KR101900116B1 - 개선된 이식가능성을 위한 조직 또는 장기의 재세포화 방법 - Google Patents

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리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타
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Abstract

본원에 기술된 것은 장기 또는 조직 매트릭스를 재세포화하는 방법이다.

Description

개선된 이식가능성을 위한 조직 또는 장기의 재세포화 방법{METHODS OF RECELLULARIZING A TISSUE OR ORGAN FOR IMPROVED TRANSPLANTABILITY}
본 발명은 2010년 9월 1일 자로 출원된 미국 가출원 제 61/379,073호로부터의 우선권을 주장하며, 이 출원은 여기서 참고로 포함된다.
본 발명은 국립보건원에 의해 수여된 승인번호(Grant Nos.) HL 063346과 HL 100407-01 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 가진다.
본 개시내용은 일반적으로 탈세포화된 조직 또는 장기를 재세포화하는 방법에 관한 것이다.
혈관이 손상되거나 혹은 세포외 매트릭스가 노출되었을 때, 혈소판과 피브린은 손상으로부터 혈액 손실을 막기 위해 응혈을 형성한다. 혈전증은 혈전이라고 불리는 혈관 안에서의 응혈의 형성이다. 이 혈관은 정맥, 동맥 혹은 모세혈관일 수 있다. 혈전은 통상적으로 순환계를 통한 혈액의 흐름을 다양한 정도로 방해한다. 생체 내에서, 항혈전 및/또는 항응혈제는 응고반응을 줄이기 위해 사용되나, 이것이 탈세포화된 장기, 조직 또는 스캐폴드(scaffold)의 이식 중에 관찰되는 혈전증을 줄이거나 제거하는 데에 유용한지는 입증되지 않았다.
한 측면에서, 조직 또는 장기 매트릭스를 재세포화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 통상적으로 조직 또는 장기 매트릭스를 압력 하에서 생리적 완충액으로 관류시키는 것(예를 들어 탈세포화된 조직 또는 장기 매트릭스 관류); 및 내피세포 또는 전구내피세포 (Endothelial progenitor cell, 내피전구세포) 집단을 포함하는 생리적 조성물로 조직 또는 장기 매트릭스를 관류시킴으로써 조직 또는 장기 매트릭스를 재내피화하는 것을 포함한다. 예시적인 분화된 내피세포 또는 평활근세포 집단은 예를 들어, 내피세포 또는 평활근세포의 세포 성질 또는 표현형 특징을 구별하기 위해 세포 단백질을 검출하는 항체를 이용하는 이중-표지 면역 형광 및 면역 과산화효소 방법을 포함하여 당해 분야에 알려진 면역세포화학 기술을 이용하여 검출할 수 있다. 내피세포에 대한 세포 마커(marker)는 예를 들어, VE-카드헤린(cadherin), CD144, CD141, CD106, 또는 CD142를 포함하는 반면 평활근세포에 대한 세포 마커는 Flk를 포함한다. 면역세포화학은 또한 e-NOS와 CD31과 같은 내피세포 유전자의 발현을 검출함으로써 내피세포를 식별하는 데에 쓰일 수 있다. 성숙 내피세포 집단은 CD45+ 집단에서처럼 조혈세포가 상대적으로 없어야 한다. 내피 유전자 mRNA에 특이적인 cDNA 또는 RNA 프로브(probe)를 이용하여 본래의 위치의 혼성화 조직화학 역시 수행할 수 있다. 특이적인 표현형의 식별을 강화하기 위해 이러한 기술을 면역세포화학요법과 결합할 수 있다. 상기 논의된 항체와 분자 프로브는 세포 식별에 도움이 되도록 웨스턴 블럿과 노던 블럿 절차 각각에 적용할 수 있다. 일 실시태양에서 실질적으로 순수한 집단은 적어도 50 %, 60 %, 70 % 또는 그 이상, 예를 들면 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % 또는 100 %의 내피세포 또는 전구내피세포이다. 관류 탈세포화는 혈관 도관은 유지하면서 탈세포화를 촉진하도록 장기, 장기의 일부 또는 혈관화 조직을 통해 탈세포화 용액을 관류시키는, 포유동물 장기, 장기의 일부(부분) 또는 혈관화 조직을 생체 외 탈세포화하는 방법이다. 그로부터 만들어진 탈세포화된 장기, 매트릭스, 조직 스캐폴드 또는 이식편은 동맥 공급, 모세혈관 베드(bed)가 존재하는 간질 공간, 그리고 정맥 출구를 포함하는 혈관계를 보유하여 유체 또는 세포가 하나 이상의 입구, 예를 들어 하나 이상의 혈관을 통해 도입되고 다른 통로를 통해 장기, 매트릭스, 조직 또는 이식편에서 나갈 수 있게 된다. 온전한 장기는 일차적인 동맥 유입을 갖고 유체가 완전하게 정맥으로 돌아가게 한다. 장기나 조직의 분리된 부분은 노출된 간질의 매트릭스로서 조직이나 장기의 일부가 삭제된 곳을 통해 배출되는 유체와 정맥환류의 결합을 가질 것이다. 존재시, 그 장기 캡슐(capsule)은 온전하게 남아 있는데, 예를 들어 침지 탈세포화를 받은 장기와 대조하여 그 캡슐을 가로지르는 수성 액체의 움직임을 촉진하지 않는다.
대표적인 내피세포는 혈액내피세포, 골수내피세포, 순환내피세포, 인간 대동맥 내피세포, 인간 뇌 미세혈관 내피세포, 인간 피부 미세혈관 내피세포, 인간 장 미세혈관 내피세포, 인간 폐 미세혈관 내피세포, 인간 미세혈관 내피세포, 간의(hepatic) 지누소이드 내피세포, 인간 복재정맥 내피세포, 인간 제정맥 내피세포, 림프 내피세포, 미세맥관(microvessel) 내피세포, 미세혈관(microvascular) 내피세포, 폐동맥 내피세포, 망막 모세혈관 내피세포, 망막 미세혈관 내피세포, 혈관 내피세포, 제대혈 내피세포, 간(liver) 지누소이드 내피세포, 콜로니(colony)형성 단위-내피세포(CFU-EC), 순환 혈관형성세포(CAC), 순환 내피 전구체(CEP), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 저증식성 잠재적 ECFC(LPP-ECFC), 고증식성 잠재적 ECFC(HPP-ECFC) 또는 이들의 조합을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 내피세포 또는 전구내피세포는 배아줄기세포(ESC), 성체줄기세포, 전구세포 또는 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)로부터 유도된다.
특정 실시태양에서, 조직 또는 장기 매트릭스는 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스다. 특정 실시태양에서, 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스는 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 장, 근육, 피부, 유방, 식도, 기관지 또는 망으로 이루어진 군에서 선택된 장기로부터 기원한다. 특정 실시태양에서 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스는 관류-탈세포화된 조직 또는 장기 매트릭스다.
특정 경우에서, 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스와 내피세포 또는 전구내피세포는 이종이다. 특정 경우에서, 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스와 내피세포 또는 전구내피세포는 동종이계이다.
일부 실시태양에서 그러한 방법은 또한 내피 또는 전구내피세포 이외의 세포를 재내피화 단계 이전에 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서 그러한 방법은 또한 내피, 내피 유도의, 미성숙의 내피세포 또는 전구내피세포 이외의 세포를 재내피화 단계 이후에 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 수혜자로의 이식 후에 재세포화된 조직 또는 장기에서의 응혈형성 및 면역원성의 감소 방법을 제공한다. 그러한 방법은 통상적으로 조직 또는 장기 매트릭스를 생리적 완충액으로 압력 하에서 관류시키는 것; 내피세포 또는 전구내피세포 집단을 포함하는 생리적 조성물로 조직 또는 장기 매트릭스를 관류시킴으로써 조직 또는 장기를 재내피화하는 것; 그리고 상기 재내피화된 조직 또는 장기 매트릭스를 수혜자에게 이식하는 것을 포함한다. 재내피화된 조직 또는 장기에서의 응혈형성은 혈소판 활성화, 산화성 파열, 용혈, 섬유소 용해, 섬유소 형성, 트롬빈 생성, 접촉 활성화, 트롬보모듈린(thrombomodulin) 분석, 및/또는 보체 활성화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 표준 혈액적합성 시험 및 분석들을 통해 평가할 수 있다. 일 실시태양에서, 재내피화된 조직 또는 장기 매트릭스는 이식에 적합하고 이식시에 이용가능하게 된다.
대표적인 내피세포는 혈액내피세포, 골수내피세포, 순환내피세포, 인간 대동맥 내피세포, 인간 뇌 미세혈관 내피세포, 인간 피부 미세혈관 내피세포, 인간 장 미세혈관 내피세포, 인간 폐 미세혈관 내피세포, 인간 미세혈관 내피세포, 간의(hepatic) 지누소이드 내피세포, 인간 복재정맥 내피세포, 인간 제정맥 내피세포, 림프 내피세포, 미세맥관 내피세포, 미세혈관 내피세포, 폐동맥 내피세포, 망막 모세혈관 내피세포, 망막 미세혈관 내피세포, 혈관 내피세포, 제대혈 내피세포, 간(liver) 지누소이드 내피세포, 콜로니 형성 단위-내피세포(CFU-EC), 순환 혈관형성세포(CAC), 순환 내피 전구체(CEP), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 저증식성 잠재적 ECFC(LPP-ECFC), 고증식성 잠재적 ECFC(HPP-ECFC) 또는 이들의 조합을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 내피세포 또는 전구내피세포는 배아줄기세포(ESC), 성체줄기세포, 전구세포 또는 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)로부터 얻어진다.
특정 실시태양에서, 조직 또는 장기 매트릭스는 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스다. 특정 실시태양에서, 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스는 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 장, 근육, 피부, 유방, 식도, 기관지 또는 망으로 이루어진 군에서 선택된 장기로부터 기원한다. 특정 실시태양에서 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스는 관류-탈세포화된 조직 또는 장기 매트릭스다.
일부 실시태양에서, 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스와 내피세포 또는 전구내피세포는 이종이다. 일부 실시태양에서, 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스와 내피세포 또는 전구내피세포는 동종이계이다. 일부 실시태양에서, 상기 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스는 수혜자에게 이종이고 여기서 내피세포 또는 전구내피세포는 수혜자에게 동종이계이다.
특정 실시태양에서, 그러한 방법은 또한 내피 또는 전구내피세포 이외의 세포를 재내피화 단계 이전에 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서 그러한 방법은 또한 내피 또는 전구내피세포 이외의 세포를 재내피화 단계 이후에 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 그러한 방법은 내피세포 또는 전구내피세포 이외의 세포를 이식 단계 이후에 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입하는 것을 포함한다. 내피세포, 내피 유도의, 또는 미성숙의 내피세포 또는 전구내피세포 이외의 세포를 포함하는 생리적 조성물은 예를 들어, 관류, 직접 주입, 국소 도포, 또는 이들의 조합을 통해 조직 또는 장기 매트릭스로 도입될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 여기서 쓰이는 모든 기술적 및 과학적 용어는 그 방법과 물질의 조성이 속하는 분야에서 당업자가 흔히 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 여기서 기술된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 그 방법과 물질 조성의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 이하에 기술한다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명적인 것이며, 제한적인 것은 아니다. 여기서 언급된 모든 문헌, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 그 전문이 참고로서 포함된다.
도 1의 패널(panel) A는 재세포화된 심장 구조물 전체에 걸친 세포의 존재를 보여주는 그래프이며, 이는 기저부부터 정점까지 분포되어 있는 네 개의 다른 단축 위치에서 DAPI 양성 핵을 정량화하여 추산되었다(방법당 N=3 심장). 래트 대동맥 내피세포(RAEC)는 단일 용량 또는 2회 용량으로 전달되었다. 각각의 방법에 대해 전달된 세포의 총수는 괄호 안에 나타나 있다. 세포의 단일 용량 전달은 세 번째 분지까지의 원위 대동맥으로의(대동맥), 또는 완두 동맥을 통한(BA) RAEC의 관류를 수반하였다. 2회 용량 전달에서, 절반의 세포가 IVC를 통해 전달된 뒤에 절반이 BA를 통하였다(BA+IVC). 전체 심장 매트릭스 전반에 걸친 RAEC의 분배는 전달에 앞서 세포의 DiI(적색) 및 DiO(녹색) 표지로 시각화하였다. 패널 B와 C에서 4000만 개의 DiI 표지된 RAEC는 BA를 통해 전달된 반면, 패널 D와 E에서는 2000만 개의 DiO 표지된 세포가 IVC를 통해 전달된 후 부가적인 2000만 개의 DiI 표지된 세포가 BA를 통해 전달되었다. 오차 막대는 평균 표준오차이며, 스케일 바는 5 mm이다. *는 p>0.05를 나타낸다.
도 2는 2000만 개의 DiO(녹색) 표지된 RAEC가 IVC를 통해 전달되고 2000만 개의 DiI(적색) 표지된 RAEC가 BA를 통해 전달되었으며 탈세포화된 스캐폴드에 접종한 후 7일 뒤에 시각화된 사진이다(패널 A-E). 표지된 RAEC는 심실벽 안에서(패널 A-C) 및 심내막 표면 상에서(패널 D-E) 다른 분포를 보였다. DAPI 양성 핵은 청색이다(패널 A-E). 패널 A-E에서 스케일 바는 50 마이크로미터다.
도 3의 패널 A-D는 BA(4000만 개의 세포, 패널 A - B) 또는 BA와 IVC(각 주입당 2000만 개, 패널 C - D)를 통해 RAEC로 재접종한 탈세포화된 래트 심장 ECM의 조직학적 평가를 보여주는 사진이다. 패널 A와 C는 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색된 부분인 반면 패널 B와 D는 베르호프-반 기슨(Verhoeff-van Gieson) 염색되었다. 혈관 직경을 정량화하였고, LV 및 RV 벽 크기에 따라 그룹화하였으며, 그 자료가 패널 E에 나와 있다(각 자료 세트 당 N=3). 스케일 바는 250 마이크로미터다. 오차 막대는 평균으로부터의 1 표준편차이다. *은 소정의 혈관 직경에 대하여 전달 방법 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(p<.001).
도 4는 제0일에 BA로의 주입을 통한 4000만 개의 RAEC(패널A) 또는 IVC로의 3000만 개의 RAEC(패널B 및 C)로 접종된 탈세포화된 래트 심장 구조물의 사진이다. 제7일에 생세포(녹색)를 형광 표지하기 위해 대동맥을 통해 생체염색 염료인 CMFDA로 심장 구조물을 관류시켰다. CMFDA-양성 RAEC가 주입 경로와 무관하게 심장 구조물의 심실벽(패널 A 및 B)과 심내막 표면(패널 C)에서 보였다. 아폽토시스(apoptosis)로 인한 세포 사멸이 터널(TUNEL) 염색에 의해 검출되었다(패널 D-I). 패널 D-F는 BA 세포 주입된 구조물에 대한 대표적인 좌심실, 중격 및 우심실 단축 영상이다. 패널 G-I는 BA와 IVC 세포 접종된 구조물에 대한 좌심실, 중격 및 우심실 터널 영상이다. 세포 핵은 DAPI(청색)으로 염색되며 터널 양성 염색은 적색이다. 시간에 따른 세포의 생존능의 변화를 추가로 정량화하기 위하여 배지를 매일 샘플링하였고 G6PDH 활성을 정량화하였다(패널 J)(N=6). 오차 막대는 평균으로부터의 1 표준편차를 나타낸다. 스케일 바는 패널 A-C에서 100 마이크로미터를 나타내며, 반면 패널 D-I에서 스케일 바는 250 마이크로미터를 나타낸다. #은 터널 양성 염색을 표기한다. 패널 J는 자료의 도표이다.
도 5는 탈세포화된 심장 스캐폴드에서의 7일 후, RAEC의 조직화학적 염색 사진이며, 이는 세포가 아직 생존 가능하고 증식성임을 보여주고(패널 A, 녹색이 CMFDA, 적색이 PCNA이다), 기능적으로 활성인 EC의 마커를 발현한다(패널 B, 적색이 eNOS, 녹색이 CMFDA, 청색이 DAPI; 패널 C, 적색이 vWF, 녹색이 CMFDA, 그리고 청색이 DAPI). 재내피화된 매트릭스는 여전히 트롬보모듈린 신호를 통해 스캐폴드의 혈전생성을 줄일 수 있었다(패널 D, 무세포 대조군에 대하여 N=6, BA 및 BA+IVC에 대하여 N=8). 각각의 방법에 대하여 전달된 RAEC의 총수는 괄호 안에 나타나 있다. 무세포 대조군과 비교하여 *는 p<.05를 나타낸다. 오차 막대는 평균 표준오차이다. 스케일 바는 100 마이크로미터를 나타낸다.
도 6은 이소성 이식 7일 후 무세포 스캐폴드의 체외이식편(패널 A-D)과 재내피화된 구조물의 체외이식편(패널 E-H) 사이의 비교를 보여주는 사진이다. 무세포 스캐폴드(각각 패널 A 및 B) 및 재내피화된 구조물(각각 패널 E 및 F)의 대동맥과 좌심실의 그로스 검사(Gross examination)는 혈전 형성이 감소하였음을 나타냈다. 무세포 스캐폴드(패널 C-D) 및 재내피화된 구조물(패널 G-H)의 헤마톡실린과 에오신 염색은 무세포 스캐폴드에서의 좀 더 묽은 혈액과 무세포 스캐폴드 및 재내피화된 스캐폴드 체외이식편 모두 안에서 비슷한 양의 모집된 세포를 나타냈다. *은 구조물에서의 명백한 혈관을 나타낸다. 스케일 바는 다음을 나타낸다: 패널 A, B, E 및 F에서 1 mm, 패널 C 및 G에서 250 마이크로미터, 패널 D에서 50 마이크로미터 그리고 패널 H에서 100 마이크로미터.
도 7은 이식 7일 후 무세포 스캐폴드(패널 A) 또는 재내피화된 구조물(패널 B)의 VEGF-R2(적색) 염색 사진이다. 이식 7일 후 무세포 스캐폴드(패널 C) 및 재내피화된 구조물(패널 D)의 PECAM(적색) 염색. DAPI 양성 핵은 청색이다. 스케일 바는 100 마이크로미터를 나타낸다. *는 혈액 자가형광을 나타낸다.
재세포화된 조직 또는 장기 매트릭스의 혈전증은 이식 및 조직 또는 장기를 혈액으로 재관류시킨 이후에 발생하는 것으로 보고되는 현상이다. 또한, 이식된 조직 또는 장기는 종종 면역원성이고 수혜자는 종종 그 이식된 조직 또는 장기에 대하여 염증 반응을 일으킨다. 조직 또는 장기 매트릭스가 후속적으로 숙주에 이식되고 혈액으로 재관류될 때, 혈전생성을 감소시키는 조직 또는 장기 매트릭스를 재세포화하는 방법이 본원에서 기술된다. 또한 여기서 기술하는 재세포화 방법은 조직 및 장기가 이식되고 혈액으로 재관류될 때, 제한적 염증을 나타내게 한다.
여기서 기술된 대로의 조직 또는 장기 매트릭스 재세포화 방법은 생물학적 조직 또는 장기 매트릭스를 이용할 수 있다. 대표적인 생물학적 조직 및 장기 매트릭스는 예를 들어, 심장, 간, 신장, 폐, 췌장, 비장, 자궁, 방광, 식도, 기관지, 척수, 관절(예를 들어, 무릎, 어깨 또는 엉덩이), 피부, 유방, 근육, 장, 망 및 지방조직을 포함한다. 생물학적 매트릭스는 또한 예를 들어, 세포에 의해 분비 또는 리모델링 된 콜라겐 매트릭스를 포함할 수 있다. 여기 기술된 대로 생물학적 매트릭스를 재세포화하는 것은 통상적으로 매트릭스에 생존가능한 세포가 전혀 없거나 또는 적어도 실질적으로 없을 것을 요구한다.
생물학적 조직과 장기는 많은 알려진 방법을 이용하여 탈세포화할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 조직 또는 장기는 관류 방법을 이용하여 탈세포화할 수 있다. 관류-기반의 탈세포화 방법에 대한 설명은 예를 들어, WO 2007/025233과 문헌[Ott et al. (2008, Nat. Med., 14:213-21)]을 참고한다. 탈세포화의 관류 방법은 재세포화에 매우 좋은 매트릭스를 생산하는 것으로 나타났다. 예를 들어, WO 2007/025233; 문헌[Ott et al. (2008, Nat. Med., 14:213-21)]; 문헌[Uygun et al., 2010, Nat. Med., 16(7):814-20]; 문헌[Petersen et al., 2010, Science, e-pub June]; 및 문헌[Ott et al., 2010, Nat. Med., e-pub July]을 참고한다.
관류-기반 탈세포화의 대안으로서, 세포를 제거하는 탈세포화 용액에 담금으로써 생물학적 조직 및 장기가 탈세포화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,376,244호 및 제6,753,181호를 참고한다. 또한, 생물학적 조직 및 장기 매트릭스를 이용하는 것의 대안으로서, 합성 매트릭스가 혈관 베드형(vascular bed-type) 구조를 갖는다면, 여기 기술된 재세포화 방법은 그러한 합성 조직 또는 장기 매트릭스를 이용할 수 있다. 대표적인 합성 조직 및 장기 매트릭스는 예를 들어, 히드로겔, 중합체 (예를 들어, 생분해성 PLGA, PLA 또는 폴리우레탄과 같은 내구적 중합체), 콜라겐 스캐폴드, 콜라겐 파이브로넥틴을 포함하는 ECM 매트릭스 스캐폴드, 라미닌 및 이들의 조합을 포함한다.
여기 기술된 대로 조직 또는 장기 매트릭스를 재세포화하는 방법은 압력 하에서 조직 또는 장기 매트릭스를 생리적 완충액으로 관류시키는 것을 포함한다. 이러한 압력 하에서의 조직 또는 장기 매트릭스의 관류는 임의의 세포를 매트릭스로 도입하기 이전에 수행되며, WO 2007/025233에 기술된 탈세포화 과정에서 사용된 관류와 비슷하게, 장기 또는 조직 매트릭스의 맥관 구조 또는 다른 루멘(lumen) 또는 도관 구조(예를 들어, 폐 내의 기관지, 간 내의 담관, 신장 내의 요도 등)를 통하고, 일반적으로 장기 또는 조직 매트릭스의 맥관 구조(예를 들어, 동맥, 정맥, 소동맥, 소정맥 및 모세혈관) 및/또는 다른 루멘 및/또는 도관(이하 "맥관 구조형" 구조로 언급함)의 캐뉼러 삽입으로 시작한다(약 1 내지 약 300 Hg). 그래서 캐뉼러 삽입은 유체, 물질 또는 노폐물의 도입 또는 제거를 위해 기관지, 방광, 또는 혈관으로와 같이 체관, 공동 또는 혈관으로의 캐뉼러 삽입을 포함한다. 여기서 쓰인 것처럼, 장기 또는 조직 매트릭스의 압력 하에서의 관류는 유체 조성물(예를 들어, 생리적 완충액)을 충분한 압력 하에서 주입하여 조직 또는 장기 매트릭스에서의 맥관 구조 및 맥관 구조형 구조가 개방되고 확대된 채로 남아있되, 조직 또는 장기 매트릭스의 맥관 구조 또는 맥관 구조형 구조에 손상 또는 팽창을 일으킬 만큼 많이는 아닌 것을 지칭한다. 압력 하에서 조직 또는 장기 매트릭스의 사전세포 관류(pre-cellular perfusion)에 적합한 생리적 완충액은 조직 또는 장기 매트릭스와 혼화 가능한 임의의 완충액일 수 있다. 예를 들어, 생리적 완충액은 당 및 탄수화물과 같은 영양소를 포함할 수 있고, 또한 예를 들어, 혈관신생을 유도하는 화합물(예를 들어, VEGF, FGF-1 및/또는 bFGF)과 같은 전내피인자(pro-endothelial factor)(예를 들어, 내피세포 또는 내피에 촉진효과를 갖는 화합물)를 포함할 수 있다. 생리적 완충액은 일반적으로 생리적 pH값을 가진다.
일 실시태양에서, 사전세포 관류 또는 세포 관류에 적합한 생리적 완충액은 이식을 포함한 저장 및/또는 장기 관류에 쓰일 수 있는 영양 공급물, 예를 들어 포도당이 있는 완충액, EGM-2, EGM-2MV, DMEM, 프로모 셀(Promo cell) 내피세포 배지, 미디엄 200(Medium 200), DMEMF/12를 포함하나 이에 국한되지는 않는 내피세포 배양에 적합한 배양 배지 용액 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 심장 조직의 예를 들면, 그러한 것은 다음의 조성물로 제조된 변형된 크렙스-헨셀라이트 완충액(Modified Krebs-Henseleit buffer)(단위는 mM)을 포함한다: 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 11 포도당, 1.75 CaCl2, 및 2.0 피루베이트 및 5 U/L 인슐린 또는 118 NaCl, 4.7 KCl, 25 NaHCO3, 1.2 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 2 CaCl2를 함유하고 95 % O2, 5 % CO2의 기체로 채워진 크렙스 완충액(단위는 mM); 또는 포도당(예를 들어, 11 mM) 또는 1 또는 1.2 mM 팔미테이트와 결합되어 있는 포도당. 신장 조직에 대해 예시적인 배지는 KPS-1 신장 관류 용액이다. 간 조직에 대해, 예시적인 배지는 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 8 mM 포도당, 및 1.25 mM CaCl2를 함유하고 2 % BSA가 보충된 크렙스-헨셀라이트 완충액이다.
어떠한 특정한 기전에 얽매이지 않고서도, 이러한 압력 하의 사전세포 관류는 매트릭스 및 특히, 조직 또는 장기 매트릭스의 혈관 베드를 열고 씻어내며, 그렇게 함으로써 재내피화 동안 더 많은 매트릭스를 세포에 노출시키고 조직 또는 장기 매트릭스의 맥관 구조 전반에 걸쳐 생존 가능한 내피의 확립을 가능케 한다고 생각한다. 다른 조직 및 장기 매트릭스(예를 들어, 다른 공급원, 예를 들어, 심장, 간, 폐, 신장, 췌장 등으로부터)는 다른 크기의 압력을 견딜 수 있는 것으로 당업자에게 이해되기도 한다. 특정한 조직 또는 장기 매트릭스가 견딜 수 있는 압력의 크기는 적어도 일부만이라도 그 특정 조직 또는 장기 매트릭스의 혈관 베드에 관련되어 있다.
여기 기술된 대로 조직 또는 장기 매트릭스를 재세포화하는 방법은 또한 조직 또는 장기 매트릭스를 내피세포, 내피 유도의, 미성숙의 내피세포 또는 전구내피세포로 재내피화하는 것을 포함한다. 내피세포의 공급원은 자가유래 채취, 예를 들어, 생검으로부터 얻어진 것들을 포함한다. 자가유래 내피세포는 동맥, 정맥 또는 특정 조직의 생검을 통해 환자로부터 채취되고 집단의 정상 성장을 위해 세포 배양에 놓인다. 내피세포의 선택은 평활근세포를 포함하는 세포 집단을 오염시키는 것을 VEGF 또는 bFGF가 억제하는 배양 조건을 통해 또는 직접적인 FACS 분류법을 통해 또는 자성비드, 미세유체, 랩온어칩, 친화 컬럼 또는 그 집단이 CD31, VEGFR-1, VEGFR-2, CD105, CD144, TEM7, CD146 및/또는 D2-40을 포함하되 이에 국한되지는 않는 허용되는 내피세포 표면 마커 중 어느 하나에 기초하여 순수한 내피세포 집단을 선택하는 관련 장치와 같은 다른 이용가능한 생체 외 선택 방법을 통해 이루어진다.
전구내피세포(EPC (Endothelial progenitor cell), 내피전구세포)는 증식, 이동 및 내피세포로 분화될 능력을 갖추었으나 아직 성숙 내피세포의 특징을 획득하지 못한 미성숙 내피세포이다. EPC는 예를 들어, 조직 손상과 같은 특정한 생리적 자극에 반응하여 골수로부터 말초 혈액으로 이동할 수 있다(순환 EPC). 순환 EPC는 성인 혈액에서 식별되었으며(문헌[Asahara et al. (1997) Science 275:964-967]) 후속의 연구는 산후 혈관 신생에서뿐만 아니라 내피 집결성 및 기능의 유지에 있어서 EPC의 역할을 제시해 왔다. EPC는 혈액, 골수, 또는 제대혈에서 분리될 수 있으며 성인 말초 단핵 세포의 CD34+ 세포 분획에서 식별된다. 이러한 것은 CD34+ 세포 또는 CD133+ 세포를 단독으로 이용하여, 또는 말초 혈액에서 EPC 풍부 세포 분획으로서의 KDR+와 함께 이용하여, 직접적인 FACS 분류법 또는 자성비드, 미세유체, 랩온어칩, 친화 컬럼 또는 관련 장치와 같은 다른 이용가능한 생체 외 선택 방법을 통해 분리될 수 있다. 그리고 나서 EPC는 매트릭스로 직접 관류되고 증식 및 분화를 돕는 적절한 조건 하에서 배양되거나, 또는 최초의 증식 기간 동안 무혈청 스템스팬®(StemSpan®) 배지(스템셀 테크놀로지(StemCell Technologies), 밴쿠버, 캐나다)에서 7일 동안 배양하고 1% 페니실린-스트렙토마이신(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 세인트루이스, 미국) 및 재조합 인간 (rh) Flt-3 리간드(100 ng/mL), rh 줄기세포 인자(100 ng/mL), rh IL-3 (20 ng/mL), rh IL-6 (20 ng/mL)로 보충하는 것과 같이 EPC 유지 배양 배지에서 전체 세포 수를 늘리도록 시험관 내 배양할 수 있다. 이러한 세포는 그리고 EPC로서 매트릭스로 관류되거나 또는 EC로 사전분화되고 매트릭스로 관류된다. EPC의 분화는 FBS (2%), 하이드로코르티손, hFGF, VEGF, R3-IGF-1, 아스코르브산, hEGF, 젠타마이신, 암포테리신-B 및 헤파린을 함유하는 내피세포 성장 배지-2 (EGM-2)(론자, 바젤, 스위스)에서 약 3×105 내지 약 1×106/1.5 mL/9.6 ㎠ 배양하는 것과 같은 방법을 통해 얻을 수 있다. 3일의 배양 후에 세포는 수집되고, 약 1×106 세포/1.5 mL/9.6 ㎠의 밀도로 파이브로넥틴(10 ㎍/ml)(시그마-알드리치, 세인트루이스, 미국)으로 코팅된 플레이트로 옮겨지고, 신선한 EGM-2 배지에서 추가 3일 동안 배양될 수 있다.
동종이계 내피 또는 내피세포 전구체 집단은 수혜자의 조직적합성 타입에 근접하게 맞도록 수혜자의 것과 동종이계이고, 그 이용에 대해 잘 알려진 조직 타이핑 방법으로 시험된 조직으로부터 만들고 이용할 수 있다. 이러한 것들은 인간 제대혈관 내피세포(HUVEC), 면역원성을 줄이기 위해 유전공학적으로 변형된 내피세포, HLA 매치된 내피세포, 제대혈 유래 내피세포, EPC로부터 유래된 EC, 전구체, iPS 또는 배아줄기세포를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 가장 동종이계적인 접근은 이식 후 면역억제제의 사용을 필요로 할 것이다. 최근의 연구는 이식 후에 면역억제가 요구되지 않는 EPC로부터 유래된 EC의 면역 특권 특성을 증명하였다(문헌[Cardiovasc Res. 2010 Oct 1;88(1):121-9. Epub 2010 Apr 13]). EPC 분화 방법의 실시예는 다음을 포함한다: 팬콜 래트(팬-바이오텍(PAN-Biotech))로 밀도 구배 원심분리에 의해 혈액으로부터 EPC를 분리하고, CD45 단일클론 항체를 이용하여 CD45-고갈을 수행한다. CD45(-) 분획은 20 mg/mL 파이브로넥틴으로 코팅된 접시에서 내피 분화 배지 [5 % FCS, 50 mg/mL 젠타마이신, 10 ng/mL 래트 VEGF, 1 ng/mL 소 bFGF, 10 ng/mL 쥐 IGF-1 (모두 R&D 시스템), 10 ng/mL 쥐 EGF, 및 1 mg/mL 하이드로코르티손으로 보충된 EBM]에서 배양된다. 비부착성 세포는 매 4일마다 배지 교체를 통해 제거하였다. 증식 세포 덩어리가 배양 약 15일 내지 약 22일 후에 나타났고, 클로닝 고리 안에서 트립신을 처리함으로써 골라낸다. PECAM-1(+)세포는 PECAM-1 항체와 IgG1 미세비드를 이용하여 MACS 분리법으로 선택한다. PECAM-1(+) 분획은 또한 25계대까지 배양될 수 있고 다수의 매트릭스 안에 관류시킬 수 있다.
덧붙여, 면역억제 기술을 사용하는 것의 대안으로, 문헌[Smithies et al., 317 Nature 230-234 (1985)]에 의해 알려지고, 세포주에서의 유전자 교체 또는 제거(knockout)까지 확장된(문헌[Zheng et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)]) 줄기세포에서의 상동 재조합을 이용한 유전자 교체 또는 제거의 방법을 주조직적합성복합체(MHC) 유전자의 제거를 위해 내피 및 내피유래 세포에 적용할 수 있다. MHC 발현이 결여된 세포는 수혜자를 면역억제시킬 필요없이 동종이계, 및 아마 이종까지도, 조직적합성 장벽을 넘어 풍부한 내피세포 집단의 이식을 가능하게 한다. 공여 세포의 항원성을 줄이기 위한 재조합 방법의 사용에 관한 일반적인 검토와 인용은 또한 문헌[Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992)]에 개시되어 있다. 표면 변경에 의해 이식조직의 면역원성을 줄이기 위한 예시적인 접근이 PCT 국제 특허 출원 WO 92/04033 및 PCT/US99/24630에 개시되어 있다. 다르게는, MHC 항원을 변경하거나 삭제한 형질전환 동물로부터 세포를 제조하여 이식편의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
내피세포 전구체는 콜로니형성 단위-내피세포(CFU-EC), 순환 혈관형성세포(CAC), 순환 내피 전구체(CEP), 내피 콜로니-형성세포(ECFC), 저증식성 잠재적 ECFC(LPP-ECFC), 및 고증식성 잠재적 ECFC(HPP-ECFC)를 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
일 실시태양에서 내피세포 및 전구내피세포는 배아줄기세포(ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포(iPSC)를 줄기세포가 내피 계통 아래로 가도록 하는 적절한 조건 하에서 배양함으로써 얻어진다. 전구내피세포는 내피세포로 분화하기 시작한 세포이나(예를 들어, 예를 들어, 계통이 예정된; 예를 들어, 내피세포가 될 운명인 세포) 완전히 분화된 내피세포로 여겨지지는 않는다. 예를 들어, 전구내피세포는 CD133과 같은 전구체 마커를 발현할 수 있고 또한 제한 없이, 혈소판 내피세포-부착 분자-1(PECAM1; aka CD31), VEGFR-1(aka Flt-1), VEGFR-2(aka Flk-1), 구아닐레이트-결합 단백질-1(GBP-1), 트롬보모듈린(aka CD141), VE-카드헤린(aka CD144), 폰빌레브란트 인자(vWF), 및 세포간 부착 분자 2(ICAM-2)와 같은 내피세포 마커를 발현할 수 있다. 일반적으로, 전구내피세포는 또한 아세틸화된 LDL을 흡수할 수 있고, 나아가 VEGF를 향해 이동할 수도 있고 및/또는 마트리겔(Matrigel)에 튜브를 형성할 수도 있다.
인간 ESC 및 인간 iPSC와 같은 ESC 또는 iPSC는 또한 예를 들어, VEGF 및 bFGF와 같이 완전히 분화된 내피세포를 만들어 내는 조건 하에서 추가로 배양될 수 있다. 덧붙여 또는 이에 대신하여, 내피세포는 골수, 혈액, 피부, 간, 심장, 폐, 망막 및 내피세포를 보유하는 임의의 다른 조직 또는 장기와 같이 많은 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 대표적인 내피세포는 제한 없이, 혈액내피세포, 골수내피세포, 순환내피세포, 인간 대동맥 내피세포, 인간 뇌 미세혈관 내피세포, 인간 피부 미세혈관 내피세포, 인간 장 미세혈관 내피세포, 인간 폐 미세혈관 내피세포, 인간 미세혈관 내피세포, 간의 지누소이드 내피세포, 인간 복재정맥 내피세포, 인간 제정맥 내피세포, 림프 내피세포, 미세맥관 내피세포, 미세혈관 내피세포, 폐동맥 내피세포, 망막 모세혈관 내피세포, 망막 미세혈관 내피세포, 혈관 내피세포, 제대혈 내피세포 및 이들의 조합을 포함한다. 당업자가 이해하는 것처럼, 이것은 내피세포의 총망라한 목록으로 의도된 것이 아니다.
EPC는 밀도 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리함으로써 말초혈액에서 얻을 수 있다. 세포 현탁액은 세포를 지탱할 수 있는 임의의 리셉터클, 특히 배양 플라스크, 배양 플레이트 또는 롤러병, 및 더욱 특히 25 ㎠ 배양 플라스크와 같은 작은 배양 플라스크에 접종된다. 현탁액에서 배양된 세포는 대략 5×104 내지 약 2×105 세포/mL로 재현탁된다(예를 들어, 약 1×105 세포/mL). 고정된 기질에 평판배양된 세포는 대략 2 내지 약 3×103 세포/㎠로 평판배양될 수 있다. 경우에 따라, 배양 플레이트가 콜라겐과 같은 매트릭스 단백질로 코팅된다. 세포는 글루타민 및 다른 아미노산, 비타민, 무기물 및 트랜스페린과 같은 단백질 등과 같이 세포 대사에 요구되는 보충물들을 함유하는, 세포 성장을 지지할 수 있는 HEM, DMEM, RPMI, F-12 등을 포함하는 임의의 알려진 배양 배지에 놓일 수 있다. 배양 배지는 또한 효모, 박테리아 및 진균으로의 오염을 막기 위해 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 등과 같은 항생제를 함유할 수 있다. 배양 배지는 소, 말, 닭 등으로부터 유래된 혈청을 함유할 수 있다. 배양의 조건은 일반적으로 생리적 조건에 가까워야 한다. 배양 배지의 pH는 생리적 pH에 가까워야 한다(예를 들어, pH 6과 8 사이, 약 pH 7과 7.8 사이, 또는 pH 7.4). 생리적 온도 범위는 약 30 ℃ 내지 40 ℃ 사이이다. EPC는 약 32 ℃ 내지 약 38 ℃ 사이의 온도에서 배양될 수 있다(예를 들어, 약 35 ℃ 내지 약 37 ℃).
경우에 따라, 배양 배지는 하나 이상의 증식-유도("유사분열") 성장 인자가 보충된다. "성장 인자"는 단백질, 펩티드 또는 성장, 증식-유도, 분화 유도, 또는 EPC에 영양 효과가 있는 다른 분자이다. "증식-유도 성장 인자"는 세포의 표면에 있는 수용체에 결합하여 세포에 영양 또는 성장-유도 효과를 발휘하는 임의의 분자를 포함하는, EPC가 증식하도록 하는 영양 인자이다. 증식-유도 성장 인자는 EGF, 암피레귤린, 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF 또는 FGF-1), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF 또는 FGF-2), 전환 성장 인자 알파(TGFα), VEGF 및 이들의 조합물을 포함한다. 성장 인자는 대개 약 1 fg/mL 내지 1 mg/mL 사이 범위의 농도에서 배양 배지에 가해진다. 약 1 내지 100 ng/mL 사이 농도가 대개 충분하다. 특정 성장 인자의 최적 농도를 결정하기 위해 단순 적정법을 쉽게 수행할 수 있다. 성장 및 영양 인자의 생물학적 효과는 일반적으로 세포 표면 수용체에의 결합을 통해 매개된다. 수많은 이러한 인자들에 대한 수용체가 식별되어 왔고, 특정 수용체에 대한 분자 프로브 및 항체가 이용가능하다. 분화의 모든 단계에서 성장 인자 수용체의 존재에 대해 EPC를 분석할 수 있다. 많은 경우에서, 특정 수용체의 식별은 외인성 성장 또는 영양 인자의 첨가로 특정한 개발 경로를 따라 세포를 좀 더 분화하는 데 있어서의 이용 전략에 대한 지침을 제시한다.
일반적으로, 약 3-10일 이후 시험관 내, EPC의 배양 배지는 배지를 흡인하고 신선한 배지를 배양 플라스크에 가함으로써 보충된다. 경우에 따라, 흡인된 배지를 수집하고 여과하여 후속적 계대 EPC에 조건 배지로서 이용한다. 예를 들어 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상의 조건 배지가 쓰인다. EPC 세포 배양은 증식을 재시작하도록 쉽게 계대배양될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 약 3 내지 약 7일 후에 배양 플라스크를 잘 흔들고 이후 EPC를 50 mL 원심분리 튜브에 옮기고 낮은 속도로 원심분리한다. 배지는 흡인되고 EPC는 적은 양의 배양 배지에 재현탁하고 이후 세포를 세고, 증식을 재시작하기 위해 바람직한 밀도로 다시 평판배양한다. 각 계대에서 생존 가능한 세포 수의 대수적인 증가를 일으키도록 매주 이러한 절차를 반복할 수 있다. 바람직한 수의 EPC를 얻을 때까지 상기 절차를 계속한다.
EPC 및 EPC 후대는 필요할 때까지 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 저온 보존할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,071,741, PCT 국제 특허 출원 WO93/14191, WO95/07611, WO96/27287, WO96/29862, 및 WO98/14058, 문헌[Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)]을 참고한다). EPC는 특정한 저온보존제를 포함하는 등장액, 바람직하게는 세포 배양 배지에서 현탁할 수 있다. 상기 저온보존제는 디메틸술폭시드(DMSO), 글리세롤 등을 포함한다. 이러한 저온보존제는 5-15 %의 농도에서 쓰일 수 있다 (예를 들어, 8-10 %). 세포는 점진적으로 -10 ℃ 내지 -150 ℃로 냉동된다(예를 들어, -20 ℃ 내지 -100 ℃, 또는 -70 ℃ 내지 -80 ℃).
배양 조건에 따라, EPC는 내피세포 또는 평활근 세포로 분화될 수 있다. EPC는 분화-유도 성장 인자로 배양 배지 내 고정된 기질 상에서 내피세포 또는 평활근세포로 분화될 수 있다. 또한 EPC의 분화는 이노시톨 3인산염 및 세포 내 Ca2 +의 유리, 디아실 글리세롤의 유리 및 단백질 키나제 C 및 다른 세포 키나제의 활성화 등을 포함하며, 성장으로 이어지는 생물학적 사건의 캐스케이드를 활성화하는 당해 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 유도될 수 있다. 포볼 에스테르, 분화-유도 성장 인자 및 다른 화학적 신호로의 처리는 분화를 유도할 수 있다. EPC의 증식을 위해 증식-유도 성장 인자 대신(상기 참고), EPC의 분화에 영향을 주기 위해 배양 배지에 분화-유도 성장 인자를 가할 수 있다. 다른 분화 유도 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 티로트로핀 방출 호르몬(TRH), 전환 성장 인자 베타(TGF,s), 인슐린-유사 성장인자(IGF-1) 등을 포함한다.
분화된 내피세포 또는 평활근 세포는 당해 분야에 알려진 면역세포화학 기술을 이용하여 검출할 수 있다. 면역세포화학(예를 들어, 이중-표지 면역 형광 및 면역 과산화효소 방법)은 내피세포 또는 평활근세포의 세포적 특징 또는 표현형적 성질을 구별하기 위해 세포 단백질을 검출하는 항체를 이용한다. 내피세포의 세포 마커는 예를 들어, VE-카드헤린, CD144, CD141, CD106, 또는 CD142를 포함하는 반면, 평활근 세포의 세포 마커는 Flk를 포함한다. 면역세포화학은 또한 CD31 및 e-NOS와 같은 내피세포 유전자의 발현을 검출함으로써 내피세포를 식별하는 데에 쓰일 수 있다.
내피 유전자 mRNA에 특이적인 cDNA 또는 RNA 프로브를 이용하여 본래의 위치의 혼성화 조직화학 역시 수행할 수 있다. 특이적인 표현형의 식별을 강화하기 위해 이러한 기술을 면역세포화학요법과 결합할 수 있다. 필요하다면, 상기 논의된 항체와 분자 프로브를 세포 식별에 도움이 되도록 웨스턴 블럿과 노던 블럿 절차 각각에 적용할 수 있다.
내피세포는 예를 들어, 전 세계의 많은 생물학적 물질의 기탁소 중 하나에서 얻을 수 있다. 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(월드와이드웹 상 ATCC.org)) 또는 인터내셔날 디포지터리 오소리티 오브 캐나다(International Depositary Authority of Canada)(IDAC; 월드와이드웹 상 nml-lnm.gc.ca)를 참고한다. 내피세포 또는 전구내피세포는 또한 이식된 조직 또는 장기 매트릭스의 수혜자가 될 개체로부터 얻을 수 있다. 이러한 세포는 수혜자에게 자가유래인 것으로 여겨지곤 한다. 덧붙여, 특정 상황 하에서 조직 또는 장기 매트릭스와 내피세포 또는 전구내피세포의 관계는 동종이계일 수 있고(즉, 같은 종으로부터의 다른 개체들); 다른 경우, 조직 또는 장기 매트릭스와 내피세포 또는 전구내피세포의 관계는 이종일 수 있다 (즉, 다른 종으로부터의 개체들). 특정한 예에서, 조직 또는 장기 매트릭스가 수혜자에게 이종이고, 내피 또는 전구-내피세포가 수혜자에게 동종이계이다.
내피세포 또는 전구내피세포를 포함하는 조성물은 통상적으로 생리적 조건(예를 들어, 37 ℃) 하에서 세포와 혼화 가능한 용액으로(예를 들어, 생리적 조성물로) 조직 또는 장기 매트릭스로 전달된다. 여기 언급되듯이, 생리적 조성물은 제한 없이, 완충액, 영양소(예를 들어, 당, 탄수화물), 효소, 증식 및/또는 분화 배지, 시토카인, 항체, 억제인자, 성장 인자, 염류 용액, 또는 혈청-유래 단백질을 포함할 수 있다. 여기서 이용될 때, 내피세포 또는 전구내피세포를 "필수적으로 포함하는" 조성물은 내피세포 또는 전구내피세포 이외의 세포가 실질적으로 없으나 생리적 조성물에서 발견할 수 있는 성분들 중 임의의 것을 여전히 포함할 수 있다(예를 들어, 완충액, 영양소 등).
재내피화를 최적화하기 위해, 내피세포 또는 전구내피세포는 일반적으로 관류에 의해 장기 또는 조직 매트릭스로 도입된다. WO 2007/025233에 기술된 대로 사전세포 관류에서처럼, 관류가 장기 또는 조직 매트릭스의 맥관 구조 또는 맥관 구조형 구조(예를 들어, 다른 루멘 또는 도관)를 통해 일어난다. 장기 또는 조직 매트릭스를 재내피화하기 위한 관류는 세포의 생리적 조성물을 맥관 구조 또는 맥관 구조형 구조를 통해 순환시키기에 충분한 유속으로 이루어져야 하고; 그러나, 조직 또는 장기 매트릭스를 재내피화하기 위한 관류는 통상적으로 압력이 거의 없거나 무압력 하에서 수행된다(예를 들어, 혈관 베드를 확대하고 씻어내기 위해 사전세포 관류 단계에서 이용되는 것보다 더 낮은 압력). 내피세포 또는 전구내피세포로 관류시키는 것은 재내피화를 훨씬 더 최적화하기 위해 여러 가지 방향(예를 들어, 전진방향 및 역행방향)일 수 있다.
재내피화를 위해 조직 또는 장기 매트릭스에 도입되는 내피세포 또는 전구내피세포의 수는 장기 또는 조직(예를 들어, 어떤 장기 또는 조직인지, 장기 또는 조직의 크기 및 무게, 장기 또는 조직의 발달 단계, 및/또는 장기 또는 조직의 혈관화의 정도) 및 내피세포, 내피 유래의, 미성숙 내피세포, 또는 전구내피세포의 유형과 발달 단계 모두에 의존한다. 또한, 하나 초과 유형의 내피세포 또는 전구내피세포(예를 들어, 내피세포 또는 전구내피세포의 혼합제)가 장기 또는 조직 매트릭스로 관류될 수 있다. 다른 유형의 내피세포 또는 전구내피세포는 그러한 세포가 도달하게 되는 집단 밀도에 관하여 다른 경향을 가질 수 있고, 유사하게, 다른 장기 또는 조직 매트릭스는 다른 밀도로 재내피화될 수 있다. 단순히 예로서, 약 100 이상의(예를 들어, 약 103, 104, 105, 106, 107, 109 또는 1010 이상) 내피세포 또는 전구내피세포가 장기 또는 조직 매트릭스로 도입될 수 있다.
이식에 앞서, 매트릭스 또는 이식편은 예를 들어, VE-카드헤린, CD144, CD141, CD106, 또는 CD142를 포함하는 내피세포에 대한 세포 마커의 발현에 의해 정해진 대로 다수의 성숙 내피세포를 함유해야 한다. 면역세포화학은 또한 CD31 및 e-NOS와 같은 내피세포 유전자의 발현을 검출함으로써 내피세포를 식별하는 데에 사용될 수도 있다. 내피 분리의 비파괴적 방법으로는 트립신의 짧은 관류(0.25 % 또는 미만) 또는 내피세포의 0.01 % 미만(<0.01 %)의 작은 분획을 제거하여 이것을 CD105, CD31 및 e-NOS의 기능적 발현을 포함하고 이에 국한되지는 않는 내피세포 마커의 발현에 대해 분석할 수 있는 다른 세포 분리 방법이 있을 수 있다. 또한 내피세포의 기능은 마트리겔 분석법에서의 내피 튜브 형성을 통해 평가할 수 있다. 간단히 말해, 96-웰 플레이트의 웰은 50 ㎕ 빙냉 마트리겔™(Matrigel™)로 코팅하고 한 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한다. 그 후, 약 25,000 내지 약 50,000 내피세포를 함유하는 100 μL EGM-2 배지가 마트리겔™에 가해진다. 인큐베이션을 5 %의 CO2가 있는 37 ℃의 습윤한 대기에서 16 시간 동안 수행한다. 튜브 형성은 도립 현미경으로 평가하고 각각 하나의 웰의 디지털 현미경 사진은 4배율로 찍혔으며 튜브 길이의 총합뿐만 아니라 튜브의 총수, 분기점, 튜브의 길이를 각각의 웰에 대하여 계산할 수 있고 내피 튜브의 존재는 기능적인 내피세포를 정의하였다. 또한, 재내피화의 측정은 혈소판 활성화, 산화성 파열, 용혈, 섬유소 용해, 섬유소 형성, 트롬빈 생성, 접촉 활성화 및 보체 활성화를 포함하나 이에 국한되지는 않는 표준 혈액적합성 시험 및 분석법의 이용을 통해 완료할 수 있다. 비파괴적 방법은 셀타이터 블루(CellTiter Blue)에서와 같이 증식 분석법, 또는 본래 조직의 내피세포 밀도 50 % 초과를 가질 것을 목표로 하고 본래 조직의 공지값으로 외삽될 수 있는 매트릭스에 존재하는 내피세포의 밀도를 결정하기 위한 다른 대사 분석법의 이용을 포함한다.
재내피화의 측정은 혈소판 활성화, 산화성 파열, 용혈, 섬유소 용해, 섬유소 형성, 트롬빈 생성, 접촉 활성화 및 보체 활성화를 포함하나 이에 국한되지는 않는 표준 혈액적합성 시험 및 분석법의 이용을 통해 수행할 수 있다. 비파괴적 방법은 셀타이터 블루에서와 같이 증식 분석법, 또는 본래 조직의 내피세포 밀도 50 % 초과를 가질 것을 목표로 하고 본래 조직의 공지값으로 외삽될 수 있는 매트릭스에 존재하는 내피세포의 밀도를 결정하기 위한 다른 대사 분석법의 이용을 포함한다.
내피세포 도입의 관류 압력은 일반적으로 맥관 구조가 300 mm Hg 초과의 압력을 지탱할 수 있음에 따라 +/- 300 %의 범위 내에서 그 매트릭스 또는 스캐폴드가 유도된 조직 또는 장기의 원 관류 압력과 일치한다.
여기 기술된 바와 같이 재내피화된 조직 또는 장기 매트릭스는 수혜자에게 이식될 수 있다. 그러한 재이식된 조직 또는 장기 매트릭스는 응혈형성을 거의 나타내지 않고 면역원성을 거의 나타내지 않는다. 그러한 재내피화된 조직 또는 장기 매트릭스는 한번 이식되면 생체 내에서 추가로 재세포화될 수 있다. 이식 후에 그러한 재내피화된 조직 또는 장기 매트릭스는 생체 내에서(즉, 수혜자의 본래 세포로) 재세포화될 수 있다. 생체 내 재세포화는 내피세포 또는 전구내피세포 이외의 세포(예를 들어, 간세포, 담관 내피세포, 줄기세포, 전구세포, iPS 세포, 골수 단핵세포, 평활근세포, 심장 근육 세포, 심장 섬유아세포, 섬유아세포, 쿠프너 세포, 골격근 세포, 위성 세포, 신장 사구체 벽세포, 신장 사구체 발세포, 신장 근위 세뇨관 솔가장자리 세포, 헨레고리 세부 세포, 신장 원위 세뇨관 세포, 신장 집합관 세포, 1형 폐포세포(폐의 공기 공간 내벽 세포), 췌장관 세포(선포중심세포), 베타세포, 랑게르한스섬 세포, 세포, 사잇 세포, 장 솔가장자리 세포(미세융모있음), 외분비선 줄무늬관 세포, 담낭 내피세포, 부고환 주세포, 간질성 신장 세포, 및 또는 부고환 기저세포와 같은 조직 또는 장기 특이적 세포)로의 추가적인 재내피화 및/또는 재세포화를 포함한다.
경우에 따라, 조직 또는 장기 매트릭스가 재내피화되기 전 또는 조직 또는 장기 매트릭스가 재내피화된 후 내피 또는 전구내피세포 이외의 세포로 조직 또는 장기 매트릭스가 시험관 내에서 재세포화될 수 있다. 여기서 쓰인 바에 따르면, "내피세포, 내피세포 유래 또는 전구내피세포 이외의" 세포는 특정 조직 또는 장기를 이루는 모든 다른 유형의 세포를 말한다. 여기서 기술된 방법에서 줄기세포 또는 전구세포(예를 들어, 배아줄기세포(ESC), 성인줄기세포, 또는 유도된 다능성 줄기(iPS))가 조직 또는 장기의 실질을 재세포화하기 위해 이용될 수 있고, 또는 조직 또는 장기 특이적 세포(즉, 분화된 혹은 부분적으로 분화된 세포)가 조직 또는 장기의 실질을 재세포화하기 위해 이용될 수 있다. 조직 또는 장기 특이적 세포에서, 통상적으로 전달된 세포의 특정 유형은 궁극적으로 생산되고 있는 조직 또는 장기의 유형에 의존한다. 예를 들어, 심장을 재세포화할 때, 심장세포, 평활근세포, 심장 섬유아세포 및/또는 심장 줄기세포가 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입될 수 있고; 간을 재세포화할 때, 간세포, 담관세포, 평활근세포, 섬유아세포 및/또는 전구간세포가 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입될 수 있고; 신장을 재세포화할 때, 발세포, 사구체세포 및/또는 내피세포가 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입될 수 있으며; 폐를 재세포화할 때, 내피세포, 클라라세포, 배상세포, 폐포 1형, 및/또는 폐포 2형 세포가 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입될 수 있고; 췌장을 재세포화할 때, 베타세포 및/또는 랑게르한스섬 세포가 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 상으로 도입될 수 있다.
내피세포 또는 전구내피세포처럼, 내피 또는 전구내피세포 이외의 세포가 생리적 조성물로(예를 들어, 완충액, 영양소, 효소, 성장 또는 분화 배지와 함께) 조직 또는 장기 매트릭스로 전달될 수 있고, 많은 경로를 이용하여 전달 또는 도입될 수 있다(예를 들어, 주사(예를 들어, 다양한 위치), 관류, 주입, 및/또는 국소 도포).
내피 또는 전구내피세포 이외의 세포가 조직 또는 장기 매트릭스의 재내피화 이후에 도입되는 실시태양에서, 다른 세포가 전달되기 전에 그 내피세포 또는 전구내피세포가 조직 또는 장기 매트릭스의 맥관 구조 내에서 얼마 동안 부착하고 확립되도록 하는 것이 유익할 수 있다. 내피세포 또는 전구내피세포가 조직 또는 장기 매트릭스에 부착하기에 충분한 시간은 예를 들어 30 내지 180 분이다. 그러나, 내피세포 또는 전구내피세포는 예를 들어, 28-30 일까지 동안(예를 들어, 약 1달) 조직 또는 장기 매트릭스에서 부착하고 확립되도록 허용될 수 있다.
일 실시태양에서, 탈세포화된 간 이식편 또는 간엽은 이식되어 원래의 간 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 간 이식편을 만들기 위해 동맥, 정맥 및/또는 간 지누소이드 내피세포로 재내피화된다. 그 간 이식편은 인접한 간으로부터의 세포 이동을 통해 자연스럽게 생체 내에서 재세포화된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 간 이식편 또는 간엽은 이식되어 원래의 간 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 간 이식편을 만들기 위해 동맥, 정맥 및/또는 간 지누소이드 내피세포로 재내피화된다. 이식 후에, 간세포(자가유래, 동종이계, 줄기세포 유래 또는 iPS 유래)와 같은 다른 세포들은 환자의 맥관 구조를 통해 관류되거나 또는 간 이식편의 간극으로 주사된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 간 이식편 또는 간엽은 이식되어 원래의 간 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 간 이식편을 만들기 위해 처음에 재내피화되고 이후 간세포가 주사된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 심장 이식편 또는 패치는 이식되어 원래의 심장 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 심장 이식편을 만들기 위해 재내피화된다. 그 이식편은 문합되고 심장의 허혈부위에 위치된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 심장 이식편 또는 패치는 이식되어 원래의 심장 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 심장 이식편을 만들기 위해 재내피화된다. 이식 후에, 심장근육세포(자가유래, 동종이계, 줄기세포 유래 또는 iPS 유래)와 같은 다른 세포들은 환자 맥관 구조를 통해 관류되거나 또는 심장 이식편의 간극으로 주사된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 심장 이식편 또는 패치는 이식되어 원래의 심장 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 심장 이식편을 만들기 위해 재내피화된다. 심장의 허혈조직은 제거되며 재내피화된 이식편이 문합되고 외과적으로 이식된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 심장 이식편 또는 패치는 이식되어 원래의 심장 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 심장 이식편을 만들기 위해 처음에 재내피화되고 이후 심장근육세포를 주사한다. 심장의 허혈 조직은 제거되며 수축성 이식편이 문합되고 외과적으로 이식된다.
일 실시태양에서, 탈세포화된 폐 이식편 또는 폐엽은 이식되어 원래의 간 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 폐 이식편을 만들기 위해 내피세포로 재내피화된다. 폐 이식편은 인접한 폐 조직으로부터의 세포 이동을 통해 생체 내에서 자연스럽게 재내피화된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 폐 이식편 또는 폐엽은 이식되어 원래의 간 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 폐 이식편을 만들기 위해서 동맥, 정맥 및/또는 간 지누소이드 내피세포로 재내피화된다. 이식 후에 폐 내피세포(자가유래, 동종이계, 줄기세포 유래 또는 iPS 유래)와 같은 다른 세포들은 환자 맥관 구조를 통해 관류되거나 또는 폐 이식편 안으로 이식편의 간질로 주사된다.
일 실시태양에서, 탈세포화된 신장 이식편 또는 신장엽은 이식되어 원래의 간 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 신장 이식편을 만들기 위해 내피세포로 내피화된다. 폐 이식편은 인접한 신장으로부터의 세포 이동을 통해 생체 내에서 자연스럽게 재세포화된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 신장 이식편 또는 신장엽은 이식되어 원래의 신장 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 간 이식편을 만들기 위해 내피세포로 내피화된다. 이식 후에, 신장 세뇨관 세포(자가유래, 동종이계, 줄기세포 유래 또는 iPS 유래)와 같은 다른 세포들은 환자 맥관 구조를 통해 관류되고 신장 이식편 안으로 이식편의 간질로 주사된다.
일 실시태양에서, 탈세포화된 췌장 이식편 또는 췌장엽은 이식되어 원래의 간 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 췌장 이식편을 만들기 위해 내피세포로 재내피화된다. 폐 이식편은 인접한 췌장으로부터의 세포 이동을 통해 생체 내에서 자연스럽게 재세포화된다.
다른 실시태양에서, 탈세포화된 췌장 이식편 또는 췌장엽은 이식될 수 있고 원래의 췌장 혈액 공급으로 문합될 수 있는 이식가능한 간 이식편을 만들기 위해서 내피세포로 재내피화된다. 이식 후, 베타 세포(자가유래, 동종이계, 줄기세포 유래 또는 iPS 유래)와 같은 다른 세포들은 환자 맥관 구조를 통해 관류되고 췌장 이식편으로 이식편의 간질로 주사된다.
일 실시태양에서, 시작 물질은 관류 탈세포화된 간엽이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 관류 탈세포화된 간엽의 일부이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 좌심실로부터 분리된 관류 탈세포화된 심장 이식편이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 우심실로부터 분리된 관류 탈세포화된 심장 이식편이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 폐엽으로부터 분리된 관류 탈세포화된 폐 이식편이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 관류 탈세포화된 폐엽이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 관류 탈세포화된 신장이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 신장의 일부분으로부터 분리된 관류 탈세포화된 신장 이식편이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 관류 탈세포화된 췌장이다. 다른 실시태양에서, 시작 물질은 췌장의 일부분으로부터 분리된 관류 탈세포화된 췌장 이식편이다.
여기 나타난 대로, 여기 기술된 재세포화 방법은 조직 또는 장기 매트릭스의 광범위한 재내피화를 일으키고, 수혜자에게 이식되었을 때, 응혈형성을 거의 나타내지 않는 조직 또는 장기 매트릭스를 생산한다. 그러한 재내피화된 조직 또는 장기 매트릭스는 또한 이식 후에 이식된 조직 또는 장기에서 관찰되는 염증 및/또는 환자에 의해 일어나는 염증반응의 양에 기초할 때, 면역원성을 거의 나타내지 않는다.
본 개시내용에 따라 당해 분야에서의 종래의 분자생물학, 미생물학, 생화학 및 재조합 DNA 기술이 쓰일 수 있다. 그러한 기술은 문헌에서 완전히 설명한다. 본 발명은 다음의 실시예에서 더욱 기술될 것이며 이는 청구항에 기술된 물질의 조성물과 방법의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1―동물
모든 실험은 미국 동물복지법에 따라 수행되었고 미네소타 대학의 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 심장 매트릭스는 스프레이그 돌리(250-319 g) 또는 피셔 344 래트(196-296 g)로부터 유래하였다. 피셔 344 매트릭스는 이식 연구에 이용하였다. 심장 스캐폴드의 발생에 이용되는 모든 래트는 체중 kg 당 케타민 100 mg(휘닉스 제약(Phoenix Pharmaceutical))과 체중 kg 당 자일라진 10 mg(휘닉스 제약)으로 마취하고 이후 전신 헤파린화하였다.
실시예 2―사체의 래트 심장의 탈세포화
사체의 래트 심장을 이전에 공개된 방법에 따라 탈세포화하였다(문헌[Ott et al., 2008; Nature Med., 14(2):213-21]). 간단히, 래트를 마취하였다. 다음, 종격동 혈관을 노출시키기 위해서 정중흉골절개술을 수행하고 나서 심막을 절개하고 및 흉골후방 지방체를 제거하였다. 상행흉부대동맥으로부터 갈라져 나온 첫 번째 세 분지 및 양 상대정맥을 묶고 횡절단하였다. 하대정맥(IVC) 및 폐 혈관(정맥 및 동맥)을 횡절단하였다. 그리고 나서 분리된 심장을 흉강으로부터 제거하고 PBS를 함유하는 페트리 접시에 놓고, 카테터를 삽입하였고, PBS로 세척하였다. 그런 다음 심장은 1 % SDS로 중력 관류시키고 이후 탈이온수, 1 % 트리톤-X100(시그마(Sigma)), 및 항생제 함유 PBS (100 U/ml 페니실린, 100 U/ml 스트렙토마이신; 깁코(Gibco))로 씻어냈다.
실시예 3― 래트 심장 스캐폴드의 재세포화
래트 대동맥 내피세포(RAEC)는 벡 테크놀로지(Vec Technologies, 뉴욕, 렌셀러)로부터 구입하였다. 14 내지 20 사이 계대의 RAEC가 모든 실험에서 쓰였다. RAEC는 완전 MCDB-131(벡 테크놀로지)에서 젤라틴-코팅된 T185 플라스크 상에서 배양하였고 트리플 익스프레스(TrypLE Express, 인비트로겐(Invitrogen))를 이용하여 패스하였다. 대동맥을 통한 재세포화에서, 세포 현탁액의 역행성 대동맥 관류는 탈세포화된 스캐폴드 안으로 수행되고; 완두 동맥(BA)을 통한 재세포화에서, 연속적인 역행성 대동맥 배지 관류 하에서의 구조물은 BA로 주입되는 세포를 가진다. IVC를 통해 재세포화된 구조는 IVC 안에 위치하는 카테터를 갖고, 이후 RAEC 관류가 있게 된다. 모든 구조에 대하여 세포는 mL 당 1000만 세포로 주입된다. 달리 명시하지 않는 한, 구조물들은 조직 배양 인큐베이터에서 7일 동안 대동맥을 통해 연속 배지 관류로 배양하였다(완전 MCDB-131). 배지 저장조에는 실험의 지속을 위해 카르보겐(5 % CO2와 95 % O2)을 연속적으로 주입하였다.
실시예 4―세포 표지
연구의 일부로, 재세포화하는 날에 RAEC를 DiI 또는 DiO로 표지하였다. 간단히, RAEC의 조밀 플레이트로부터 배지를 제거하고 5 μM의 SP-DiIC18 또는 SP-DiOC18을 함유하는 DPBS(인비트로겐)로 대체하였다. 37 ℃에서 5분 동안 인큐베이션 한 뒤 플레이트를 냉각기로 옮기고 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션 하였다. 그 후 플레이트를 PBS로 한번 씻어내고 분리 및 구조물 접종 전에 배양 배지에서 37 ℃로 2 시간 동안 회복되게 하였다. 실험의 마지막에, 구조물을 생물반응기로부터 제거하고 스테레오 디스커버리 V20 마크로 스테레오(Stereo Discovery V20 Macro Stereo, 칼 자이스 인크.(Carl Zeiss Inc.)) 상에 영상화하고, 절단하고, 슬로우페이드(Slowfade)(인비트로겐)에 놓고, 510 메타 공초점 현미경(510 Meta Confocal microscope, 칼 자이스 인크.) 상에 영상화하였다.
별개의 연구에서, 완전 배양 배지를 제거하고 DMEM을 함유하는 무혈청 CMFDA (셀그로(Cellgro))를 37 ℃에서 45분간 순환시켜 RAEC 접종된 구조물을 셀 트랙커 그린 CMFDA (Cell Tracker Green CMFDA, 인비트로겐)로 배양 마지막 날(제7일)에 표지하였다. CMFDA 함유 배지는 이후 완전 MCDB-131로 대체하였고 구조물을 45분 동안 인큐베이션하였다. CMFDA-표지된 구조물을 이후 생물반응기로부터 제거했고, 절단하였고, 슬로우페이드(인비트로겐)에 두었으며 510 메타 공초점 현미경(칼 자이스 인크.) 상에 영상화하였다.
실시예 5―조직학 및 세포 핵/혈관 정량화
배양 마지막 날에, 생물반응기에서 구조물을 제거하였고 기저부터 정점까지 무작위로 분포되어 있는 네 개의 단축면으로 구획한 후, 파라핀 매립하였다. 파라핀 매립, 구획, 및 재수화 후, 표준 방법에 따라 헤마톡실린 및 에오신 또는 베르호프-반 기슨 염색을 하였다. 슬라이드는 니콘 이클립스 TE200 도립 현미경(Nikon Eclipse TE200 inverted microscope, 프라이어 코. 인크.(Fryer Co. Inc.))을 이용하여 영상화하였다. 핵 정량화를 위해서 염색되지 않은 슬라이드를 DAPI를 함유한 벡타쉴드(Vectashield, 벡터랩(Vectorlabs))에 봉입하고 각 구획마다 5개의 무작위의 고배율 영상이 찍었다. DAPI-양성 핵을 정량화하고 조직 면적에 대해 정규화하였다. 혈관 직경 정량화를 위해, 5개의 무작위로 분포된 고배율 영상을 베르호프-반 기슨 염색된 구획에서 찍었고 이전에 기술한 대로 처리하였다. 직경은 혈관을 함유하는 세포의 단축 직경을 이미지제이 소프트웨어(ImageJ Software, NIH)로 측정하여 평가하였다. 모든 영상은 니콘 이클립스 TE200 도립 현미경(프라이어 코.인크.)을 이용하여 수행하였다.
실시예 6― 면역형광 염색
파라핀 구획은 농도차가 있는 알코올과 크실렌의 변화를 통해 재수화하였다. 슬라이드를 pH 6.0에서 20분 동안 0.05 % 트윈-20(Tween-20)이 있는 10 mM의 시트레이트 완충액에서 끓였다. 한 시간 동안 PBS에서 3 % BSA로 블로킹을 수행하였다. PCNA, PECAM-1 (토끼 폴리클로날, 산타 크루즈(Santa Cruz)), vWF, eNOS, 칼레티닌, 비멘틴(토끼 폴리클로날, 애브캠(Abcam)), vWF (염소 폴리클로날, 산타 크루즈), FLK-1(쥐 모노클로날, BD 바이오사이언스), CD34, CD45, CD11b (쥐 모노클로날, 산타 크루즈), 알파-평활근 액틴(쥐 모노클로날, 시그마), 및 CD8 (토끼 모노클로날, 애브캠)에 대한 일차 항체를 PBS에서 10 ㎍/ml로 희석하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 슬라이드는 단계 사이에 0.05 % 트윈-20이 있는 PBS를 3회 교체하여 씻었다. FITC 또는 텍사스 레드(Texas Red, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))와 접합된 적절한 이차 항체를 1:250으로 희석하였고 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드는 DAPI-함유 봉입제로 봉입하고 니콘 이클립스 TE200 형광 현미경으로 시각화하였다.
실시예 7― G6PDH 분석법
배지를 생물반응기로부터 매일 채취하고 -20 ℃에서 저장하였다. 분석날, 샘플을 해동시켰고, 제조자의 지시에 따라 G6PDH 활성을 바이브란트 세포독성 분석 키트(Vybrant Cytotoxicity Assay Kit, 인비트로겐)를 이용해서 정량화하였다.
실시예 8―터널
배양 7일 후, 재내피화된 구조물을 포르말린으로 고정하였고 기저부터 정점까지 네 개의 대표적인 단축면으로 잘랐으며 파라핀 매립하였고 이후 구획하였다. 자국난 DNA를 염색하기 위해 데드엔드 컬러리메트릭 터널 시스템(DeadEnd Colorimetric TUNEL system, 프로메가(Promega))을 이용하였다. 파라핀-매립 샘플에 대한 제조자의 지시를 다음과 같이 변경하여 따랐다: 샘플을 탈파라핀화하고, 에탄올 시리즈로 재수화한 후, 10 mM 시트레이트 완충액에서 2분 동안 마이크로웨이빙하였다(문헌[trater et al., 1995, Histochem . Cell Biol., 103(2):157-60); 그리고 스트렙타비딘에 접합된 홀스래디쉬-퍼옥시다제를 이용하는 대신, 샘플을 다이라이트(DyLight) 594-접합 스트렙타비딘으로 처리하였다(잭슨 이뮤노리서치). 슬라이드를 DAPI를 함유하는 벡타쉴드(벡터랩)로 봉입하였고 니콘 이클립스 TE200 도립 현미경(프라이어 코.인크., 헌틀리, 일리노이)을 이용하여 영상화하였다.
실시예 9―시험관 내 트롬보모듈린 분석법
이전에 공개된 실시에서 트롬보모듈린 분석법을 채택하였다(문헌[Calnek & Grinnell, 1998, Experimen. Cell Res., 238(1):294-8; Ibrahim & Ramamurthi, 2008, J. Tissue Eng . Regen . Med., 2(1):22-32]). 배양의 마지막 날(제7일), 페놀레드가 없는 DMEM/F12(인비트로겐)로 총 45분 동안 1 mL/분의 유속으로 구조물을 3회 씻어냈다. 인간 알파-트롬빈을 함유하는 페놀레드가 없는 DMEM/F12(0.1 NIH U/mL; 헤마톨로직 테크놀로지(Haematologic Technologies)) 4 밀리리터 및 인간 단백질 C(12 ㎍/mL; 헤마톨로직 테크놀로지)가 그 이후 1 mL/분으로 45분 동안 대동맥을 통해 심장 구조물을 통해 연속적으로 순환하였다. 3회에서, 100 μL 배지를 96-웰 플레이트로 이동시켰고, 히루딘 스톡(12 ATU/mL; 아메리칸 다이어그노스티카(American Diagnostica)) 50μL와 섞었으며 37 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 각 샘플-함유 웰에 기질 S-2366 50 μL(최종 농도 0.75 mM; 크로모제닉스(Chromogenix))를 가했고 5분 동안 실온에서 인큐베이션 했다. 410 nm 및 490 nm에서의 흡광도는 스펙트라 맥스 340(Spectra MAX 340, 몰리큘러 디바이스(Molecular Devices))을 이용하여 측정했다. 최종의 상대흡광도는 410 nm로부터 490 nm에서의 흡광도를 뺌으로써 계산하였고 이후 무세포 스캐폴드 대조군으로 정규화하였다.
실시예 10―이소성 이식
수혜자 래트, RNU 누드(213-388 g) 또는 피셔 344(278-351 g)을 펜토바비탈나트륨(60 mg/체중 Kg, 복강 내 주사)으로 마취하였다. 복부 벽에서 하행 대동맥과 하대정맥을 노출시키기 위해 정중선 절개를 이용하였다. 공여자 심장 상행 대동맥 및 좌폐동맥의 수혜자 래트 복부 대동맥 및 대정맥으로의 단측문합은 오노 린지법(문헌[Ono, 1969, J. Thorac . Cardiovasc . Surg ., 57(2):225-9])에 따라 9-0 봉합으로 수행하였다. 래트는 이식 전에 식수에서 연속적인 항응고 치료(이식일에 두 번 체중 Kg 당 100 i.u., 다음 이틀 동안 피하로 체중 Kg 당 200 i.u.로 헤파린 나트륨)와 쿠마딘(0.25 mg/체중 Kg/일)을 받는 누드 매트릭스 단일의 이식조직으로 사전헤파린화하였다.
실시예 11― 래트 대동맥 내피세포의 관류 및 분배
내피세포 전달을 위한 최적의 기술을 결정하기 위해 세 개의 재세포화 방법을 조사하였다: (a) 대동맥을 통해 RAEC를 직접 관류, (b) 대동맥을 통한 배지 흐름과 BA를 통한 세포 관류, 또는 (c) 세포들의 병행 전달: 기술된 대로 처음에 IVC를 통하고 이후 BA를 통한 두 번째 주입. 전달 후에, 구조물을 배지의 역행성 대동맥 관류 하에서 분석하기 전 1주일 동안 배양하였다. 배양 7일 후에 세포의 편재화를 확인하고 세포충실성을 정량화하기 위해 구조물을 고정하였고, 기저부터 정점까지 분포되어 있는 4개의 단축면으로 구획하였고, 파라핀 매립하였으며 염색하였고 DAPI 양성 핵을 정량화하였다(도 1A). 각각의 전달 방법에서, 세포가 구조물 및 라이닝 된 혈관강 내에 보유되었다. 2000만 세포가 대동맥 또는 BA를 통해 전달되었을 때 매트릭스 내 내피세포의 숫자에서는 통계학적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 1A). 그러나, 대동맥을 통해 전달된 세포는 심장 전체에 걸쳐 균일한 분배를 얻지 못하였고 대신, 심장의 기저는 무세포로 남아 있는 반면 정점에 편재되었다. 정량화된 세포충실성의 통계학적으로 유의한 증가는 세포 접종 수가 2배가 되었을 때 관찰되었다. 가장 높은 세포충실성은 IVC와 BA 접종 구조물에서 발견하였는데 이는 심지어 동일한 세포 수의 단일의 BA 주입의 경우와 비교하여도 통계학적으로 유의하였다.
재세포화에 앞서 RAEC를 DiI와 DiO로 표지하는 것은 BA(도 1B-C) 또는 IVC 플러스 BA(도 1D-E)를 통해 전달된 세포를 접종한 구조물의 심장 매트릭스 전반에 걸쳐 세포의 균일한 분포를 확인시켰다. 이와 유사하게, IVC RAEC 관류 이후 정점부터 기저까지 심장 전반에 걸쳐 (DiO 양성)세포를 관찰할 수 있다. DiO 및 DiI 모두 표지된 세포 접종을 한 구조물의 검사는 심실 내벽에서 혈관이 단일 경로를 통해 전달된 세포로 재표면화되거나(도 2A 및 B)(즉, BA 또는 IVC 전달된 세포) 또는 양 경로 모두를 통해 전달된 세포를 함유함(도 2C)을 밝혔다. 좌심실 심내막 표면은 주로 BA로 전달된 세포로 재세포화되는 반면 우심실의 심내막 표면은 IVC를 통해 전달된 RAEC로 재라이닝된다(도 2D 및 E).
7일 동안 배양된 구조물의 조직학(헤마톡실린 및 에오신 및 베르호프-본 기슨 염색)은 엘라스틴 양성 동맥 혈관 및 엘라스틴 음성 혈관 모두가 그러했듯(도 3B 및 D), 다양한 직경의 혈관이 재라이닝되었음을 보여준다(도 3A-D). 이러한 결과는 RAEC가 재세포화 및 후속의 시험관 내 배양 동안 눈에 띄는 혈관 선호를 보이지 않는다는 것을 나타냈다. 심실 중벽부 내의 혈관의 직경 정량화는 IVC와 BA를 통한 세포의 병행 전달이 BA RAEC 전달 단독으로 하는 것보다 작은 혈관(직경 11 내지 25 마이크로미터)의 숫자에서 통계학적으로 유의한 증가를 일으킨다는 것을 밝혔다(도 3E). 정점 구역을 조사할 때, 혈관 직경 분포의 이러한 전달방법-의존성은 관찰되지 않았다.
실시예 12―배양에서의 래트 대동맥 내피세포 생존
재세포화된 구조물에서 RAEC 표현형을 유지하고 세포 사멸을 방지하기 위해 역행 관류가 충분한지 아닌지를 확인하기 위해 세 개의 다른 분석법을 사용하였다: (a) 시험관 내 배양의 마지막에 CMFDA 세포 표지, (b) 터널 염색법, 및 (c) 7일에 걸쳐 구조물 관류액에서의 포도당-6-포스페이트 탈수소화효소(G6PDH) 활성 정량화. 구조물을 BA 또는 IVC 단독을 통하여 재세포화하였고, 기술한 대로 7일 동안 배양하였고, 이후 CMFDA 표지하였다. CMFDA는 오로지 생존가능한 세포만 표지하고 그에 의해 나눠질 수 있기 때문에 이용되었다. 제7일에 BA- 및 IVC-전달된 세포 모두 CMFDA를 나눌 수 있었다(도 4A-C). 우심실을 라이닝하는 내피세포를 표지하였고(도 4C), 흔적 관상동맥을 나타낸다. 터널 분석법은 세포 위치에 관계없이(LV, RV 또는 격막) 제7일에 RAEC가 아폽토시스를, 만일 그렇다고 하더라도, 거의 나타내지 않았다는 것을 보여주었다(도 4D-I). 진행중인 세포 사멸의 지표로서, G6PDH 활성을 정량화하였다. 세포 전달 방법에 관계없이 실험 지속동안 G6PDH의 증가는 발견되지 않았다(도 4J). 이러한 결과는 어떻게 전달되었는지와 관계없이 재세포화된 심장 구조물을 통한 RAEC의 유지에 대동맥 관류가 충분하다는 것을 나타낸다.
실시예 13― 재내피화된 구조물의 시험관 내 표현형 분석
재세포화 후 제7일에 구조물에서의 세포의 면역형광 염색에 의해 RAEC 표현형과 기능을 조사하였다. 구조물 전체에 걸쳐, 증식이 계속 중임을 시사하는 PCNA+세포를 발견할 수 있었다(도 5A). 이처럼, eNOS+세포를 혈관 트리 전체에 걸쳐 발견할 수 있었고, 이는 세포가 기능적으로 남아있음을 암시하였다(도 5B). 마지막으로, RAEC는 폰빌레브란트 인자를 발현했으며(도 5C), 응혈을 통제할 수 있는 잠재력을 나타냈다. 재내피화된 구조물이 응혈 경로를 막을 수 있는지 없는지 결정하기 위해 구조물을 통해 순환하는 관류액에서 시험관 내 트롬보모듈린 분석법을 수행하였다. 그렇게 하기 위해서, 제7일에 트롬빈 및 단백질 C를 함유하는 용액을 재세포화된 구조물 또는 무세포 스캐폴드를 통해 순환시켰다. 트롬보모듈린과 트롬빈 매개 단백질 C 활성에 있어서 통계학적으로 유의한 6 내지 8 배의 증가를 보였다(도 5D). 단백질 C는 응혈 캐스케이드의 음성 조절자이고; 따라서, 이러한 결과는 재세포화된 구조물이 단백질 C를 활성화할 수 있는 능력을 보유하기 때문에 잠재적으로 응혈 캐스케이드를 막을 수 있다는 것을 나타낸다. BA 플러스 IVC 세포 전달된 구조물이 더 잘 수행하는 경향이 있기는 하지만, BA- 및 BA 플러스 IVC-재세포화 구조물은 유사하게 수행하였다.
실시예 14―이소성 체외이식편의 특성화
무세포 스캐폴드 및 BA RAEC 재내피화된 구조물 모두 수혜자 래트의 복부 안으로 이소성으로 이식된다. 이식에 앞서, RAEC의 부착과 성장을 위해 재내피화된 구조물을 7일 동안 배양하였다. 이식 후 제7일에 구조물을 체외이식하였고 검사하였다(도 6). 응고가 대동맥에서 형성되었지만 재세포화된 구조물에서 감소하였다(도 6A 및 E). LV벽 및 심실의 검사는 재내피화된 구조물에 비하여 무세포 스캐폴드 이식조직에서의 더 높은 응혈형성을 보였다(도 6B 및 F). 재내피화된 구조물에서 혈액으로 채워진 명백한 혈관이 관찰된 것에 반해(도 6D 및 I) 좀 더 묽은 혈액이 무세포 스캐폴드의 실질에서 관찰되었다(도 6C 및 G). 면역형광 염색에 의한 모집된 세포 특성화는(표 1) 대식세포(CD11b) 또는 림프구(CD8) 마커에 대해 양성인 것이 거의 없음(4 % 미만)을 나타냈다. 덧붙여, 평활근(SMA), 중피(칼레티닌), 전구내피(CD34), 내피(vWF) 및 섬유아세포(비멘틴) 마커는 오직 모집된 세포의 작은 부분집합에 의해서만 발현되었다(표 1). 모집된 세포의 대다수는 그 구조물이 재세포화 되었는지 아닌지 여부에 관계없이 세포 마커 PECAM+ 및 VEGFR2+를 발현하였다(도 7). 그러나, 전구세포 마커, CD34과 조혈모세포(CD45)는 오직 모집된 세포의 작은 부분집합에 의해서만 발현되었다(표 1).
Figure 112013027557352-pct00001
방법 및 물질의 조성이 수많은 다른 측면과 함께 여기 기술되었지만, 다양한 측면에 대한 위의 기술은 예시하기 위함이고 방법 및 물질의 조성의 범위를 제한하지 않는다고 이해해야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변경은 다음의 청구항의 범위 내에 있다.
개시된 방법 및 조성은 그 개시된 방법 및 조성의 생성물을 위해 이용될 수 있고, 이와 함께 이용될 수 있으며, 이를 생산하기 위해 이용될 수 있고 또는 이의 생성물이다. 이러한 및 다른 물질이 여기 개시되었고, 이러한 방법 및 조성의 조합, 부분집합, 상호작용, 군 등이 개시되어 있다고 이해한다. 즉, 이러한 조성 및 방법의 각각의 다양한 개별적인 및 집합적인 조합 및 치환에 대한 분명한 언급은 명쾌하게 개시되어 있지 않지만, 각각을 여기서 분명히 고려하고 기술한다. 예를 들어, 그 반대로 분명히 나타나 있지 않는 한 물질의 특정 조성 또는 특정 방법을 개시하고 논의하고 수많은 조성 또는 방법을 논의하며, 그 조성 및 방법의 각각 및 모든 조합과 치환을 분명히 고려한다. 이처럼, 이러한 것들의 어떠한 부분집합 또는 조합 또한 분명히 고려하고 개시한다.
모든 공보, 특허 및 특허출원은 여기에 참고로서 포함된다. 앞에서의 명세서에서 본 발명은 그것의 특정 바람직한 실시태양과 관련하여 기술되었고 많은 세부사항이 예시의 목적으로 만들어졌으며, 본 발명이 부가적인 실시태양을 허용하는 것과 여기 기술된 세부사항은 분명히 본 발명의 기본 원칙을 벗어나지 않고서도 상당히 다양화될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (24)

  1. a) 포유동물 혈관화 조직 또는 장기의 관류 탈세포화된 매트릭스를 제공하는 단계이며, 여기서 상기 장기 또는 조직의 상기 매트릭스는 혈관계를 포함하고, 유체가 상기 탈세포화된 매트릭스의 상기 혈관계 내의 한 입구에 도입되면 상기 혈관계가 유체를 보유하여 이것이 혈관계의 다른 통로를 통해 나가게 되는 것인 단계, 및
    b) 실질적으로 순수한 내피세포 또는 내피전구세포 집단을 포함하는 생리적 조성물로 상기 조직 또는 장기 매트릭스의 탈세포화된 맥관 구조를 전진방향 및 역행방향으로 관류시킴으로써 조직 또는 장기 매트릭스를 재내피화하는 단계
    를 포함하는, 조직 또는 장기 매트릭스를 생체 외 재세포화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 내피세포가 혈액내피세포, 골수내피세포, 순환내피세포, 인간 대동맥 내피세포, 인간 뇌 미세혈관(microvascular) 내피세포, 인간 피부 미세혈관 내피세포, 인간 장 미세혈관 내피세포, 인간 폐 미세혈관 내피세포, 인간 미세혈관 내피세포, 간의(hepatic) 지누소이드 내피세포, 인간 복재정맥 내피세포, 인간 제정맥 내피세포, 림프 내피세포, 미세맥관(microvessel) 내피세포, 미세혈관 내피세포, 폐동맥 내피세포, 망막 모세혈관 내피세포, 망막 미세혈관 내피세포, 혈관 내피세포, 제대혈 내피세포, 간(liver) 지누소이드 내피세포, 콜로니 형성 단위-내피세포(CFU-EC), 순환 혈관형성세포(CAC), 순환 내피 전구체(CEP), 내피 콜로니-형성 세포(ECFC), 저증식성 잠재적 ECFC(LPP-ECFC), 고증식성 잠재적 ECFC(HPP-ECFC) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 내피세포 또는 내피전구세포가 배아줄기세포(ESC) 또는 유도된 다능성 줄기세포(iPSC) 유래의 내피세포 또는 내피전구세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스가 혈관화 조직 매트릭스인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 장기 매트릭스가 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 장, 근육, 피부, 유방, 식도, 기관지, 또는 망(omentum)으로 이루어진 군에서 선택된 장기로부터 기원하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스가 장기 매트릭스인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 장기 매트릭스 및 내피세포 또는 내피전구세포가 이종의 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조직 또는 장기 매트릭스 및 내피세포 또는 내피전구세포가 동종이계의 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, b) 단계 이전에 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 조직 또는 장기 매트릭스 상으로 내피세포 또는 내피전구세포 이외의 세포를 도입하는 것을 더 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, b) 단계 이후에 조직 또는 장기 매트릭스 안으로 또는 조직 또는 장기 매트릭스 상으로 내피세포 또는 내피전구세포 이외의 세포를 도입하는 것을 더 포함하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 내피세포 또는 내피전구세포 이외의 세포를 포함하는 생리적 조성물이 관류, 직접 주사, 국소 도포, 또는 이들의 조합을 통해 조직 또는 장기 매트릭스로 도입되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 재내피화가 재세포화된 조직 또는 장기에서 응혈형성 및 면역원성을 감소시키는 것인 방법.

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