CN107635592A - 充气的去细胞化胞外基质 - Google Patents

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Abstract

提供了一种制备哺乳动物器官或其血管化部分或者哺乳动物血管化组织或其血管化部分的膨胀的去细胞化胞外基质的方法、一种哺乳动物器官或其血管化部分或者哺乳动物血管化组织或其血管化部分的膨胀的去细胞化胞外基质、及其用途。

Description

充气的去细胞化胞外基质
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2015年3月26日提交的美国申请系列号62/138,850的提交日期的权益，所述申请案的公开内容在本文中通过引用来结合。
发明背景
胞外基质(ECM)是形成组织特异性架构的结构蛋白和功能蛋白的复杂网络。所述ECM包含各组织和器官中的居留细胞(resident cell)的分泌产物。基质分子包括结构蛋白和功能蛋白、糖蛋白以及糖胺聚糖。ECM的居留细胞，除产生ECM之外，亦接收来自其中的信号，允许组织发育和/或内稳态。该特性是基于ECM的材料用于组织工程和再生医学的基础。因为ECM为细胞生存和生长提供具有较低免疫原性的天然存在且高度保守的基底，所以具有单独ECM组分的基于ECM的基底或者全去细胞化组织的基于ECM的基底已在临床前和临床环境中得到广泛应用。
发明概述
本发明提供哺乳动物器官或其血管化部分、或者血管化的哺乳动物组织或其部分的充气的(膨胀的)去细胞化胞外基质。在一个实施方案中，三维去细胞化胞外基质保留原始器官或其部分、或者组织或其部分的形状。在一个实施方案中，相对于相应的未膨胀胞外基质的高度，膨胀之后的胞外基质具有大于约0.2cm直至约0.6cm的高度，例如约0.3cm至约0.5cm，包括约0.4cm。例如，相对于相应的未膨胀的肝叶胞外基质的高度，膨胀之后的大型哺乳动物的肝叶胞外基质具有大于约0.3cm至约0.5cm的高度，包括约0.4cm。在一个实施方案中，相对于相应的未膨胀胞外基质，膨胀之后的胞外基质具有增加了至少25％直至1000％的高度，例如至少50％直至约500％或者约75％直至约250％。在一个实施方案中，器官或组织的充气的去细胞化胞外基质具有的形状、大小或体积为相应的原生器官或组织的形状、大小或体积的约25％至125％，例如约50％至约150％或者约75％至约110％。将例如蒸气(含颗粒或液滴的气体)等气体经器官或组织的去细胞化胞外基质的天然脉管系统或任何其他管道(例如导管或腔)主动引入器官或组织的去细胞化胞外基质中，提供了器官或组织基质的充气的去细胞化胞外基质，所述胞外基质相对于其未膨胀形状而言为扩张的，以及在一些实施方案中，其具有去细胞化之前的所述天然(细胞化的)器官或组织的原始形状。所述充气的去细胞化胞外基质(例如充有空气的去细胞化胞外基质)的形状因气体被封在组织或器官内并填充原本被细胞占据的空间而得以保留。在一个实施方案中，气体在没有密封的情况下被保留在胞外基质中。产物为一种三维去细胞化胞外基质，其可用于但不限于：作为外科网状物(surgical mesh)、外科填充物、空隙填充物的植入，组织工程及其它。膨胀使得基质通过曾由细胞占据的区室被填充而展开，从而使所述基质因变得更刚硬而易被切割。同样，基质通过引入气体得到的展开使其在冷冻时更易被破碎(morsalized)。
在一个实施方案中，所述气体包括常规空气、CO2、氩气、氮气或氧气，或其任意组合。在一个实施方案中，所述气体包含雾化药物，例如一种或多种类固醇、抗生素或抗真菌药。在一个实施方案中，蒸气组分包含诸如过乙酸(periacetic acid)或过氧化氢等灭菌剂，或者载体，例如磷酸盐缓冲盐水、乳糖、葡萄糖或脂质体载体，或者具有多种药物或蛋白质的喷雾器型蒸气，所述药物或蛋白质包括但不限于一种或多种抗生素、类固醇或抗真菌药，或者诸如VEGF、FGF-2、EGF、PDGF、IGF或HGF等蛋白质，或者包含蛋白质、小分子或药物的微粒或纳米颗粒。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的附图。在请求并支付必要费用之后，专利局将提供带有彩图的本专利或专利申请出版物的副本。
图1.膨胀之前的肝叶的去细胞化胞外基质的图像。
图2.膨胀之前的插管肝脏的去细胞化胞外基质的图像。
图3.膨胀期间的插管肝脏的去细胞化胞外基质的图像。
图4.处于膨胀期间且在图3中的图像之后获取的插管肝脏的去细胞化胞外基质的图像。
图5.处于膨胀期间且在图4中的图像之后获取的插管肝脏的去细胞化胞外基质的图像。
图6.处于膨胀期间且在图5中的图像之后获取的插管肝脏的去细胞化胞外基质的图像。
图7.膨胀期间的肝的去细胞化胞外基质的侧面图像。
图8.膨胀期间的肝的去细胞化胞外基质的侧面图像。
图9.膨胀期间的肝的去细胞化胞外基质的侧面图像。
发明详述
去细胞化得到具有胞外基质的无细胞组织或器官。原本被细胞占据的去细胞化所得空间被去细胞化溶液或者组织处于其中的任何溶液占据。在含有高细胞与胞外基质比(例如根据组织类型为1∶3至1∶20的比率)的诸如肝、肺、肌肉、脾和心脏等组织和器官中，，所述器官或组织的原始形状因曾经包含细胞的区室塌陷而减小。尽管如果在压力下对所述器官或组织灌注可维持其原始形状，但一旦去除压力，所述器官或组织将随着所述流体缓慢排出而缩小。为了制造一种保持器官或组织原始形状、大小或体积的三维基质，将气体或包含颗粒或液滴的气体(蒸气)引入去细胞化器官或组织的至少一条血管、导管或腔以填充空隙空间，得到可进行切割、成形和/或造型以用于各种用途的三维基质，而不会使细胞曾存留于其中的区室塌陷。
因此，在一个实施方案中，本发明提供进入去细胞化器官或组织的血管网络的有效通道。其可通过插管、直接向ECM注入或者使用正向位移装置(positive displacementdevice)，并可选地封闭属于去细胞化器官或组织的任何主要静脉或动脉来完成。在一些实施方案中，可封堵其他血管通道以制造更封闭的血管系统。在一个实施方案中，使用泵、注射器、压缩气体、罐装气体和/或含有包含一种或多种蛋白质、小分子、药物或其他媒介的气体或蒸气的小罐将气体或蒸气通过连接于与插管的动脉或静脉血管的管道、插管、连接器、针头和/或注射器将气体或蒸气有效引入所述去细胞化器官或组织中，包括例如在组织外部施加真空以导致引入的气体和/或蒸气的分布，例如以如约10至约10,000mL/min的泵速以及约1至约200mmHg的压力。气体或蒸气以确定的速率(例如2,000mL/min)被泵送，直至达到所需的结果，所需结果可由例如目测或者经物理测量所确定，如填充至确定的体积或体积形状、增加的表面张力和/或增加的反压。膨胀的器官或组织中的气体或蒸气被封入细胞区室中并保留在该处。
所述气体或蒸气填充的去细胞化器官或组织基质可用于多种治疗应用，包括使用所述整体去细胞化器官或组织，或者所述器官或组织的部分，例如用作外科填充物、外科网状物、用于瘘管和其他空隙的填充物，以及用以制备所述器官或组织的去细胞化ECM的颗粒或碎块。碎块直径约为0.5mm至10mm；颗粒直径＜约0.5mm。碎块产生可包括将扩张的ECM磨碎并随后使所述碎块通过一系列筛滤器以得到所需大小范围的碎块。颗粒产生可包括将磨碎的碎块研磨成更小的碎块并随后使其通过一系列更小的筛滤器以得到所需的颗粒大小范围。或者，所述器官或组织的去细胞化ECM可用来接种任何类型的细胞或任意组合的细胞。
在一个实施方案中，充气的(扩张的)去细胞化基质用作保持形状的外科填充物。在一个实施方案中，充气的去细胞化基质用于对瘘的治疗。在一个实施方案中，充气的去细胞化基质经历电子束灭菌，例如以固定所述基质的蛋白质构象，从而增进其形状的保留。在一个实施方案中，用于使去细胞化基质膨胀的气体对所述去细胞化基质灭菌。去细胞化基质的膨胀使切割所期望的基质的三维部分变得容易、使冷冻干燥和/或粉碎去细胞基质以用于创伤应用变得容易。在一个实施方案中，用蒸气使去细胞化基质膨胀，或者去细胞化基质在使用不含颗粒、不含液滴的气体被初步膨胀之后，与含有一种或多种药物(例如一种或多种细胞因子或生长因子)的蒸气接触从而诱导体内重建和/或在接种细胞时增加细胞植入。在一个实施方案中，用含有一种或多种小分子或蛋白质的蒸气使去细胞化基质膨胀，或者去细胞化基质在用不含颗粒、不含液滴的气体使被初步膨胀之后，与含有一种或多种药物的蒸气接触，所述含有一种或多种药物的蒸气充当受控的递送媒介、载体或装置在体内缓释所述一种或多种药物。
图2-6显示去细胞化的肝使用空气逐渐膨胀。图7-9显示膨胀的肝不依赖主动压力(active pressure)来保持其形状。膨胀肝叶的横截面亦显示了将膨胀基质切片的能力。
用于去细胞化ECM的器官和组织的示例性来源
组织为具有共同结构和功能的一组细胞，例如上皮组织、结缔组织、肌肉组织(骨骼肌、心肌或平滑肌)和神经组织，且包括覆盖或内衬或连接器官的柔韧薄膜。器官为以结构单位连接以提供共同功能的一群组织(两个或更多个)。器官包括但不限于脑、肝、胰、骨、脾、心、胃、肾、肺、整块肌肉、胸腺、肛门和肠。如在本文中所使用的，器官包括可灌注的整个器官、或器官的部分、或其血管化结构，组织包括含血管化组织的任何结构，例如气管。
在一个实施方案中，器官或组织或其ECM的部分在本发明的方法中被采用，例如心脏的心房或心室或者包含胰岛的胰腺的内部结构。在一个实施方案中，所述部分厚度约为5至10mm。在一个实施方案中，所述部分厚度约为70至100mm。
器官或组织的ECM或其血管化部分，可获自任何来源，包括但不限于心、肝、肺、骨骼肌、脑、胰、脾、肾、子宫、眼、脊髓、肠、网膜、整块肌肉、或膀胱、或其任何部分(例如主动脉瓣、二尖瓣、肺动脉瓣、三尖瓣、肺静脉、肺动脉、冠状脉管系统、隔膜、右心房、左心房、右心室或左心室)。实体器官是指具有“基本上封闭的”脉管系统的器官。就器官而言的“基本上封闭的”脉管系统意指，假设将所述主要血管插管、结扎或以其他方式限制，在用液体灌注之后，大部分所述液体包含在所述实体器官之内或者流过所述天然血管结构且不会漏出所述实体器官。尽管具有“基本上封闭的”脉管系统，但许多上文所列的器官亦具有确定的“入口”和“出口”血管，其用于在灌注期间引入液体并使液体在整个所述器官移动。此外，其它类型的血管化器官或组织，例如关节(例如膝、肩或髋)的全部或部分、肛门、气管或脊髓，可进行灌注法去细胞化。此外，在对较大的血管化结构的部分(例如整条腿)去细胞化时，例如软骨或角膜等的无血管组织可被去细胞化。
具有基本上封闭的血管系统的器官的灌注法去细胞化基质为有用的，因为灌注法去细胞化保留完整的基质和微环境，包括完整的血管和微血管系统，所述血管系统或导管或其它管道，可用于在体外递送细胞以及将营养物和/或分化或维持因子递送给所述细胞。细胞以及营养物和/或其它因子可通过其它方式来递送，例如注射、或被动方式、或其组合。在一个实施方案中，关注的细胞群被灌注到膨胀之后的灌注法去细胞化器官ECM中，从而被接种到所述血管导管之外的间隙空间或基质中。其包括使细胞主动迁移和/或归巢至其原生显微结构，例如使内皮细胞归巢至脉管系统。在一个实施方案中，关注的细胞群被灌注到灌注法去细胞化ECM中，接着灌注第二细胞群，例如在引入β细胞群之后引入内皮细胞群，其中内皮细胞保留在血管导管中，如同在其原生微环境中。在一个实施方案中，关注的细胞群被灌注到膨胀之后的灌注法去细胞化ECM中，接着灌注第二细胞群，例如在引入内皮细胞群之后引入包含β细胞的细胞群，其中内皮细胞保留在所述血管导管中，如同在其原生微环境中。在另一个实施方案中，两种或更多种细胞群组合并一起被灌注。在另一个实施方案中，通过灌注、直接注射或二者的组合序贯引入两种或更多种不同的细胞群。
细胞可处于支持所述细胞的增殖、代谢和/或分化的培养基中被引入。或者，培养基可在细胞定殖于ECM之后更换成支持所述细胞的增殖、代谢和分化的培养基。培养的细胞可以生理细胞密度存在于ECM中，且当在ECM中存在支持细胞增殖、代谢和/或分化的培养基和/或适当的微环境时，允许所述细胞的维持和/或功能分化。
所述细胞和ECM可以是异种的或同种异体的。在一个实施方案中，可将部分或完全分化的人类细胞和来自小型动物(例如非人类哺乳动物)的灌注法去细胞化器官或组织组合。在一个实例中，用内皮细胞和从人胚胎干细胞部分分化而来的肝细胞接种来自人类的灌注法去细胞化肝基质，分别得到同种异体或异种的细胞接种基质。
器官或组织的去细胞化
去细胞化一般包括以下步骤：实体器官(例如其血管化结构)或组织的稳定化，实体器官或组织的去细胞化，实体器官或组织的复性和/或中和，洗涤实体器官，降解残留在器官上的任何DNA，器官或组织的消毒以及器官的内稳态。
对器官血管化结构或组织去细胞化的起始步骤为对器官或组织进行插管。可使用本领域已知的方法和材料对器官或组织的血管、导管和/或腔进行插管。接着，使用细胞裂解培养基灌注插管的器官血管化结构或组织。沿器官灌注可以是多方向的(例如顺行的和逆行的)。
心脏的Langendorff灌注法作为一种生理灌注法(亦称为四腔工作模式灌注法)在本领域中为常规的。参见例如Dehnert，The Isolated Perfused Warm-Blooded HeartAccording to Langendorff，In Methods in Experimental Physiology andPharmacology：Biological Measurement Techniques V(根据实验生理学和药理学：生物学测定技术V的方法中的Langendorff分离的灌注的温血心脏).Biomesstechnik-VerlagMarch GmbH，西德，1988。
简单地说，对于Langendorff灌注法，在主动脉上插管并与含生理溶液的容器连接，以使所述心脏在体外运行一定的时间。为了实现灌注法去细胞化，将该方案改良为以恒定流速，例如用输液泵或滚子泵或者通过恒流静压泵，在逆行方向沿主动脉递送细胞裂解培养基来灌注。在这两种情况下，主动脉瓣被迫关闭并将所述灌注液导向冠状动脉口(从而经由顺行来灌注心脏的整个心室块)，其随后经由冠状窦排入右心房中。对于工作模式的灌注，将第二个插管与左心房连接且灌注可变为逆行的。
在一个实施方案中，生理溶液包括磷酸缓冲盐水(PBS)。在一个实施方案中，生理溶液为补充以例如营养补充剂(例如葡萄糖)的在生理上相容的缓冲液。对于肝，所述生理溶液可以是补充以2％BSA的含118mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、26mMNaHCO3、8mM葡萄糖和1.25mM CaCl2的Krebs-Henseleit缓冲液。对于具有胰岛、β-细胞或胰岛素样细胞的再内皮化肝移植物，所述生理溶液可以是补充或未补充催乳素的Miami改良培养基-1或者改良的CMRL 1066组织培养基，其含有：10％胎牛血清、25mM HEPES、100个单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素，pH 7.4，含或不含VEGF。
用于灌注其它器官或组织的方法在本领域中为已知的。作为示例，下列参考文献描述了肺、肝、肾、脑和四肢的灌注。Van Putte等，Ann.Thorac.Surg.，74(3)：893(2002)；den Butter等，Transpl.Int.，8：466(1995)；Firth等，Clin.Sci.(Lond.)，77(6)：657(1989)；Mazzetti等，Brain Res.，999(1)：81(2004)；Wagner等，J.Artif.Organs，6(3)：183(2003)。
可将一种或多种细胞裂解培养基用于将组织或器官去细胞化。细胞裂解培养基一般包含至少一种洗涤剂，例如但不限于SDS、PEG、CHAPS或Triton X。细胞裂解培养基可包含水，由此培养基与细胞在渗透上为不相容的。或者，细胞裂解培养基可包含缓冲液(例如PBS)，使其与所述细胞具有渗透相容性。细胞裂解培养基亦可包含酶，例如但不限于一种或多种胶原酶、一种或多种分散酶、一种或多种DNA酶或者蛋白酶，如胰蛋白酶。在一些情况下，细胞裂解培养基亦可包含或者可选地包含一种或多种酶的抑制剂(例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂和/或胶原酶抑制剂)。
在某些实施方案中，可使用两种不同的细胞裂解培养基序贯地灌注插管的器官或组织。例如，第一种细胞裂解培养基可包含阴离子洗涤剂，例如SDS，第二种细胞裂解培养基可包含离子型洗涤剂，例如Triton X。在用至少一种细胞裂解培养基灌注之后，插管的器官或组织可使用例如洗涤液和/或含一种或多种酶(例如在本文中公开的酶)的溶液灌注。
交替灌注方向(例如顺行的和逆行的)可辅助将整个器官或组织去细胞化。去细胞化一般是由内而外将器官去细胞化，从而对ECM造成极小的损伤。可在介于4-40℃之间的合适温度将器官或组织去细胞化。根据器官或组织的大小和重量以及细胞裂解培养基中的特定洗涤剂和洗涤剂的浓度，一般用细胞裂解培养基对器官或组织进行灌注约0.05小时至约5小时/克实体器官或组织(实体器官或组织一般＞50克)或者约2小时至约12小时/克实体器官或组织(实体器官或组织一般＜50克)。包括洗涤在内，可将器官灌注直至约0.75小时至约10小时/克实体器官或组织(实体器官或组织一般＞50克)，或者约12小时至约72小时/克组织(实体器官或组织一般＜50克)。去细胞化时间取决于器官或组织的血管密度和细胞密度，并依整体质量而作有限程度的按比例延长或缩短。因此，提供上述时间范围和质量以作为通用指南。一般将灌注调整至包括搏动血流、速度和压力的生理条件。
去细胞化器官或组织具有所述器官或组织的所有或大部分区域的胞外基质(ECM)组分，包括血管树的ECM组分。ECM组分可包括下列的任何或全部：纤连蛋白、原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原家族的成员(例如胶原I、III和IV)、ECM相关的生长蛋白(包括生长因子和细胞因子)、糖胺聚糖、底物、网状纤维和血小板反应蛋白，其可如确定的结构，例如基底层一样保持有序。成功的去细胞化可以被定义为：使用标准组织学染色程序检测到在组织切片中不含可检测到的肌丝、内皮细胞、平滑肌细胞和细胞核，或者如通过荧光测定法测定为去除了超过97％的可检测的DNA。残留的细胞碎片可从去细胞化器官或组织中去除。
ECM的形态和架构在去细胞化过程期间和之后得到保持。如在本文中所用的“形态”是指器官、组织或者ECM的总体形状，而如在本文中所用的“架构”是指外表面、内表面及其之间的ECM。
ECM的形态和架构可进行目测和/或组织学检验。例如，实体器官的外表面上或者器官或组织的脉管系统内的基底层，不应因灌注去细胞化而被去除或显著损伤。此外，ECM的原纤维应与未经去细胞化的器官或组织的原纤维类似或者与之相比未显著改变。
可在去细胞化器官或组织之中或之上施加一种或多种化合物，以用来，例如，保存去细胞化器官，或者制备用于再细胞化的去细胞化器官或组织和/或用来在所述再细胞化过程期间辅助或刺激细胞。这类化合物包括但不限于一种或多种生长因子(例如VEGF、DKK-1、FGF、BMP-1、BMP-4、SDF-1、IGF、HGF、激活素A、视黄酸和bFGF)、免疫调节剂(例如细胞因子、糖皮质激素、IL2R拮抗剂、白细胞三烯拮抗剂)、化学物质(氯氮平-N-氧化物、磷酸肌醇-3-激酶抑制剂和烟酰胺)和/或调解凝血级联反应的因子(例如阿司匹林、肝素结合蛋白和肝素)。此外，去细胞化器官或组织可使用，例如，辐照(例如UV、γ)进行进一步处理以减少或消除残留在去细胞化器官或组织之上或之中任何类型的微生物的存在。
心脏的示例性灌注法去细胞化
PEG去细胞化方案
不使用再循环，用含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U肝素和2mg腺苷的200ml PBS洗涤心脏。然后使用手动再循环，用35ml聚乙二醇(PEG；1g/mL)将心脏去细胞化达30分钟。然后使用再循环泵，将所述器官用500mL PBS洗涤达24小时。所述洗涤步骤至少重复两次，每次至少24小时。使用手动再循环，将心脏与35ml DNA酶I(70U/mL)接触达至少1小时。再次用500ml PBS将所述器官洗涤至少24小时。
Triton X和胰蛋白酶去细胞化方案
不使用再循环，用含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U肝素和2mg腺苷的200ml PBS洗涤心脏达至少约20分钟。然后用0.05％胰蛋白酶将心脏去细胞化达30分钟，接着用含5％Triton-X和0.1％氢氧化铵的500mL PBS灌注达约6小时。用去离子水将心脏灌注约1小时，并随后用PBS灌注12小时。然后使用再循环泵，将心脏用500mL PBS洗涤3次，每次24小时。使用手动再循环，将所述心脏用35ml DNA酶I(70U/mL)灌注1小时，并使用再循环泵，用500ml PBS洗涤两次，每次至少约24小时。
1％SDS去细胞化方案
不使用再循环，用含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U肝素和2mg腺苷的200ml PBS洗涤心脏达至少约20分钟。使用再循环泵，用含1％SDS的500mL水将所述心脏去细胞化达至少6小时。然后用去离子水将所述心脏洗涤约1小时并用PBS洗涤约12小时。使用再循环泵，用500mL PBS将所述心脏洗涤三次，每次至少约24小时。然后使用手动再循环，用35ml DNA酶I(70U/mL)将所述心脏灌注约1小时，并使用再循环泵，用500ml PBS洗涤三次，每次至少约24小时。
Triton X去细胞化方案
不使用再循环，用含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U肝素和2mg腺苷(Adenocard)(腺苷(adenosine))的200ml PBS洗涤心脏达至少约20分钟。然后使用再循环泵，用含5％Triton-X和0.1％氢氧化铵的500mL水将心脏去细胞化达至少6小时。然后用去离子水将心脏灌注约1小时并随后用PBS灌注约12小时。使用再循环泵，通过用500mL PBS灌注3次、每次至少24小时来洗涤心脏。然后使用手动再循环，用35ml DNA酶I(70U/mL)将心脏灌注约1小时，并用500ml PBS洗涤三次，每次约24小时。
可以60cm H2O的冠状动脉灌注压来灌注心脏。虽然不需要，但亦可将所述心脏置于去细胞小室中并完全浸没，以连续流为5mL/分钟的再循环模式，用含抗生素的PBS灌注72小时，以尽可能多地洗除细胞组分和洗涤剂。
去细胞化的检测
成功的去细胞化可通过在组织切片中不含核酸来测定。血管结构的成功保留可通过在包埋组织切片之前用2％伊文思蓝灌注来评价。通过下述处理方法，可观察到高效的去细胞化：器官首先用溶于去离子H2O的离子型洗涤剂(1％十二烷基硫酸钠(SDS)，约0.03M)以恒定的冠脉灌注压顺行灌注，并随后用非离子型洗涤剂(1％Triton X-100)顺行灌注以去除所述SDS以及有可能地使胞外基质(ECM)蛋白复性。所述器官可间断地使用磷酸盐缓冲溶液进行逆行灌注以清理阻塞的毛细血管和小血管。
为了显示去细胞化之后的完整血管结构，可将去细胞化器官通过使用伊文思蓝的Langendorff灌注法染色，从而将血管基膜染色并对大血管和小血管密度进行定量。
膨胀器官或组织的再细胞化
使膨胀的去细胞化器官或组织与一群细胞接触，所述细胞可以是分化的(成熟或原代)细胞、干细胞或部分分化细胞。因此，所述细胞可以是全能细胞、多能(pluripotent)细胞或专能(multipotent)细胞，并且可以是未定型的或定型的，以及可以是单系细胞。所述细胞可以是未分化细胞、部分分化细胞或者完全分化细胞，包括胎儿来源的细胞。细胞可包括祖细胞、前体细胞或者“成体”来源的干细胞，包括脐带细胞和胎儿干细胞。在本发明基质中有用的细胞包括胚胎干细胞(如国立卫生研究院(NIH)所定义；参见，例如，万维网stemcells.nih.gov的词汇表)和iPS细胞。
可用于使膨胀的去细胞化器官或组织再细胞化的细胞的实例包括但不限于胚胎干细胞、脐带血细胞、组织来源的干细胞或祖细胞、骨髓来源的干细胞或祖细胞、血液来源的干细胞或祖细胞、间充质干细胞(MSC)、骨骼肌来源的细胞、多能成体祖细胞(MAPC)或iPS细胞。可使用的其他细胞包括心脏干细胞(CSC)、多能成体心脏来源的干细胞、心脏成纤维细胞、心脏微脉管系统内皮细胞、主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、肝细胞、β-细胞、角质形成细胞、浦肯野(purkinji)纤维、神经元、胆管上皮细胞、胰岛细胞、肺细胞、克拉拉细胞、刷状缘细胞或足细胞。骨髓来源的干细胞，例如骨髓单核细胞(BM-MNC)、内皮或血管干细胞或祖细胞，以及外周血来源的干细胞，例如内皮祖细胞(EPC)，亦可用作细胞。
被引入灌注法去细胞化的膨胀支架之中及之上的细胞数量，可取决于器官(例如，何种器官、器官的大小和重量)或组织以及再生细胞的类型和发育阶段二者。不同类型的细胞就其将达到的群体密度而言可具有不同的趋势。类似地，不同的器官或组织可以不同的密度进行细胞化。作为示例，膨胀的去细胞化器官或组织可“接种”至少约1,000个(例如至少10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000个)细胞；或者可具有约1,000个细胞/mg组织(湿重，例如在去细胞化之前)至约10,000,000个细胞/mg组织(湿重)与之结合。
细胞可通过注射到一个或多个位置被引入(“接种”)到膨胀的去细胞化器官或组织中。此外，可将多于一种类型的细胞引入膨胀的去细胞化器官或组织中。例如，可在膨胀的去细胞化器官或组织的多个位置注射一群分化的细胞类型，或者可将不同的细胞类型注射到去细胞化器官或组织的不同部分中。可选地，或者除注射之外，可通过灌注将细胞或细胞的混合物引入插管的膨胀的去细胞化器官或组织中。例如，可使用灌注培养基将细胞灌注到膨胀的去细胞化器官中，然后可将所述灌注培养基更换成扩增和/或分化培养基以诱导细胞的生长和/或分化。可通过将细胞置于器官内的不同位置来实现位置特异性分化，例如置于心脏的区域中，如心房、心室或房室结(nodal)。
在再细胞化期间，将器官或组织维持在使至少某些细胞可在该器官或组织之中和之上增殖和/或分化的条件。所述条件包括但不限于适当的温度和/或压力、电活性和/或机械活性、力、适量的O2和/或CO2、适量的湿度以及无菌或接近无菌的条件。在再细胞化期间，将去细胞化器官或组织以及附着其中的再生细胞维持在合适的环境中。例如，细胞可能需要营养补充剂(例如营养物和/或碳源，如葡萄糖)、外源性激素或生长因子、和/或特定pH。
如在本文中所述的使组织或器官基质再细胞化的方法，包括在压力下用生理缓冲液灌注组织或器官基质。这种在压力下灌注组织或器官基质，在将任何细胞引入基质之前进行，且类似在WO 2007/025233中描述的用于去细胞化过程中的灌注，经由器官或组织基质的脉管系统或其他管腔或管道结构(例如肺中的气管、肝中的胆管、肾中的尿道等)，且一般开始于在器官或组织基质的脉管系统(例如动脉、静脉、微动脉、微静脉和毛细管)和/或其他管腔和/或管道(下文称为“脉管系统型”结构)插管(约1-约300Hg)。因此插管包括将套管插入身体导管、腔或血管中，如插入气管、膀胱或血管中以引入或去除流体、物质或废物。如在本文中所用的，在压力下灌注器官或组织基质，是指在足够压力下递送流体组合物(例如生理缓冲液)，以使得组织或器官基质中的脉管系统和脉管系统型结构保持打开和扩张，但压力不会过高而致对组织或器官基质的脉管系统或脉管系统型结构造成损伤或肿胀。适用于在压力对组织或器官基质进行细胞前灌注(pre-cellular perfusion)的生理缓冲液可以是与所述组织或器官基质相容的任何缓冲液。例如，生理缓冲液可包含营养物，如糖和碳水化合物，且亦可包含促内皮因子(例如对内皮细胞或内皮有正效应的化合物)，例如诱导血管发生的化合物(如VEGF、FGF-1和/或bFGF)。生理缓冲液一般处于生理pH。
在一个实施方案中，适于细胞前灌注或细胞灌注的生理缓冲液包括但不限于磷酸缓冲盐水(PBS)或者适于内皮细胞培养的培养基溶液，包括但不限于EGM-2、EGM-2MV、DMEM、PromoCell内皮细胞培养基、培养基200、DMEMF/12、连同营养补充剂(例如葡萄糖)的缓冲液，其可用于器官灌注和/或保存，包括移植。其包括，例如对于心脏组织，配制下列组成(以mM计)的改良Krebs-Henseleit缓冲液：118NaCl、4.7KCl、1.2MgSO4、1.2KH2PO4、25NaHCO3、11葡萄糖、1.75CaCl2和2.0丙酮酸盐及5U/L胰岛素，或者Krebs缓冲液，其含(以mM计)118NaCl、4.7KCl、25NaHCO3、1.2MgSO4、1.2KH2PO4、2CaCl2，充以95％O2、5％CO2气体；或者葡萄糖(例如11mM)或与1或1.2mM棕榈酸盐组合的葡萄糖。对于肾组织，示例性培养基为KPS-1肾灌注溶液。对于肝组织，示例性培养基为Krebs-Henseleit缓冲液，其含118mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、26mM NaHCO3、8mM葡萄糖和1.25mM CaCl2，补充以2％BSA。
尽管不受任何具体机理束缚，但这种在压力下的细胞前灌注被认为打开并冲洗基质，特别是组织或器官基质的血管床，从而在再内皮化期间使更多的基质与细胞接触并允许在组织或器官基质的脉管系统各处建立可存活的内皮。本领域技术人员将理解的是，不同的组织和器官基质(例如来自不同来源，如心、肝、肺、肾、胰等)可承受不同量的压力。特定组织或器官基质可承受的压力的量，至少部分地，与特定组织或器官基质的血管床有关。
细胞对于去细胞化器官或组织而言可以是同种异体的(例如用人细胞接种人去细胞化器官或组织)，或者是异种的(例如用人细胞接种猪去细胞化器官或组织)。如在本文中所用的“同种异体的”是指细胞获自与器官或组织来源的物种相同的物种(例如有亲缘关系或无亲缘关系的个体)，而如在本文中所用的“异种的”是指细胞获自与器官或组织来源的物种不同的物种。
干细胞或祖细胞培养基可包含多种组分，所述组分包括，例如，KODMEM培养基(Knockout Dulbecco′s改良Eagle′s培养基)、DMEM、Ham′s F12培养基、FBS(胎牛血清)、FGF2(成纤维细胞生长因子2)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子)。这些细胞分化培养基亦可包含诸如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/链霉素)、N2、B27和β-巯基乙醇等补充物。设想可向上述细胞分化培养基中添加额外的因子，包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、肝素、硫酸肝素、视黄酸、表皮生长因子家族(EGF)的成员、成纤维细胞生长因子家族(FGF)的成员(包括FGF2、FGF7、FGF8和/或FGF10)、血小板来源的生长因子家族(PDGF)的成员、转化生长因子(TGF)/骨形态发生蛋白(BMP)/生长和分化因子(GDF)因子家族拮抗剂(包括但不限于头蛋白、卵泡抑素、腱蛋白、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高剂量激活素和无羊膜蛋白或其变体或功能片段)。TGF/BMP/GDF拮抗剂亦可以TGF/BMP/GDF受体-Fc嵌合体的形式添加。可添加的其他因子包括可激活或灭活通过Notch受体家族的信号转导的分子，包括但不限于δ-样和锯齿状家族的蛋白以及Notch加工或切割的抑制剂，或其变体或功能片段。其他生长因子可包括胰岛素样生长因子家族(IGF)的成员、胰岛素、无翅基因相关的(WNT)因子家族以及刺猬因子家族或其变体或功能片段。可添加额外的因子以促进中内胚层干细胞/祖细胞、内胚层干细胞/祖细胞、中胚层干细胞/祖细胞或者定形内胚层干细胞/祖细胞增殖和生存以及这些祖细胞的衍生物的生存和分化。
在一个实施方案中，将膨胀的去细胞化基质与使用拟胚体(EB)法分化的iPS或ES细胞组合。例如，使用通过转录因子(OCT4、SOX2、NANOG和LIN28；Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc；或Oct3/4、Sox2和Klf4)的转导(例如慢病毒介导的转导)重组的人iPS细胞系。可使用胎儿来源或新生儿来源的iPS克隆。亦可使用人ES细胞系。iPS细胞和ES细胞可在含有补充以20％KnockOut血清代用品(Invitrogen)、0.1mmol/L非必需氨基酸、1mmol/L L-谷氨酰胺和0.1mmol/Lβ-巯基乙醇(Sigma)的DMEM/F12培养基的6-孔培养板(Nunc)中，以19,500个细胞/cm2的密度维持在的辐照小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。此外，培养基可补充以100ng/mL斑马鱼碱性成纤维细胞生长因子以用于iPS细胞，以及补充以4ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)以用于hES细胞。亦可将iPS和ES细胞系维持在含15％胎牛血清(FCS；Sigma-Aldrich)、0.1μmol/L 2-巯基乙醇(2ME)和1,000个单位/ml LIF(ChemiconInternational)的DMEM(Sigma-Aldrich)的凝胶化100-mm培养皿上。对于分化，可用0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(GIBCO)处理这些细胞，并以3×104个细胞/孔的浓度将其转移到含有补充以10％FSC和0.05μmol/L 2ME的α-最小必需培养基(GIBCO)的凝胶化6-孔板。
通过在37℃与1mg/mL分散酶(Gibco)溶液一起孵育8-15分钟来使群落脱离培养板，并将其置于超低附着培养板中悬浮培养例如达4天。在悬浮培养期间，可在第1天更换培养基，接着在不更换培养基的情况下再培养3天。然后以例如50-100个EB/孔的密度将EB置于0.1％明胶覆盖的培养板上，或者置于灌注法去细胞化的ECM中并用分化培养基培养(例如每天更换)。
在一些情况下，要将通过本文所述的方法生成的器官或组织移植到患者中。在所述情况下，用于将去细胞化的器官或组织再细胞化的细胞可获自患者，由此所述细胞对于所述患者而言为“自体的”。来自患者的细胞可使用本领域已知的方法获自例如处于生命的不同阶段(例如出生前、新生或围产期、青春期或者作为成体)的血液、骨髓、组织或器官。或者，用于将去细胞化的器官或组织再细胞化的细胞对于患者而言可以是同系的(即来自同卵双生)，细胞可以是来自例如患者的亲属或者与患者无亲缘关系的HLA匹配个体的人淋巴细胞抗原(HLA)-匹配细胞，或者细胞对于患者而言可以是同种异体的，其来自例如非-HLA-匹配的供者。
不考虑细胞来源(例如是否自体的)的情况下，去细胞化实体器官对于患者而言可以是自体的、同种异体的或异种的。
可在再细胞化期间监测细胞的进展。例如，可通过在再细胞化期间的一个或多个时间点获取活检来评价器官或组织之上或之中的细胞数量。此外，可通过确定各种标志物是否存在于细胞或细胞群体中来监测细胞经历的分化程度。与不同的细胞类型以及那些细胞类型的不同分化阶段相关的标志物在本领域中为已知的，且可使用抗体和标准免疫测定法容易地检测。参见例如Current Protocols in Immunology(免疫学中的现行方案)，2005，Coligan等编辑，John Wiley&Sons，第3章和第11章。核酸测定法以及形态学和/或组织学评价可用于监测再细胞化。
内皮祖细胞(EPC)为不成熟的内皮细胞，其具有增殖、迁移和分化成内皮细胞的能力，但尚未获得成熟内皮细胞的特征。在响应某些生理刺激(例如组织损伤)的情况下，EPC可从骨髓移动到外周血中(循环EPC)。在成人血液中鉴定了循环EPC(Asahara等，(1997)Science 275：964-967)且后续研究表明EPC在维持内皮完整性和功能性以及在出生后新血管形成中的作用。EPC可分离自血液、骨髓或脐带血且在成人外周单核细胞的CD34+细胞流分中得到鉴定。其可使用单独的CD34+细胞或CD133+细胞或者与KDR+组合作为外周血中富含EPC的细胞流分，经由直接FACS分选或其他可用的离体选择方法，例如磁珠、微流体、芯片实验室、亲和柱或相关装置来进行分离。然后可将EPC直接灌注到基质上并在适当条件下培养以辅助增殖和分化，或者在EPC维持培养基中体外培养以增加总细胞数，例如在初始扩张期间用无血清培养基(StemCell Technologies，温哥华，加拿大)培养七天并补充以1％青霉素-链霉素(Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国)和重组人(rh)Flt-3配体(100ng/mL)、rh干细胞因子(100ng/mL)、rh IL-3(20ng/mL)、rh IL-6(20ng/mL)。然后将这些细胞作为EPC灌注到基质中或预先分化成EC再灌注到基质中。EPC的分化可通过这样的方法实现，例如在含FBS(2％)、皮质醇、hFGF、VEGF、R3-IGF-1、抗坏血酸、hEGF、庆大霉素、两性霉素B和肝素(Lonza，巴塞尔，瑞士)的内皮细胞生长培养基-2(EGM-2)中培养约3×105至约1×106个细胞/1.5mL/9.6cm2。培养三天之后，可采集所述细胞并以约1×106个细胞/1.5mL/9.6cm2的密度转移至覆盖有纤连蛋白(10μg/ml)(Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国)的培养板，并用新鲜EGM-2培养基再培养三天。
一群同种异体的内皮细胞或内皮细胞前体可被使用，并可从与所述受者的组织而言为同种异体的组织制备，上述内皮细胞或内皮细胞前体可通过众所周知的组织分型方法测试其用途，以紧密匹配所述受者的组织相容性类型。这些细胞包括但不限于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、为减小免疫原性而遗传修饰的内皮细胞、HLA匹配的内皮细胞、脐带血来源的内皮细胞、来源于EPC、祖细胞、iPS或胚胎干细胞的EC。大部分同种异体方案需要在移植之后使用免疫抑制剂。近期研究已证实来源于EPC的EC的免疫赦免性质(CardiovascRes.2010年10月1日；88(1)：121-9.Epub 2010年4月13日)，其中在移植之后将不需要免疫抑制。EPC分化方法的实例包括：从血液中通过使用Pancoll大鼠(PAN-Biotech)的密度梯度离心法分离EPC，并使用CD45单克隆抗体进行CD45-清除。CD45(-)流分在20mg/mL纤连蛋白覆盖的培养皿中，用内皮分化培养基[补充以5％FCS、50mg/mL庆大霉素、10ng/mL大鼠VEGF、1ng/mL牛bFGF、10ng/mL鼠IGF-1(二者均来自R&D Systems)、10ng/mL鼠EGF和1mg/mL皮质醇的EBM]进行培养。通过每4天更换培养基来去除未附着的细胞。过度生长的细胞簇在培养约15至约22天之后出现，并通过在克隆环内进行胰蛋白酶消化来挑取。PECAM-1(+)细胞可使用PECAM-1抗体和IgG1微珠通过MACS分离来选择。该PECAM-1(+)流分可进一步培养至25代并可被灌注于多种基质中。
此外，除采用免疫抑制技术外，作为另一个可选方案，由Smithies等，317 Nature230-234(1985)教导的使用干细胞中的同源重组进行基因替代或敲除的方法，，以及扩展至在细胞系中进行基因替代或敲除(Zheng等，88Proc.Natl.Acad.Sci.8067-8071(1991))的方法，可应用于内皮及内皮衍生细胞以去除主要组织相容性复合物(MHC)基因。缺乏MHC表达的细胞允许跨越同种异体以及或许甚至异种的组织相容性障碍来移植富集的内皮细胞群，而无需对受者进行免疫抑制。关于使用重组方法来减小供体细胞抗原性的一般性综述和引文，亦由Gruber，54Transplantation 1-11(1992)公开。通过表面修饰来减小移植物的免疫原性的示例性方法由PCT国际专利申请WO 92/04033和PCT/US99/24630公开。可选地可通过从MHC抗原已被改变或被删除的转基因动物中制备细胞来减小移植物的免疫原性。
内皮细胞前体包括但不限于群落形成单位-内皮细胞(CFU-EC)、循环血管发生细胞(CAC)、循环内皮前体细胞(CEP)、内皮群落形成细胞(ECFC)、低增殖潜能ECFC(LPP-ECFC)和高增殖性ECFC(HPP-ECFC)。
在一个实施方案中，通过在适当条件下培养胚胎干细胞(ESC)或诱导超多能干细胞(iPSC)以将干细胞导向内皮细胞系来获得内皮细胞和内皮祖细胞。内皮祖细胞为这样的细胞，其已开始分化成内皮细胞(例如，如受谱系限制的；如必定要成为内皮细胞的细胞)但不被认为是完全分化的内皮细胞。例如，内皮祖细胞可表达诸如CD133等祖细胞标志物，亦可表达内皮细胞标志物，例如但不限于血小板内皮细胞-黏附分子-1(PECAM1；又称CD31)、VEGFR-1(又称Flt-1)、VEGFR-2(又称Flk-1)、鸟苷酸结合蛋白-1(GBP-1)、血栓调节蛋白(又称CD141)、VE-钙黏着蛋白(又称CD144)、血管假性血友病因子(vWF)和细胞间黏附分子2(ICAM-2)。通常，内皮祖细胞亦能够摄入乙酰化LDL，并可进一步朝VEGF迁移和/或在基质胶上形成小管。
ESC或iPSC，例如人ESC和人iPSC，可在能最终得到完全分化的内皮细胞(例如VEGF和bFGF)的条件下进行进一步培养。另外或可选地，内皮细胞可获自任何数量的来源，例如骨髓、血液、皮肤、肝、心、肺、视网膜以及包含内皮细胞的任何其他组织或器官。例如，代表性内皮细胞包括但不限于血内皮细胞、骨髓内皮细胞、循环内皮细胞、人主动脉内皮细胞、人脑微血管内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞、人肠微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞、人微血管内皮细胞、肝窦内皮细胞、人隐静脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、淋巴内皮细胞、微血管内皮细胞(microvessel endothelial cell)、微脉管内皮细胞(microvascularendothelial cell)、肺动脉内皮细胞、视网膜毛细管内皮细胞、视网膜微脉管内皮细胞、血管内皮细胞、脐带血内皮细胞及其组合。如本领域技术人员将理解的，不意图其为内皮细胞的详尽无遗的列表。
可通过密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)来从外周血中获得EPC。将细胞悬液接种到能够维持细胞的任何容器中，具体而言，培养瓶、培养皿或滚瓶，以及更具体而言，诸如25cm2培养瓶等小型培养瓶。可以约5×104至约2×105个细胞/mL(例如约1×105个细胞/mL)将悬浮培养的细胞重悬浮。接种到固定基底上的细胞，可以约2至约3×103个细胞/cm2接种。可选的是，用诸如胶原等基质蛋白覆盖所述培养皿。可将细胞置于能够支持细胞生长的任何已知培养基中，包括HEM、DMEM、RPMI、F-12等等，其含有细胞代谢所需的补充物，例如谷氨酰胺及其他氨基酸、维生素、矿物质和蛋白质，如转铁蛋白等。上述培养基亦可含有抗生素以防止受酵母、细菌和真菌污染，例如青霉素、链霉素、庆大霉素等。上述培养基可含有来源于牛、马、鸡等的血清。用于培养的条件一般应接近生理条件。上述培养基的pH应接近生理pH(例如介于pH 6-8之间、介于约pH 7-7.8之间或者为pH 7.4)。生理温度范围介于约30℃至40℃之间。可在介于约32℃至约38℃之间的温度培养EPC(例如，介于约35℃至约37℃)。
可选的是，用至少一种增殖诱导(“促有丝分裂的”)生长因子补充上述培养基。“生长因子”为对EPC具有生长、增殖诱导、分化诱导或营养作用的蛋白质、肽或其他分子。“增殖诱导生长因子”为允许EPC增殖的营养因子，包括与细胞表面上的受体结合以发挥对细胞的营养或生长诱导作用的任何分子。增殖诱导生长因子包括EGF、双调蛋白、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、转化生长因子α(TGFα)、VEGF及其组合。通常以范围介于约1fg/mL至1mg/mL之间的浓度向培养基中添加生长因子。介于约1-100ng/mL的浓度通常已足够。可容易地进行简单滴定试验来确定特定生长因子的最佳浓度。生长因子和营养因子的生物效应一般通过与细胞表面受体结合来介导。已鉴定出用于许多上述因子的受体，且用于特异性受体的抗体和分子探针为可得的。可在所有分化阶段对EPC分析生长因子受体的存在。在许多情况下，特定受体的鉴定为通过添加外源生长因子或营养因子来使细胞沿特定发育途径进一步分化所采用的策略提供指导。
一般而言，在体外约3至10天之后，通过吸出培养基并向培养瓶中添加新鲜培养基来补充EPC的培养基。可选的是，吸出的培养基被收集、过滤并用作后续传代EPC的条件培养基。例如使用10％、20％、30％、40％或更多的条件培养基。可容易地将EPC细胞培养物传代以重新开始增殖。例如，在体外约3至约7天之后，充分振摇培养瓶，随后将EPC转移至50mL离心管并低速离心。吸出培养基，用少量培养基重悬浮所述EPC，然后对细胞计数并以所需密度重新接种以重新开始增殖。可每周重复该程序以得到在各代的活细胞数量上的对数增加。继续上述程序直到获得所需数量的EPC。
在被需要之前，可通过本领域已知的任何方法将EPC和EPC后代冻存。(参见例如美国专利号5,071,741、PCT国际专利申请WO93/14191、WO95/07611、WO96/27287、WO96/29862和WO98/14058、Karlsson等，65 Biophysical J.2524-2536(1993))。可用含特定冻存剂(cryopreservant)的等渗溶液(优选细胞培养基)使所述EPC悬浮。冻存剂包括二甲亚砜(DMSO)、甘油等。这些冻存剂可以5-15％的浓度使用(例如8-10％)。将细胞逐步冷冻至-10℃至-150℃的温度(例如，-20℃至-100℃，或者-70℃至-80℃)。
根据培养条件，EPC可分化成内皮细胞或平滑肌细胞。在含分化诱导生长因子的培养基中，EPC可在固定基底上分化成内皮细胞或平滑肌细胞。EPC的分化亦可通过本领域已知的任何方法诱导，所述方法激活导致生长的生物事件级联反应，其包括释放肌醇三磷酸和胞内Ca2+、释放二酰基甘油以及激活蛋白激酶C和其他细胞激酶，等等。使用佛波酯、分化诱导生长因子和其他化学信号处理可诱导分化。可向培养基中添加分化诱导生长因子替换用于EPC增殖的增殖诱导生长因子(见上文)以影响所述EPC的分化。其他分化诱导生长因子包括血小板来源的生长因子(PDGF)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-1)等。
可使用本领域已知的免疫细胞化学技术检测分化的内皮细胞或平滑肌细胞。免疫细胞化学(例如双重标记免疫荧光法和免疫过氧化物酶法)使用检测细胞蛋白的抗体以区分内皮细胞或平滑肌细胞的细胞特征或表型特性。用于内皮细胞的细胞标志物包括例如VE-钙黏着蛋白、CD144、CD141、CD106或CD142，而用于平滑肌细胞的细胞标志物包括Flk。通过检测诸如CD31和e-NOS等内皮细胞基因的表达，免疫细胞化学亦可用于鉴定内皮细胞。
使用对所述内皮基因mRNA特异的cDNA或RNA探针，亦可进行原位杂交组织化学。可将这些技术与免疫细胞化学法组合以增强特异性表型的鉴定。需要时，可将上述抗体和分子探针分别应用于DNA印迹和RNA印迹步骤以辅助细胞鉴定。
内皮细胞可获自例如世界各地的众多生物材料保藏所之一。参见例如美国典型培养物保藏中心(万维网ATCC.org)或加拿大国际保藏局(IDAC；万维网nml-lnm.gc.ca)。内皮细胞或内皮祖细胞亦可获自将成为移植组织或器官基质受者的个体。这些细胞被认为对于所述受者而言为自体的。另外，在某些情况下，组织或器官基质和内皮细胞或内皮祖细胞之间的关系可以是同种异体的(即来自相同物种的不同个体)；在其他情况下，组织或器官基质和内皮细胞或内皮祖细胞之间的关系可以是异种的(即来自不同物种的个体)。在某些情况下，组织或器官基质对于受者而言为异种的，而内皮细胞或内皮祖细胞对于受者而言为同种异体的。
通常在生理条件下(例如37℃)，用与细胞相容的溶液(例如用生理组合物)将包含内皮细胞或内皮祖细胞的组合物递送给组织或器官基质。如在本文中所提及的生理组合物，可包括但不限于缓冲液、营养物(例如糖、碳水化合物)、酶、扩增和/或分化培养基、细胞因子、抗体、阻抑物、生长因子、盐溶液或血清来源的蛋白质。如在本文中所用的“基本上由内皮细胞或内皮祖细胞组成的”组合物为这样的组合物，其基本上不含除内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞，但仍可包含可能存在于生理组合物中的任何组分(例如缓冲液、营养物等)。
为了优化再内皮化，一般通过灌注将内皮细胞或内皮祖细胞引入器官或组织基质中。正如细胞前灌注，以及如在WO 2007/025233中所述，经由器官或组织基质的脉管系统或脉管系统型结构(例如其他管腔或管道)进行灌注。使器官或组织基质再内皮化的灌注应处于足以使细胞的生理组合物通过所述脉管系统和脉管系统型结构循环的流速；然而，使组织或器官基质再内皮化的灌注通常在较小压力至无压力下进行(例如小于用于细胞前灌注步骤以扩张和冲洗所述血管床的压力)。使用内皮细胞或内皮祖细胞的灌注可以是多方向的(例如顺行的和逆行的)，以进一步优化再内皮化。
引入组织或器官基质中用于再内皮化的内皮细胞或内皮祖细胞的数量取决于器官或组织(例如何种器官或组织、器官或组织的大小和重量、器官或组织的发育阶段和/或器官或组织的血管化程度)以及内皮细胞、内皮来源的细胞、不成熟的内皮细胞或内皮祖细胞的类型和发育阶段二者。此外，可将多于一种类型的内皮细胞或内皮祖细胞(例如内皮细胞或内皮祖细胞的混合物)灌注到器官或组织基质中。就细胞将达到的群体密度而言，不同类型的内皮细胞或内皮祖细胞可具有不同的趋势，且类似地，不同的器官或组织基质可以不同的密度再内皮化。仅作为示例，可将至少约100个(例如至少约103、104、105、106、107、109或1010个)内皮细胞或内皮祖细胞引入器官或组织基质中。
在植入之前，基质或移植物应包含大部分成熟的内皮细胞，该成熟的内皮细胞通过内皮细胞的细胞标志物的表达来确定，所述标志物包括例如VE-钙黏着蛋白、CD144、CD141、CD106或CD142。通过检测诸如CD31和e-NOS等内皮细胞基因的表达，免疫细胞化学亦可用于鉴定内皮细胞。内皮分离的非破坏性方法将为胰蛋白酶(0.25％或更少)的短暂灌注或者其他细胞脱离法，以能够从内皮细胞移除一小部分＜0.01％，随后对其测定内皮细胞标志物的表达，包括但不限于CD105、CD31以及e-NOS的功能表达。此外，可通过在基质胶试验中的内皮小管形成来评价内皮细胞的功能。简单地说，用50μL冰冷的MatrigelTM覆盖96孔板的孔，接着于37℃孵育一小时。之后，向所述MatrigelTM中添加含约25,000至约50,000个内皮细胞的100μL EGM-2培养基。于37℃、5％CO2的潮湿气氛下进行孵育达16小时。使用倒置显微镜评价小管形成，以四倍放大倍数获取各单孔的数字显微照片，并且可对各孔计算管的总数、分支点、管长度以及管长总和，其为内皮管定义的功能内皮细胞的存在。
此外，能够通过使用标准血液相容性测试和试验来完成再内皮化的测定，包括但不限于血小板激活、氧化爆发(oxidative burst)、溶血、纤维蛋白溶解、纤维蛋白形成、凝血酶生成、接触激活和补体激活。非破坏性方法包括使用诸如CellTiter Blue等增殖测定法或其他代谢测定法以确定存在于基质中的内皮细胞的密度，可将其外推成原生组织的已知值，其中目标为具有＞50％的原生组织的内皮细胞密度。
可通过使用标准血液相容性测试和试验来进行再内皮化的测定，包括但不限于血小板激活、氧化爆发、溶血、纤维蛋白溶解、纤维蛋白形成、凝血酶生成、接触激活和补体激活。非破坏性方法包括使用诸如CellTiter Blue等增殖测定法或其他代谢测定法以确定存在于所述基质中的内皮细胞的密度，可将其外推成原生组织的已知值，其中目标为具有＞50％的原生组织的内皮细胞密度。
用于引入内皮细胞的灌注压一般对应于基质或支架来源于其的组织或器官的原生灌注压，其在+/-300％的范围内，因为脉管系统能够维持压力＞300mm Hg。
可将如在本文中所述的再内皮化组织或器官基质移植到受者中。该再内皮化组织或器官基质表现出非常少的血栓形成和非常小的免疫原性。一经移植，这种再内皮化组织或器官基质便可在体内进一步再细胞化。移植之后，这种再内皮化组织或器官基质可在体内再细胞化(即具有来自受者的原生细胞)。体内再细胞化可包括进一步再内皮化和/或用除内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞再细胞化(例如，组织或器官特异性细胞，如肝细胞、胆管上皮细胞、干细胞、祖细胞、iPS细胞、骨髓单核细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、心肌成纤维细胞、成纤维细胞、肝巨噬细胞(kuffner cell)、骨骼肌细胞、卫星细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、肾近端小管刷状缘细胞、细尿管袢薄段细胞、肾远端小管细胞、肾集合管细胞、I型肺细胞(内衬肺细胞的气室)、胰管细胞(泡心细胞)、β细胞、胰岛细胞、细胞、闰细胞、肠刷状缘细胞(具有微绒毛)、外分泌腺分泌管细胞、胆囊上皮细胞、附睾主细胞、间质肾细胞和/或附睾基底细胞)。
可选的是，可在组织或器官基质再内皮化之前或者在组织或器官基质再内皮化之后，用除内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞在体外将组织或器官基质再细胞化。如在本文中所用的“除内皮细胞、内皮来源的细胞或内皮祖细胞之外的”细胞，是指居于特定组织或器官的所有其他类型的细胞。在本文所述的方法中，干细胞或祖细胞(例如胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞或诱导多能干细胞(iPS))可用于使组织或器官的实质再细胞化，或者组织或器官特异性细胞(即分化或部分分化的细胞)可用于使组织或器官的实质再细胞化。使用组织或器官特异性细胞，所递送的细胞的特定类型通常取决于最终产生的组织或器官的类型。例如，当使心脏再细胞化时，可将心肌细胞、平滑肌细胞、心肌成纤维细胞和/或心脏干细胞引入组织或器官基质之中或之上；当使肝再细胞化时，可将肝细胞、胆管细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和/或肝细胞祖细胞引入组织或器官基质之中或之上；当使肾再细胞化时，可将足细胞、肾小球细胞和/或上皮细胞引入组织或器官基质之中或之上；当使肺再细胞化时，可将上皮细胞、克拉拉细胞、杯状细胞、I型肺泡和/或II型肺泡细胞引入组织或器官基质之中或之上；当使胰再细胞化时，可将β-细胞和/或胰岛细胞引入组织或器官基质之中或之上。
正如内皮细胞或内皮祖细胞一样，除所述内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞可在生理组合物(例如含缓冲液、营养物、酶、生长或分化培养基)中被递送至组织或器官基质，且可使用任何数量的途径递送或引入(例如，注射(如在多个位置)、灌注、输注和/或局部施用)。
在于组织或器官基质的再内皮化之后引入除所述内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞的实施方案中，在递送任何其他细胞之前使所述内皮细胞或内皮祖细胞有一定时间黏附并定殖于组织或器官基质的脉管系统之内可能是有利的。使内皮细胞或内皮祖细胞黏附于组织或器官基质的足够时间为例如30-180分钟。而内皮细胞或内皮祖细胞可黏附并定殖于组织或器官基质长达例如28-30天(例如约1个月)。
用于将器官或组织去细胞化和/或再细胞化的受控系统
用于将器官或组织去细胞化和/或再细胞化的系统(例如生物反应器)一般包括至少一个对器官或组织进行插管的插管装置、用于通过插管灌注器官或组织的灌注装置、以及为器官或组织维持无菌环境的工具(例如密封系统)。插管和灌注为本领域众所周知的技术。插管装置一般包括用于引入器官或组织的血管、导管和/或腔的适当大小的空心管道。通常，在器官中将一个或多个血管、导管和/或腔插管。灌注装置可包括用于液体(例如细胞裂解培养基)的容纳容器和用于经由一个或多个插管通过器官移动液体的机械装置(例如泵、气压、重力)。可使用本领域已知的各种技术维持器官或组织在去细胞化和/或再细胞化期间的无菌，例如控制和过滤空气流和/或使用例如抗生素、抗真菌剂或其他抗微生物剂灌注以防止不必要的微生物的生长。
如在本文中所述的将器官或组织去细胞化和再细胞化的系统，可具有监测特定灌注特征(例如压力、体积、流型、温度、气体、pH)、机械力(例如室壁运动和应力)和电刺激(例如起搏)的能力。因为冠状动脉血管床随着去细胞化和再细胞化的进程变化(例如血管阻力、容积)，所以调节压力的灌注装置有利于避免大幅波动。可在流出物和在组织切片中评估灌注的有效性。可使用标准方法监测灌注体积、流型、温度、局部O2和CO2压力和pH。
传感器可用于监测系统(例如生物反应器)和/或器官或组织。超声测微法(sonomicromentry)、微量测压法和/或电导测定可用于获得相对于心肌室壁运动和性能的压力-体积或者前负荷可补充搏出功信息。例如，传感器可用于监测液体流过插管器官或组织的压力；系统中的环境温度和/或器官或组织的温度；液体流过插管器官或组织移动的pH和/或流速；和/或再细胞化器官或组织的生物活性。除具有用于监测上述特征的传感器之外，用于将器官或组织去细胞化和/或再细胞化的系统亦可包括用于维持或调节上述特征的工具。用于维持或调节上述特征的工具可包括这样的组件，例如温度计、恒温器、电极、压力传感器、溢流阀、用于改变液体流速的阀、用于打开和关闭与用于改变溶液pH的溶液的流体连接的阀、气囊、外起搏器和/或顺应室。为了帮助确保稳定的条件(例如温度)，小室、容器和管道可以是水套式的。
可通过与可编程处理器组合的计算机可读储存介质来控制用于生成器官或组织的系统(例如，如在本文中所用的计算机可读储存介质具有储存于其上的用于使可编程处理器执行特定步骤的指令)。例如，储存介质与可编程处理器组合，可接收并处理来自一个或多个传感器的信息。与可编程处理器联合的储存介质亦可将信息和指令传输回生物反应器和/或器官或组织。
可对正在经历再细胞化的器官或组织监测生物活性。所述生物活性可以是器官或组织本身的生物活性，例如对于心脏组织为器官或组织的电活性、机械活性、机械压力、收缩性和/或室壁应力。此外，可监测黏附于器官或组织的细胞的生物活性，例如监测离子运输/交换活性、细胞分裂和/或细胞存活力。参见例如Laboratory Textbook of Anatomyand Physiology(解剖学和生理学实验教材)(2001，Wood，Prentice Hall)和CurrentProtocols in Cell Biology(细胞生物学中的现行方案)(2001，Bonifacino等编辑，JohnWiley&Sons)。如上所述，其可用于模拟再细胞化期间在器官上的有效负荷。本发明的计算机可读储存介质，与可编程处理器组合，可用于协调监测和维持器官或组织上的有效负荷所需的组件。
在一个实施方案中，可将器官或组织的重量输入如在本文中所述的计算机可读储存介质中，其与可编程处理器组合，可计算用于特定器官或组织的暴露时间和灌注压。所述储存介质可记录前负荷和后负荷(分别为灌注前后的压力)以及流速。在此实施方案中，例如，与可编程处理器组合的计算机可读储存介质，可经由一个或多个泵和/或阀控制来调节灌注压、灌注方向和/或灌注溶液的类型。
所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中。尽管在前述说明书中，本发明由其特定的优选实施方案来阐述，且用于阐述的目的陈述了许多细节，但对本领域技术人员而言显而易见的是，本发明易具有另外的实施方案，且在不背离本发明的基本原则的情况下，本文中的某些细节可进行相当大的改变。

Claims (20)

1.一种哺乳动物器官或其血管化部分、或者血管化的哺乳动物组织或其血管化部分的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述去细胞化胞外基质包含血管树、导管或腔，且填充并保留了气体，其中所述器官的所述去细胞化胞外基质包含外表面，且其中包含血管树的所述胞外基质保留所述胞外基质在去细胞化之前的形态。
2.权利要求1的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述哺乳动物器官为心、肾、肝、脾、胰、膀胱、骨骼肌、小肠、大肠、胃、骨、脑或肺。
3.权利要求1的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述血管化部分为哺乳动物心、肾、肝、脾、胰、膀胱、骨骼肌、小肠、大肠、胃、骨、脑或肺的部分。
4.权利要求1-3中任一项的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述气体包括空气、氧气或氮气。
5.权利要求1的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述气体为蒸气。
6.权利要求1-5中任一项的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述气体包含药物或雾化药物。
7.权利要求1-5中任一项的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述气体包含一种或多种蛋白质。
8.权利要求7的膨胀的去细胞化胞外基质，其中所述一种或多种蛋白质包括细胞因子或生长因子。
9.权利要求1的膨胀的去细胞化胞外基质，其中去细胞化器官或血管化组织为猪、牛、羊、犬或人器官或组织。
10.一种使哺乳动物器官或其血管化部分、或者哺乳动物血管化组织或其血管化部分膨胀的离体方法，其包括：
提供哺乳动物器官或其血管部分或者血管化哺乳动物组织或其血管化部分的去细胞化胞外基质，其中所述器官的所述胞外基质包含完整的外表面，其中所述器官或其部分或者组织或其部分的所述胞外基质包含血管树，其中所述器官的所述去细胞化胞外基质保留引入所述去细胞化胞外基质血管树的大部分流体或气体，且其中所述器官或组织具有基本上封闭的血管床；
在一个或多个血管、腔和/或导管对所述器官或其部分或者所述组织或其部分进行插管，从而产生插管的器官或其部分或者插管的组织或其部分；和
将气体引入所述插管的器官或其部分或者插管的组织或其部分的所述一个或多个血管、腔或导管中，由此提供膨胀的胞外基质。
11.权利要求10的方法，其中所述气体包括空气、氮气或氧气。
12.权利要求10或11的方法，其中所述气体包含VEGF、FGF-2、EGF、PDGF、IGF或HGF中的一种或多种、或其任意组合。
13.权利要求10-12中任一项的方法，其中所述哺乳动物为人、非人灵长类动物、牛、猪、犬、猫科动物、山羊、绵羊或啮齿类动物。
14.权利要求10-13中任一项的方法，其进一步包括将所述膨胀的去细胞化胞外基质进行灭菌。
15.权利要求10-14中任一项的方法，其进一步包括将细胞引入所述血管、导管或腔的至少一个。
16.权利要求10-15中任一项的方法，其中所述哺乳动物器官为心、肾、肝、脾、胰、膀胱、骨骼肌、小肠、大肠、胃、骨、脑或肺。
17.一种填补哺乳动物体腔中的空隙或治疗其中伤口的方法，其包括将权利要求1-9中任一项的胞外基质或其部分给予所述空隙或伤口。
18.权利要求17的方法，其中被给予的所述部分为颗粒状的或粉碎的的。
19.权利要求17或18的方法，其中给予的所述胞外基质为冷冻干燥的。
20.权利要求17的方法，其中所述给予为给予瘘。
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