CN103458935B - 使组织或器官再细胞化以提高其可移植性的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述使器官或组织基质再细胞化的方法。

Description

使组织或器官再细胞化以提高其可移植性的方法
相关申请
本申请要求2010年9月1日提交的美国临时申请序列号61/379,073的优先权，所述申请通过引用纳入本文。
联邦政府资助的研究或开发
本发明在国立卫生研究院授予的批准号HL063346和HL100407-01下由政府支持完成。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本公开一般涉及使脱细胞组织或器官再细胞化的方法。
背景
当血管受伤或细胞外基质暴露时，血小板和纤维蛋白形成血块来防止失血。血栓症是血管内的血块形成，也称作血栓。所述血管可以是静脉、动脉或毛细血管。血栓通常以不同程度堵塞通过循环系统的血液流通。在体内，抗血栓形成剂和/或抗凝剂用于减轻凝固反应，但是未证明用于减轻或消除脱细胞器官、组织或支架移植中观察到的血栓症。
概要
一方面，提供了使组织或器官基质再细胞化的方法。所述方法一般包括灌注组织或器官基质，例如，使用生理缓冲液在压力下灌注脱细胞组织或器官基质；通过使用包含内皮细胞或内皮祖细胞群的生理组合物灌注所述组织或器官基质，使所述组织或器官基质再内皮化。可以使用本领域已知的免疫细胞化学技术检测已分化内皮细胞或平滑肌细胞的典型细胞群，所述免疫细胞化学技术包括例如免疫荧光双重标记和免疫过氧化物酶法，所述方法使用检测细胞蛋白的抗体来识别所述内皮细胞或平滑肌细胞的细胞特征或表型特性。用于内皮细胞的细胞标记物包括例如VE-钙粘蛋白、CD144、CD141、CD106或CD142，而用于平滑肌细胞的细胞标记物包括Flk。还可以利用免疫细胞化学通过检测内皮细胞基因(例如CD31和e-NOS)的表达来鉴别内皮细胞。成熟的内皮细胞群应相对不含造血细胞如CD45+细胞群。还可以利用内皮细胞基因mRNA特异性cDNA或RNA探针进行原位杂交组织化学研究。这些技术可以结合免疫细胞化学方法来提高对特异性表型的鉴别。可将上文所述的抗体和分子探针分别应用到Western印迹和Northern印迹中以协助细胞鉴定。在一个实施方式中，基本纯得细胞群有至少50％、60％、70％或更多，如80％、85％、90％、95％、99％或100％的内皮细胞或内皮祖细胞。灌注法去细胞化是使哺乳动物器官、部分器官或血管化组织脱细胞的离体方法，其中将去细胞溶液灌注通过器官、部分器官或血管化组织以在保持所述血管的同时协助去细胞。所得的去细胞器官、基质、组织支架或移植物保留脉管系统，所述脉管系统包括动脉供给、存在毛细血管床的间质空间和静脉输出，使得流体或细胞能通过一个或多个入口点(例如一条或多条血管)被引入，并通过不同途径离开所述器官、基质、组织或移植物。完整器官的主要动脉输入将有着流体完全静脉回流。器官或组织的隔离部分将具有静脉回流和通过已暴露间质基质离开的流体的组合，所述已暴露间质基质中组织或部分器官被切除。存在时，所述器官囊保持完整，例如，不促进水性流体穿过所述囊移动，这与接受浸没去细胞化的器官相反。
代表性的内皮细胞包括但不限于：血液内皮细胞、骨髓内皮细胞、循环内皮细胞、人主动脉内皮细胞、人脑微血管内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞、人肠微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞、人微血管内皮细胞、肝窦状腺内皮细胞、人隐静脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、淋巴内皮细胞、微脉管内皮细胞、微血管内皮细胞、肺动脉内皮细胞、视网膜毛细管内皮细胞、视网膜微血管内皮细胞、血管内皮细胞、脐带血内皮细胞、肝血窦内皮细胞、内皮细胞集落形成单位(CFU-EC)、循环血管生成细胞(CAC)、循环内皮前体细胞(CEP)、内皮集落形成细胞(ECFC)、低增殖潜能ECFC(LPP-ECFC)、高增殖ECFC(HPP-ECFC)或其组合。在一些实施方式中，所述内皮细胞或内皮祖细胞衍生自胚胎干细胞(ESC)、成人干细胞、祖细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在某些实施方式中，所述组织或器官基质是生物组织或器官基质。在某些实施方式中，所述生物组织或器官基质来源自选自心、肾、肝、肺、胰腺、肠、肌肉、皮肤、胸部、食道、气管或网膜的器官。在某些实施方式中，所述生物组织或器官基质是灌注-去细胞组织或器官基质。
在某些情况中，所述生物组织或器官基质以及所述内皮细胞或内皮前体细胞是异种异体的。在某些情况中，所述生物组织或器官基质以及内皮细胞或内皮前体细胞是同种异体的。
在一些实施方式中，所述方法还包括在再内皮化步骤之前将内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。在一些实施方式中，所述方法还包括将除内皮细胞、内皮衍生、未成熟内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。
另一方面，提供了降低移植入受体后再细胞化组织或器官内的血栓形成和免疫原性的方法。所述方法通常包括：用生理缓冲液在压力下灌注组织或器官基质；通过使用包含内皮细胞或内皮祖细胞群的生理组合物灌注所述组织或器官基质，使所述组织或器官基质再内皮化；和移植所述再内皮化的组织或器官基质到所述受体中。可以通过标准血液相容性测试和分析来评估再内皮化组织或器官内的血栓性，所述标准血液相容性测试和分析包括但不限于，血小板激活、氧化迸发、溶血、纤维蛋白溶解、纤维蛋白形成、凝血酶生成、接触激活、血栓调节蛋白分析和/或补体激活。在一个实施方式中，所述再内皮化组织或器官基质适于移植和移植后保持开放。
代表性的内皮细胞包括但不限于：血液内皮细胞、骨髓内皮细胞、循环内皮细胞、人主动脉内皮细胞、人脑微血管内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞、人肠微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞、人微血管内皮细胞、肝窦状腺内皮细胞、人隐静脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、淋巴内皮细胞、微脉管内皮细胞、微血管内皮细胞、肺动脉内皮细胞、视网膜毛细管内皮细胞、视网膜微血管内皮细胞、血管内皮细胞、脐带血内皮细胞、肝血窦内皮细胞、内皮细胞集落形成单位(CFU-EC)、循环血管生成细胞(CAC)、循环内皮前体细胞(CEP)、内皮集落形成细胞(ECFC)、低增殖潜能ECFC(LPP-ECFC)、高增殖ECFC(HPP-ECFC)或其组合。在一些实施方式中，所述内皮细胞或内皮祖细胞衍生自胚胎干细胞(ESC)、成人干细胞、祖细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在某些实施方式中，所述组织或器官基质是生物组织或器官基质。在某些实施方式中，所述生物组织或器官基质的来源自选自心、肾、肝、肺、胰腺、肠、肌肉、皮肤、胸部、食道、气管或网膜得器官。在某些实施方式中，所述生物组织或器官基质是灌注去细胞的组织或器官基质。
在一些实施方式中，所述生物组织或器官基质以及所述内皮细胞或内皮前体细胞是异种异体的。在一些实施方式中，所述生物组织或器官基质以及内皮细胞或内皮前体细胞是同种异体的。在一些实施方式中，所述生物组织或器官基质对于受体而言是异种异体的，其中，所述内皮细胞或内皮祖细胞对于受体而言是同种异体的。
在某些实施方式中，所述方法还包括在所述再内皮化步骤之前将内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。在某些实施方式中，所述方法还包括在所述再内皮化步骤之后将内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。在某些实施方式中，所述方法还包括在所述移植步骤之后将内皮细胞或内皮祖细胞之外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。可以通过例如灌注、直接注射、局部应用或其组合将所述生理组合物引入所述组织或器官基质，所述生理组合物包括除内皮细胞、内皮衍生或未成熟内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本方法及组合物所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管在所述方法和组合物的实施或测试中可以使用与本文所述相似或相同的方法和材料，将合适的方法和材料描述于下。此外，所述材料、方法和实施例仅用作说明性而非意在限定。所有本文提到的出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用全文纳入本文。
附图说明
图1，图A显示遍布再细胞化心脏结构的细胞的存在，其通过量化从基底到顶点分布的四个不同短轴位置处的DAPI阳性细胞核来评估(N＝3个心脏/方法)。以单剂量或双剂量递送大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)。就各个方法而言圆括号中指示递送细胞总数。细胞的单剂量递送涉及灌注RAEC进入第三分枝远端主动脉(主动脉)，或通过头臂动脉(BA)。在双剂量递送中，通过IVC递送一半细胞，然后通过BA(BA+IVC)递送一半。通过递送前DiI(红色)和DiO(绿色)标记细胞来观察遍布整个心脏基质的RAEC分布。图B和C中通过BA递送40,000,000个DiI标记的RAEC，而通过IVC递送20,000,000个DiO标记的细胞，然后图D和E中通过BA额外递送20,000,000个DiI标记的细胞。误差条是平均数标准误差，比例尺是5mm。*表示p>0.05。
图2的照片中通过IVC递送20,000,000个DiO(绿色)标记的RAEC，通过BA递送20,000,000个DiI(红色)标记的RAEC，且在接种去细胞化支架7天后可视化(图A-E)。在心室壁中(图A-C)和内皮表面上(图D-E)观察经标记RAEC细胞的不同分布。DAPI阳性细胞核显蓝色(图A-E)。图A-E中的比例尺是50微米。
图3，图A-D是显示去细胞化大鼠心脏ECM的组织学评估的照片，所述去细胞化大鼠心脏ECM通过BA补种RAEC(40,000,000个细胞，图A-B)或通过BA和IVC补种RAEC细胞(各注射20,000,000个，图C-D)。图A和C是苏木精和曙红染色的部分，而图B和D是伟郝夫范吉森(Verhoeff-vanGieson)染色的部分。定量血管直径并根据LV和RV壁的尺寸将其归类，所得数据显示在图E中(N＝3/数据组)。比例尺是250微米。误差条是一个标准离均差。*表示就给定血管直径而言所述递送方法间的的统计上显著差异(p<0.001)。
详细描述
再细胞化组织或器官基质的血栓症是据报道在组织或器官的移植和用血液再灌注之后发生的现象。此外，移植的组织或器官通常具有免疫原性，而受体常增强针对所移植组织或器官的免疫反应。本文描述使组织或器官基质再细胞化的方法，所述方法在所述组织或器官基质随后移植入宿主并用血液再灌注时引起血栓性降低。本文所述的再细胞化方法还引起组织和器官在被移植和用血液再灌注时显示有限的炎症。
本文所述的使组织或器官基质再细胞化的方法可采用生物组织或器官基质。代表性的生物组织和器官基质包括，例如，心、肝、肾、肺、胰、脾、子宫、膀胱、食道、气管、脊髓、关节(例如，膝、肩或髋)、皮肤、胸部、肌肉、肠、网膜和脂肪组织。生物基质还可以包括，例如已由细胞分泌或重建的胶原基质。如本文所述的生物基质再细胞化通常要求所述基质没有或至少基本上没有活细胞。
可以使用许多已知的方法使生物组织和器官去细胞化。例如，可以使用灌注方法使生物组织或器官去细胞化。参见例如，WO2007/025233和Ott等(2008,Nat.Med.,14:213-21)对基于灌注的去细胞化方法的描述。去细胞化灌注方法已显示就再细胞化产生极好基质。参见例如，WO2007/025233；Ott等(2008,Nat.Med.,14:213-21)；Uygun等，2010,Nat.Med.,16(7):814-20；Petersen等，2010,Science,6月电子出版以及Ott等，2010,Nat.Med.,7月电子出版。
作为基于灌注的去细胞化的替代选择，可以将生物组织或器官浸入移除细胞的去细胞液来使其去细胞化。参见例如，美国专利号6,376,244和6,753,181。此外，作为使用生物组织和器官基质的替代选择，本文所述的再细胞化方法可以使用合成组织或器官基质，前提是所述合成基质具有血管床型的结构。代表性的合成组织和器官基质包括例如，水凝胶、多聚物(例如，可生物降解的PLGA、PLA或耐用多聚物如聚亚安酯)、胶原支架、ECM基质支架(包括胶原纤连蛋白、层粘连蛋白)和其组合。
本文所述的使组织或器官基质再细胞化的方法包括用生理缓冲液在压力下灌注组织或器官基质。所述压力下的组织或器官基质灌注在引入任何细胞进入所述基质之前实行，并且与WO2007/025233所述去细胞化方法中使用的灌注相似，所述灌注是通过所述器官或组织基质的脉管系统或其它腔或管结构(例如，肺内的气管、肝内的导管、肾内的尿道等)，并且通常由器官或组织基质的脉管(例如，动脉、静脉、小动脉、小静脉和毛细血管)和/或其它腔和/或管(在下文中称为“脉管型”结构)的插管开始(约1-约300Hg)。套管插入术因而包括将套管插入身体导管、腔或血管，例如插入气管、膀胱或血管来引入或移出流体、物质或废物。本文所用的在压力下灌注器官或组织基质指在足够压力下递送流体组合物(例如，生理缓冲液)从而所述组织或器官基质的脉管和脉管型结构保持开放和扩张，但该压力又不会高到引起对所述组织或器官基质的脉管或脉管型结构的损坏或膨胀。适于在压力下灌注组织或器官基质的生理缓冲液可以是与所述组织或器官基质相容的任何缓冲液。例如，生理缓冲液可以包含营养物例如糖和碳水化合物，也可以包含促内皮因子(例如，对内皮细胞或内皮具有正效果的化合物)，例如，诱导血管再生的化合物(例如，VEGF、FGF-1和/或bFGF)。生理缓冲液通常处于生理pH。
在一个实施方式中，适于前细胞灌注或细胞灌注的生理缓冲液包括但不限于：磷酸盐缓冲液(PBS)或适于培养内皮细胞的培养基溶液(包括但不限于EGM-2、EGM-2MV、DMEM、PromoCell内皮细胞培养基、培养基200、DMEMF/12)、缓冲液以及营养补充物例如葡萄糖，所述溶液可以用于器官器官灌注和/或保存，包括移植。所述溶液包括例如对心组织而言，制备具有下列组成的改性克-汉二氏缓冲液(Krebs-Henseleitbuffer)以mM计)：118NaCl、4.7KCl、1.2MgSO4、1.2KH2PO4、25NaHCO3、11葡萄糖、1.75CaCl2和2.0内酮酸盐以及5U/L胰岛素，或者包含以下的克雷布斯缓冲液(Krebsbuffer)(以mM计)：118NaCl、4.7KCl、25NaHCO3、1.2MgSO4、1.2KH2PO4、2CaCl2，用95％O2、5％CO2充气；或者是葡萄糖(例如11mM)或葡萄糖与1或1.2mM棕榈酸盐的组合。对肾组织而言，示范性介质是KPS-1肾灌注液。对肝组织而言，示范性介质是克-汉二氏缓冲液(Krebs-Henseleitbuffer)，其包含118mMNaCl、4.7mMKCl、1.2mMMgSO4、1.2mMKH2PO4、26mMNaHCO3、8mM葡萄糖和1.25mMCaCl2，补充有2％BSA。
尽管不受任何特定机制限制，认为所述压力下的前细胞灌注打开并冲出所述基质，特别是所述组织或器官基质的血管床，从而在再内皮化过程中使更多基质接触所述细胞，并能在所述组织或器官基质的脉管系统中建立活性内皮。本领域技术人员将理解，不同的组织和器官基质(例如，来自不同来源如心、肝、肺、肾、胰等)能够经受不同量的压力。特定组织或器官基质能够承受的压力量与所述特定组织或器官基质的血管床相关或至少部分相关。
本文所述的使组织或器官基质再细胞化的方法包括用内皮细胞、内皮衍生、不成熟内皮细胞或内皮祖细胞使所述组织或器官基质再内皮化。内皮细胞的来源包括从自体收获物(例如，活检)获取的那些。自体内皮细胞可以通过动脉、静脉或特定组织活检从患者获得，并放入细胞培养用于所述细胞群的正常生长。实现内皮细胞的选择是在一定培养条件下，其中VEGF或bFGF抑制污染细胞群(包括平滑肌细胞)，或者通过直接FACS分选或其它可用的离体选择方法例如磁珠、微流体、芯片实验室(lab-on-a-chip)、亲和柱或就所述细胞群来选择纯内皮细胞群的联合装置，这是基于任何以下可接受的内皮细胞表面标志，包括但不限于CD31、VEGFR-1、VEGFR-2、CD105、CD144、TEM7、CD146和/或D2-40。
内皮祖细胞(EPC)是不成熟的内皮细胞，其具有增殖、迁移和分化成为内皮细胞的能力，但还未获得成熟内皮细胞的特点。可使EPC响应某些生理刺激如组织损伤从骨髓移动至周围血液(循环EPC)。循环EPC在成人血液中鉴定(Asahara等.(1997)Science275:964-967)，而后续研究表明EPC在维持内皮完整和功能以及在出生后血管新生方面的作用。EPC可以分离自血液、骨髓或脐带血，并在成人外周血单核细胞的CD34+细胞部分中鉴定。这些可以用单独CD34+细胞或CD133+细胞或联合KDR+分离为周围血液中EPC丰富的细胞部分，通过直接FACS分选或其它可用的离体选择方法例如磁珠、微流体、芯片实验室、亲和柱或联合装置。然后，可直接灌注EPC到所述基质上并在合适的条件下培养以帮助增殖和分化，或者体外培养以在EPC维持培养基中增加总细胞数，例如在初始扩增期中于无血清培养基(干细胞技术公司(StemCellTechnologies)，加拿大温哥华)内培养7天并补充1％青霉素-链霉素(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国圣路易斯)和重组人(rh)Flt-3配体(100ng/mL)、rh人干细胞因子(100ng/mL)、rh人IL-3(20ng/mL)、rh人IL-6(20ng/mL)。然后，这些细胞以EPC形式灌注进入所述基质，或预分化成为EC并灌注入所述基质。可以通过以下方法实现EPC的分化，诸如在含有FBS(2％)、氢化可的松、hFGF、R3-IGF-1、抗坏血酸、hEGF、庆大霉素、两性霉素B和肝素(龙沙公司(Lonza)，瑞士巴塞尔)的内皮细胞生长培养基-2(EGM-2)中培养约3×105-约1×106/1.5mL/9.6cm2。培养三天后，收集细胞并以约1×106细胞/1.5mL/9.6cm2密度转移至包被有纤连蛋白(10μg/ml)(西格玛奥德里奇公司，美国圣路易斯)的平板，且在新鲜EGM-2培养基中额外培养三天。
可使用同种异体的内皮或内皮细胞前体细胞群并从与受体同种异体的组织制备，并通过众所周知的组织分型方法用于测试，以紧密匹配所述受体的组织相容性类型。这些包括但不限于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，基因改造以降低免疫原性的内皮细胞，HLA匹配内皮细胞，脐带血来源的内皮细胞，源自EC、祖细胞、iPS或胚胎干细胞的EPC。大多数同种异体方法需要在移植后使用免疫抑制剂。近期研究证明源自EPC的EC的免疫赦免特性(CardiovascRes.2010年10月1；88(1):121-9.电子出版2010年4月13日)，其中移植后不需免疫抑制。EPC分化方法的例子包括：采用Pancoll大鼠(PAN生物技术公司(PAN-Biotech))，通过密度梯度离心从血液分离EPC，并使用CD45单克隆抗体进行CD45消耗。在20mg/mL纤连蛋白包被培养皿中于内皮分化培养基[EBM补充有5％FCS、50mg/mL庆大霉素、10ng/mL大鼠VEGF、1ng/mL牛bFGF、10ng/mL鼠IGF-1(都为安迪生物(R&DSystems)、10ng/mL鼠EGF和1mg/mL氢化可的松]内培养CD45(-)部分。通过每四天更换培养基来移除非贴壁细胞。在培养约15-约22天后，出现过度生长细胞团，其通过克隆环内胰蛋白酶消化来挑出。用PECAM-1抗体和IgG1微珠通过MACS分离选择PECAM-1(+)细胞。所述PECAM-1(+)部分可以进一步培养至25代，且能灌注入多种基质。
此外，作为采用免疫抑制技术的替代选择，可以对内皮和内皮衍生细胞实施以下方法来消除主要组织相容性复合体(MHC)基因：Smithies等(317Nature230-234(1985))所教授用干细胞内同源重组的基因置换或敲除方法，以及延伸至细胞系中的基因置换或敲除(Zheng等,88Proc.Natl.Acad.Sci.8067-8071(1991))。缺乏MHC表达的细胞允许跨同种异体且可能甚至是异种异体间组织相容性屏障移植富集内皮细胞群，而不需免疫抑制受体。Gruber,54Transplantation1-11(1992)也公开了使用重组方法降低供体细胞抗原性的一般性综述和引用。PCT国际专利申请WO92/04033和PCT/US99/24630公开了通过表面修饰降低移植物免疫原性的示范性方法。或者，可以通过从已改变或删除MHC抗原的转基因动物制备细胞来降低移植物的免疫原性。
内皮细胞前体包括但不限于内皮细胞集落形成单位(CFU-EC)、循环血管生成细胞(CAC)、循环内皮前体细胞(CEP)、内皮集落形成细胞(ECFC)、低增殖潜能ECFC(LPP-ECFC)以及高增殖性ECFC(HPP-ECFC)。
在一个实施方式中，通过在合适条件下培养胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)来引导所述干细胞趋向内皮细胞系，获得内皮细胞和内皮祖细胞。内皮祖细胞是已经开始向内皮细胞分化(例如，谱系限制；例如，必然会成为内皮细胞的细胞)但还未视作完全分化内皮细胞的细胞。例如，内皮祖细胞可以表达祖细胞标志例如CD133，并且也能表达内皮细胞标志，例如但不限于，血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM1；akaCD31)、VEGFR-1(akaFlt-1)、VEGFR-2(akaFlk-1)、鸟苷酸结合蛋白-1(GBP-1)、血栓调节蛋白(akaCD141)、VE-钙粘着蛋白(akaCD144)、血管性血友病因子(vWF)以及胞间粘附分子2(ICAM-2)。一般而言，内皮祖细胞也能够摄入乙酰化LDL，可向VEGF迁移和/或在基质胶上形成管状。
ESC或iPSC例如人ESC和人iPSC，可在产生完全分化内皮细胞如VEGF和bFGF的条件下进一步培养。除此以外或作为替代，内皮细胞可以获自任何数量的来源例如骨髓、血液、皮肤、肝、心、肺、视网膜以及含有内皮细胞的任何其他组织或器官。例如，代表性的内皮细胞包括但不限于，血液内皮细胞、骨髓内皮细胞、循环内皮细胞、人主动脉内皮细胞、人脑微血管内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞、人肠微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞、人微血管内皮细胞、肝窦状腺内皮细胞、人隐静脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、淋巴内皮细胞、微脉管内皮细胞、微血管内皮细胞、肺动脉内皮细胞、视网膜毛细血管内皮细胞、视网膜微血管内皮细胞、血管内皮细胞、脐带血内皮细胞和其组合。如本领域技术人员所理解，这里并不意在对内皮细胞穷尽列举。
EPC可以通过密度梯度离心分离周围血液单核细胞(PBMC)来从周围血液获得。将细胞悬液接种在在任何能维持细胞的容器内，特定是培养瓶、培养板或滚板，更特定在小培养瓶(例如25cm2培养瓶)中。可以将悬浮培养的细胞以约5×104细胞/mL-约2×105细胞/mL(例如，约1×105细胞/mL)重悬。接种于固定底物上的细胞可以约2-约3×103细胞/cm2接种。可选地，用基质蛋白例如胶原蛋白包被所述培养板。可将所述细胞置于任何已知能够支持细胞生长的培养基中，所述培养基包括HEM、DMEM、RPMI、F-12等，其包含细胞代谢所需的补充物，例如谷氨酰胺和其它氨基酸、维生素、矿物质和蛋白如转铁蛋白等。所述培养基还可包含抗生素如青霉素、链霉素、庆大霉素等以防止酵母菌、细菌和真菌的污染。所述培养基可包含获自牛、马、鸡等的血清。培养条件一般应与生理学条件相近。所述培养基的pH应与生理pH相近(例如，pH6-8，约pH7-7.8，或pH7.4)。生理温度范围为约30℃-40℃。可以在约32℃-约38℃的温度(例如，约35℃-约37℃)培养EPC。
可选地，所述培养基中补充至少一种诱导增殖的(“促有丝分裂的”)生长因子。所述“生长因子”是蛋白、肽或对EPC具有生长、增殖诱导性、分化诱导性或营养作用的其它分子。所述“增殖诱导性生长因子”是允许EPC增殖的营养因子，其包括结合所述细胞的表面受体以对所述细胞发挥营养或生长诱导性作用的任何分子。增殖诱导性生长因子包括EGF、双调蛋白、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF或FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、转化生长因子-α(TGFα)、VEGF和其组合。通常向所述培养基添加浓度范围约1fg/mL-1mg/mL的生长因子。约1-100ng/mL的浓度通常足够。可以进行简单的滴定分析来测定特定生长因子的最佳浓度。所述生长因子和营养因子的生物学效果一般通过结合细胞表面受体来调节。鉴定许多这类因子的受体，可获得用于特定受体的抗体和分子探针。在分化的所有阶段，可就生长因子受体的存在来分析EPC。在许多情况中，特定受体的鉴定为在通过添加外源性生长因子或营养因子使所述细胞沿特定发展途径进一步分化中的应用提供策略指导。
一般而言，在体外约3-10天后，通过吸出培养基并加入新鲜培养基至培养瓶来补充EPC的培养基。可选地，收集所吸出的培养基，过滤并用作条件培养基以随后传代EPC。例如，使用10％、20％、30％、40％或更多条件培养基。可以简单传代EPC细胞培养物来重新起始增殖。例如，在体外约3-约7天后，良好振荡所述培养瓶，然后将EPC转移至50mL离心管，低速离心。吸出培养基，在少量培养基中重悬EPC，然后对所述细胞计数，并以所需密度重接种以再起始增殖。可以每周重复该过程，以使每次传代中活细胞数目达到对数增长。持续该过程直至获得所需数目的EPC。
可以通过本领域的任何已知方法冷藏保存EPC和EPC后代直至需要其。(参见例如，美国专利号5,071,741、PCT国际专利申请WO93/14191、WO95/07611、WO96/27287、WO96/29862和WO98/14058，以及Karlsson等，65BiophysicalJ.2524-2536(1993))。可以在等渗溶液优选细胞培养基中悬浮EPC，所述溶液包含特定低温保护剂。所述低温保护剂包括二甲亚砜(DMSO)、甘油等。这些低温保护剂可以以5-15％的浓度(例如，8-10％)使用。逐步冷冻细胞至-10℃～-150℃的温度(例如，-20℃～-100℃，或-70℃～-80℃)。
取决于培养条件，EPC可以分化为内皮细胞或平滑肌细胞。EPC能在有分化诱导性生长因子的培养基中固定底物上分化成内皮细胞或平滑肌细胞。EPC的分化也可以由本领域已知的任何方法诱导，所述方法激活引起生长的生物事件级联，所述生物事件包括肌醇三磷酸和胞内Ca2+的释放、二酰甘油的释放以及蛋白激酶C和其它细胞激酶的激活，等等。使用佛波酯、分化诱导性生长因子和其它化学信号处理，能够诱导分化。可以向所述培养基添加分化诱导性生长因子以影响EPC的分化，而不是用于EPC增殖的增殖诱导性生长因子(参见上文)。其它分化诱导性生长因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)、促甲状腺素释放激素(TRH)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-1)等。
可以使用本领域已知的免疫细胞化学技术检测分化的内皮细胞或平滑肌细胞。免疫细胞化学(例如，免疫荧光双重标记和免疫过氧化物酶法)使用检测细胞蛋白的抗体来区分内皮细胞或平滑肌细胞的细胞特征或表型特性。内皮细胞的细胞标志包括例如VE-钙粘着蛋白、CD144、CD141、CD106或CD142，而平滑肌细胞的细胞标志包括Flk。通过检测内皮细胞基因例如CD31和e-NOS的表达也可以使用免疫细胞化学方法鉴定内皮细胞。
还可以进行原位杂交组织化学法，使用对内皮细胞基因mRNA特异的cDNA或RNA探针。这些技术可与免疫细胞化学方法组合来增强对特定表型的鉴别。需要时，可以在Western和Northern印迹中分别应用上文所述的抗体和分子探针来协助鉴别细胞。
内皮细胞可以获自，例如世界各地的众多生物材料存放处之一。参见例如，美国模式培养物保藏所(www.ATCC.org)或加拿大国际寄存机构(IDAC；www.nml-lnm.gc.ca)。内皮细胞或内皮祖细胞还能获自将要接受所移植组织或器官基质的个体。对于所述受体，这些细胞视作自体。此外，在某些环境下，所述组织或器官基质和所述内皮细胞或内皮祖细胞之间的关系可以是同种异体的(即，来自同一物种的不同个体)；在其它情况中，所述组织或器官基质和所述内皮细胞或内皮祖细胞之间的关系可以是异种异体的(即，来自不同物种的个体)。在某些情况中，所述组织或器官基质对所述受体而言是异种异体的，而所述内皮细胞或内皮祖细胞对于所述受体而言是同种异体的。
通常将包括内皮细胞或内皮祖细胞的组合物在与所述细胞相容的溶液中(例如，在生理组合物中)于生理条件下(例如，37℃)递送至组织或器官基质。如本文所述的生理组合物能包括但不限于，缓冲液、营养物(例如，糖、碳水化合物)、酶、扩增培养基和/或分化培养基、细胞因子、抗体、阻遏物、生长因子、盐溶液或血清来源的蛋白质。本文所用的“基本由(内皮细胞或内皮祖细胞)组成”组合物是基本不含内皮细胞或内皮祖细胞以外细胞的组合物，但仍可包括在生理组合物中可发现的任何成分(例如，缓冲液、营养物等)。
为了优化再内皮化，一般通过灌注将内皮细胞或内皮祖细胞引入器官或组织基质。如前细胞灌注并如WO2007/025233所述，灌注通过所述器官或组织基质的脉管或脉管型结构(例如，其它腔或管)发生。使器官或组织基质再内皮化的灌注的流速应该足以使细胞生理组合物循环贯穿所述脉管和脉管型结构；然而，使组织或器官基质再内皮化的灌注通常在很少压强或无压强下实施(例如，低于在前细胞灌注步骤中用以扩张和冲洗血管床的压力)。使用内皮细胞或内皮祖细胞的灌注可以是多向的(例如正向和逆向)从而进一步优化再内皮化。
引入组织或器官基质用于再内皮化的内皮细胞或内皮祖细胞数量既取决于所述器官或组织(例如，哪个器官或组织、所述器官或组织的尺寸和重量、所述器官或组织的发育阶段和/或所述器官或组织的血管化程度)，又取决于所述内皮细胞、内皮衍生、未成熟内皮细胞或内皮祖细胞的类型和发育阶段。此外，可以将多于一种类型的内皮细胞或内皮祖细胞(例如，内皮细胞或内皮祖细胞的混合物)灌注进入器官或组织基质。不同类型的内皮细胞或内皮祖细胞根据那些细胞将达到的群密度会有不同的趋向，并且相似地，不同的器官或组织基质会在不同密度下被再内皮化。简单地举例来说，可以向器官或组织基质引入至少约100个(例如，至少约103、104、105、106、107、109或1010个)内皮细胞或内皮祖细胞。
在移植之前，所述基质或移植物应包含大部分的成熟内皮细胞，如内皮细胞的细胞标志表达所确定，所述细胞标志包括例如VE-钙粘着蛋白、CD144、CD141、CD106或CD142。还可以使用免疫细胞化学法通过检测内皮细胞基因例如CD31和e-NOS的表达来鉴别内皮细胞。内皮分离的无损方法是短时灌注胰蛋白酶(0.25％或更少)，或其它细胞脱离方法以能移出小部分(<0.01％)内皮细胞，然后可以检测所述内皮细胞的内皮细胞标志表达，所述内皮细胞标志包括但不限于CD105、CD31和e-NOS的功能性表达。此外，可以通过分析基质胶中内皮管的形成来评估所述内皮细胞的功能。简而言之，96孔板的孔包被有50μL冰冷MatrigelTM，随后在37℃孵育1小时。此后，向MatrigelTM添加100μL包含约25,000-约50,000个内皮细胞的EGM-2培养基。在加湿气氛中，于37℃、5％CO2下进行孵育16小时。使用倒置显微镜评价管的形成，用四倍放大对各个单孔拍摄数码显微照片，能就各孔计算管的总数目、分枝点、管的长度和管的长度之和，通过内皮管的存在确定功能性内皮细胞。
此外，可以通过使用标准血液相容性测试和分析来完成再内皮化测量，所述标准血液相容性测试和分析包括但不限于，血小板激活、氧化迸发、溶血、纤维蛋白溶解、纤维蛋白形成、凝血酶生成、接触激活和补体激活。无损方法包括使用增殖检测，例如CellTiterBlue或其它代谢试验来测定所述基质中存在的内皮细胞密度，由此能推断出自然组织的已知值，其中目标是自然组织中具有>50％内皮细胞密度。
可以通过使用标准血液相容性测试和分析来完成再内皮化测量，所述标准血液相容性测试和分析包括但不限于，血小板激活、氧化迸发、溶血、纤维蛋白溶解、纤维蛋白形成、凝血酶生成、接触激活和补体激活。无损方法包括使用增殖检测，例如CellTiterBlue或其它代谢试验来测定所述基质中存在的内皮细胞的密度，由此能推断出自然组织的值，其中目标是自然组织中具有>50％内皮细胞密度。
引入内皮细胞的灌注压一般相当于所述组织或器官的自然灌注压，由于脉管系统能够承受>300mmHg的压强，所以在+/-300％范围内获得所述组织或器官的基质或支架。
本文所述的再内皮化组织或器官基质能移植到受体中。所述再内皮化组织或器官基质显示很少的血栓形成和很低的免疫原性。所述再内皮化组织或器官基质一经移植即能进一步在体内再细胞化。移植后，所述再内皮化组织或器官基质可以在体内再细胞化(即，用来自受体的自然细胞)。体内再细胞化能包括进一步的再内皮化和/或再细胞化，其利用内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞(例如，组织或器官特异性细胞，例如肝细胞、胆管上皮细胞、干细胞、前体细胞、iPS细胞、骨髓单核细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、心肌成纤维细胞、成纤维细胞、库夫纳(kuffner)细胞、骨骼肌细胞、卫星细胞、肾小球壁细胞、肾小球足细胞、近端肾小管刷状缘细胞、亨氏(Henle)细段细胞袢、远曲肾小管细胞、肾集合管细胞、I型肺泡细胞(肺细胞衬里气腔)、胰管细胞(泡心细胞)、β-细胞、胰岛细胞、细胞、(集合小管)闰细胞、肠刷状缘细胞(具有微绒毛)、外分泌腺纹状管细胞、胆囊上皮细胞、附睾主细胞、肾间质细胞和/或附睾基细胞)。
可选地，在组织或器官基质再内皮化之前或所述组织或器官基质再内皮化之后，可以用内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞使所述组织或器官基质体外再细胞化。本文所用的“除内皮细胞、内皮衍生或内皮祖细胞之外的”细胞指生长于特定组织或器官的所有其它细胞类型。在本文所述的方法中，干细胞或祖细胞(例如，胚胎干细胞(ESC)、成人干细胞或诱导性多能干细胞(iPS))能用于使组织或器官实质再细胞化，或者组织或器官特异性细胞(即，已分化或已部分分化的细胞)能用于使组织或器官实质再细胞化。关于组织或器官特异性细胞，递送细胞的特定类型通常取决于最终生成的组织或器官的类型。例如，使心脏再细胞化时，可以将心肌细胞、平滑肌细胞、心肌成纤维细胞和/或心肌干细胞引入所述组织或器官基质之内或之上；使肝脏再细胞化时，可以将肝细胞、胆管细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和/或肝祖细胞引入所述组织或器官基质之内或之上；使肾脏再细胞化时，可以将足细胞、肾小球细胞和/或上皮细胞引入所述组织或器官基质之内或之上；使肺再细胞化时，可以将上皮细胞、克拉拉(clara)细胞、杯形细胞、I型肺泡细胞和/或II型肺泡细胞引入所述组织或器官基质之内或之上；使胰腺再细胞化时，可以将β-细胞和/或胰岛细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。
与内皮细胞或内皮祖细胞一样，可以将内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞在生理组合物(例如，用缓冲液、营养物、酶、生长培养基或分化培养基)内递送至组织或器官基质，并能使用任何数量的途径(例如，注射(例如，在多个位置)、灌注、注入和/或局部应用)进行递送或引入。
在内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞于所述组织或器官基质再内皮化后引入的实施方式中，使内皮细胞或内皮祖细胞在任何其它细胞递送之前能有一些时间来粘附所述组织或器官基质的脉管系统并在其内得到确立可能是有益的。使内皮细胞或内皮祖细胞粘附所述组织或器官基质的充足时间是例如30-80分钟。然而，所述内皮细胞或内皮祖细胞能够粘附所述组织或器官基质并在其内确立多至例如28-30天(例如，约一个月)。
在一个实施方式中，利用动脉、静脉和/或肝窦内皮细胞使去细胞化的肝脏移植物或肝叶再内皮化，以生成可移植的肝移植物，其能移植并与天然肝脏血液供给吻合。所述肝移植物通过来自相邻肝脏的细胞迁移在体内自然地再细胞化。
在另一个实施方式中，利用动脉、静脉和/或肝窦内皮细胞使去细胞化的肝移植物或肝叶再内皮化，以生成可移植的肝移植物，其能移植并与天然肝脏血液供给吻合。在移植后，其它细胞通过所述患者的脉管系统灌注或注射入所述肝移植物的间质，所述其它细胞是例如肝细胞(自体同源、同种异体、干细胞源性或iPS源性)。
在另一个实施方式中，首先使去细胞化的肝移植物或肝叶再内皮化，其次注射肝细胞，以生成可移植的肝移植物，其能移植并与天然肝脏血液供给吻合。
在另一个实施方式中，使去细胞化的心脏移植物或补片再内皮化，以生成可移植的心脏移植物，其能移植并与天然心脏血液供给吻合。所述移植物吻合并置入所述心脏缺血区。
在另一个实施方式中，使去细胞化的心脏移植物或补片再内皮化，以生成可移植的心脏移植物，其能移植并与天然心脏血液供给吻合。移植后，其它细胞通过所述患者的脉管系统灌注或注射入所述心脏移植物的间质，所述其它细胞是例如心肌细胞(自体同源、同种异体、干细胞源性或iPS源性)。
在另一个实施方式中，使去细胞化的心脏移植物或补片再内皮化，以生成可移植的心脏移植物，其能移植并与天然心脏血液供给吻合。移出所述心脏的缺血组织，使所述再内皮化的移植物吻合并通过外科手术植入。
在另一个实施方式中，首先使去细胞化的心脏移植物或补片再内皮化，再注入心肌细胞，以生成可移植的心脏移植物，其能够移植并与天然心脏血液供给吻合。移出所述心脏的缺血组织，使所述有收缩性的移植物吻合并通过外科手术植入。
在一个实施方式中，利用内皮细胞使去细胞化的肺移植物或肺叶再内皮化，以生成可移植的肺移植物，其能够移植并与天然肝脏血液供给吻合。通过来自相邻肺组织的细胞迁移使所述肺移植物在体内自然地再细胞化。
在另一个实施方式中，用动脉、静脉和/或肝窦内皮细胞使去细胞化的肺移植物或肺叶再内皮化，以生成可移植的肺移植物，其能够移植并与天然肝脏血液供给吻合。移植后，其它细胞通过所述患者的脉管系统灌注或注射入所述移植物的间质以进入所述肺移植物，所述其它细胞例如肺上皮细胞(自体同源、同种异体、干细胞源性或iPS源性)。
在一个实施方式中，用内皮细胞使去细胞化的肾移植物或肾叶再内皮化，以生成可移植的肾移植物，其能够移植并与天然肝脏血液供给吻合。通过来自相邻肾的细胞迁移使所述肾移植物在体内自然地再细胞化。
在另一个实施方式中，利用内皮细胞使去细胞化的肾移植物或肾叶再内皮化，以生成可移植的肝脏移植物，其能够移植并与天然肾血液供给吻合。移植后，其它细胞通过所述患者的脉管系统灌注或注射入所述移植物的间质以进入所述肾移植物，所述其它细胞诸如肾小管细胞(自体同源、同种异体、干细胞源性或iPS源性)。
在一个实施方式中，用内皮细胞使去细胞化的胰腺移植物或胰叶再内皮化，以生成可移植的胰腺移植物，其能够移植并与天然肝脏血液供给吻合。通过来自相邻胰腺的细胞迁移使所述肺移植物在体内自然地再细胞化。
在另一个实施方式中，用内皮细胞使去细胞化的胰腺移植物或胰叶再内皮化，以生成可移植的肝移植物，其能够移植并与天然胰腺血液供给吻合。移植后，其它细胞通过所述患者的脉管系统灌注或注射入所述移植物的间质以进入所述胰腺移植物，所述其它细胞例如β-细胞(自体同源、同种异体、干细胞源性或iPS源性)。
在一个实施方式中，起始材料是灌注去细胞化肝叶。在另一个实施方式中，起始材料是灌注去细胞化肝叶的部分。在另一个实施方式中，起始材料是与左心室分离的灌注去细胞化心脏移植物。在另一个实施方式中，起始材料是与右心室分离的灌注去细胞化心脏移植物。在另一个实施方式中，起始材料是与肺叶分离的灌注去细胞化肺移植物。在另一个实施方式中，起始材料是灌注去细胞化肺叶。在另一个实施方式中，起始材料是灌注去细胞化肾。在另一个实施方式中，起始材料是与部分所述肾分离的灌注去细胞化肾移植物。在另一个实施方式中，起始材料是灌注去细胞化胰腺。在另一个实施方式中，起始材料是与部分所述胰腺分离的灌注去细胞化胰腺移植物。
如本文所示，本文所述的再细胞化方法引起广泛的所述组织或器官基质再内皮化，产生的组织或器官基质在移植入患者中时显示极小血栓性。所述再内皮化组织或器官基质还显示很低的免疫原性，这基于所移植组织或器官中观察到的炎症量和/或在移植后受体增加的炎性反应量。
与本公开一致，可以使用本领域技术中的传统分子生物学、微生物学、生物化学和DNA重组技术。所述技术在文献中有充分解释。本发明将会在以下实施例中进一步描述，其不限定所述权利要求中描述的方法和物质组合物的范围。
实施例
实施例1——动物
所有的实验遵照美国动物福利法实施，并由美国明尼苏达大学实验动物管理与使用委员会批准。心脏基质获自SD(SpragueDawley)大鼠(250-319g)或Fisher344大鼠(196-296g)。在移植研究中使用Fisher344基质。在心支架生成中使用的所有大鼠都以100mg克他命(ketamine)/kg体重(凤凰药业(PhoenixPharmaceutical))和10mg甲苯噻嗪/kg体重(凤凰药业)麻醉，随后全身肝素化。
实施例2——大鼠尸体心脏的去细胞化
根据先前发表的方法使大鼠尸体心脏去细胞化(Ott等.,2008；NatureMed.,14(2):213-21)。简而言之，麻醉大鼠。接着，实施正中胸骨切开术，然后剖开心包膜，并移除胸骨后脂肪体以暴露纵膈血管。绑扎并横切上行胸主动脉的前三根分枝和两根上腔静脉。横切下腔静脉(IVC)和肺部血管(静脉和动脉)。然后，从胸腔移出分离的心脏，置于含PBS的皮氏培养皿(petridish)中，插管并用PBS冲洗所述心脏。然后，用1％SDS重力灌注所述心脏，然后用去离子水、1％Triton-X100(西格玛公司(Sigma))和含有抗生素的PBS(100U/ml青霉素、100U/ml链霉素；吉布可公司(Gibco))清洗所述心脏。
实施例3——大鼠心脏支架的再细胞化
大鼠大动脉内皮细胞(RAEC)购自VEC技术公司(VecTechnologies)(纽约伦斯勒)。在所有实验中使用第14代-第20代的RAEC。RAEC在明胶包被的T185培养瓶中于MCDB-131完全培养基(VEC技术公司)内培养，并使用TrypLEExpress(英杰公司(Invitrogen))传代。就通过主动脉再细胞化而言，向去细胞化支架中逆行大动脉灌注细胞悬液；就通过头臂动脉再细胞化而言，在连续逆行大动脉介质灌注下的构建体具有注入BA的细胞。通过IVC再细胞化的构建体具有置入所述IVC的导管，然后灌注RAEC。对于所有构建体而言，细胞以10,000,000个/mL注入。除非另有说明，构建体在组织培养箱中通过主动脉用连续介质灌注(MCDB-131完全培养基)培养七天。在实验持续期间，连续向所述培养基贮器注射卡波金(carbogen)(5％CO2和95％O2)。
实施例4——细胞标记
在研究亚类中，在再细胞化的当天用DiI或DiO标记RAEC。简而言之，从RAEC融合板上移去培养基，并用含有5μMSP-DiIC18或SP-DiOC18(英杰公司)的DPBS取代。在37℃孵育5分钟后，板转移至冰箱，并在4℃孵育15分钟。然后用PBS清洗板一次，使其在分离和构建体接种之前于培养基中37℃恢复2小时。在该实验结束时，将构建体从生物反应器中移出并在StereoDiscoveryV20立体显微镜(卡尔·蔡司公司(CarlZeiss))上成像、解剖、放入Slowfade(英杰公司)中，并在510Meta共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司(CarlZeiss))上成像。
在单独研究中，在培养最后一天(第7天)通过移除完全培养基并在37℃循环含有DMEM(Cellgro)的无血清CMFDA45分钟，用细胞示踪剂CellTrackerGreenCMFDA(英杰公司)标记接种了RAEC的构建体。然后，用MCDB-131完全培养基替代含有CMFDA的培养基，所述构建体孵育45分钟。然后，将经CMFDA标记的构建体从生物反应器中移出，解剖，置入Slowfade(英杰)中，并在510Meta共聚焦显微镜(卡尔·蔡司公司(CarlZeiss))上成像。
实施例5——组织学和细胞核/血管定量
在培养最后一天，将所述构建体从生物反应器中移出，切成从底至顶随机分布的四个短轴面，然后石蜡包埋。在石蜡包埋后，切片并再水合，根据标准步骤对其进行苏木精和曙红或伟郝夫范吉森(VerhoeffvanGieson)染色。切片用尼康(Nikon)EclipseTE200倒置显微镜(Fryer有限责任公司(FryerCo.Inc.))成像。对于细胞核定量，用含有DAPI的Vectashield(载体实验室(Vectorlabs))封固未染色载玻片，每个切片随机拍5张高倍率图像。然后，定量DAPI阳性细胞核，并对组织区域标准化。对于血管直径定量，对伟郝夫范吉森染色切片拍5张随机分布的高倍率图像，并如上文所述处理。通过用ImageJ软件(NIH)测量含血管的细胞短轴直径来估测所述直径。所有成像使用尼康(Nikon)EclipseTE200倒置显微镜(Fryer有限责任公司)完成。
实施例6——免疫荧光染色
通过二甲苯和分级醇改变使石蜡切片再水合。载玻片在有0.05％吐温-20的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中煮沸20分钟。在含3％BSA的PBS中封闭一小时。针对PCNA、PECAM-1(兔多克隆抗体，圣克鲁斯公司(SantaCruz))、vWF、eNOS、钙视网膜蛋白、波形蛋白(兔多克隆抗体，艾碧康公司(Abcam))、vWF(山羊多克隆抗体，圣克鲁斯公司)、FLK-1(小鼠单克隆抗体，BD生物科学公司(BDBioscience))、CD34、CD45、CD11b(小鼠单克隆抗体，圣克鲁斯公司(SantaCruz))、α-平滑肌肌动蛋白(小鼠单克隆抗体，西格玛公司)和CD8(兔单克隆抗体，艾碧康公司)的一抗在PBS中稀释至10μg/ml，并在4℃过夜孵育。在步骤与步骤之间通过三次交换含0.05％吐温-20的PBS来清洗载玻片。将结合FITC或德克萨斯红(TexasRed)(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch))的合适二抗以1:250稀释，并孵育一小时。用含有DAPI的封固剂封固所述载玻片，并在尼康(Nikon)EclipseTE200荧光显微镜上观察。
实施例7——G6PDH检验
每天从生物反应器回收培养基，并储存于-20℃。在分析当天，解冻样品，按照生产商说明书，使用Vybrant细胞毒性检测试剂盒(英杰公司)定量G6PDH活性。
实施例8——TUNEL
在培养7天后，用福尔马林固定再内皮化构建体，切成四个从底至顶的代表性短轴面，石蜡包埋，然后切片。使用DeadEndTUNEL比色检测系统(DeadEndColorimetricTUNELsystem，普洛麦格公司(Promega))染色带切口DNA。按照生产商关于石蜡包埋样品的说明书，做以下修改：在样品脱蜡并通过乙醇系列再水合后，使所述样品在10mM柠檬酸盐缓冲液中微波2分钟(trater等，1995,Histochem.CellBiol.,103(2):157-60)；并且使用结合DyLight594的链霉亲和素(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch))处理样品，而不是使用结合辣根过氧化物酶的链霉亲和素。载玻片用含DAPI的Vectashield(载体实验室公司(Vectorlabs))封固，并使用尼康(Nikon)EclipseTE200倒置显微镜(Fryer有限责任公司，美国伊利诺伊州亨特利)成像。
实施例9——体外血栓调节蛋白检测
血栓调节蛋白检测根据先前发表的工作(Calnek和Grinnell,1998,Experimen.CellRes.,238(1):294-8；Ibrahim和Ramamurthi,2008,J.TissueEng.Regen.Med.,2(1):22-32)修改。在培养的最后一天(第七天)，构建体用不含酚红的DMEM/F12(英杰公司)以1mL/分钟的流速清洗三遍，总共45分钟。然后，将四毫升含有人α-凝血酶(0.1NIHU/mL；血液学技术公司(HaematologicTechnologies))和人蛋白C(12μg/mL；血液学技术公司)的无酚红DMEM/F12以1mL/分钟经主动脉连续循环通过心脏结构，持续45分钟。将100μL培养基转移至96孔板(一式三份)，与50μL水蛭素储液(12ATU/mL；美国诊断公司(AmericanDiagnostica))混合，在37℃孵育5分钟。向每个含有样品的孔中加入50μLS-2366底物(终浓度0.75mM；Chromogenix)，并在室温孵育5分钟。用SprectraMAX340(分子仪器公司(MolecularDevices))检测410nm和490nm处的吸光度。最终相对吸光值通过410nm处吸光值减去490nm处吸光值来计算，然后由无细胞支架对照标准化。
实施例10——异位移植
受体大鼠即RNU裸鼠(213-388g)或Fisher344(278-351g)用戊巴比妥钠(60mg/Kg体重，腹腔内注射)麻醉。利用腹壁中线切口来暴露下行主动脉和下腔静脉。按照Ono和Lindsey(Ono,1969,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,57(2):225-9)，对供体心脏的上行动脉和受体大鼠腹主动脉和腔静脉左侧肺的动脉使用9-0缝合线进行端侧吻合术。用接受持续抗凝血治疗的仅含基质的裸移植物(肝素钠，100i.u./Kg体重，移植当天实施两次；200i.u/Kg体重，接下来两天由皮下实施)和含有香豆定(Coumadin)(0.25mg/Kg体重/天)的饮用水，在移植前对大鼠预肝素化。
实施例11——大鼠大动脉内皮细胞的灌注和分布
研究三个再细胞化方法来确定用于内皮细胞递送的最佳技术：(a)通过主动脉直接灌注RAEC，(b)通过BA灌注细胞，使介质流过主动脉，或(c)细胞的联合递送：首先通过IVC，然后如所述通过BA进行第二注入。递送后，构建体在分析前于逆行大动脉介质灌注下培养一周。为了在培养七天后确定所述细胞的位置并对细胞性定量，固定构建体，切成4个从底至顶分布的短轴面，石蜡包埋，染色，对DAPI阳性细胞核定量(图1A)。在各递送方法中，细胞保留在所述构建体中，并沿血管腔排列。通过主动脉或BA递送20,000,000个细胞时，未见基质中内皮细胞数量的统计上显著差异(图1A)。然而，通过主动脉递送的细胞没有实现贯穿心脏的统一分布，相反，所述细胞定位于心脏顶端而心脏底部保持无细胞。细胞接种数量加倍时，观察到量化细胞性呈统计上显著增长。在IVC和BA接种的构建体中观察到最大细胞性，其甚至与相同细胞数的单独BA注入相比都具有统计上显著性。
对于接种有经BA(图1B-C)或IVC加BA(图1D-E)递送细胞的构建体而言，在再细胞化之前用DiI和DiO标记RAEC确定遍布心脏基质的统一细胞分布。相似地，在IVCRAEC灌注之后，可以从顶至底在整个心脏观察到(DiO阳性)细胞。用DiO和DiI标记细胞接种的构建体检测显示，在心室壁中，可以发现血管被通过单一途径递送的细胞(即，通过BA或IVC递送的细胞)重新覆盖(图2A和B)，或是含有通过双途径递送的细胞(图2C)。所述左心室的内皮表面主要被递送入BA的细胞再细胞化，而右心室的心内表面则重新衬上通过IVC递送的RAEC(图2D和E)。
培养七天的构建体的组织学(苏木精和曙红和伟郝夫范吉森(Verhoeff-vonGieson)染色)显示，不同直径的血管被重衬(图3A-D)，弹性蛋白阳性的动脉血管和弹性蛋白阴性的血管也如此(图3B和D)。这些结果显示，在再细胞化和随后的体外培养过程中，RAEC没有显示出可观察的血管偏好性。居中心室壁内的血管直径定量显示，与单独的BARAEC递送相比，通过IVC和BA的联合细胞递送引起小血管(直径为11-25μm)数量在统计上显著增长(图3E)。检测顶端部分时，在血管直径分布中没有观察到递送依赖性。
实施例12——大鼠主动脉内皮细胞在培养中的存活
为了确定逆行灌注是否足以维持RAEC表型并防止再细胞化构建体内的细胞死亡，使用了三种不同的检测方法：(a)体外培养结束时的CMFDA细胞标记，(b)TUNEL染色，以及(c)七天时间段中构建体灌注液内的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性定量。构建体通过单独BA或IVC再细胞化，如所述培养七天，然后标记CMFDA。使用CMFDA，因为它能只标记活细胞并由活细胞割开。在第七天，BA递送和IVC递送的细胞都能切割CMFDA。排列在右心室内的心内细胞被标记，指示基本的冠状动脉。TUNEL分析显示，极少数(如果有)RAEC在第七天凋亡，与细胞位置(LV、RV或隔膜)无关。定量G6PDH活性，作为持续细胞死亡的指示物。在实验持续过程中没有观察到G6PDH增加，与细胞递送方法无关。这些结果表明，大动脉灌注足够维持RAEC遍布再细胞化心脏结构，与它们如何递送无关。
实施例13——再内皮化构建体的体外表型分析
通过在再细胞化后第七天对构建体内的细胞免疫荧光染色来检测RAEC表型和功能。所述构建体中能发现PCNA+细胞，表示持续增殖。同样地，血管树中能发现eNOS+细胞，意味着所述细胞保持功能性。最后，RAEC表达血管性血友病因子，指示凝血调节潜能。为检测再内皮化构建体是否能够抑制凝血途径，对循环通过所述构建体的灌注液进行体外血栓调节蛋白检测。为此，在第七天，使含有凝血酶和蛋白C的溶液循环通过再细胞化构建体或无细胞支架。在血栓调节蛋白和凝血酶介导的蛋白C活性中观察到统计学上显著的6倍-8倍增长。蛋白C是凝血级联的负调节物；因此，这些结果表明，由于再细胞化构建体保持了活化蛋白C的能力，其能够潜在地抑制凝血级联。尽管BA加IVC细胞递送构建体有性能更佳的趋势，BA和BA加IVC的再细胞化构建体表现相似。
实施例14——异位外植体的鉴定
将无细胞支架和BARAEC再内皮化构建体异位移植入受体大鼠腹腔。在移植前，将再内皮化构建体培养七天以允许RAEC附着和生长。在移植后的第七天，移植并检测构建体。主动脉内有凝块形成，但在再细胞化构建体中有所减少。对LV壁和心室的检测显示，无细胞支架移植体中相较再内皮化构建体有更多的血栓形成。在无细胞支架的实质中观察到更零散的血液，而在再内皮化构建体中观察到开放血管填充有血液。通过免疫荧光染色鉴定所招募细胞(表1)显示，极少数(少于4％)为巨噬细胞(CD11b)或淋巴细胞(CD8)标记物阳性。此外，平滑肌(SMA)、间皮(钙视网膜蛋白)、内皮祖细胞(CD34)、内皮细胞(vWF)和成纤维细胞(波形蛋白)标志物仅由小部分的招募细胞表达(表1)。大部分的所述招募细胞的大部分表达细胞标志物PECAM+和VEGFR2+，与所述结构建体有或没有再细胞化无关。然而，祖细胞标志物，CD34和造血干细胞(CD45)仅仅由小部分的招募细胞表达(表1)。
表1
应理解，尽管本文结合许多不同方面描述了所述方法和物质组合物，上文对所述不同方面的描述意在说明而非限定所述方法和物质组合物的范围。其它方面、优势和修改都落在下列权利要求的范围之内。
公开了能用于、能联用、能用于制备的方法和组合物，或是所公开方法和组合物的产物。本文公开了这些和其它材料，应理解公开了这些方法和组合物的组合、子集、相互作用、组等。即，尽管没有明确地公开对这些组合物和方法的各个不同单一或共同组合及排列的特定引用，它们各在本文中特定考虑和描述。例如，如果特定物质组合物或特定方法经公开和讨论并且讨论了许多组合物或方法，特定考虑各个和每个组合以及所述组合物的排列和方法，除非特别表明相反情况。同样地，这些的任何子集或组合也经特定考虑并公开。
所有的出版物、专利和专利申请通过引用纳入本文。尽管在上文说明书中本发明根据其某些优选实施方式加以描述，且列出许多细节用于说明目的，但对于本领域技术人员显而易见的是，本发明允许额外的实施方式，并且本文所述的某些细节可显著改变而不背离本发明的基本原理。

Claims (33)

1.一种使组织或器官基质再细胞化的离体方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供在压力下用生理缓冲液灌注的去细胞化的组织或器官基质，其中该去细胞化的器官基质包含完整的器官囊，并且其中基质包含脉管系统，其中流体被引入所述脉管系统的一个入口点时，其通过所述系统中的不同点离开；和
b)通过用包含基本纯内皮细胞或内皮祖细胞群的生理组合物以正向和逆向灌注所述组织或器官基质的去细胞化脉管系统来使所述去细胞化的组织或器官基质再内皮化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是：血液内皮细胞、骨髓内皮细胞、循环内皮细胞、肝窦状腺内皮细胞、淋巴内皮细胞、血管内皮细胞、内皮细胞集落形成单位CFU-EC、循环血管生成细胞CAC、循环内皮前体细胞CEP、内皮集落形成细胞ECFC和其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是微血管内皮细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是微脉管内皮细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人微血管内皮细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人主动脉内皮细胞、肝血窦内皮细胞、人隐静脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞，或脐带血内皮细胞。
7.如权利要1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人脑微血管内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞、人肠微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞，或视网膜微血管内皮细胞。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述ECFC是低增殖潜能内皮集落形成细胞LPP-ECFC。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述ECFC是高增殖内皮集落形成细胞HPP-ECFC。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞或内皮祖细胞是非人类胚胎干细胞的胚胎干细胞ESC源性或诱导性多能干细胞iPSC源性内皮细胞或内皮祖细胞。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质来源于选自心、肾、肝、肺、胰腺、肠、肌肉、皮肤、胸部、食道、气管或网膜的器官。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质以及所述内皮细胞或内皮祖细胞是异种异体的。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质以及所述内皮细胞或内皮祖细胞是同种异体的。
14.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤b)之前，将内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤b)之后，将内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。
16.一种减少再细胞化组织或器官内在移植进入受体后血栓形成和免疫原性的离体方法，所述方法包括：
a)提供在压力下用生理缓冲液灌注的去细胞化的组织或器官基质，其中去细胞化的器官基质包含完整的器官囊，并且其中所述基质包含脉管系统，其中流体被引入所述脉管系统的一个入口点时，其通过所述系统的不同点离开；和
b)通过用包含基本纯内皮细胞或内皮祖细胞群的生理组合物以正向和逆向灌注所述组织或器官基质的去细胞化脉管系统来使所述去细胞化的组织或器官基质再内皮化。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是：血液内皮细胞、骨髓内皮细胞、循环内皮细胞、肝窦状腺内皮细胞、淋巴内皮细胞、血管内皮细胞、内皮细胞集落形成单位CFU-EC、循环血管生成细胞CAC、循环内皮前体细胞CEP、内皮集落形成细胞ECFC和其组合。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是微血管内皮细胞。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是微脉管内皮细胞。
20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人微血管内皮细胞。
21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人主动脉内皮细胞、肝血窦内皮细胞、人隐静脉内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞，或脐带血内皮细胞。
22.如权利要16所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人脑微血管内皮细胞、人真皮微血管内皮细胞、人肠微血管内皮细胞、人肺微血管内皮细胞，或视网膜微血管内皮细胞。
23.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述ECFC是低增殖潜能内皮集落形成细胞LPP-ECFC。
24.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述ECFC是高增殖内皮集落形成细胞HPP-ECFC。
25.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞或内皮祖细胞是胚胎干细胞ESC源性或诱导性多能干细胞iPSC源性内皮细胞或内皮祖细胞。
26.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质是生物组织或器官基质。
27.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质来源自选自心、肾、肝、肺、胰腺、肌肉、皮肤、胸部、食道、气管或网膜的器官。
28.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质是灌注去细胞化的组织或器官基质。
29.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质以及所述内皮细胞或内皮祖细胞是异种异体的。
30.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质以及所述内皮细胞或内皮祖细胞是同种异体的。
31.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述组织或器官基质对于所述受体而言是异种异体的，其中所述内皮细胞或内皮祖细胞对于所述受体而言是同种异体的。
32.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤b)之前，将内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。
33.如权利要求16-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤b)之后，将内皮细胞或内皮祖细胞以外的细胞引入所述组织或器官基质之内或之上。
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