至右心耳流出无色液体后停止灌注，断头取出脑组织，去除非中枢神经系统组织后将脑组织放入玻璃皿中，脱色摇床上完成脱细胞：1％TritonX-100+0.1％氨水(PH 7-8)漂洗，速度：80rpm/min，液体浑浊后更换液体，至脱细胞支架成无色透明为止；PBS漂洗：3次×5min/次；DNA酶处理3次×30min/次；PBS漂洗：3次×5min/次；将脱细胞支架置于4℃PBS中保存备用。其中，在灌注取脑如图1A及图1B所示。如图2漂洗过程的过程图；其中，图2A-图2E分别为12h、24h、36h、48h、60h的漂洗过程图；如图3所示为不同时间点的HE染色图；其中，图3A-图3E分别为12h、24h、36h、48h、60h的HE染色图；如图4所示为不同时间点的DAPI染色。由图5可见：与正常脑组织染色(对照组)相比，阿利新蓝染色及马松三色法染色显示脑脱细胞支架中残留有粘多糖(如图5A所示)，及胶原蛋白(如图5B所示)。同时，在脑脱细胞支架中可以检测到一定量的残留BDNF因子(如图5D所示)。扫描电镜可见脑脱细胞支架为一含有多孔隙的三维网状结构(如图5C所示)。通过步骤(1)的去污剂浸泡漂洗法能获得脑脱细胞支架，并经HE、DAPI染色等验证获得的支架中无核残留。
在进一步的实施例中，所述步骤(2)具体包括以下过程：将HUVECs种植到步骤(1)所得到的脑脱细胞支架中，并使其过表达VEGF，将其移植到SD大鼠腹部皮下，经HE、CD31染色证实支架中有血管形成。预血管化的支架较空支架相比，携带HUVECs的支架能够快速的实现血管化，血管密度高，过表达VEGF组的血管化效果更明显，其过量释放的VEGF因子能够诱导更多的血管长入。
在进一步的实施例中，一种脑脱细胞支架的制备方法还包括步骤(3)，将PC12细胞移植到步骤(2)所制备的预血管化的支架中，验证预血管化的脑脱细胞支架中血管网络的形成，在组织工程中对种子细胞移植的重要性。
其中，所述步骤(3)具体包括以下过程：将PC12细胞移植到预血管化的支架中，作为实验组；并以未经步骤(2)预血管化的脑脱细胞支架作为对照组，经PC12细胞在预血管化支架中存活时间与在对照组时间进行比较。
具体验证如下：
验证一：脑脱细胞支架免疫源性及组织相容性检测
脑脱细胞支架中主要成分为细胞外基质，包含胶原蛋白、粘多糖等，免疫源性低，组织相容性好。HE染色显示，脑脱细胞支架皮下种植4W周后(如图6A所示)嗜中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润较对照组(如图6B)无明显差异。CD8+T淋巴细胞同样未见明显增多(如图6C-F所示)。
验证二、脑脱细胞支架对HUVEC的毒性检测
利用Transwell小室将脑脱细胞支架与HUVECs共培养后分别以Live/Dead及CCK8检测均证实脑脱细胞支架对HUVECs无毒性。图7A、B：Live/Dead检测显示脑脱细胞支架与HUVECs共培养48h后死细胞比例与对照组无差异；图7C：CCK8检测结果显示脑脱细胞支架组与对照组支架无差别，支架对细胞无毒性。
验证三、HUVECs在脑脱细胞支架中的粘附生存
如图8所示，HE染色显示HUVECsVEGF/GFP在脑脱细胞支架上能够粘附，并长时间生存，早期细胞主要集中在局部注射部位生长，随着培养时间延长，细胞逐渐迁移后均匀分布在支架中。如图9所示，Ki67检测显示HUVECsVEGF/GFP在脑脱细胞支架上具有增殖能力。如图10所示，HE染色显示HUVECsGFP在脑脱细胞支架上能够粘附，并长时间生存，同HUVECsVEGF/GFP，细胞早期主要集中在局部注射部位，后逐步均匀分布在支架中，随着时间的延长，粘附的细胞有减少的趋势。如图11所示，Ki67检测显示HUVECsGFP在脑脱细胞支架上具有增殖能力。Ki67阳性细胞比例分析显示HUVECsVEGF/GFP在7d-14d左右增殖能力最强，如图12所示。
验证四、PC12细胞在脑脱细胞支架中的粘附生存
如图13所示，HE染色显示PC12细胞在脑脱细胞支架上能够粘附，并长时间生存。PC12细胞在脑脱细胞支架中的HE染色。HE染色显示PC12细胞能够在脑脱细胞支架上粘附，并长时间生存。
验证五、脑脱细胞支架腹部皮下预血管化
脑脱细胞支架具备良好的组织相容性及低免疫源性，HUVECs能够在支架上粘附、增殖并长期生存，将无细胞的脑脱细胞支架(空支架组)、携带HUVECsVEGF/GFP脑脱细胞支架(HUVECsVEGF/GFP组)、携带HUVECsGFP脑脱细胞支架(HUVECsGFP组)分别种植于大鼠腹部皮下进行预血管化。HE染色显示，脑脱细胞支架在皮下可以诱导血管长入，实现预血管化。通过对比发现，HUVECsVEGF/GFP组血管密度明显高于HUVECsGFP组及空支架组，并且血管长入时间明显早于其它两组。
脑脱细胞支架种植腹部皮下预血管化。如图14所示，HE染色显示，脑脱细胞支架在皮下可以诱导血管长入，实现预血管化。为了准确量化血管形成，利用血管内皮细胞特异性抗体CD31对血管进行鉴定。图15、16、17分别为HUVECsVEGF/GFP组皮下预血管化CD31免疫荧光染色、HUVECsGFP组皮下预血管化CD31免疫荧光染色、空支架组皮下预血管化CD31免疫荧光染色。如图18所示，通过对血管管腔样结构密度统计学分析显示，HUVECsVEGF/GFP组预血管化能力明显强于HUVECsGFP组及对照组；后期管腔样结构减少，考虑为小的管腔逐渐成熟融合变大的原因。
验证六、脑脱细胞支架皮下预血管化后PC12细胞种植
将实验组分为：预血管化组和未预血管化组，预血管化组分为：空支架预血管化+PC12组，HUVECsVEGF/GFP支架预血管化+PC12组，HUVECsGFP支架预血管化+PC12组；未预血管化组分为：空支架+PC12组，空支架+HUVECsVEGF/GFP+PC12组。共5组。预血管化组3W后种植PC12细胞。
如图19所示，PC12细胞在支架中存活情况分析：通过beta III Tubμlin免疫荧光染色分析显示PC12细胞移植后在预血管化的脑脱细胞支架中存活时间明显长于未预血管化组。预血管化组形成的血管网络可以为移植的PC12细胞提供营养支持，使其能够长期存活。
PC12细胞存活统计学分析：图20A：PC12细胞移植3d后细胞存活分析；HUVECsVEGF/GFP支架预血管化+PC12组的细胞存活数最多，与空支架+PC12组相比，具有显著性差异；图20B：PC12细胞移植7d后细胞存活分析；结果与图20A吻合；图20C：PC12细胞移植14d后细胞存活分析；预血管化组较未预血管化组PC12存活数具有统计学差异；图20D：结果与图20C吻合。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种脑脱细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用去污剂浸泡漂洗法获得脑脱细胞支架作为细胞载体；(2)对步骤(1)脑脱细胞支架的预血管化，得到预血管化的脑脱细胞支架。
2.根据权利要求1所述的一种脑脱细胞支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下过程：取300-400g SD大鼠，复合麻醉剂腹腔麻醉成功后打开胸腹腔，充分暴露心脏后从心尖端进针经左心室插入升主动脉，并用止血钳固定，随后剪开右心耳，灌注0.9％氯化钠注射液约300ml，至右心耳流出无色液体后停止灌注，断头取出脑组织，去除非中枢神经系统组织后将脑组织放入玻璃皿中，脱色摇床上完成脱细胞：1％TritonX-100+0.1％氨水漂洗，,速度：80rpm/min，液体浑浊后更换液体，至脱细胞支架成无色透明为止；PBS漂洗：3次×5min/次；DNA酶处理3次×30min/次；PBS漂洗：3次×5min/次；将脱细胞支架置于4℃PBS中保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种脑脱细胞支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下过程：将HUVECs种植到步骤(1)所得到的脑脱细胞支架中，并使其过表达VEGF，将其移植到SD大鼠腹部皮下，经HE、CD31染色证实支架中有血管形成。
4.根据权利要求1所述的一种脑脱细胞支架的制备方法，其特征在于，还包括步骤(3)，将PC12细胞移植到步骤(2)所制备的预血管化的支架中，验证预血管化的脑脱细胞支架中血管网络的形成，在组织工程中对种子细胞移植的重要性。
5.根据权利要求4所述的一种脑脱细胞支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下过程：将PC12细胞移植到预血管化的支架中，作为实验组；并以未经步骤(2)预血管化的脑脱细胞支架作为对照组，经PC12细胞在预血管化支架中存活时间与在对照组时间进行比较。
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