CN105980541A - 用于分离进行治疗评价和预测转移能力的侵袭性和转移性细胞的方法及装置 - Google Patents

用于分离进行治疗评价和预测转移能力的侵袭性和转移性细胞的方法及装置 Download PDF

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Abstract

本申请的实施例提供了一种装置的生产方法，所述装置体外模拟原发性肿瘤位点、次级远隔器官和循环的人体微环境。还提供了方法和装置，所述方法和装置提供用于分离原发性肿瘤、侵袭转移性细胞的平台，用于评价转移性肿瘤的治疗效果和诊断。

Description

用于分离进行治疗评价和预测转移能力的侵袭性和转移性细胞的方法及装置
相关申请的交叉引用
本申请要求，根据35U.S.C.§119(e)，于2014年1月22日申请的美国临时申请号为61/930,390以及2015年1月6日申请的申请号为62/100,375的优先权，在此将其以全文引入的方式并入本文。
技术领域
本申请中的实施例涉及一种用于培养细胞的方法和装置，更具体地，涉及一种用于在模拟人类原发性肿瘤位点、远处转移位点和循环的微环境条件下，培养癌细胞的方法和装置，从而研究癌症的疗法以及开发原发性、原位、侵袭性、转移性和复发性癌症的诊断和预测策略。
背景技术
癌转移是一个复杂的多步骤过程，其中恶性细胞从原发性肿瘤中脱离出来，通过组织的基底膜侵袭，在非贴壁依赖性条件下在循环中存活，并在次级位点定植(colonize)外部微环境(Gupta GP等人，细胞，127:679(2006)；Mehlen P等人，自然综述〃癌症，6:449(2006))。
癌转移是与癌症相关的发病的重要原因，占癌症相关死亡的90％(Gupta GP等人，细胞，127:679(2006)；Mehlen P等人，自然综述〃癌症，6:449(2006))。尽管开发了新的治疗策略，患有由大多数癌症发展的远处位点转移的患者的五年存活率保持在30％以下(社会AC.癌症事实&数字，美国癌症学会(2013))。由于癌转移而产生如此高的死亡率的原因很可能是因为缺少有效的可以明确确定和针对在很大程度上具有耐药性的转移癌细胞的治疗剂和早期诊断方案。
为了成功地定植次级位点，转移癌细胞必须找到一个支持其生存和生长的生态位。所述生态位包括特定组织的细胞外基质，基质、免疫及其它细胞成分，和分泌因素。
划痕试验、Transwell细胞迁移试验和侵袭试验等体外方法，仅评价了细胞在固体基质上或通过固体基质的迁移能力，并没有概括通过循环进行转移性传播而需要的非贴壁依赖性(Kam Y等人，BMC癌症，8:198(2008)；Kramer N等人，突变研究/突变研究综述(2012)；Liang C-C等人，自然实验手册2:329(2007))。另外，基质胶侵袭等侵袭试验不能解释原发性位点和次级位点的细胞外基质组成部分的不同(Ioachim E等人，欧洲癌症杂质期刊，38:2362(2002))。这些缺点在很大程度上限制了将标准体外方法应用于研究肿瘤细胞从原发性位点传播或侵袭次级器官的研究中，但不是两者都受到限制。癌转移的小鼠模型同样不适用于临床前使用，因其不能真实地概括人类疾病。
发明内容
本发明涉及一种细胞培养装置，一种综合系统，用于在体外模拟人类原发性肿瘤位点、次级远处器官和循环的微环境。有时，在此所述的细胞培养装置是指一个重建的癌转移模型或“rMet”系统、培养基、平台或模型。在此提供的数据显示了所述rMet系统概括了肿瘤发生(即原发性肿瘤，侵袭性、转移性和复发性癌症)的所有阶段和癌转移扩散的主要步骤：1)脱离原发性位点，2)通过基底膜侵袭，3)在非贴壁依赖性条件下生存，和4)次级位点的侵袭/定植(colonization)。另外，所述rMet系统同时考虑到原发性位点和次级位点的细胞外基质，从而克服了目前使用中的系统的主要局限性。
在其中一个实施例中提供的细胞培养装置，包括：a)第一组成部分，包含来自脊椎动物的流体，并且可选地包含原发性位点生长基质，b)第二组成部分，包含生物基质模拟物，和c)动力学流体组成部分，包含合成的或来自脊椎动物的次级位点生长培养基，其中所述流体组成部分与第一和第二组成部分流体接触。在其中一些实施例中，所述次级位点生长培养基的血清浓度比所述流体的高。例如，所述次级位点生长培养基的血清(血清替代物或血清取代物)浓度可能在10％-30％范围内，而所述流体的血清浓度在0％至5％之间。
在另一个实施例中提供的确定抗癌治疗剂的方法，包括：a)将含有潜在抗癌治疗剂的溶液加入到所述细胞培养装置中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的癌细胞，包括但不限于原发性肿瘤细胞、侵袭细胞和/或转移癌细胞，b)在加入潜在抗癌治疗剂之前和之后，检测所述细胞培养装置中的原发性肿瘤细胞、侵袭细胞和/或转移癌细胞的量，和c)确定潜在抗癌治疗剂。
在另一个实施例中提供的确定抗癌治疗剂对患者疗效的方法，包括：a)将含有潜在抗癌治疗剂的溶液加入到所述细胞培养装置的第一组成部分中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的癌细胞，包括但不限于原发性肿瘤细胞、侵袭细胞和/或转移癌细胞，b)在加入所述潜在抗癌治疗剂之前和之后，检测所述第二组成部分中的原发性肿瘤细胞、侵袭细胞和/或转移癌细胞的量，和c)确定抗癌治疗剂的疗效。
在另一个实施例中提供的一种预测和/或确定患者癌转移扩散的方法，包括：a)将含有患者癌细胞的溶液加入到所述细胞培养装置的第一组成部分中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的患者癌细胞，和b)在足够长的时间之后，检测在所述细胞培养装置的第二组成部分中是否存在转移癌细胞。
在本说明书中进一步会出现更多的实施例。
附图说明
本发明中的实施例将结合附图进行详细说明，使本发明易于理解。本发明中的实施例以举例的方式进行说明，而不仅限于附图中的图表。
图1A-D示出了多个实施例中的rMet模型装置，其用于模拟原发组织和次级器官的体内微环境；图1A示出了用作细胞培养装置的rMet模型装置，用于在体外(重建癌转移，rMet模型)模拟原发性位点(插入物)和次级位点(组织培养板的孔)，并具有一个用于在所述装置中搅拌流体的可选装置；图1B示出了固化基质胶(“原发性位点”细胞外基质)的低温扫描电子显微镜图像；图1C示出了聚合重建的骨髓(rBM)基质的低温扫描电子显微镜图像；图1D示出了在rMet培养一段时间后的细胞分布。
图2示出了rMet模型的一个可选装置，其中，原发组织和/或次级位点分别处于不同的容器中，所述容器通过一个可以使流体在所述容器间流动的资源(source)相连。
图3A-D示出了所述rMet模型，概括了实体肿瘤转移的复杂性；图3A示出了在rMet中培养的乳腺癌细胞的肿瘤样侵袭性转移癌细胞群的形成；图3B示出了在rMet中培养的原发性乳腺癌细胞的肿瘤样转移癌细胞群的形成；图3C示出了在rMet中培养的前列腺癌细胞的肿瘤样侵袭性转移癌细胞群的形成；图3D示出了在rMet中培养的肺、胃、胰腺、结肠、卵巢、黑色素瘤和睾丸癌细胞的肿瘤样侵袭性转移癌细胞群的形成。
图4示出了基于肿瘤类型的“转移癌位点”的移植时机。
图5示出了在rMet的“转移癌位点”，细胞倾向于以基质底层为基础进行癌转移移植。
图6示出了在rMet模型中的转移癌细胞保留了活性。
图7A-B示出了从所述rMet分离的细胞的癌转移能力；图7A示出了当肿瘤样细胞在体内的传播能力严重降低时，从所述rMet模型分离的转移癌细胞诱导癌转移；图7B示出了在多个次级位点出现的癌转移病灶。
图8示出了，与传统的培养方法相比，利用rMet平台进行效力试验的优点。
详细说明
在下述详细说明中，参考作为本文一部分的附图，其中通过举例说明本发明可以实践的实施例。需要了解的是，在不脱离范围的情况下，可以利用其它实施例并且在结构或逻辑上做出改变。因此，下述详细说明不能被理解为限制，并且实施例的范围通过权利要求书及它们的等同物限定。
不同的操作可能作为多个分离的操作，以有助于理解实施例的方式依次进行说明；但是，说明的顺序不意味着这些操作是依赖于顺序的。
本说明书可能基于视角进行说明，如上/下、在上方/在下方、后/前、和顶端/底端。这些说明仅仅是为了易于讨论，而不是为了限制实施例的应用。
定义
在此提供的细胞培养装置，用于在体外，在装置中培养真核细胞，所述装置用于重建细胞从有机体的原发性位点迁移到次级部位的过程。如上所述，所述细胞培养装置是一个重建的癌转移模型，有时被称为“rMet”模型、系统、细胞培养装置或平台。所述rMet模型允许肿瘤细胞从原发组织位点，如乳腺，传播至次级位点，如骨髓，与利用传统培养方法进行的传播相比，所述传播更类似于在体内的传播。所述rMet模型，为分离原发性肿瘤、侵袭性和转移性细胞提供了更好的机会，所述分离的细胞用于治疗剂开发、抗癌药物测试、评价治疗反应和预测个体肿瘤的转移可能性。
在下文中说明用于描述所述rMet模型的术语。
所述细胞培养装置可以应用组织培养容器或细胞培养容器。为了描述实施例，短语“组织培养容器”和“细胞培养容器”可交替使用，指任何适于真核细胞生长的容器/器皿，包括任何市售的或定制的容器/器皿。在一些实施例中，短语“组织培养插入物”、“细胞培养插入物”、“插入容器”或“Transwell小室”指放入组织培养容器中以形成多个隔离腔的装置。组织培养容器或容器插入物可以由以下材料制成，包括但不限于：聚苯乙烯、聚合物、玻璃、塑料等，并且具有一个适于细胞附着的处理/披覆/构成表面。插入物可能具有一个由以下材料构成的多孔膜：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或任何其他合适的材料。组织培养容器和/或插入物的表面可以是亲水的、疏水的、带负电荷的、带正电荷的、非离子的、或结构的改变，以增加一个或多个表面区域。另外，组织培养容器可以是透气的，和/或可以包括一个透气的保护盖/盖子/封闭物。实施例中的组织培养容器包括但不限于，烧瓶、单孔板、多孔板、微量滴定板、瓶子、皮氏培养皿、载玻片，及其他器皿。
在此使用的术语“来自于脊椎动物的流体”可以包括，但不限于，来自任何脊椎动物(包括但不限于人类、非人类灵长类、大鼠、鼠、兔子、猪、狗或其他)的血浆或血清、骨髓、腹膜液、腹水、脑脊髓液、全血、淋巴液和/或滑液、眼泪、尿液、唾液或其他任何的胃肠液。所述脊椎动物可以是健康的，也可以患有癌症或癌变前综合征。在其中一个实施例中，所述脊椎动物没有癌症并且是健康的，可以将来自相同或不同来源的肿瘤细胞加入所述系统中。在实施例中，所述脊椎动物患有癌症，所述流体可以包括来自任何患有任何形式的癌症的脊椎动物(包括但不限于人类、非人类灵长类、大鼠、鼠、兔子、猪、狗或其他)的血浆、血清、腹膜液、腹水、脑脊髓液、血液、淋巴液和/或滑液，所述任何形式的癌症，包括但不限于，实体瘤、骨癌、软组织癌、肌肉癌、皮肤癌和/或血癌。为了说明实施例，短语“健康脊椎动物”、“正常脊椎动物”或“无病脊椎动物”可以互换使用，指没有任何疾病或病理的脊椎动物。
在一些实施例中，所述第一组成部分也可以包括“原发性位点生长基质”，用于模拟所述原发性肿瘤生长位点或器官等健康组织。所述原发性肿瘤位点可以选自多种位点，包括膀胱、骨、脑、乳腺、宫颈、结肠、食道、肾、肝、肺、皮肤、卵巢、胰腺、前列腺、胃、子宫、睾丸、甲状腺等。在多个实施例中，所述基质包含细胞培养基，包括含有L-谷氨酰胺(或其他生长培养基)的RPMI-1640培养基和约1％的马血清。所述基质也可以包含抗菌剂、抗生素和/或抗真菌物质。例如，在此举例的多个实施例中，生长培养基包括含有L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基，20％的胎牛血清(FBS)，6.2x10-4M的CaCl2，1x10-6M的丁二酸钠，1x10-6M的氢化可的松和1％的青霉素/链霉素。
所述原发性位点生长基质的添加成分可以根据所述原发性肿瘤位点进行选择。添加成分可以包括基底膜(BM)、胶原蛋白(下述定义的CI-V是指胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV和胶原蛋白V)、纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、弹性蛋白、凝集蛋白聚糖等。
在下述表IA中示出了示例性原发性位点生长基质。并且进一步示出了代表性的浓度和适当的浓度范围。
表IA.原发性位点生长基质
#基质胶:LN；CIV(主要成分)
1骨肉瘤；2肌肉瘤；3软骨肉瘤
为了说明实施例，短语“生物基质模拟物”、“重建器官基质”、“器官特异性基质”或“细胞外基质”指的是包括基质胶等市售产品在内的任何物质、溶液、混合物，用于在体外模拟或近似于一种或多种生物基质，如细胞外基质、细胞内基质、基底膜和/或结缔组织结构。所述基质模拟癌转移位点或次级位点。可以基于次级位点或癌转移位点选择所述基质。添加成分可以包括基底膜(BM)、胶原蛋白(下述定义的CI-V是指胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV和胶原蛋白V)、纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)或相关的透明质烷、弹性蛋白、凝集蛋白聚糖、 或其他糖胺聚糖类、软骨素、皮肤素、或相关的细胞外基质或糖萼成分或它们的组合，等等。在下述表IB中示出了代表性的基质及其浓度。
表IB.生物基质模拟物
为了说明实施例，短语“次级位点生长培养基”指的是细胞培养基，包括含有L-谷氨酰胺或合适的生长培养基的RPMI-1640培养基，来源于骨髓基质细胞培养物的流体或来自脊椎动物的流体，并添加有6.2x10-4M的CaCl2，1x10-6M的丁二酸钠，和1x10-6M的氢化可的松。生长培养基也可以包含抗菌剂/抗生素/抗真菌物质。可以用马血清或来源于骨髓间质细胞培养物的流体代替来源于健康脊椎动物或患癌症脊椎动物的流体。实施例之间的生长培养基中各成分的摩尔浓度和/或质量摩尔浓度可以发生变化。“来源于骨髓间质细胞培养物的流体”可以包括从骨髓间质细胞培养物中采集的细胞培养基，所述骨髓间质细胞培养物，可以包括但不限于，来源于任何脊椎动物(包括但不限于人类、非人类灵长类、大鼠、鼠、兔子、猪、狗或其他)的骨髓间质细胞系或原发性骨髓细胞。短语“骨髓间质细胞培养物”指的是一个系统，其中，原发性骨髓细胞或骨髓细胞系在一个覆盖有细胞培养基的组织培养容器中生长。
设想所述流体和可选的所述原发性位点生长基质模拟肿瘤细胞起源的原发性肿瘤位点。在癌转移过程中，原发性肿瘤细胞需要侵袭并迁移到一个不同的位点，所述位点通过本发明中所述第二组成部分的生物基质模拟物进行模拟。体内的侵袭和迁移是通过循环系统介导的。在本发明中，所述动力学流体组成部分模拟了所述循环系统，并且其中的所述次级位点生长培养基模拟了循环血液或淋巴液。
在此背景下，当所述次级位点生长培养基中的血清含量比所述流体的更高时，发现所述系统的仿真效率有所提高。例如，所述次级位点生长培养基的血清浓度可能在8％-35％，特别是10％-30％范围内。与之相比，所述第一组成部分中的流体的血清含量可能是1％-5％，或更普遍地是0.5％-6％。
正如本领域中公知的，血清是除去血细胞和凝血因子后的血液成分，是不包含纤维蛋白原的血浆。血清包括所有不用于凝血作用的蛋白质，和所有的电解质、抗体、抗原、激素和任何外源性物质。天然血清可以从健康的或患癌症的脊椎动物血液中分离。
也可以制备和采用市售的合成血清、血清替代物或血清取代物(统称为“血清替代物”)。血清替代物代表性地含有在脊椎动物中发现的大多数或所有的主要血清蛋白质。所述主要血清蛋白质包括，例如，白蛋白、球蛋白和调节蛋白。更特定的例子包括，但不限于，前白蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1酸性糖蛋白、α1甲胎蛋白、α2-巨球蛋白、丙种球蛋白、β2-微球蛋白、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、补体成分3、补体成分4、C-反应蛋白(CRP)、脂蛋白(乳糜微粒、VLDL、LDL、HDL)、转铁蛋白、甘露聚糖结合凝集素、和甘露糖结合蛋白质。
在一些方面，所述次级位点生长培养基中的血清或血清替代物浓度至少为8％、9％、10％、12％、15％、18％、20％或25％。在一些方面，所述第一组成部分的流体中的血清或血清替代物浓度少于6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3％、2％或1.5％。在一些方面，所述次级位点生长培养基中的血清或血清替代物浓度至少高于50％或高于80％，或是所述第一组成部分的流体中的血清或血清替代物浓度的两倍、三倍、四倍或五倍。
孵化器、显微镜、泵等附加组成部分可以与所述细胞培养装置连接。术语“连接(coupled)”和“相连(connected)”可以与它们的衍生物一起使用。需要理解的是，这些术语不能作为彼此的同义词使用。当然，在特定的实施例中，“相连”可以表示两个或以上的元素，彼此之间直接物理或电接触。“连接”可以指两个或以上的元素直接物理或电接触。但是，“连接”也可以指两个或以上的元素，彼此之间不直接接触，但仍相互配合或作用。
为了说明实施例，短语“孵化器”是一个温控的加湿腔，具有控制的二氧化碳(CO2)环境，使细胞培养物保持在30℃-45℃的温度和1％-10％CO2的条件下。
在此使用的短语“实体肿瘤”指的是任何非造血起源的癌症，“抗癌治疗剂”指的是任何防止癌细胞生长或迁移、诱导癌细胞死亡和/或不利于癌细胞群生存和扩散的化合物，化学药品，物质，或这些化合物、化学药品和物质的组合，纳米颗粒，或其他药物载体。
为了说明实施例，短语“肿瘤”、“癌”、“恶性肿瘤”和“瘤”可以互换使用。
细胞培养装置及其组成部分
在此提供一种独特的系统，所述系统提供用于分离肿瘤细胞群的平台，以分离处于肿瘤发生不同阶段的细胞(如原发性肿瘤、侵袭性和转移性细胞以及经常性/复发性癌细胞)。
因为临床开发过程失败，超过90％的抗癌药物不能进入市场。尽管在临床前开发过程中，动物模型表现高效性，但新治疗剂在二期或三期临床试验，即功效阶段的衰减率最高。这表明用于临床前开发的实验性转移的啮齿动物体内模型不能真实地模拟人体组织的微环境。因此，开发了一种全面三维(3-D)体外重建转移(rMET)模型，将原发性位点和次级位点的截然不同的组织特异性人体微环境引入一个测试中，以概括转移的主要阶段(脱离原发性位点及远处器官定植)，包括非贴壁依赖性步骤。rMet系统的模块化设计允许建立器官特异性微环境，重建原发性和次级位点以及人类组织循环环境。特异性细胞外基质组成部分的存在使得人体肿瘤和非恶性细胞成功扩增，保持细胞-细胞互联，这些与体内的情况相似。
rMet模型不仅可以分离转移性和侵袭性细胞群，也提供了一种综合系统，用于研究癌症和其传播的基础生物学。rMet模型对于设计和评价新的靶向原发性肿瘤、侵袭性和转移性群的治疗剂，个性化治疗方案以确定对病人个体有效的药物，以及预测肿瘤个体的转移能力是个有用的工具。下文对这些实施例进行更充分的描述。此外，该模型适用于具有靶向特定细胞区室潜力的药物的高通量分析。
使用在此所述的方法和系统，可以对多种原发性肿瘤位点和转移性肿瘤位点进行研究。例如，原发性肿瘤位点包括但不限于膀胱、骨、骨髓、脑、乳腺、宫颈、结肠、子宫内膜、食管、肠、肾、肝、肺、口、肌肉、卵巢、皮肤、胰腺、前列腺、皮肤、胃、睾丸、甲状腺、子宫以及任何过度增殖组织，包括血管结构(如内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞、瘢痕、纤维化组织，外科粘连组织或过度增殖性骨病变)等。
使用在此所述的系统，可以对多种转移性位点进行研究。这些位点包括但不限于肾上腺、骨、脑、肾、肝、肺、淋巴结、卵巢、腹膜、皮肤、脾脏等。在一个实施例中，细胞培养装置不包括乳腺原发性位点和骨髓转移位点的组合。
在一个实施例中，细胞培养装置包括来自脊椎动物的流体，可选地包括原发性位点生长基质、包含生物基质模拟物的第二组成部分和动力学流体组成部分，所述动力学流体组成部分包含次级位点生长培养基，其中流体组成部分与第一和第二组成部分流体接触。
可用在此所述的细胞装置培养多种细胞。在某些实施例中，培养的细胞可以包括上皮细胞、造血细胞、基质细胞和/或任何其他真核细胞。尽管一些实施例涉及培养癌细胞，但本公开也涵盖用于培养各种类型细胞的组装装置、装置和方法，这些细胞包括但不限于原幼细胞、多形核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、早幼粒多形核细胞(pre-PMN cells)、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、淋巴细胞、B和/或T细胞、有核红细胞、早幼红细胞、嗜碱性粒成红细胞、嗜多染红细胞、正色红细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、肌上皮细胞，间充质干细胞、网状细胞、破骨细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞、间质细胞、神经细胞等。
在一个实施例中，第一组成部分包括来自脊椎动物的流体。在一些实施例中，流体来自于患癌症脊椎动物。该组成部分可以模拟原发性肿瘤位点。一些实施例进一步包括将来自健康的脊椎动物或患癌症脊椎动物的流体加入到生物基质模拟物的表面，而其他实施例进一步包括细胞培养流体和/或稀释剂加入到生物基质模拟物的表面。一些实施例包括来自脊椎动物的含有造血或基质成分的流体。一个或多个细胞粘附因子或其他因素，包括但不限于激素、生长因子、细胞因子、趋化因子，也可以添加到生物基质模拟物和/或流体。
第二组成部分包括生物基质模拟物。该组成部分模拟转移位点。在一个实施例中，基质模拟物具有器官特异性。在一个实施例中，器官特异性基质模拟肾上腺、骨髓、脑、肝或肺组织、淋巴结、卵巢、腹膜、皮肤、脾脏、结缔组织、骨、血管结构或关节等。
而在一些实施例中是生物基质模拟物，在其他实施例中，也可用另一种生物基质模拟物和/或的一个或多个组成部分作为生物基质模拟物。
此外，所述原发性位点生长基质、所述次级位点培养基和所述生物基质模拟物可以包含细胞粘附因子。细胞粘附因子在本领域中是已知的，包括纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、层粘连蛋白、弹性蛋白、玻璃粘连蛋白、健生蛋白、透明质酸、凝集蛋白聚糖、带正电荷的分子(如多聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚合丙烯酸树脂等)、细胞表面碳水化合物结合蛋白/糖蛋白、整合素、钙粘素、细胞粘附分子片段/亚基、细胞粘附分子合成类似物、明胶、多聚鸟氨酸等。实施例可以包括这些因素中的1、2、3、4、5、6或多个，作为各混合物的组成部分，和/或一种或多种，作为添加剂，添加到来源于健康脊椎动物或患癌症脊椎动物的流体中。另外，这些因素的比例和/或浓度可以在实施例间有所改变。
此外，可以在任何的所述混合物和/或所述来源于脊椎动物的流体中添加一种或多种稀释剂和/或细胞培养基。稀释剂/培养基可以包括水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、RPMI-1640生长培养基、最小必需培养基(MEM)、鹰的基本培养基(BME)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、Hank's平衡盐溶液(HBSS)、及它们的变形等。细胞培养基可以是新鲜的，或从脊椎动物细胞培养物中采集。
所述第一和第二组成部分与静态或动态流体组成部分流体接触。所述动态流体组成部分模拟循环系统。此组成部分包括前述的次级位点生长培养基。可以通过搅动或搅拌所述装置，使所述流体成为动态。可选地，所述装置可以与机械装置连接，所述机械装置可以移动所述系统。在其中一个实施例中，所述装置可以与搅拌装置，甚至是泵，连接或相连。这些将在下文中进一步讨论。
所述第一和第二组成部分与所述静态或动态流体层流体接触。在其中一个实施例中，所述第一组成部分和所述第二组成部分包括膜或其他多孔组成部分，其中所述组成部分的成分可以从所述第一组成部分通过所述动态流体组成部分移动到所述第二组成部分。
制备和使用细胞培养装置的方法
细胞培养装置可以是垂直的，如图1A所示，或是水平的，如图2所示。
图1A是描述rMet模型的基本组成部分和装置的示意图。将基质胶与人类癌细胞结合，混合物加入8μm孔的细胞培养插管中，细胞培养插管随后插入含有rBM基质的组织培养板的孔中。可设想本领域的技术人员能够容易确定合适的孔的大小。代表性插管的孔的大小是4μm到10μm。为了完成在细胞培养插管中设立原位肿瘤位点，将细胞/基质胶培养物放置在生长培养基上。为组装转移性位点微环境，将骨髓培养基(BMCM)加入到含有rBM的组织培养孔中。将整体装置放在章动搅拌器上，使基质上的介质得以搅拌。章动混合只是提供流体组成部分运动的一个选择。虽然此图指的是骨髓培养基，但各种培养基可以使用，包括但不限于生长培养基，健康脊椎动物或患癌症脊椎动物的流体等。
图1B描述聚合基质胶的结构，通过低温扫描电子显微镜可视化(比例尺：5μm)。图1C描述聚合rBM的结构，通过低温扫描电子显微镜可视化(比例尺：5μm)。图1D描述在rMet培养基14天后，细胞在肿瘤样成分中的分面，肿瘤样成分由在插管中基质胶截留的球体组成部分。侵袭性成分包含侵入基质胶中的细胞组成部分，形成插管模表面上的单层。最终，侵入基质胶中的转移性群体在非贴壁依赖性条件下的BMCM中存活，定植rBM基质。
在一些实施例中，rMet模型引入器官特异性细胞外基质成分，研究生理相关性行为中的实体瘤转移。在某些实施例中，rMet模型包括组织培养管，所述组织培养管加入形成凝胶的生物基质模拟物、覆盖有细胞培养基，随后插入到组织培养容器中，所述组织培养容器涂覆第一混合物、包含在第一混合物上形成凝胶的生物基质模拟物的第二混合物和第二混合物上覆盖的细胞培养基。在一些实施例中，人类癌细胞被嵌入在插管的凝胶内，用于重建原发性位点。插管随后置于设有凝胶和培养基的组织培养容器内。根据实施例形成rMet细胞培养基的方法在这里进一步描述。
在一些实施例中，形成rMet模型的方法包括将生物基质模拟物置入含有多孔膜的组织培养插管中以模拟原发性肿瘤位点，覆盖含有细胞培养基的混合物，将插管插入到包覆有生物基质模拟物的组织培养容器中以模拟感兴趣组织的基膜，覆盖形成凝胶的混合物以模拟组织，覆盖细胞培养基。搅拌装置与系统相连，所述搅拌装置选自蠕动泵或任一种泵、章动混合器、或其他任一种能够搅拌插管以下的细胞培养基的装置。然后培养整个装置。在一些实施例中，一个或多个真核细胞可以设置在涂层和凝胶之间，而在其他实施例中，真核细胞可以嵌入在任一个或两个腔室的凝胶中，或放置在任一个或两个腔室的介质中。其它实施例包括用于原发性和次级组织位点的独立的组织培养容器。
更具体地说，一种形成rMet模型的方法，包括：1)将真核细胞和生物基质模拟物置入含有多孔膜的织培养插管，其中混合物形成凝胶、真核细胞嵌入凝胶中，将第二混合物加入第二混合物表面，第二混合物含有来自脊椎动物个体的流体；2)用第一混合物包覆组织培养容器部分内表面，第一混合物含有特异于组织基膜的细胞外基质蛋白，将第二混合物加入到组织培养容器部分内表面上，第二混合物含有生物基质模拟物，其中第二混合物形成凝胶；将第三混合物加入到第二混合物的表面，第三混合物含有来自脊椎动物个体的流体；3)将(1)插入到(2)中，在以下条件下培养装置：流体(2)运动，温度约30℃-45℃，例如约37℃，CO2 1％-10％，例如约为5％的CO2。
在另一个实施例中，用于rMet模型的方法，包括：1)将生物基质模拟物置入含有多孔膜的组织培养插管，其中混合物形成凝胶、真核细胞嵌入凝胶中，将第二混合物加入第二混合物表面，第二混合物含有来自脊椎动物个体的真核细胞和流体；2)用第一混合物包覆组织培养容器部分内表面，第一混合物含有特异于组织基膜的细胞外基质蛋白，将第二混合物加入到组织培养容器部分内表面上，第二混合物含有生物基质模拟物，其中第二混合物形成凝胶；将第三混合物加入到第二混合物的表面，第三混合物含有来自脊椎动物个体的流体；3)将(1)插入到(2)中，在以下条件下培养装置：流体(2)运动，温度约30℃-45℃，例如约37℃，CO2 1-10％，例如约为5％的CO2。
在另一个实施例中，用于rMet模型的方法，包括：1)将真核细胞和生物基质模拟物置入含有多孔膜的织培养插管，其中混合物形成凝胶、真核细胞嵌入凝胶中；将第二混合物加入第二混合物表面，第二混合物含有来自脊椎动物个体的流体；2)用第一混合物包覆组织培养容器部分内表面，第一混合物含有特异于组织基膜的细胞外基质蛋白，将真核细胞和第二混合物加入到组织培养容器部分内表面上，第二混合物含有生物基质模拟物，其中第二混合物形成凝胶；将第三混合物加入到第二混合物的表面，第三混合物含有来自脊椎动物个体的流体；3)将(1)插入到(2)中，在以下条件下培养装置：流体(2)运动，温度约30-45℃，例如约37℃，CO2 1-10％，例如约为5％的CO2。
在另一个实施例中，用于rMet模型的方法，包括：1)将真核细胞和生物基质模拟物置入织培养插管，其中混合物形成凝胶、真核细胞嵌入凝胶中；将第二混合物加入第二混合物表面，第二混合物含有来自脊椎动物个体的流体；2)用第一混合物包覆组织培养容器部分内表面，第一混合物含有特异于组织基膜的细胞外基质蛋白，将真核细胞和第二混合物加入到组织培养容器部分内表面上，第二混合物含有生物基质模拟物，其中第二混合物形成凝胶；将第三混合物加入到第二混合物的表面，第三混合物含有来自脊椎动物个体的流体；3)将组织培养容器(1)和(2)相连，使得来自患癌症脊椎动物的流体移动通过每个组织培养容器的生物基质模拟物，在以下条件下培养装置：流体(2)运动，温度约30℃-45℃，例如约37℃，CO2 1％-10％，例如约为5％的CO2。
在如上所述的示例性实施例中，一种制备用于多孔组织培养板中真核细胞生长的培养装置，可以使用24孔组织培养板中的1孔(对于其他培养皿，相应调节体积)。
本领域的普通技术人员会很容易理解这些示范性方法可以修改，以得到所需结果。在一些实施例中，最初加入到孔中的时候，基质混合物中没有细胞，而在其他实施例中，基质混合物包含细胞。标记的细胞，正常细胞，癌细胞和其他类型的细胞可以单独或以组合的方式添加到基质混合物中。此外，生长介质可以添加到一些和/或所有的所述混合物中。
本领域的技术人员也应意识到再悬浮和之后加入到个别混合物中的细胞的最佳密度对于每个细胞类型是特定的。因此，在上述步骤中列出的密度在常规的实验中是多种多样的。实施例考虑rMet培养装置和方法中所用的细胞的多种密度。实施例也考虑添加剂的最佳添加量，所述添加剂包括但不限于抗癌化合物、抗病毒化合物、抗菌化合物、抗真菌化合物或介质补充物，所有这些都有助于促进感兴趣的细胞的生长，并阻止不感兴趣的细胞、病毒或生物的生长。
如上所述，细胞培养装置也可以是水平的。图2描述了rMet培养基的另一设置，其中图1A中细胞培养插管中原发性位点微环境设置在独立组织培养容器中，所述独立组织培养容器来自次级位点微环境，所述次级位点微环境设在独立容器中，在图1中装置的底部。连接两容器的管道代表图1A中“次级位点基质”所示的循环微环境。设置泵是为了移动容器间的流体，并等同于图1A中的章动混合器。肿瘤样细胞群形成原发性位点的组织培养容器中的球体，细胞在原发性位点处的基质迁移形成侵袭性成分，但侵袭性成分与组织培养容器内的膜保持接触。细胞从一个组织培养容器行进到另一个，形成转移性成分。
一个实施例进一步提供了一种用于支持原发性肿瘤、侵袭性和转移性细胞群的体外扩增的装置，提供接触癌干细胞，用于进一步分析。实施例中的装置提供一种临床前模型，用于测试药物和/或其他治疗对rMet细胞区室、癌细胞和/或肿瘤的影响。一个实施例提供一种装置，用于研究正常和恶性组织中的细胞因子/趋化因子和生长因子网络，以及正常组织稳态和疾病状态组织稳态的细胞传导。另一些实施例提供用于治疗剂的高通量和/或高内涵分析的装置，所述治疗剂具有靶向各种细胞区室的潜力，所述分析包括但不限于对单个细胞、正常细胞、癌细胞和实体瘤。
在一些实施例中，一个或多个真核细胞可能嵌入rMET模型的生物基质模拟凝胶层中，而在其他实施例中，真核细胞置于生物基质模拟物上方的流体中。在一个实施例中，第一种类型的细胞可以嵌入中间凝胶层，而另一种类型的细胞可以设置在底层和中间层之间。rMet组织培养装置进一步可以根据如上所述的rMet培养方法进行修改。
抗癌/抗增殖治疗的测试方法
实施例公开培养方法和装置，所述方法和装置有利于临床前测试的现在仍在研究的方面，测试中，在总的微环境下观察恶性细胞扩增。肿瘤微环境的rMet重建为在整个恶性等级上评价治疗策略和新药物的治疗潜力提供必要的工具。
在一个示范性实施例中，用于检测抗癌治疗的rMet模型重建原发性和次级位点的微环境，对正常和/或癌细胞进行治疗，可以对其进行观察，确定对细胞的治疗效果和潜在毒性和脱靶效应。一个实施例提供了确定抗癌(或抗增殖(抗HPP))的方法，包括：a)将含有潜在治疗剂的溶液加入到在此所述的细胞培养装置中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的原发性肿瘤、侵袭性、转移性癌干细胞或HPP细胞，b)在加入潜在抗癌治疗剂之前和之后，检测癌细胞在所述细胞培养装置中的量，和c)确定潜在抗癌或抗过度增殖治疗剂。在一个实施例中，细胞培养装置进一步包含用于检测转移性细胞定植的系统，所述系统与所述装置相连。在一个实施例中，细胞培养装置进一步包含与所述装置相连的数字显微镜。在另一个实施例中，细胞培养装置进一步包含与所述装置相连的流式细胞仪。
在一些实施例中，通过减少rMet组织培养装置的尺寸/体积和/或使用96孔、384孔、1536孔、3456孔或另一任何数目的孔的微孔板，装置可用于高通量筛选/分析。可以由个人、计算机、自动化机器、机器人或另一种方法观察培养基。rMet组织培养装置进一步可以用于高内涵筛选，可以包含自动化图像阅读器、数字显微镜/图像阅读器和/或流式细胞仪。根据不同实施例的数字显微镜可以是荧光显微镜、自动化显微镜、共聚焦显微镜、广角镜等。另外，用于检测癌症治疗的装置的实施例可以包括图像分析软件。
在一些实施例中，治疗剂放置在rMet装置中任一隔室中、管道、流体和/或基质模拟物。
实施例提供一种测量治疗剂对细胞的作用，包括但不限于对rMet装置中任何细胞的细胞毒性、抑制细胞生长、抗增殖、抗迁移和/或一些其他的作用。
确定抗癌治疗效果的方法
在一个典型的实施例中，用于确定抗癌治疗效果的rMet装置重建原发性位点和次级位点的微环境，对正常和/或癌细胞进行治疗，然后可以观察上述细胞，确定对这些细胞的治疗效果。实施例提供细胞治疗效果的测定方法，包括但不限于对于rMet装置中任何细胞的细胞毒性、抑制细胞生长、抗增殖和/或一些其他的效果。可以由个人、计算机、自动化机器、机器人或另一种方法观察培养基。rMet组织培养装置也可用于高内涵筛选，也可以包含自动图像阅读器、数字显微镜/图像阅读器，和/或流式细胞仪。根据不同的实施例，数字显微镜可以是荧光显微镜、自动显微镜、共聚焦显微镜、广角镜等。此外，为了检测癌症治疗的装置的实施例可以包括图像分析软件。
在一个实施例中，提供了一种确定患者肿瘤的抗癌治疗效果的方法，包括：a)将含有潜在抗癌治疗剂的溶液加入到在此所述的细胞培养装置的第一组成部分中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的转移癌细胞细胞，b)在加入潜在抗癌治疗剂之前和之后，检测转移性细胞在所述第二组成部分中的量，和c)确定抗癌治疗剂的效果。在一个实施例中，所述细胞培养装置进一步包括用于检测转移性细胞定植的系统，所述系统与所述装置相连。在一个实施例中，所述装置进一步包括与该装置相连的数字显微镜。在另一个实施例中，所述细胞培养装置进一步包括与该装置相连的流式细胞仪。
在一个实施例中，来自于患癌症脊椎动物个体的肿瘤细胞在rMet中培养，对rMet装置施加治疗，测量细胞毒性、抑制细胞生长、抗增殖和/或一些其他的效果。将个体治疗和/或组合施加到患癌症脊椎动物个体的rMet培养中，确认治疗可以清除rMet任一隔室中的癌细胞。该过程可以用于多个患癌症脊椎动物个体。
预测肿瘤转移能力的方法
在一个典型的实施例中，rMet装置重建原发性位点和次级位点的微环境，用于预测个体肿瘤的转移潜力。这些实施例提供一种用于测量肿瘤细胞的迁移和扩散能力的方法，以识别可能发生转移的个体肿瘤。可以由个人、计算机、自动化机器、机器人或另一种方法观察培养。rMet组织培养装置也可用于高内涵筛选，也可以包含自动图像阅读器、数字显微镜/图像阅读器，和/或流式细胞仪。根据不同的实施例，数字显微镜可以是荧光显微镜、自动显微镜、共聚焦显微镜、广角镜等。此外，为了检测癌症治疗的装置的实施例可以包括图像分析软件。
在一个实施例中，提供了一种预测和/或确定患者癌症转移扩散的方法，包括：a)将含有患者癌细胞的溶液加入到在此所述的细胞培养装置的第一组成部分中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的患者癌细胞，和b)在足够长的时间之后，检测所述细胞培养装置中第二组成部分中转移性细胞的存在或不存在。在一个实施例中，所述细胞培养装置进一步包括用于检测转移性细胞定植的系统，所述系统与所述装置相连。在一个实施例中，所述装置进一步包括与该装置相连的数字显微镜。在另一个实施例中，所述细胞培养装置进一步包括与该装置相连的流式细胞仪。
在一个实施例中，来自于患癌症脊椎动物的肿瘤细胞在rMet装置中培养，检测到的转移性细胞获取个体肿瘤转移能力。该过程可以用于多个患癌症脊椎动物个体。
当前公开的系统和方法也对靶向筛选和发现，以及评价侯选治疗剂的毒性和脱靶效果。例如，所述系统可以与微阵列、下一代测序、抗体阵列、质谱和多个其他技术联用，用以通过离体使用在此所述的系统筛选对恶性细胞和组织非治疗剂、组合或治疗程序/方案。
例如，药物发现可以基于非恶性、癌变前、非转移性、侵袭性和转移性细胞与癌干细胞以及之上任意组合的基因、蛋白、脂质、代谢产物和其他任何细胞内或细胞外组分的差异表达/生产。基于引入rMet的非增殖细胞群对药物治疗的响应，可对治疗剂的脱靶效应进行评价，如基质细胞(成纤维细胞、肌上皮细胞、脂肪细胞、成骨细胞、破骨细胞等)、血细胞(T细胞、B细胞、血浆细胞、白细胞等)、上皮和任何其他非癌组织，药物治疗。
在一个实施例中，本公开的系统可用于评价个别患者对单药剂或组合治疗的治疗反应。例如，在rMet中生长的肿瘤细胞暴露于潜在的治疗方法和，可基于细胞治疗反应和脱靶毒性，选择最佳治疗。
实施例
实施例1
与乳腺或前列腺原发性位点和骨髓次级位点一起使用的典型rMet系统
在一个rMet系统中，原发性位点是乳腺或前列腺，次级位点是骨髓，其中的基质混合物设定如下。鼠尾胶原蛋白I(BD Biosciences)的母液2mL在中性缓冲液的2X磷酸盐缓冲液(PBS)(100mM HEPES(Sigma))中稀释，pH 7.2-7.4。在实体骨和骨髓界面的外细胞基质层——重建骨内膜(rEnd)是不含CaCl2和MgCl2的1XPBS(Sigma)、1mg/mL人血浆纤连蛋白(Millipore)和2mg/mL胶原蛋白I的混合物，体积比为63：5.3:1。重建骨髓(rBM)基质设为基质胶(BD biosciences)、1mg/mL纤连蛋白、2mg/mL胶原蛋白I和2mg/mL透明质酸的混膈物，体积比为4：2.5：1：1。
rMet系统组装方法如下。重建骨髓(rBM)设于24孔细胞培养容器中，加入130μL/孔rEnd基质，在37℃下培养1h，除去多余流体，加入rBM基质75μL/孔，在37℃下培养1h。将1mL温暖的骨髓间充质干细胞条件培养基(BMCM)覆盖在固化rBM基质的顶部，即完成rBM的组装。收集培养骨髓间充质干细胞3天后(生长培养基：由6.2x10-4M CaCl2、1x10-6M琥珀酸钠、1x10-6M氢化可的松、20％FBS、1％青霉素/链霉素补充的RPMI-1640)的条件培养基，获得BMCM。
在含有8μm孔(Corning)的组织培养插管中建立乳腺或前列腺微环境：将基质胶(23μL)与乳腺或前列腺癌细胞混合，密度为2.5x104细胞/7μL PBS/插管，将基质胶/细胞混合物移液到细胞培养插管中，在37℃凝胶化30min，将每个插管放入24-孔组织培养容器的一个孔中，所述组织培养容器预先设有rBM基质，用温暖的生长培养基(由1％马血清(Sigma)和1％青霉素/链霉素补充的RPMI-1640)覆盖插管中的细胞/基质混合物。装置整体置于章动搅拌器上，搅拌培养基，置于37℃、5％CO2的组织培养箱中。
为了可视化聚合基质，使用低温扫描电子显微镜。对于低温扫描电子显微镜，将少量基质胶或rBM基质放置于低温保持器的狭缝插管中，低温保持器随后投入半熔化液氮中。抽真空，样品转移到Gatan Alto 2500预置室(冷却到-170℃)。将冷冻手术刀切断样品形成自由断裂面，样品在-90℃下升华10min，随后溅射镀铂金120s。然后将样品转移到显微镜低温台(-130℃)成像。
根据表IA和IB的信息，该系统可用于大量不同原发性位点和次级位点。
实施例2
rMet系统中不同转移性癌细胞的再定植
在图3和图4描述的实施例中，不同细胞株以与实施例1相似的方法在rMet系统中测试。测试的细胞株如下：在rMet培养基中生长的乳腺癌(MCF10A，MCF10ANEOT，MCF10CA1H，MCF10CA1A，MDA-MB-231，MDA-MB-231BO，MCF7)、前列腺癌(前列腺癌)、肺癌(A549)，胃癌(AGS)，胰腺癌(Panc-1)、大肠癌(LoVo)，卵巢癌(SK-OV-3)、恶性黑色素瘤(A375)，睾丸癌(NTERA-2)细胞株培养在RMET。细胞株来自ATCC和Barbara Ann Karmanos癌症机构。从患有侵袭转移性癌症的患者分离得到的乳腺癌细胞也使用rMet模型测试。装置的制备和各种使用的基质的更多细节提供如下。
聚合胶原蛋白I凝胶的制备
1)制备好的中性缓冲溶液：2XPBS中100mM HEPES。该溶液的pH是7.0。
2)将10.21mg/mL鼠尾胶原蛋白I在中性缓冲溶液中稀释制得2mg/mL胶原蛋白I溶液。将溶液在移液管中低速涡旋并充分混合。
3)在步骤2制备的溶液加入到孔板，在37℃下培养至少1h，使其充分聚合，形成凝胶。根据所需凝胶厚度，确定加入的体积。
重建骨内膜(rEnd)的制备
1)制备5mL rEnd：将纤连蛋白(1mg/mL母液)384.6μL、胶原蛋白I(2mg/mL母液)72.3μL和1X PBS 4.543mL混合，保持在冰上。
重建骨髓基质(rBM)的制备
1)制备104μl基质胶的rBM：将纤连蛋白(1mg/mL母液)68μl、胶原蛋白I(2mg/mL母液)28μl和透明质酸(2mg/mL)28μl混合，保持在冰上。
骨髓生长培养基(BMGM)的制备
1)制备BMGM：将氯化钙(0.62M母液)500μL、琥珀酸钠(1x10-3M母液)500μL、氢化可的松(1x10-3M母液)500μL和1％青霉素/链霉素加入到含有10％FBS的RPMI-1640培养液培养394mL中。
乳腺上皮细胞生长培养基(MEGM)
1)制备MEGM：将1％青霉素/链霉素、1％马血清加入到RPMI-1640 490mL中。
建立重建转移(rMET模型)
1)将基质胶在4℃解冻过夜。
2)按照上述方法制备rEnd,rBM,MEGM和BMGM。
3)将rEnd 130uL加入24孔板的每个孔中。
4)将其在37℃下培养1小时。
5)用rEnd培养1h，将溶液从孔中移出，将rBM 75uL加入到每个孔的中心，将板在37℃下培养1h。
6)24孔板中每个孔中，将7uL PBS中25000个细胞和基质胶23μL混合。
7)将步骤6的混合物轻轻地添加到插管的膜上，并均匀分布。
8)将细胞/基质胶混合物在37℃下培养30分钟。
9)一旦组织培养板和插管中的基质固化，将每个插管置于24孔板中的孔中，所述24孔板提前放置基质。
10)将BMGM 1mL加入到组织培养板的每个孔中。
11)将MEGM 400mL加入到插管中。
12)将整个装置放置在章动搅拌机上，放入37℃和5％二氧化碳的培养箱。
使用亮视野显微镜，细胞在rMet模型中培养12-14天，顶部侵袭转移性成分的亮视野图象使用配有Axiovision软件4.7.3(Zeiss)的Zeiss Axiovert倒置显微镜拍摄。使用Zeiss Axiovert 40C倒置显微镜观察rMet中的细胞迁移。
图3所示的板描述人体乳腺癌细胞株(图3A)、人体乳腺癌原代细胞(图3b)、前列腺癌(图3c)、肺癌细胞株(图3D(a))、胃癌细胞株(图3(b))、胰腺癌细胞株(图3(c))、结肠癌细胞株(图3D(D))、卵巢癌细胞株(图3D(E))、黑色素瘤细胞株(图3D(F))和睾丸癌细胞株(图3D(G))分别在rMET模型中培养14天，并成像。所有类型的肿瘤产生原发性肿瘤样部分、侵袭性部分，包含细胞培养插管上的膜上生长的细胞(黑色点：模上的孔)以及转移性部分。
图4描述细胞在rMet模型中转移的倾向非常匹配细胞在体内转移倾向。高度转移性细胞，例如，MCF10CA1a、MDA-MB-231、MDA-MB-231BO、PC-3、A549和AGS稳定地形成rMet中转移性部分，14天后占组织培养容器的90％以上。中度转移性细胞，例如，PANC-1、LOVO、和SK-OV-3形成转移性部分，占组织培养容器的50-75％。弱转移性部分和非转移性细胞，例如MCF10AneoT、MCF10CA1h、A375和NTERA-2形成稀疏的转移部分，非转移性细胞，例如，MCF10A、MCF7和LNCaP细胞没有在rMET中形成转移层。
表II提供了在此所述系统使用的不同细胞株的转移性特点。
表II不同癌细胞株的转移性和rMet迁移特点
图5描述了基质成分对维持rMet中细胞的转移性能力的作用。rMet培养基(组织培养容器)的底部室内设置有不同的基质成分或它们的混合物(基质胶/纤连蛋白、胶原蛋白I(CI)、纤连蛋白(FN)、透明质酸(HA)、或RBM(基质胶、胶原蛋白I、纤连蛋白、透明质酸的混合物))，在rMet培养基中14天后观察转移性部分的形成。rBM能够维持转移性细胞有最大的数量，同时基质胶/纤连蛋白混合物或个别成分不能维持转移性部分的形成在相当的水平(p-值＝0.0056)。
实施例3
rMet系统的细胞活力
在图6所示的实施例中，进行rMet细胞培养，随后，测量每个部分的细胞活力。根据实施例1制备细胞装置，对下列细胞株进行测试：乳腺癌(MDA-MB-231、MDA-MB-231BO、MCF7)、前列腺癌(PC-3和LNCap)、肺癌(A549)、胃癌(AGS)，胰腺癌(Panc-1)、大肠癌(LoVo)、卵巢癌(SK-OV-3)、恶性黑色素瘤(A375)、睾丸癌(NTERA-2)。
为了测量rMet模型中12-14天后的细胞活力，根据供应商的指导，对肿瘤样、侵袭、转移部分使用LIVE/DEAD活力/毒性试剂盒(美国生命技术公司，Life Technologies)进行染色。简而言之，用1μM钙黄绿素AM和乙锭同源二聚体-1在37℃下培养细胞30min。在染色1h后，在Zeiss AxioObserver显微镜上分别使用493nm和528nm滤件对钙黄绿素和乙锭产生的荧光进行成像。编辑图像的亮度、对比度或大小，使用ImageJ软件(1.46r版本，NIH)添加比例尺。
图6描述了每个细胞株在rMet模型中培养14天后，大多数转移性细胞(95％)在rMet中存活(绿色：钙黄绿素AM阳性，活细胞；红：乙锭同源二聚体-1阴性，死细胞)。
实施例4
与含有移植模型的rMet系统的对比
在图7的示的实施例中，建立移植模型，验证来自rMet的转移性部分的转移能力。
为评价来自rMet模型的细胞的转移潜力，根据供应商的指导，并做以下修改，使用Cell Recovery Solution(CRS)(BD biosciences)从14天rMet培养基中分离得到肿瘤样和转移部分。去除rMet系统中顶部室和底部室的介质，分别将565μL和1585μL冰冷的CRS加入到细胞培养插管和板中的剩余基质层中。CRS/细胞/基质混合物转移到微离心管，在冰上培养1h。随后，细胞以1800rpm离心10min，除去CRS,用2XPBS冲洗。细胞颗粒再悬浮于1XPBS中，用于注射。原发性肿瘤样或转移性细胞100mL使用271/2规格的针头注入NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)鼠(Jackson实验室)的左心室。使用异氟醚麻醉小鼠(3.0L/min O2中2.0-2.5％；VetEquip工作台-顶部蒸发器)。所有动物实验的进行得到动物保护和使用委员会的批准。当动物出现无力、活动能力丧失、体重减轻或出现明显肿瘤＞1cm3时，采用CO2窒息/颈脱位处死动物。在尸检中，使用Canon Powershot A650IS数码相机获得器官损害和转移性病变的图像。
图7A说明，与原发性肿瘤样群体相比，来自rMet的转移性群体产生转移性病变的频率较高，灵敏度100％(即所有注射转移性成分的动物出现远处位点转移)。
图7B提供次级位点处转移性病变的实施例，如骨、肺、卵巢、肝、肾。
实施例5
用流式细胞仪评价取自移植物的肿瘤细胞中人类白细胞抗原(HLA)的存在。
肿瘤片段切成小块，用0.5mg/mL-1mg/mL胶原酶(Sigma)或释放酶(Roche)在37°C下培养30min，在700rpm下振荡。加入生长培养基，将酶灭活，游离细胞穿过40μM细胞滤器(BD)，在3000rpm离心10min，用1x PBS洗涤一次，再次离心。使用用针头为271/2规格的10mL注射器用30mL-40mL 1X PBS将细胞由股骨和颈骨中冲洗出来。冲出来的细胞通过上下移液，破碎团聚体，穿过40μM细胞过滤器，并在3000rpm下离心10min。细胞颗粒再悬浮于蒸馏水中1min，溶解红细胞。随后，加入几体积的1XPBS，细胞在3000rpm下离心10min。游离细胞用10％中性福尔马林(NBF)在室温下固定15min，在3000rpm下离心10min，用PBS冲洗，在4℃下储存在PBS中。根据供应商的指导，使用抗小鼠CD16/32FC Block试剂(BD Pharmingen)和M.O.M试剂盒(Vector实验室)封闭非特异性结合。细胞用小鼠抗HLA-A-C-PE-Cy5或小鼠IgG1κ-PE-Cy5同种型对照(BD Pharmingen)培养1h(1:50稀释)，在Beckman Coulter FC500流式细胞仪上进行分析。使用FlowJo软件(10.0.6版本)进行数据分析。
从转移性病变分离得到的细胞对人类白细胞抗原(HLA)呈阳性，证明每个病变来自于注入的人类细胞。基于配对t检验分析，用转移性成分注射的小鼠转移性病变中HLA阳性细胞有显著增加(p值＝0.021)，同时，用rMet中肿瘤样成分注射的小鼠中同型对照水平以是的HLA-阳性染色并没有增加(p值>0.05)。
实施例6
使用原位明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶(MMP)活性。根据供应商的指导，细胞培养在如前所述的rMET模型中，DQ-FITC I型或IV型抗原(Life Technologies)加入基质胶和rBM基质中。使用Zeiss AxioObserver倒置显微镜用荧光光谱监测NMP分泌14天以上。获得在495nm激发波长下曝光相同时间点的图像。用ImageJ(1.46r版本；NIH)或AdobePhotoshop CS6extended(13.0版本)编辑图像的亮度、对比度和尺寸。
实施例7
为了证明rMet临床前能力，用常规和rMet临床前模型评价5种治疗剂的效果。当在rMet系统中评估，化合物1、化合物3和化合物5表现出最小阻力，证明了体内和临床活性。化合物2II期临床试验失败，化合物4放弃；两者都表现出了rMet低活性(rMet曲线仍高于失效阈值)。因此，这个实施例证明了rMet系统实验结果与临床实验结果的高相关性。这样的相关性，因此，强调了rMet系统在预测侯选癌症治疗剂的临床性能上的价值。
为了统计分析，每个实验对至少三个单独的生物复制品进行。使用卡方检验对比转移性和非转移性细胞开始定植的时间。分别使用时序检验和配对t检测确定BM中HLA阳性细胞的生存时间和存在的统计学意义。数据表示为平均值±误差。使用GraphPad Prism软件(Mac；San Diego,CA 5.0a版本，www.graphpad.com)进行所有的分析，p<0.05时认为是显著的。
一些实施例可以仅含有rMet组织培养装置和培养箱，同时其它实施例进一步可以含有自动化图像阅读器、数字显微镜和/或流式细胞仪。在rMet组织培养装置的一些实施例中，自动化图像阅读器可以与数字显微镜和/或流式细胞仪连接，数字显微镜可以与流式细胞仪连接。在一些实施例中，这些组成部分中的任一个或所有可以与计算机和/或用户界面相连或受控于计算机和/或用户界面。在用于高通量和/或高内涵筛选的一些实施例中，一些或所有组成部分可以自动化控制。
虽然在此说明和描述的一些实施例用于描述优选实施例，本领域的普通技术人员应理解在不背离本发明的范围下可以用于相同目的的多种替代和/或等效实施例或实施方法取代所示实施例。本领域的技术人员应当容易明白根据本发明的实施例可以用多种多样的方法实现。本申请旨在覆盖在此所述实施例的任何修改或变形。因此，很明显本发明的实施例仅受限于权利要求和其等同物。

Claims (24)

1.一种细胞培养装置，包括：
a)第一组成部分，包含来自脊椎动物的流体，可选地原发性位点生长基质，
b)第二组成部分，包含生物基质模拟物，和
c)动力学流体组成部分，包含次级位点生长培养基，其中流体组成部分与第一和第二组成部分流体接触，
其中所述次级位点生长培养基的血清浓度比流体的高。
2.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述次级位点生长培养基包含至少8％的血清或血清替代物。
3.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中次级位点生长培养基包含至少15％的血清或血清替代物。
4.如权利要求2所述的细胞培养装置，其中所述流体包含低于5％的血清或血清替代物。
5.如权利要求2所述的细胞培养装置，其中所述次级位点生长培养基中的血清浓度是流体中的至少2倍。
6.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述第一组成部分和所述第二组成部分包含在单独的组织培养容器中。
7.如权利要求1所述的细胞培养装置，其中所述第一组成部分至少部分地包含在嵌入式容器中。
8.如权利要求1-7中任一项所述的细胞培养装置，进一步包含泵或搅拌装置，所述泵或搅拌装置与流体组成部分连接。
9.如权利要求1-8中任一项所述的细胞培养装置，其中所述第一组成部分中的流体来自于健康的脊椎动物。
10.如权利要求1-8中任一项所述的细胞培养装置，其中所述第一组成部分中的流体来自于患癌症的脊椎动物。
11.如权利要求1-10中任一项所述的细胞培养装置，其中所述动力学流体组成部分包含来自于患癌症的脊椎动物的流体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的细胞培养装置，其中所述动力学流体组成部分包含来自于骨髓基质细胞培养的流体。
13.上述任一项权利要求所述的细胞培养装置，其中所述生物基质模拟物包含器官特异性基质。
14.如权利要求13所述的细胞培养装置，其中所述器官特异性基质模拟肾上腺、骨髓、脑、肝、肺组织、淋巴结、卵巢、腹膜、皮肤、脾脏、结缔组织、骨、血管结构或关节。
15.根据上述任一项权利要求所述的细胞培养装置，其中生物基质模拟物包含胶原蛋白1-14或其片段、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、透明质酸或相关透明质烷、凝集蛋白聚糖、基质胶或其他糖胺聚糖、软骨素、皮肤素或相关细胞外基质或糖萼组分或它们的组合。
16.根据上述任一项权利要求所述的细胞培养装置，其中所述第一组成部分模拟膀胱、骨、骨髓、脑、乳腺、宫颈、结肠、子宫内膜、食道、肾、肝、肺、皮肤、卵巢、胰腺、前列腺、胃、睾丸、甲状腺、或子宫的实体瘤，内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞、瘢痕、纤维化组织、外科粘连组织或过度增殖性骨病变。
17.根据上述任一项权利要求所述的细胞培养装置，其中第一组成部分包含胶原蛋白I、胶原蛋白II、胶原蛋白III、胶原蛋白IV、胶原蛋白V、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、透明质酸、凝集蛋白聚糖、基质胶或它们的组合。
18.根据上述任一项权利要求所述的细胞培养装置，其中该系统保持在约30℃至约45℃的温度下。
19.一种确定抗癌或抗过度增殖(anti-HPP)治疗剂的方法，包括：
a)将含有潜在抗癌/抗过度增殖治疗剂的溶液加入到如权利要求1至18中任一项所述的细胞培养装置中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的转移癌细胞或过度增殖细胞，
b)在加入潜在抗癌/抗过度增殖治疗剂之前和之后，检测原发性肿瘤、侵袭转移性细胞或过度增殖细胞在细胞培养装置中的量，和
c)确定潜在抗癌/抗过度增殖治疗剂。
20.一种确定抗癌/抗过度增殖治疗剂或组合或治疗方案对患者的疗效的方法，包括：
a)将含有潜在抗癌/抗过度增殖治疗剂或组合的溶液加入到或将治疗方案施加到如权利要求1至18中任一项所述的细胞培养装置的第一或第二组成部分中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的转移癌细胞或过度增殖细胞，
b)在加入潜在抗癌/抗过度增殖治疗剂或施加治疗方案之前和之后，检测原发性肿瘤、侵袭转移性细胞或过度增殖细胞在所述第二组成部分中的量，和
c)确定潜在抗癌/抗过度增殖治疗剂、组合或治疗方案的疗效。
21.一种预测和/或确定患者癌症转移扩散或病理性过度增殖繁殖进程的方法，包括：
a)将含有来自于患者的癌细胞或过度增殖细胞的溶液加入到如权利要求1-18任一项所述的细胞培养装置的第一组成部分中，其中所述细胞培养装置的第二组成部分包含可检出量的患者癌细胞或过度增殖细胞，和
b)在足够长的时间之后，检测所述细胞培养装置中第二组成部分中转移性细胞或过度增殖细胞的存在或不存在。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述细胞培养装置还包含用于检测转移性细胞定植的系统，该系统与所述装置连接。
23.如权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述细胞培养装置还包含数字显微镜或系统，所述数字显微镜或系统用于检测转移性癌细胞或过度增殖细胞的定植，与所述装置连接。
24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中所述细胞培养装置进一步包含与所述装置连接的流式细胞仪。
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